Luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp hoạt chất huperzine a của chủng vi nấm nội sinh penicillium sp lđl 4 4 từ cây thạch tùng răng cưa
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.48 MB, 76 trang )
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Lu
Họ và tên tác giả luận văn: Hoàng Thị Hồng Anh
ận
n
vă
th
TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN
ạc
sỹ
NGHIÊN C U NÂNG CAO KH NĂNG INH T NG H
HU
IN A C A CH NG VI N M NỘI INH Penicillium sp.
LĐL4.4 TỪ CÂY THẠCH TÙNG ĂNG CƯA
nh
Si
c
họ
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Hà Nội – 2019
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Họ và tên tác giả luận văn: Hoàng Thị Hồng Anh
ận
Lu
vă
n
TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN
ạc
th
NGHIÊN C U NÂNG CAO KH NĂNG INH T NG H
HU
IN A C A CH NG VI N M NỘI INH Penicillium sp.
LĐL4.4 TỪ CÂY THẠCH TÙNG ĂNG CƯA
sỹ
nh
Si
: Sinh học thực nghiệm
Mã số
: 8420114
c
họ
Chuyên ngành
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
Hướng dẫn 1 : TS. Lê Thị Minh Thành
Hà Nội – 2019
Lời cam đoan
Tơi xin cam đoan: Luận văn
là
cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung
thực và chưa được công bố trong các cơng trình khác. Mọi sự giúp đỡ cho
việc hồn thành luận văn đều đã được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trình bày
trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc. Nếu khơng đúng như nêu trên, tơi
xin hồn tồn chịu trách nhiệm về đề tài của mình.
Lu
ận
Tác giả luận văn
n
vă
ạc
th
Hoàng Thị Hồng Anh
sỹ
nh
Si
c
họ
Lời cảm ơn
ận
Lu
Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm chân thành tới TS. Lê Thị
Minh Thành – Phó giám đốc Trung tâm Giống và Bảo tồn Nguồn gen Vi sinh
vật - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
thực hiện luận văn.
Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Trung Tâm Giống và Bảo Tồn Nguồn
Gen Vi Sinh Vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi
trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa
Công nghệ Sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn và truyền đạt kiến thức cho tôi
trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người
ln bên cạnh, động viên, giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập để tơi có
được kết quả như ngày hơm nay.
n
vă
ạc
th
sỹ
nh
Si
Hà Nội, tháng 4 năm 2019
c
họ
Hoàng Thị Hồng Anh
Danh mục ký hiệu và chữ viết tắt
Từ viết tắt
Chữ viết đầy đủ
CYA
Czapek yeast extract agar
HPLC
High-performance liquid
chromatography
Malt Extract Agar
MNNG
N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine
PDA
Potato Dextrose Agar
PDB
Potato Dextrose Broth
TLC
Thin layer chromatography
UV
Ultra violet
ận
Lu
MEA
n
vă
ạc
th
sỹ
nh
Si
c
họ
Danh mục bảng
Bảng 1.1. Sử dụng tác nhân vật lý gây đột biến ............................................ 24
Bảng 1.2. Cơ chế tác động của tác nhân hóa học gây đột biến ...................... 24
Bảng 2.1. Các môi trường nuôi cấy .............................................................. 32
Bảng 2.2. Môi trường khảo sát đặc điểm hình thái ....................................... 33
Bảng 2. . Thành phần các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy ......................... 37
Bảng 2.4. Thành phần dung dịch môi trường MS ......................................... 39
Bảng 2.5. Nguồn C, N và chất bổ sung được lựa chọn.................................. 40
Lu
Bảng 2.6. Thành phần môi trường nhân giống .............................................. 41
Bảng .1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng Penicillium sp. LĐL 4.4
ận
trên các môi trường nuôi cấy ................................................................ 44
vă
Bảng .2. Các khuẩn lạc đột biến được chọn ngẫu nhiên .............................. 49
n
Bảng . . Kết quả định lượng HupA của chủng đột biến ........................... 51
th
Bảng .4. Lượng sinh khối tươi thu được và hàm lượng HupA trong dịch
các môi trường nuôi cấy khác nhau . 53
ạc
chiết của chủng vi nấm LĐL4.4
sỹ
Bảng .5. Ảnh hư ng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp HupA
Si
của chủng nấm LĐL4.4 ........................................................................ 56
nh
Bảng .6. Ảnh hư ng của hàm lượng nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng
hợp HupA của chủng nấm LĐL4.4 ....................................................... 58
họ
Bảng .7. Ảnh hư ng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp HupA của
c
chủng nấm LĐL4.4 .............................................................................. 58
Bảng . . Ảnh hư ng của chất bổ sung tới sinh khối tươi và hàm lượng HupA
của chủng vi nấm nghiên cứu ............................................................... 60
Bảng .9. Ảnh hư ng của hàm lượng ethanol tới sinh khối tươi và hàm lượng
HupA của chủng vi nấm LĐL 4.4 nghiên cứu ...................................... 61
Bảng .10. Khả năng sinh trư ng của chủng nấm LĐL 4.4 trên một số môi
trường nhân giống ................................................................................ 63
Bảng .11. Ảnh hư ng của thời gian nhân giống đến khả năng sinh tổng hợp
HupA của chủng vi nấm LĐL 4.4 ......................................................... 64
Bảng .12. Ảnh hư ng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp HupA của
chủng LĐL 4.4 ..................................................................................... 65
Bảng .1 . Ảnh hư ng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp HupA
của chủng LĐL 4.4 ............................................................................... 66
Bảng .14. Ảnh hư ng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp HupA của
chủng chủng LĐL 4.4 ........................................................................... 66
Bảng .15. Ảnh hư ng của độ thơng khí đến khả năng sinh tổng hợp HupA
của chủng LĐL 4.4 ............................................................................... 67
Bảng .16. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp HupA của chủng nấm
LĐL 4.4 trên thiêt bị lên men 5 lít ........................................................ 69
ận
Lu
n
vă
ạc
th
sỹ
nh
Si
c
họ
Danh mục hình ảnh
Hình 1.1: Cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) [6] ............................. 6
Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Huperzine A [2] ............................................ 9
Hình 1. : Nấm nội sinh phát triển trong rễ cây Cối xay và cây Phong đường
[11]....................................................................................................... 10
Hình .1. Hình thái khuẩn ty của chủng LĐL 4.4 trên các môi trường sau 5
ngày nuôi cấy. ...................................................................................... 46
Hình .2. Đặc điểm vi hình thái của chủng Penicillium LĐL 4.4 trên các môi
trường sau 5 ngày nuôi cấy ................................................................... 46
Lu
Hình . . Sắc ký đồ (UV 310 nm) Penicillium sp. LĐL4.4 trên hệ thống sắc
ận
ký lỏng hiệu năng cao ........................................................................... 47
vă
Hình .4. Tỷ lệ sống sót chủng LĐL 4.4 sau xử lí đột biến ........................... 48
n
Hình .5. Khuẩn lạc các chủng đột biến 4.4hc15.2 (A), 4.4hc20.1 (B) và
th
4.4uv30.3 (C) trên mơi trường PDA ..................................................... 50
ạc
Hình .6. Sắc kí lớp mỏng – TLC của chất chỉ thị HupA (a, b), dịch chiết nấm
thể 4.4hc20.1 (d), 4.4uv 0. (e) và 4.4hc15.2 (f) trên bản silica gel Merk
sỹ
0.25 mm được phát hiện bằng thuốc nhuộm KMnO4 0,5% ................... 50
Si
nh
Hình .7. Sắc ký đồ HPLC (UV 10 nm, Ref 90 nm) của chất chỉ thị
Huperzine A (A) và các mẫu phân tích 4.4hc15.2 (B), 4.4hc20.1 (C) và
họ
4.4uv30.3 (D) ....................................................................................... 51
c
Hình . . Sinh khối lên men và dịch chiết (hòa trong Chlorofom) chủng LĐL
4.4 trên mơi trường MT9 ...................................................................... 54
Hình .9. Sắc kí đồ xác định hàm lượng HupA của chủng LĐL 4.4 trên mơi
trường MT 9 ......................................................................................... 55
Hình .10. Sinh khối chủng LĐL 4.4 trong môi trường khoai tây (A), Czapek
– Dox (B) và PDA (C) .......................................................................... 63
Hình .11. Sinh khối của chủng LĐL4.4 khi nuôi cấy
các pH môi trường
khác nhau ............................................................................................. 66
Hình 3.12. Sinh khối của chủng LĐL 4.4 khi nuôi cấy
các nhiệt độ khác
nhau...................................................................................................... 67
Hình 3.13. Sinh khối của chủng khi lắc
các tốc độ khác nhau ................... 68
Hình .14. Sinh khối lên men chủng LĐL 4.4 quy mơ 5L
các thời gian khác
nhau ..................................................................................................... 70
Hình .15. Sắc ký đồ (UV 310 nm) dịch chiết chủng Penicillium sp. LĐL4.4
quy mô lên men 5L trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ............. 70
ận
Lu
n
vă
ạc
th
sỹ
nh
Si
c
họ
MỤC LỤC
ận
Lu
MỤC LỤC ..................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 6
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA VÀ HOẠT
CHẤT HUPERZINE A .............................................................................. 6
1.1.1. Cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) .................................... 6
1.1.2. Hoạt chất Huperzine A (HupA) ........................................................ 7
1.2. VI NẤM NỘI SINH TRONG THỰC VẬT ......................................... 9
1.2.1. Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật ....................................... 10
1.2.2. Một số nghiên cứu về phân lập nấm nội sinh trong các loài thực vật
khác nhau ................................................................................................. 11
1.2. . Ứng dụng của vi nấm nội sinh trong thực vật ................................. 13
1. . TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI NẤM NỘI SINH CÂY THẠCH
TÙNG RĂNG CƯA SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT HUPERZINE A. 14
1. .1. Các nghiên cứu trên thế giới ........................................................... 14
1. .2. Các nghiên cứu trong nước ............................................................. 18
1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH TRƯỞNG
PHÁT TRIỂN CỦA VI NẤM .................................................................. 19
1.4.1. Ảnh hư ng của nuôi cấy đến sự sinh trư ng phát triển của vi nấm . 19
1.4.2. Các nguồn dinh dưỡng trong sinh trư ng của vi nấm ...................... 20
1.5. TẠO GIỐNG VI SINH VẬT BẰNG ĐỘT BIẾN .............................. 22
1.5.1. Khái niệm chung ............................................................................ 22
1.5.2. Quy trình tạo giống bằng phương pháp gây đột biến....................... 23
1.5. . Đột biến chủng bằng tia UV ........................................................... 25
1.5.4. Đột biến chủng MNNG (N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine) .... 25
1.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ [5] .......................................................... 25
1.6.1. Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography – TLC) ................... 25
1.6.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography
– HPLC ) .................................................................................................. 27
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 31
2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................ 31
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 31
n
vă
ạc
th
sỹ
nh
Si
c
họ
1
ận
Lu
2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị thí ngiệm .................................................... 31
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................... 32
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi nấm ..................................... 32
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm 33
2.2. . Các phương pháp gây đột biến chủng ............................................. 35
2.2.4. Các phương pháp nghiên cứu mơi trường ni cấy thích hợp ....... 355
2.2.5. Phương pháp tách chiết hoạt chất Huperzine A từ chủng nấm ........ 42
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt chất HupA ........................................... 42
CHƯƠNG . KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 44
.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, VI HÌNH THÁI
CỦA CHỦNG VI NẤM Penicillium sp. LĐL 4.4 .................................... 44
3.2. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP HUPA CỦA CHỦNG
Penicillium sp. LĐL4.4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN CHỦNG .. 47
.2.1. Kết quả sàng lọc chủng đột biến có khả năng sản sinh Huperzine A
................................................................................................................. 48
.2.2. Kết quả xác định khả năng sinh tổng hợp HupA của các chủng đột
biến bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC ..................... 50
. . NGHIÊN CỨU NÂNG CAO SINH TỔNG HỢP HUPA CỦA
CHỦNG Penicillium sp. LĐL4.4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NU I CẤY
CHỦNG ................................................................................................... 52
. .1. Kết quả nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA bằng nghiên cứu
môi trường ni cấy thích hợp .................................................................. 52
. .2. Kết quả nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA bằng nghiên cứu
điều kiện lên men thích hợp...................................................................... 62
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 72
4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 73
n
vă
ạc
th
sỹ
nh
Si
c
họ
2
MỞ ĐẦU
ận
Lu
Bệnh Alzheimer (AD) là một bệnh thần kinh thoái hóa tác động đến trí
nhớ, suy ngh và hành vi của con người. AD ảnh hư ng đến hơn 20 triệu
người trên toàn thế giới bao gồm cả 4,5 triệu người Mỹ và được coi là nguyên
nhân lớn thứ ba gây tử vong các nước phát triển sau bệnh tim mạch và ung
thư [1]. Hiện tại khơng có phương thức chữa trị cho AD. Tuy nhiên, sử dụng
các chất ức chế cholinesterase (AChEI) là một trong những hầu hết các chiến
lược được chấp nhận trong điều trị AD [2]. Huperzin A (HupA), một
Lycopodium alkaloid, được tách chiết lần đầu tiên từ một cây thảo dược
truyền thống của Trung Quốc - Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trev.
(Thạch tùng răng cưa) trong những năm 19 0 [3]. Sau khi các cơng trình
nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc được công bố, thì các nhà khoa
học Phương Tây đã kết luận rằng chất này có tác dụng trong việc chữa trị các
bệnh suy giảm về trí nhớ, đặc biệt đối với bệnh Alzeimer. Alkaloid này có
khả năng xuyên qua hàng rào mạch máu não và tác động trực tiếp lên não bộ
với liều lượng rất thấp tính bằng microgram. Trên thực tế, HupA ức chế việc
sản sinh ra acetylcholinesterase, một enzym tạo ra sự suy thoái của
acetylcholine. Khi mà enzym này bị thiếu hụt, hoặc chỉ có với hàm lượng rất
thấp thì hàm lượng acetylcholine trong não tăng lên, giúp cho trí nhớ và các
chức năng nhận thức được cải thiện. So với các loại thuốc dược phẩm tacrine,
donepezil, rivastigmine và galanthamine; HupA và dẫn xuất bán tổng hợp của
ZT-1 có hoạt động chống AChE tốt hơn, thời gian dài hơn, khả dụng sinh học
đường uống cao hơn và ít tác dụng độc hại hơn [4, 5]. HupA đã được phê
duyệt trong năm 1990 Trung Quốc như là một thuốc điều trị Alzheimer và
bán trên thị trường Mỹ như một chế độ ăn uống bổ sung, và ZT-1 đã được
hoàn thành giai đoạn II lâm sàng thử nghiệm cả Trung Quốc và châu Âu,
năm 2007 nước Pháp coi đây là vấn đề phải quan tâm hàng đầu của quốc gia
[5].
n
vă
ạc
th
sỹ
nh
Si
c
họ
Các nghiên cứu về hoạt chất Huperzine A trong cây H. serrata làm
nguyên liệu trong sản xuất thuốc chữa trị các bệnh rối loạn về trí nhớ và AD
3
ận
Lu
đã thu được các thành tựu rất đáng quan tâm. Các kế hoạch bảo tồn, phát triển
loài này được một số nước trong đó có Trung Quốc chú trọng phát triển.
Ngoài phát triển trồng trọt, nhân giống invitro cũng đã được quan tâm nhằm
nhân nhanh sản lượng cây và tăng cao sản lượng hoạt chất HupA [6, 7]. Tuy
nhiên, do điều kiện nuôi trồng thực vật cây H. serrata cũng như ni cấy cây
in vitro rất khó khăn (địi hỏi phải mất nhiều thời gian kéo dài nhiều năm, chi
phí nhiều cho trồng trọt nhân cây) để có thể thu được một lượng lớn cây
nguyên liệu cho chiết tách được một lượng lớn HupA phục vụ việc sản xuất
thuốc, nên việc tìm kiếm chủng vi nấm sản sinh ra HupA là quan trọng, cần
được quan tâm và là một hướng đi mới nhằm hướng tới một nguồn nguyên
liệu lớn có hiệu quả kinh tế cho ngành công nghiệp dược trong nước và trong
điều trị bệnh suy giảm trí nhớ tại Việt Nam, đáp ứng cho nhu cầu thị trường
trong và ngồi nước.
vă
n
Vi sinh vật nội sinh thường sống trong mơ thực vật được tìm thấy vùng
rễ, thân, lá, quả của thực vật. Nấm nội sinh trong thực vật thường sinh trư ng,
phát triển nội sinh hoàn toàn hoặc một phần trong mô của các tế bào cây chủ,
thường không gây triệu chứng rõ ràng của bệnh. Gần đây, nấm nội sinh được
phân lập từ các loại cây trồng đã được chấp nhận như là một nguồn nguyên
liệu quan trọng của ngành công nghiệp dược. Một lượng lớn các hợp chất có
cấu trúc mới và hoạt tính sinh học khác nhau đã được chiết xuất từ các nấm
nội sinh này [8]. Do đó, việc nghiên cứu phân lập các chủng nấm nội sinh
trong cây H. serrata có khả năng sản sinh hoạt chất HupA đã được các nhà
khoa học quan tâm nhằm thay thế, tăng cường lượng HupA cho ngành công
nghiệp dược. Đã có nhiều kết quả nghiên cứu khả quan được cơng bố, đặc
biệt là Trung Quốc – nơi có cây H. serrata phân bố nhiều. Hợp chất Hup A
được tìm thấy sinh tổng hợp b i các lồi nấm nội sinh trong cây H. serrata
bao gồm các chi chủ yếu như Aspergillus, Trichoderma, Alternaria,
Podospora, Penicillium, Cyphellophora, Colletotrichum, Acremonium,
Blastomyces, Botrytis.
ạc
th
sỹ
nh
Si
c
họ
Ở Việt Nam, Thạch tùng răng cưa mới được phát hiện tại Sa Pa, Lâm
Đồng độ cao 1.000 m. Đây là loài cây dược liệu quý hiếm, thuộc danh sách
4
ận
Lu
"đỏ" trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý
hiếm về cây thuốc, nhưng chưa được quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng
dụng trong điều trị bệnh tại Việt Nam. Mặt khác, tại Việt Nam trước đây đã
có nhiều nghiên cứu về vi nấm nội sinh trong một số loại cây trồng, tuy nhiên,
các nghiên cứu về nấm nội sinh cây Thạch tùng răng cưa Việt Nam đến nay
là chưa có cơng bố. Hiện tại, lần đầu tiên tại Việt Nam, từ năm 2015 đến nay,
Viện Cơng nghệ sinh học đã và đang có các nghiên cứu trong khuôn khổ đề
tài cấp cơ s và cấp Nhà nước về các chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp
HupA trong cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Việt Nam. Nhóm đề tài đã
thu được các kết quả rất khả quan, trong đó chủng vi nấm Penicillium sp.
LĐL4.4 được phân lập từ lá cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Đà Lạt là
một trong những chủng giống có tiềm năng sinh tổng hợp hoạt chất HupA
cao. Vì vậy, đề tài:
ạ
vă
n
ừ y
T ạ
ù
ư được thực hiện nhằm nâng cao khả năng sinh tổng
hợp HupA của chủng, từ đó tạo được nguồn nguyên liệu chủng giống gốc
trong nghiên cứu, sản xuất hoạt chất HupA phục vụ cho sản xuất thuốc h trợ
điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại Việt Nam, đặc biệt là bệnh Azheimer sau này.
ạc
th
sỹ
đề à :
nh
Si
Mụ đí
c
họ
Nâng cao được khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A của
chủng nấm Penicillium sp. LĐL4.4 nhằm tạo được nguồn nguyên liệu
chủng giống gốc cho nghiên cứu, sản xuất HupA trong h trợ điều trị
bệnh rối loạn trí nhớ tại Việt Nam, đặc biệt là bệnh Azheimer.
d
:
-
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học chủng vi nấm Penicillium sp.
LĐL4.4.
-
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi nấm
Penicillium sp. LĐL4.4 bằng phương pháp đột biến chủng.
-
Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi
nấm Penicillium sp. LĐL4.4 bằng phương pháp nuôi cấy chủng.
5
rất nhiều năm (có khi tới 15 năm) phát triển trong tự nhiên mới có thể để sử
dụng làm thuốc. Chính vậy, nguồn cung cấp hoạt chất HupA từ cây Thạch
tùng răng cưa làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc là khơng cao (khoảng
0,1%). B i vậy, có rất nhiều sự n lực để thực hiện việc sản xuất HupA như
nuôi cấy in vitro cây H. serrata và tổng hợp hóa học [6].
ận
Lu
Họ Huperziaceae bao gồm 2 chi: Huperia và Phlegmariurus. Loài
Huperzia hiện đang nằm trong danh sách tuyệt chủng của các loài thực vật,
hầu hết chúng được sử dụng trong mục đích y tế. Trong các lồi khác nhau
của Huperziaceae, hàm lượng HupA cao nhất được tìm thấy Phlegmariurus
caritus cao hơn loài Huperzia serata. Cây trồng trong điều kiện độ ẩm cao (
các khu rừng ẩm ướt) cũng cho hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với cây
trồng trong mơi trường có độ ẩm thấp. Lượng HupA cũng thay đổi đáng kể
theo mùa, cao nhất giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân.
vă
n
Hàm lượng Huperzine A cao nhất lồi H. pinifolia (1765.9 µg g-1
dw), hàm lượng Huperzia elmeri từ Philippines (60 µg g-1 ) và H. carinata
(1030 µg g-1) từ Queensland, Australia. Cịn với H. serrata từ Trung Quốc đạt
từ 80,2- 182,6 µg g-1 [5]. Trong điều kiện Việt Nam chỉ có thể ni trồng
được H. serrata như của Trung Quốc.
ạc
th
sỹ
nh
Si
1.1.2. Hoạt chất Huperzine A (HupA)
c
họ
Huperzine A là một Lycopodium alkaloid, hoạt chất chính trong cây
Thạch tùng răng cưa. Các nhà khoa học Trung Quốc là những người đầu tiên
cô lập được chất này từ cây và tiến hành các thí nghiệm lâm sàng cũng như
các ứng dụng điều trị các bệnh rối loạn trí nhớ tại Trung Quốc. Sau đó, các
nhà khoa học phương Tây cũng nghiên cứu và đã kết luận HupA có tác dụng
rất tốt trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đặc biệt đối với bệnh Alzeimer.
1.1 2 1 Bệ
Bệnh Alzheimer (AD, SDAT) hay đơn giản là Alzheimer là một
chứng mất trí phổ biến nhất. Vào năm 1906, lần đầu tiên bác s tâm thần và
thần kinh học người Đức Alois Alzheimer đã chỉ ra căn bệnh này không thể
chữa được, mang tính thối hóa và gây tử vong. Căn bệnh này được đặt theo
7
ận
Lu
tên ông. Trong những năm 1970 - 1985 khoa học nhận thấy người mất trí
các lứa tuổi khác nhau lại có triệu chứng lâm sàng giống nhau. Khi bệnh tiến
triển, các triệu chứng bao gồm sự nhầm lẫn, khó chịu, thay đổi tâm trạng, mất
khả năng phân tích ngơn ngữ, mất trí nhớ dài hạn, suy giảm các giác quan.
Dần dần, cơ thể sẽ mất đi một số chức năng, cuối cùng dẫn đến cái chết. Bệnh
Alzheimer có thể phát triển tiềm tàng trong một thời gian dài trước khi xuất
hiện những triệu chứng có thể phát hiện được bệnh. Thơng thường khi các
triệu chứng này bộc lộ, thì người bệnh chỉ có thể sống được khoảng 7 năm,
dưới % bệnh nhân sống thọ thêm 14 năm sau khi phát hiện bệnh. Bệnh này
thường xuất hiện người trên 65 tuổi, tuy nhiên dạng Alzheimer sớm dù
khơng phổ biến nhưng có thể xảy ra sớm hơn rất nhiều. Năm 2006 có 26,6
triệu người mắc bệnh Alzheimer trên toàn thế giới. Dự đoán tỉ lệ mắc
Alzheimer trên thế giới sẽ là 1,18% vào năm 2050.
vă
n
Hiện nay khoa học vẫn chưa hiểu rõ nguyên nhân và tiến triển của bệnh
Alzheimer. Nghiên cứu cho thấy căn bệnh này có liên quan với các mảng và
đám rối trong não. Các phương pháp điều trị hiện tại chỉ giúp giảm một phần
nhỏ triệu chứng bệnh, chưa có phương pháp trị liệu nào có thể ngăn chặn hoặc
làm chậm tiến triển của bệnh. Tính tới thời điểm 200 , đã có hơn 500 thử
nghiệm lâm sàng nhằm tìm ra phương pháp chữa trị bệnh Alzheimer, nhưng
vẫn chưa biết có kết quả nào khả quan trong các phương pháp đã được thử
nghiệm. Một số thói quen sống đã được đưa ra khuyến cáo nhằm phòng
ngừa bệnh Alzheimer, nhưng cũng chưa có đủ chứng cớ cho thấy những
khuyến cáo này có thể làm giảm sự thối hóa não.
ạc
th
sỹ
nh
Si
c
họ
1122
đề
ị bệ
HupA là một alkaloid, có cấu trúc hóa học là C15H18N2O (hình 1.2), có
trọng lượng phân tử là 242, 2, nhiệt độ nóng chảy 2 0oC, tan trong methanol,
ethanol, ít hịa tan trong nước.
Cơ chế của Hup A trong điều trị bệnh là: Trong cơ thể người, não sản
xuất ra một chất truyền thần kinh là acetylcholine có chức năng quan trọng
trong chuyển động cơ bắp, suy ngh và trí nhớ; aceteycholine bị ức chế, gây
thối hóa b i enzym acetylcholinesterase (AChE). Hoạt chất HupA có tác
8
dụng ức chế việc sản sinh ra acetylcholinesterase, giúp cho việc làm giảm
lượng enzym này và khi đó lượng acetylcholine trong não tăng lên, giúp cho
trí nhớ và các chức năng nhận thức được cải thiện [10]. Trong một nghiên
cứu, các nhà khoa học phát hiện ra rằng 5 % bệnh nhân Alzheimer cải thiện
đáng kể cả hai chức năng nhận thức và trí nhớ khi dùng 200 mcg HupA m i
ngày. Ngồi ra, tác dụng tích cực ghi nhận những bệnh nhân này về chất
lượng cuộc sống cũng như khả năng tìm lại những kỷ niệm đã qua trong q
khứ, nó khơng chỉ h trợ điều trị hiệu quả cho não bộ của người bệnh
Alzheimer, người già có biểu hiện suy giảm trí nhớ mà cịn có hiệu quả trong
việc cải thiện trí nhớ người lớn khỏe mạnh.
ận
Lu
n
vă
ạc
th
sỹ
Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Huperzine A [9]
nh
Si
So với các loại thuốc dược phẩm tacrine, donepezil, rivastigmine và
galanthamine; HupA và dẫn xuất bán tổng hợp của ZT-1 có hoạt động chống
AChE tốt hơn, thời gian dài hơn, khả dụng sinh học đường uống cao hơn và ít
tác dụng độc hại hơn [4, 5]. HupA đã được phê duyệt trong năm 1990
Trung Quốc như là một thuốc điều trị Alzheimer và bán trên thị trường Mỹ
như một chế độ ăn uống bổ sung, và ZT-1 đã được hoàn thành giai đoạn II
lâm sàng thử nghiệm cả Trung Quốc và châu Âu, năm 2007 nước Pháp coi
đây là vấn đề phải quan tâm hàng đầu của quốc gia [4].
c
họ
1.2. VI NẤM NỘI SINH TRONG THỰC VẬT
Vi nấm nội sinh – fungal endophyte sống mô sâu thực vật, thể hiện
mối liên kết giữa cây và nấm bằng cách hình thành khuẩn lạc trong mô tế bào
thực vật các giai đoạn sinh trư ng phát triển cây chủ, thường không gây
triệu chứng bệnh rõ ràng cho cây [12, 13].
9
1 2 1 3 Sự
yề
ự
ậ
Vi nấm nội sinh có thể lây nhiễm từ phần này sang phần khác trong cây
chủ (truyền ngang), hoặc các cây di truyền cho các thế hệ sau (truyền dọc). Ví
dụ cho cơ chế truyền ngang: một số nghiên cứu chỉ ra rằng, trong hạt giống và
cây hầu như không chứa nấm nội sinh, tuy nhiên tỷ lệ nấm nội sinh tăng lên
khi lá hay hạt lớn lên [16, 17]. Cịn số nấm nội sinh lồi Neotyphodium và
Epichloë lại được truyền theo chiều dọc lưu trữ trên thế hệ con cháu [18].
1.2.2. Một số nghiên cứu về phân lập nấm nội sinh trong các loài thực vật
khác nhau
ận
Lu
Mặc dù nấm nội sinh trong thực vật đã được biết đến thế kỷ trước,
nhưng chúng mới chỉ được quan tâm chú trọng tới trong vòng hơn 0 năm tr
lại đây.
vă
n
Năm 19 1, Webber là nhà nghiên cứu đầu tiên công bố phát hiện nấm
nội sinh Phomopisis oblonga cây Du (Ulmus). Lồi nấm này sau đó được
Clayton và cộng sự xác định thuộc Xylariaceae [12]. Từ đó đến nay, một loạt
các nhóm cây cũng đã được phát hiện là có vi nấm nội sinh sống trong cây.
ạc
th
sỹ
Một số nghiên cứu vi nấm nội sinh thực vật trong những năm gần đây:
Si
cây thông đỏ (Taxus brevifolia):
nh
- Nấm nội sinh
c
họ
Năm 1995 – 1996, các nghiên cứu ngoài nước đã phân lập được hàng trăm
lồi nấm nội sinh từ các cây thơng đỏ Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Có thể
nói các cây thông đỏ là một kho báu chứa nhiều vi sinh vật chưa từng được
phát hiện và rất đáng chú ý, chúng tương tác với nhau và với cây chủ. Những
nấm đã được phân lập từ cây thuộc các chi: Taxomyces sp., Pestolotiopsis sp.,
Penicillium sp. và Truncatella sp [13].
Năm 2010, các nhà nghiên cứu thuộc phòng Sinh học thực nghiệm - Viện
Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên đã đưa ra biểu đồ về quy luật phân bố của
các chủng nấm nội sinh trên các bộ phận của cây thơng đỏ (Taxus
wallichiana). Theo đó, vi nấm nội sinh được phân bố trên tất cả các bộ phận
khác nhau, nhiều nhất lá (50 chủng), thân (4 chủng), cành ( 9 chủng), rễ
(24 chủng) và ít nhất là quả (1 chủng). Bằng phương pháp phân loại hình
11
thái và sinh học phân tử đã định tên được 4 chủng nấm là Trichoderma
aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii
SHT101và Gongroniella butleri SHT106 [13].
- Nấm nội sinh trong cây thầu dầu (Ricinus communi):
ận
Lu
Sardul và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân lập nấm nội sinh trong cây
thầu dầu Ấn Độ. Các nhà khoa học cho rằng các nấm nội sinh này có khả
năng sản sinh hoạt chất Hypericin (C30H16O8) có hoạt tính kháng sinh chống
vi khuẩn E.Coli, các loài Samonella sp., Staphylococus sp. và các nấm
Candida sp.. Kết quả, từ 46 mẫu (16 lá, 16 thân và 14 rễ) đã phân lập được 10
chủng nấm nội sinh thuộc các chi Aspergillus sp. , Fusarium sp., Curvularia
sp., Alternaria sp., Dreschslera sp [8].
- Nấm nội sinh trong chi cỏ xạ hương (Thymus):
vă
n
Cỏ xạ hương được biết đến như một loại gia vị, ngồi ra nó cịn là một cây
thuốc có tác dụng giảm đau, kháng viêm. Tại tỉnh Hameda – Iran, Sahar và
cộng sự thu nhập các mẫu cây từ 6 loài cỏ xạ hương khác nhau vào ba thời
điểm mùa xuân, hè, thu năm 2011 để tiến hành phân lập các chủng nấm nội
sinh trong cây. Từ 00 mẫu cây thu được đã phân lập được 95 chủng thuộc 11
chi nấm khác nhau, ngồi ra cịn có 6 loại nấm men. Gồm các chi: Fusarium
sp., Aspergillus sp., Alternaria sp., Stemphylium sp., Ulocladium sp., Phoma
sp., Curvularia sp., Cylindrocarpon sp., Cylindrocarpon sp; trong đó , các
chi Alternaria sp., Phoma sp., Fusarium sp. là phong phú nhất.
ạc
th
sỹ
nh
Si
c
họ
- Nấm nội sinh trong cây kiwi (Actinidia macrosperma):
Ở Trung Quốc, cây Kiwi là một cây thuốc dùng trong điều trị nhiều bệnh
khác nhau như bệnh phong, áp xe, viêm thấp khớp, viêm khớp, vàng da, và
huyết trắng bất thường. Trong nghiên cứu điều tra vi nấm nội sinh trong kiwi
và xác định hoạt tính sinh học của chúng thu được 17 chủng vi nấm nội sinh
phân lập được từ cây Kiwi Trung Quốc, có 11 chủng thuộc 5 chi khác nhau:
Acremonium sp., Cylindrocarpon sp., Trichoderma sp., Paecilomyces sp., và
Chaetomium sp. Sáu chủng với các đặc điểm hình thái và dữ liệu phân tử cịn
giới hạn nên mới chỉ xác định thuộc lớp Ascomycete [19].
12
1.2.3. Ứng dụng của vi nấm nội sinh trong thực vật
1231 T
ơ
ệ
Các chất có hoạt tính sinh học được sản xuất trực tiếp từ vi nấm nội
sinh, hay là sản phẩm kết hợp giữa mối quan hệ tương tác giữa nấm và thực
vật, giúp cho vi nấm nội sinh thích ứng tốt hơn và thực hiện một số chức năng
bảo vệ, cung cấp các chất có lợi cho cây chủ [13]. Bên cạnh đó, vi nấm nội
sinh cũng có thể là nguyên nhân gây biến đổi sinh lý cây chủ giúp cây chủ
chống lại được với điều kiện sống bất lợi.
ận
Lu
Acremonium sp. là một dạng nấm nội sinh được biết đến khả năng có
thể kiểm sốt cơn trùng gây hại. Lợi dụng tính chất này, Koga và cộng sự đã
thực hiện cấy nhiễm nấm chi Acremonium vào các cây để chúng có thể truyền
cho cây chủ khả năng kháng lại sự cạnh tranh với các loài gây hại cho cây.
Kết quả nghiên cứu công bố đã cấy nhiễm thành công vào cây cỏ đuôi trâu
(Festuca arundinacea) và cỏ hắc mạch (Lolium perenne), các cây này đã
kháng lại được sâu kéo màng cỏ Poa P. teterrella [12].
n
vă
ạc
th
sỹ
Năm 1999, Pereira và cộng sự đã áp dụng trên cây chuối.Việc cấy
nhiễm nấm nội sinh vào cây chuối khơng chỉ giúp cây có khả năng kháng lại
thuốc diệt nấm mà nó cịn đột biến để duy trì sự đối kháng [12].
nh
Si
c
họ
Beauveria bassiana là loại nấm diệt côn trùng bằng cách gây bệnh
lên côn trùng giai đoạn ấu trùng và trùng. Nấm này được cấy nhiễm vào
một số hạt ngũ cốc để chống lại các côn trùng tấn công cây chủ trong một số
giai đoạn sinh trư ng và phát triển. Tuy nhiên, trong một số cây đã tìm thấy
sự có mặt của lồi này, chứng tỏ nấm này có dạng nội sinh tự nhiên khơng
liên quan tới q trình nấm xâm nhập vào cây. Ngồi ra, một số nấm gây bệnh
trên cơn trùng cũng đã được phân lập trên một số cây trồng khác [12].
1232 T
y dư
Các chất có hoạt tính sinh học được sản sinh b i các vi nấm nội sinh
được đánh giá là có tiềm năng phát triển trong l nh vực y dược. Theo các
nghiên cứu đánh giá, vi nấm nội sinh cung cấp hàng loạt các chất chuyển hóa
thứ cấp hoạt tính sinh học có cấu trúc độc đáo, bao gồm: alkaloid,
13
benzopyranones, chinones, flavonoid, acid phenolic, quinon, steroid,
terpenoid, tetralon,... [20]. Các chất chuyển hóa hoạt tính sinh học được ứng
dụng rộng rãi như hóa chất nơng nghiệp, thuốc kháng sinh, ức chế miễn dịch,
chất chống oxy hóa và chất chống ung thư [18].
ận
Lu
Ergoflavin (C30H26O14) thuộc nhóm hợp chất Ergochromes được mơ tả
như là một tác nhân chống ung thư mới được phân lập từ một loại nấm nội
sinh phát triển trên lá của cây thuốc Sến xanh (một loài thuộc họ Hồng xiêm)
Ấn Độ [21]. Chủng nấm nội sinh Penicillium brasilianum được tìm thấy
trong vỏ rễ cây Xoan, thúc đẩy sự sinh tổng hợp các amit phenylpropanoid nhóm chất Phenylpropanoid này được chú ý vào việc sử dụng như thuốc
chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm. Chủng nấm F0010
thuộc chi Xylaria sp. nội sinh trong cây thân g được mô tả là sản xuất ra
Griseofulvin – một chất kháng sinh chống nấm được dùng điều trị cho người
và động vật.
n
vă
ạc
th
Chất chống oxy hóa tự nhiên thường được tìm thấy trong cây thuốc, rau
và trái cây. Tuy nhiên, chất chuyển hóa từ nấm nội sinh có thể là một nguồn
tiềm năng của chất chống oxy hóa tự nhiên mới. Pestacin (C 15H14O4) đã thu
được từ các loại nấm nội sinh Pestalotiopsis sp. phân lập từ cây Terminalia
morobensis. Pestacin được cho là có hoạt tính chống oxy hóa gấp 11 lần lớn
hơn trolox - một dẫn xuất vitamin E [20].
sỹ
nh
Si
họ
c
Ngoài ra, các nhà khoa học đã tách chiết được rất nhiều các chất có
hoạt tính sinh học có ứng dụng cao trong y dược từ các nấm nội sinh thuộc
các chi: Aspergillus, Fusarium, Alternaria, Penicillium, Pestalotiopsis, [20]
1. . TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI NẤM NỘI SINH CÂY THẠCH TÙNG
RĂNG CƯA SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT HUPERZINE A
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới
1311
ề
yT ạ
ù
ư
Hầu hết hoạt chất Huperzine A hiện đang sử dung được tách chiết từ
cây Thạch tùng răng cưa và các cây thuộc họ Thạch tùng. Tuy nghiên, trong
cây Thạch tùng răng cưa chứa rất ít lượng Huperzine A. Bên cạnh đó, lồi cây
14
này phải mất nhiều thời gian để phát triển (phải mất ít nhất 15 năm từ khi bào
tử nảy mầm cho đến giai đoạn trương thành), đòi hỏi điều kiện phát triển ngặt
nghèo và chi phí cao trong trồng trọt. Mặc dù các nghiên cứu gần đây đã chỉ
ra nhân giống in vitro có thể cung cấp lượng HupA cao hơn cây trồng tự
nhiên [7, 6]; tuy nhiên, nó vẫn mất rất nhiều thời gian để có thể đủ lượng sinh
khối cho thu nhận HupA nên chưa thể đáp ứng được hết nhu cầu của ngành
công nghiệp dược.
ận
Lu
Gần đây, nấm nội sinh thực vật được phân lập từ các loại cây được chấp
nhận như là nguồn nguyên liệu quan trọng cung cấp cho ngành công nghiệp
dược. Một lượng lớn các chất có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học đa dạng
đã được chiết xuất từ nấm nội sinh [22]. Do vậy, các nhà khoa học đã quan
tâm đến việc nghiên cứu các chủng nấm nội sinh trong cây Thạch tùng răng
cưa có khả năng sản sinh hoạt chất HupA nhằm thay thế cho phương pháp
chiết xuất hoạt chất từ cây trồng tự nhiên, giúp tăng cường lượng HupA phục
vụ ngành cơng nghiệp dược. Đã có nhiều kết quả nghiên cứu khả quan được
công bố, đặc biệt là Trung Quốc – nơi có cây H. serrata phân bố nhiều. Hợp
chất Hup A được tìm thấy sinh tổng hợp b i các loài nấm nội sinh trong cây
H. serrata bao gồm các chi chủ yếu như Aspergillus, Trichoderma,
Coniochaeta,
Rhizoctonia,
Alternaria,
Plectosphaerella,Podospora,
Penicillium, Cyphellophora, Colletotrichum, Acremonium, Blastomyces,
Botrytis. Với phương pháp phân loại bằng đặc điểm hình thái và bằng phân
tích trình tự ITS – rDNA, Shi và cs (2005) đã phân lập được 4 chủng:
Cephalosporium sp., Plasmoparad sp., Saccharomyces sp., Penicillium sp.
nội sinh trong cây H. Serrata trồng tại tỉnh An Huy [21]; Huang và cs (2009)
đã phân lập được 4 chủng trong cây H. Serrata trồng tại tỉnh Hồ Nam
(Cladosporium sp., Penicillium sp., Fusarium sp., and Coniothyrium sp.)
[23]; Chen và cs (2011a,b) – sau khi khử trùng mẫu rễ, thân, lá cây H.
Serrata bằng ethanol và sodium hypochloride, các mẫu cây được đặt nuôi trên
môi trường PDA có bổ sung streptomycin sunfate - đã phân lập được 52
chủng nấm nội sinh trong cây H. serrata trồng tỉnh Hải Nam và 5 chủng
trong cây trồng
tỉnh Quảng Tây, các chủng này thuộc 26 chi
(Colletotrichum, Trichoderma, Fusarium, Coniochaeta, Rhizoctonia,
n
vă
ạc
th
sỹ
nh
Si
c
họ
15
ận
Lu
Alternaria, Aspergillus, Plectosphaerella, Podospora, Cyphellophora...)[24].
Trong đó - bằng kỹ thuật phân tích sắc ký màng lỏng (TLC) và sắc ký màng
lỏng hiệu năng cao (HPLC) - Li và cộng sự (2007) đã xác định được chủng
Acremonium sp. 2F09P0 B sản sinh HupA với hàm lượng , 2µg l [25];
Wang và cộng sự (2011) - với phương pháp khử trùng mẫu thân, lá cây H.
serrata bằng ethanol và mercuric chloride, sau đó đặt các mẫu cây trên mơi
trường PDA có bổ sung streptomycin và ampicilin - đã phân lập được 127
chủng nấm, trong đó bằng nhận dạng hình thái và phân tích trình tự ITS đã
định dạng được 69 chủng thuộc 19 chi nấm Aspergillus, Podospora,
Penicillium, Colletotrichum, Acremonium, Blastomyces, Botrytis... [34]. Bằng
kỹ thuật phân tích sắc ký màng lỏng (TLC) và sắc ký màng lỏng hiệu năng
cao (HPLC) đã xác định được 9 chủng có khả năng sản sinh HupA và chủng
Shiraia sp. Slf14 cho sản lượng HupA cao nhất là 27, µg L [26]; trình tự
gennom của chủng Shiraia sp. Slf14 đã được Zhang và cs công bố vào 2014.
n
vă
ạ
ạc
th
1312
sỹ
Các chủng giống vi nấm có khả năng sinh tổng hợp HupA là nguồn
cung cấp HupA dễ kiểm soát và thao tác, có thể thu với lượng lớn với thời
gian nhanh nhất. Tuy nhiên, chủng sản phân lập từ tự nhiên thường có khả
năng tổng hợp hoạt chất sinh học thấp. Thơng thường, để chủng có khả năng
tổng hợp hoạt chất sinh học cao, có giá trị trong cơng nghiệp cần phải áp dụng
các phương pháp nâng cao hoạt tính như lựa chọn các điều kiện, mơi trường
ni cấy thích hợp, tối ưu thành phần môi trường lên men theo mô hình đáp
ứng bề mặt... hoặc gây đột biến chủng (đột biến cảm ứng, kỹ thuật di truyền
và công nghệ gen, điều khiển hoạt động của gen, gây đột biến định hướng).
nh
Si
c
họ
Theo các tài liệu đã cơng bố hoạt tính huperzin A của các chủng nấm
nội sinh khác nhau dao động từ ,32 đến 27, mcg L dịch lên men. Tuy
nhiên nhiều chủng nấm dại phân lập có hoạt tính thấp, cần có sự nghiên cứu
về thành phần mơi trường ni cấy, điều kiện nuôi cấy, điều kiện lên men để
tăng khả năng sản sinh Hup A. Các chủng nấm nội sinh tổng hợp Hup A cần
nhiều chất dinh dưỡng đặc biệt trong môi trường sống, chúng phát triển tốt
16
trong cây thạch tùng và độ cao và nhiệt độ đặc biệt cho nên trong môi
trường tổng hợp Hup A có lẽ cũng cần một số chất đặc biệt. Tuy nhiên, hai
yếu tố nguồn cacbon và nguồn nito trong môi trường vẫn đóng vai trị quan
trọng trong tổng hợp Hup A. Các chủng vi nấm khác nhau có khả năng sử
dụng các nguồn cacbon, nito khác nhau để sinh tổng hợp Hup A.
ận
Lu
Theo Zhao X-M và cộng sự (201 ), khi nghiên cứu ảnh hư ng của
nguồn cacbon đến tổng hợp Hup A của chủng Colletotrichum gloeosporioides
ES026 cho thấy nguồn cacbon, glucose và sucrose, tổng hợp HupA cũng như
hệ sợi mạnh hơn trong khi nguồn cacbon maltose cũng chủng này thì ngược
lại [27]. Nghiên cứu tối ưu các điều kiện lên men khác nhau để sản xuất
HupA từ C. gloeosporioides ES026 đã làm tăng 25,5 % sản lượng HupA.
Môi trường khoai tây bổ sung glucose hoặc sucrose nhưng khơng có maltose
đã làm tăng khả năng sản xuất HupA từ nấm. Ethanol được bổ sung vào môi
trường đạt nồng độ cuối cùng 0,5-2% đã kích thích sự phát triển của nấm
trong khi methanol với lượng tương tự đã ức chế sự tăng trư ng. Tuy nhiên,
cả methanol và ethanol đã làm tăng khả năng sản xuất HupA lên nhiều (năng
suất cao nhất của HupA tăng 51, 9% khi bổ sung ethanol). Phân tích sâu hơn
cho thấy cả ethanol và methanol là chất cảm ứng mạnh mẽ cho sản xuất
HupA, trong khi ethanol một phần được sử dụng như một nguồn carbon trong
quá trình lên men. Màu sắc của sợi nấm dần dần tr nên đen khi cho ethanol
trong khi cho methanol thì sợi nấm có màu xám trong suốt q trình lên men.
Các nghiên cứu này đã cho thấy tầm quan trọng của việc tối ưu hóa q trình
lên men, trong đó, kết hợp với các chất gây cảm ứng đem lại hiệu quả sản
xuất hợp chất Hup A từ nấm nội sinh.
n
vă
ạc
th
sỹ
nh
Si
c
họ
Theo Zhu và cộng sự (2010), chủng nấm Shiraia sp. Slf14 sau khi lên
men 14 ngày 2 oC cho lượng Hup A đạt 27, mcg L dịch lên men [26].
Nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp Hup A của chủng Shiraia sp. Slf14, Yan
và cộng sự (2014) đã bổ sung vào môi trường lên men một số chất cảm ứng
HSE (H. serrata extracts - tách chiết từ cây, lá thạch tùng răng cưa), L-Lysine
và acid acetic với các nồng độ khác nhau, lên men
2 oC trong 14 ngày
[28]. Việc bổ sung L-Lysine và HSE đã kích thích khả năng sinh Hup A và hệ
17
sợi nấm, với acid acetic thì ngược lại. Bổ sung 1 lượng rất nhỏ HSE đã làm
tăng khả năng sinh Hup A, đạt 40 mcg g sinh khối khô. Đặc biệt, chủng
Shiraia sp. Slf14 bổ sung 0,2 g L-1 l-lysine trong môi trường nuôi cấy năng
suất Hup A tăng đến 296,7 mg L-1, cao hơn so với đối chứng không bổ sung
L-Lysine khoảng 40%.
Theo Zhou và cộng sự (2009), để tăng sản lượng huperzin A của nấm
nội sinh Penicillium chrysogenum SHB từ cây họ Thạch sam (Lycopodium
serratum), các điều kiện lên men lỏng đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy
điều kiện lên men lỏng thích hợp nhất của SHB để sản xuất huperzin A là
ận
Lu
28℃, pH ban đầu 6,4, tỉ lệ giống 12% , tuổi giống 4 giờ, khuấy 160
vòng phút và lên men trong ngày. Dưới những điều kiện này năng suất
huperzin A có thể đạt 7,21 mcg /ml [28].
vă
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước
n
Ở nước ta, Thạch tùng răng cưa mới được phát hiện tại Sa Pa, Lâm Đồng
độ cao 1.000 m. Đây là loài cây dược liệu quý hiếm, thuộc danh sách "đỏ"
trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm về
cây thuốc, nhưng chưa được quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng
trong điều trị bệnh tại Việt Nam.
ạc
th
sỹ
Si
nh
Ở Việt Nam trước đây đã có nhiều đề tài nghiên cứu về vi nấm nội sinh;
tuy nhiên, các nghiên cứu về nấm nội sinh cây Thạch tùng răng cưa Việt
Nam đến nay là chưa có cơng bố. Gần đây, tại Viện Công nghệ sinh học các
nhà khoa học đã phân lập được một số chủng vi nấm nội sinh từ cây Thạch
tùng răng cưa phân bố tại Sa Pa và Đà Lạt. Bằng phương pháp sắc ký màng
mỏng (TLC) và sắc ký hiệu năng cao (HPLC), nhóm đề tài đã xác định được
một số chủng có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất HupA thuộc các chi
Penicillium, Fusarium, Xylaria, Fungal Endophyte...; trong đó có chủng
Penicillium sp. LĐL4.4 được phân lập từ lá cây Thạch tùng răng cưa phân bố
tại Đà Lạt. Các kết quả này là tiền đề và cơ s khoa học để các nhà khoa học
thực hiện các nghiên cứu tiếp theo về tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên
cứu sản xuất HupA nhằm phục vụ h trợ điều trị bệnh suy giảm trí nhớ, đặc
biệt là bệnh Alzheimer Việt Nam.
c
họ
18
