Báo cáo tn vsv 1 sggbehtttttttttttttttt
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (917.38 KB, 27 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC
BÁO CÁO
THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT
Giảng viên hướng dẫn: Nguyễn Minh Thiện
Lớp: L02
Sinh viên thực hiện
HỌ VÀ TÊN
MSSV
Nguyễn Hiếu Vinh
2115298
Hồ Thái Anh Thi
2114854
Bùi Bảo Trung
2115105
Mai Nguyễn Lập Thành
2114779
Nguyễn Thị Quỳnh Giang
2113257
TP. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2023
MỤC LỤC
BÀI 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY .......................................................................................... 3
1.
ĐẠI CƯƠNG: ...................................................................................................................... 3
2.
THỰC HÀNH: ..................................................................................................................... 4
3.
KẾT QUẢ ............................................................................................................................ 6
BÀI 2. CẤY .................................................................................................................................. 7
1.
ĐẠI CƯƠNG: ...................................................................................................................... 7
2.
THỰC HÀNH: ..................................................................................................................... 9
3.
KẾT QUẢ: ......................................................................................................................... 11
BÀi 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH
VẬT ............................................................................................................................................ 12
1.
ĐẠI CƯƠNG ..................................................................................................................... 12
2.
THỰC HÀNH .................................................................................................................... 13
3.
KẾT QUẢ: ......................................................................................................................... 17
BÀI 4. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TRỰC TIẾP ............................................................. 19
1.
ĐẠI CƯƠNG ..................................................................................................................... 19
2.
THỰC HÀNH ................................................................................................................... 20
3.
KẾT QUẢ .......................................................................................................................... 21
BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP ........................................................................................ 24
1.
ĐẠI CƯƠNG ..................................................................................................................... 24
2.
THỰC HÀNH: ................................................................................................................... 24
3.
KẾT QUẢ: ......................................................................................................................... 26
BÀI 1: MƠI TRƯỜNG NI CẤY
1.
ĐẠI CƯƠNG:
1.1. Khái niệm
Mơi trường nuôi cấy là nguyên liệu chứa chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn
phát triển trong phịng thí nghiệm.
1.2. Phân loại
−
Phân loại theo trạng thái lý hóa:
+
Mơi trường lỏng: thường dùng để nhân giống, nghiên cứu một số đặc tính,
tổng hợp vi sinh vật; môi trường này không chứa agar hay gelatin…
+
Môi trường rắn (môi trường đặc): cho một lượng agar (1.5 – 2%) hay gelatin
(10 – 20%) vào môi trường lỏng để làm đặc môi trường, thường dùng để phân lập, nghiên
cứu đặc điểm hình thái, sinh lý của vi sinh vật…
+
Môi trường bán rắn: hàm lượng chất tạo độ đặc ít hơn mơi trường rắn (0.3 –
0.7% agar), thường dùng cho việc xác định khả năng chuyển động của vi sinh vật…
−
Phân loại theo thành phần:
+
Môi trường xác định: chứa các chất hóa học mà thành phần được xác định và
định lượng một cách cụ thể và chính xác.
+
Môi trường bán tổng hợp: chứa chiết xuất nấm men, thịt hay thực vật,
peptone, vitamin và các yếu tố sinh trưởng…
+
Mơi trường có sẵn: mơi trường được pha sẵn dưới dạng bột, chỉ cần hòa tan
với một hàm lượng nước nhất định là có thể sử dụng được.
−
Phân loại theo mục đích:
+
Mơi trường chọn lọc: hạn chế sự phát triển của vi khuẩn không mong muốn
và làm tăng sự phát triển của vi khuẩn mong muốn.
+
Môi trường chuyên biệt: giúp phân biệt khuẩn lạc của vi khuẩn mong muốn.
+
Môi trường tăng sinh: tăng nồng độ vi khuẩn mong muốn.
1.3. Nguyên tắc tạo môi trường dinh dưỡng
−
Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các
chất dinh dưỡng của từng loại vi sinh vật.
−
Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh
vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường.
−
Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của
vi sinh vật.
1.4. Các chỉ tiêu của một môi trường nuôi cấy
−
Đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho lồi vi khuẩn cần ni.
−
Đủ độ ẩm cần thiết.
−
Khoảng pH thích hợp.
−
Mức độ oxy cần thiết.
−
Tiệt trùng.
−
Ủ ở nhiệt độ thích hợp mà thành phần dinh dưỡng khơng bị ảnh hưởng.
2.
THỰC HÀNH:
2.1. Chuẩn bị dụng cụ
−
Ống nghiệm
−
Đĩa petri
−
Đèn cồn
−
Ống đong
−
Chai đựng hóa chất
2.2. Chuẩn bị hóa chất
−
Mơi trường ni cấy NB (Nutrient Broth)
−
Bột thạch Agar
2.3. Tiến hành thí nghiệm
Bước 1: Cân, đong các thành phần của môi trường
+
Đối với môi trường lỏng: H2O và 8 g/l NB.
+
Đối với môi trường rắn: H2O, 8 g/l NB và 1.5% agar.
Bước 2: Hịa tan từng thành phần của mơi trường trong một lượng nước nhỏ, sau
đó trộn lẫn tất cả các thành phần dinh dưỡng với nhau và thêm nước cho đủ thể tích. Khi
pha mơi trường cần phải khuấy đều cho agar tan hồn tồn để tránh việc mơi trường khơng
đơng đặc lại.
Bước 3: Cho mơi trường đã hịa tan vào chai đựng hóa chất để tiến hành hấp tiệt
trùng.
Bước 4: Hấp tiệt trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút.
Bước 5: Để nguội. Sau đó dùng ống nghiệm để chuẩn bị môi trường thạch đứng,
thạch nghiêng và đĩa petri để chuẩn bị môi trường thạch đĩa.
+
Đối với môi trường thạch đứng: cho khoảng 1/2 ống nghiệm và để thẳng
đứng trong giá đựng ống nghiệm. Sau đó dùng nút bơng bịt chặt vừa phải và dùng giấy
bọc phần miệng ống với nút bông lại.
+
Đối với môi trường thạch nghiêng: để ống nghiệm nằm nghiêng <2o, phần
thạch nghiêng khoảng từ 1/2 đến 1/3 ống nghiệm. Chú ý phần thạch cách miệng ống
khoảng 2 cm. Sau đó dùng nút bông bịt chặt vừa phải và dùng giấy bọc phần miệng ống
với nút bông lại.
+
Đối với môi trường thạch đĩa: Khi đổ môi trường thạch đĩa, tất cả các thao
tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Trước khi đổ phải hơ đĩa petri và chai đựng hóa
chất qua ngọn lửa đèn cồn. Lưu ý mặt thạch phải nhẵn, phẳng, có độ dầy khoảng 1/3 đĩa.
Sau khi đổ môi trường vào đĩa petri, sau 1-2 ngày tiến hành kiểm tra xem mơi trường có
bị nhiễm khuẩn khơng rồi mới đưa vào sử dụng.
3.
KẾT QUẢ
Môi trường thạch nghiêng
Môi trường thạch đĩa
BÀI 2. CẤY
1.
ĐẠI CƯƠNG:
1.1. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn:
-
Phân lập là khâu quan trọng trong quá trình nghiên cứu ni cấy vi khuẩn.
-
Mục đích của phương pháp phân lập là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể
ban đầu tạo thành các clon thuần khiết để khảo sát và định loại. Khi vi khuẩn tăng trưởng
và phát triển trên bề mặt môi trường rắn đã tạo ra những khuẩn lạc, hình thái của các
khuẩn lạc sẽ mang tính đặc trưng của từng loại vi khuẩn. Việc mô tả chính xác các khuẩn
lạc đã tách rời có thể góp phần rất quan trọng trong việc chẩn đoán vi khuẩn học. Các nhà
nghiên cứu vi khuẩn học đã tiêu chuẩn hố có ý nghĩa khi miêu tả hình dáng, độ cao và
bờ, rìa của khuẩn lạc.
-
Điều quan trọng cách ni vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại
nhiễm vào mơi trường ni cấy. Do vậy, ngồi các thao tác luôn phải được tiến hành trong
điều kiện vô trùng tuyệt đối, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy
đến các vật dụng cần thiết đều phải được khử trùng trước khi sử dụng.
1.2. Dạng mẫu nuôi cấy:
-
Dạng dịch mẫu chỉ định nuôi cấy vi khuẩn đã được đồng nhất, dịch nuôi cấy
hoặc môi trường lỏng chứa chủng vi sinh vật cần phân tích.
-
Dạng trên bề mặt của môi trường rắn chứa thạch (từ 1,5-2%) trong ống thạch
nghiêng hay trong đĩa petri.
1.3. Dụng cụ cấy:
-
Que cấy thẳng: Que cấy kim loại có đầu nhọn, dùng để cấy vi khuẩn có tạo
khuẩn ty.
-
Que cấy vịng: Là que cấy kim loại đầu có vịng trịn, dùng cấy chủng từ môi
trường rắn hoặc lỏng lên môi trường rắn, lỏng.
-
Que cấy trang: Là que bằng kim loại hay thủy tinh, đầu hình tam giác, dùng
để dàn trải vi khuẩn trên bề mặt thạch rắn.
1.4. Các phương pháp phân lập và nuôi cấy:
1.4.1. Kỹ thuật cấy ria:
-
Dùng que cấy vòng thao tác vơ trùng nhúng vào dịch mẫu để có các vi khuẩn
muốn phân lập.
-
Ria các đường trên đĩa petri có chứa mơi trường thạch thích hợp. Sau mỗi
đường ria liên tục, hãy đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện thao tác
tiếp theo.
-
Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ấm.
1.4.2. Kỹ thuật cấy trang:
-
Dùng pipet chuyển 0,1ml dịch canh khuẩn lên trên bề mặt môi trường thạch
trong đĩa petri.
-
Nhúng đầu thanh gạt vào cồn và hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Sau đó, để
đầu thanh gạt nguội trong khơng gian vô trùng của ngọn lửa.
-
Mở đĩa petri, nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu
thanh gạt trải đều dịch vi khuẩn lên trên bề mặt thạch. Quá trình thực hiện hãy xoay đĩa
một vài lần, mỗi lần khoảng nửa chu vi đĩa để tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch vi
khuẩn đều khắp bề mặt môi trường.
-
Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ổn nhiệt.
1.4.3. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng:
-
Đốt nóng đỏ đầu que cấy trong ngọn lửa rồi hơ nhẹ phần cán, rồi cầm thẳng
đứng que cấy cho que cấy nóng đều.
-
Tay trái cầm ống nghiệm xoay nhẹ, tay phải cầm que cấy. Dùng ngón út của
tay phải để mở nút bông. Sau khi mở nút bông, xoay miệng ống nghiệm qua ngọn lửa.
-
Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm và làm nguội que cấy
(áp đầu que cấy vào thành ống cho nguội). Nhúng que cấy vào môi trường lỏng, rút thẳng
que cấy ra khơng để dính vào thành và miệng ống để thu sinh khối. Hơ nóng miệng ống
nghiệm và đậy nút bông rồi đặt ống nghiệm vào giá đỡ.
-
Đầu que nuôi cấy vi khuẩn được giữ ở vùng khơng khí vơ trùng gần ngọn
đèn. Dùng tay trái lấy ống nghiệm chứa môi trường mới rồi mở nút bơng và khử trùng
miệng ống nghiệm. Tiếp đó, đưa đầu que cấy vào bên trong môi trường.
-
Nhúng và khuấy nhẹ nhàng que cấy trong dịch môi trường để tách sinh khối
ra khỏi đầu que cấy.
-
Rút thẳng đầu que cấy ra. Khử trùng miệng ống nghiệm và đậy nút bông.
-
Khử trùng que cấy ngay sau khi cấy xong.
1.4.4. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống thạch nghiêng:
-
Phương pháp này tiến hành tương tự như trên, nhưng có một số khác biệt sau:
-
Cấy giống lên trên bề mặt thạch nghiêng bằng cách đặt nhẹ đầu que cấy lên
bề mặt môi trường ở đáy ống.
-
Sau đó, cấy theo hình chữ chi từ đáy ống nghiệm lên đến đầu trên mặt thạch
nghiêng.
2.
THỰC HÀNH:
2.1. Hóa chất:
-
Dịch lỏng chứa vi khuẩn cần phân lập.
-
Mơi trường cấy: Thạch đĩa petri, thạch nghiêng, ống nghiệm chứa môi trường
-
Cồn.
lỏng.
2.2. Dụng cụ:
-
Que cấy vòng.
-
Que cấy trang.
-
Pipet đầu rời (micropipette).
-
Đèn cồn.
2.3. Thực hành:
-
Thực hiện các kỹ thuật trong tủ cấy vô trùng.
2.3.1. Cấy ria trên môi trường thạch đĩa:
-
Rửa sạch tay trước khi cấy để tránh nhiễm khuẩn.
-
Dùng bút lông đánh dấu trên đĩa:
-
Dùng que cấy vịng nhúng vào cồn để vơ trùng, hơ trên ngọn lửa đèn cồn và
để nguội.
-
Hơ nắp đĩa trên lửa để khử khuẩn, khi mở nắp tránh có vi sinh vật lạ rơi vào
-
Thao tác như kỹ thuật cấy ria ở trên theo các đường đã đánh dấu.
đĩa.
2.3.2. Cấy trang trên môi trường thạch đĩa:
-
Rửa sạch tay trước khi cấy để tránh nhiễm khuẩn.
-
Hơ nắp đĩa trên lửa để khử khuẩn, khi mở nắp tránh có vi sinh vật lạ rơi vào
-
Thao tác như kỹ thuật cấy trang ở trên.
đĩa.
2.3.3. Cấy trên môi trường thạch nghiêng:
-
Rửa sạch tay trước khi cấy để tránh nhiễm khuẩn.
-
Thao tác như kỹ thuật cấy giống từ môi trường lỏng sang ống thạch nghiêng.
2.3.4. Cấy trong môi trường lỏng:
-
Rửa sạch tay trước khi cấy để tránh nhiễm khuẩn.
-
Thao tác như kỹ thuật cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa
môi trường lỏng.
3.
KẾT QUẢ:
Cấy trang trên môi trường thạch đĩa
Cấy ria trên môi trường thạch đĩa
Cấy trong môi trường thạch nghiêng
Cấy trong môi trường lỏng
BÀi 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI
VI SINH VẬT
1.
ĐẠI CƯƠNG
1.1. Mục đích
Nhuộm màu vi sinh vật giúp nhận định sơ bộ hình thể, kích thước, tính chất bắt
màu, cách sắp xếp của vi sinh vật và các cấu trúc đặc biệt của tế bào khi soi dưới kính
hiển vi quang học
Phân biệt các chủng vi sinh vật khác nhau -> phân loại và định danh vi sinh vật.
1.2. Tiêu bản nhuộm vi sinh vật không cố định
1.2.1. Nguyên tắc
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm khơng hoặc ít độc đối với vsv và được pha
lỗng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vsv vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm
Các loại thuốc nhuộm thường sử dụng
•
dung dịch xanh methylen hay fuchsin(1:1 000)
•
dung dịch đỏ Congo bão hịa 5%
•
dung dịch đỏ trung tính (0,001 - 0,00001%)
1.2.2. Cách nhuộm
•
cho một giọt thuốc nhuộm lên phiến kính ( xanh methylen 0,001%)
•
dùng que cấy đưa vào đó một ít vi sinh vật lấy từ khuẩn lạc hay một giọt
dung dịch ni cấy
•
đậy lamelle lên giọt kính
•
quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X
1.3. Tiêu bản nhuộm vi sinh vật cố định
1.3.1. Các bước tiến hành làm tiêu bản cố định
a.
Tạo vết bơi
Đặt một giọt nước sạch vào giữa phiến kính, sau đó dùng que cấy đã khử trùng lấy
một vịng que cấy vi sinh vật cho vào giọt nước và dàn đều ra. Trường hợp ni cấy trên
mơi trường lỏng thì dùng pipet để lấy dung dịch nghiên cứu. Hơ khô phiến kính đã có vi
sinh vật trên ngọn lửa đền cồn hoặc để khô tự nhiên ta được một vết mờ trên phiến kính
gọi là vết bơi.
Chú ý:
•
Lượng vi sinh vật lấy vừa phải.
•
Vết bơi trịn, gọn, thật mỏng.
•
Các tế bào vi sinh vật được dàn đều, dễ quan sát.
b.
Cố định vết bơi
•
Việc cố định vết bơi nhằm các mục đích sau:
•
Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu và an toàn khi tiếp xúc (nếu là vi
sinh vật gây bệnh).
•
Gắn chặt vi sinh vào phiến kính để lúc nhuộm khơng bị rửa trơi.
•
Các cách cố định:
•
Cố định bằng nhiệt: dùng kẹp gỗ để kẹp phiến kính, hơ mặt dưới của phiến
kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần (chừng vài ba giây), tránh không để tiêu bản
quá nóng.
•
Cố định bằng hố chất:
* Nhúng vết bơi vào cồn 95 độ khoảng 10 – 15 phút rồi sấy khô.
* Ngâm vết bôi vào trong dung dịch axeton 5 phút
* Sấy bằng hơi formol 10 – 15 giây.
1.3.2. Nhuộm màu tiêu bản cố định
a.
Ngun tắc
•
sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với
thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững
•
tùy theo mục đích nghiên cứu và khả năng bắt màu khác nhau của các tế bào
mà chọn loại thuốc nhuộm và cách nhuộm phù hợp
•
có 2 cách nhuộm chính:
•
nhuộm đơn: chỉ dùng 1 loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản
•
2.
nhuộm kép: dùng đồng thời 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản
THỰC HÀNH
2.1.
a)
Nhuộm đơn
Nguyên tắc
Nhuộm đơn là phương pháp nhuộm chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm màu. Vi
sinh vật sau khi nhuộm đơn sẽ trông thấy rõ hơn khi để tươi.
Các loại thuốc nhuộm thường dùng để nhuộm đơn là:
- Fuchsin kiềm.
- Xanh metylen.
- Tím gentian.
- Đỏ trung tính.
b)
Dụng cụ và hóa chất
-
Dụng cụ
•
Lame
•
Đèn cồn
•
Que cấy
•
Kính hiển vi
-
Hóa chất
•
Mẫu vi sinh vật
•
Xanh methylen
•
Nước cất
c)
Tiến hành :
Bước 1 : Làm khơ mẫu
•
Đặt mẫu trên lam kính để chuẩn bị nhuộm. Hơ nóng lam kính chứa mẫu hai
hoặc ba lần trên đèn cồn để mẫu bám chặt vào lam.
Bước 2 : Bắt đầu nhuộm
•
Nhỏ 1 giọt xanh methylen vào mẫu và để một phút. Rửa lam với một dòng
nước nhẹ đến khi nước rửa khơng cịn màu
•
Sấy khơ lam
•
Thêm dầu soi và soi dưới kính hiển vi 100x
2.2.
Nhuộm kép - nhuộm gram
a)
Nguyên tắc
Vi khuẩn Gram dương và Gram âm có cấu tạo vách tế bào khác nhau, do đó khi
thực hiện nhuộm thì chúng sẽ bắt màu các thuốc nhuộm khác nhau. Lớp vách tế bào mang
tính quyết định đến tính chất bắt màu trong quá trình nhuộm. Màu sắc của hai loại vi
khuẩn này như sau:
+ Vi khuẩn Gram (+): có màu tím.
+ Vi khuẩn Gram (-): có màu hồng.
- Với vi khuẩn Gram dương: chúng có lớp vách tế bào peptidoglycan dày, dạng
lưới có khả năng bắt màu tím của thuốc nhuộm tím gentian tinh thể. Cũng vì lớp vách dày
nên việc tẩy cồn sẽ khó khăn hơn do đó vi khuẩn giữ được màu tím của thuốc nhuộm tím
Gentian.
- Với vi khuẩn Gram âm: lớp vách peptidoglycan mỏng hơn và nó có thêm lớp
màng lipopolysaccharide phía ngồi, khi tẩy cồn cồn hòa tan lớp màng và do lớp vách
mỏng bị cồn tẩy dễ dàng nên nó khơng giữ được màu tím của thuốc nhuộm mà sẽ bắt màu
thuốc nhuộm sau là dung dịch Fushin kiềm.
b)
Dụng cụ và hóa chất :
Dụng cụ :
•
Đèn cồn
•
Kính hiển vi
•
Que cấy
Hố chất :
•
Mẫu vi sinh vật
•
Tím kết tinh
•
Dung dịch Iot / Lugol (chất bắt thuốc nhuộm mà cố định tím kết tinh trong
thành tế bào)
•
Chất khử màu (Cồn-ethanol)
•
Safranin (thuốc nhuộm thứ hai)
•
Nước cất
c)
Tiến hành :
Bước 1 : Làm khơ mẫu
•
Đặt mẫu trên lam kính để chuẩn bị nhuộm. Hơ nóng lam kính chứa mẫu hai
hoặc ba lần trên đèn cồn để mẫu bám chặt vào lam.
Bước 2 : Bắt đầu nhuộm
•
Nhỏ 1 giọt thuốc tím kết tinh vào lam và để một phút. Rửa lam với một dịng
nước nhẹ đến khi nước rửa khơng cịn màu.
Mục đích: để vi khuẩn thấm đều màu thuốc nhuộm.
•
Nhuộm với dung dịch Lugol trong 1 phút. rửa sạch dung dịch Lugol
Mục đích: giúp vi khuẩn giữ màu thuốc nhuộm tím Gentian tốt hơn.
•
Tẩy màu bằng cồn 96 độ bằng cách nhúng lam vào ly chứa cồn 3 lần. rửa
sạch cồn bằng nước cất
Mục đích: đây là bước tẩy màu, nếu trường hợp là vi khuẩn gram âm nó sẽ hịa tan
lớp màng lipid bên ngoài. Cần tẩy màu kỹ để vi khuẩn bắt đúng màu thuốc nhuộm tránh
nhận định kết quả sai.
•
Nhuộm với dung dịch Safranin trong 1 phút. rửa sạch lam bằng nước cất
Mục đích: giúp các vi khuẩn khơng bắt màu tím sẽ bám màu hồng của thuốc thử
này.
•
Sấy khơ lam
•
Thêm dầu soi và soi dưới kính hiển vi 100x
3.
KẾT QUẢ:
3.1. Nhuộm đơn
a.
Đĩa cấy chứa vi sinh vật
b.
Dung dịch lỏng chứa vi sinh vật
3.2. Nhuộm gram
a.
Đĩa cấy chứa vi sinh vật
b.
Dung dịch lỏng chứa vi sinh vật
BÀI 4. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TRỰC TIẾP
1.
ĐẠI CƯƠNG
1.1 Cơ sở lý thuyết
Để xác định số lượng vi sinh vật theo phương pháp trực tiếp, một dụng cụ được
dùng phổ biến là buồng đếm hồng cầu Goriaep (Hemocytometer).
Phương pháp đếm trực tiếp cho phép ta đếm được số lượng vi sinh vật có kích
thước lớn như nấm men, tảo,… dưới kính hiển vi.
Buồng đếm hồng cầu
1.2. Cấu tạo buồng đếm
Buồng đếm là một phiến kính dày hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng, khoảng giữa
chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng này có kẻ một lưới đếm, gồm 25 ô vuông lớn.
Mỗi ô vuông lớn lại được chia ra thành 16 ơ vng nhỏ, mỗi ơ nhỏ có diện tích 1/400
mm2, và chiều dày là 1/10 mm, như vậy thể tích một ơ vng nhỏ là 1/4000 mm3 hay
1/4.000.000 ml, cịn thể tích của cả một buồng đếm là 1x10-4 ml.
Buồng đếm có 1 lá kính dày để đậy lên các ơ và để quan sát dưới kính hiển vi.
2.
THỰC HÀNH
2.1. Vật liệu
Mẫu nấm men
Buồng đếm hồng cầu
Nước cất
2.2. Tiến hành
Bơm mẫu vào ống nghiệm bằng micropipette.
Pha loãng mẫu bằng nước cất thành các nồng độ lần lượt là loãng 5, 10, 20, 40 và
80 lần so với mẫu ban đầu.
Đo mật độ quang OD của từng nồng độ. Ghi nhận lại số liệu.
Nhỏ mẫu đã pha loãng vào buồng đếm hồng cầu sao cho số vi sinh vật nằm trên
mỗi ô lớn nằm trong khoảng 10-50, nếu nằm ngồi khoảng này cần pha lỗng lại cho phù
hợp.
Đếm số lượng vi sinh vật trong buồng đếm dưới kính hiển vi. Chọn đếm các ô lớn
là các ô ở mỗi 4 góc và 1 ơ chính giữa. Ghi nhận lại số liệu.
