báo cáo khoa học phân lập các chủng BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI ở việt nam

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG BACILLUS
THURINGIENSIS KURSTAKI Ở VIỆT NAM

Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn,
Nguyễn Thuỳ Châu
Bộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu hoạch
Đinh Duy Kháng
Phòng Vi Sinh Phân tử, Viện Công Nghệ Sinh học

Ngày nay các chế phẩm sinh học an toàn cho phòng trừ sâu
hại cây trồng và nông sản bảo quản đã được khuyến khích,
ứng dụng để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá học, trong
đó thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis (gọi tắt là
Bt) được dùng rộng rãi nhất. Trong những năm gần đây các
nhà khoa học đã có rất nhiều cố gắng để phân lập vi khuẩn
này từ môi trường của nhiều nước trên thế giới với hy vọng
tìm ra những chủng B. thuringiensis có phổ gây bệnh mới
và khoảng vật chủ rộng hoặc nâng cao hoạt tính các chủng
B.thuringiensis đối với các nhóm côn trùng mới, hay tìm
kiếm nguồn gen từ những chủng phân lập cho các kỹ thuật

di truyền tiếp theo. Với sự phát triển mạnh mẽ của công
nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là công nghệ gen đã mở ra
những tiềm năng hết sức to lớn cho việc phát triển thuốc trừ
sâu sinh học B. thuringiensis. Việc làm giàu thêm bộ sưu
tập các chủng B. thuringiensis phân lập ở Việt Nam và
nguồn gen quý từ những chủng này nhằm tạo ra các chủng
tái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng hơn đối với một số loài
côn trùng quan trọng là rất cần thiết. Chúng tôi đã tiến hành
phân lập, phân loại các chủng B. thuringiensis có hoạt tính
diệt sâu từ nguồn tự nhiên của Việt Nam, sử dụng một số
kỹ thuật sinh hoá và sinh học phân tử để xác định tính chất
của các chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập được.

I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

I.1. Thu thập mẫu để phân lập các chủng B. thuringiensis

Tiến hành thu thập 137 mẫu gồm có 55 mẫu đất nông
nghiệp, 56 mẫu lá, 26 mẫu mùn thóc từ các nguồn khác
nhau của một số tỉnh có sinh thái khác nhau ở miền Bắc
Việt nam.







I.2. Phân lập các chủng B. thuringiensis:

Cắt một phần của lá (2-3 cm
2
) nghiền với 0,5 ml dịch nước
muối. Đối với các mẫu đất và mùn thóc cân 0,5 gam trộn
với 5 ml môi trường T
3
lỏng chứa 0,25 M đệm natri acetate
(pH = 6,8) và lắc trong 4 giờ ở 150 vòng/phút, nhiệt độ 30
0
C. Mẫu được xử lý nhiệt ở 80
0
C trong 3 phút. Lấy 0,2 ml
dịch nổi trải trên đĩa petri có môi trường T3 nuôi ở 30
0
C
trong 3 ngày. Quan sát hình dạng tinh thể của các chủng B.
thuringiensis phân lập bằng kính hiển vi đối pha Olympus.

I.3. Thử sinh học hoạt tính diệt sâu:

Tiến hành theo phương pháp của S.H.Park [10]: Đối tượng
sâu được thử là sâu tơ (Plutella xylostella), sâu keo
(Spodoptera exiqua) và sâu khoang (Spodoptera litura): lá
bắp cải tươi được cắt thành các khoanh tròn có đường kính
3cm vào hỗn dịch bào tử tinh thể B. thuringiensis có nồng
độ 5x107 bào tử/ml, sau đó đặt vào đĩa petri và cho vào
mỗi đĩa 10 con sâu; mỗi mẫu thử với 30 con sâu. Đối với

sâu bông (Helicoverpa armigera) cũng được tiến hành
tương tự trên lá bông. Hoạt tính diệt sâu ngài gạo (Corrcyra
cephalonia) được đánh giá như sau: bỏ 30 con sâu ngài gạo
vào bình thuỷ tinh 400g gạo đã được nhiễm bào tử và tinh
thể của B. thuringiensis với liều 5x10
7
bào tử/gam gạo, nuôi
ở 30
0
C với độ ẩm 70-80%.

I.4. Xác định tính chất 10 chủng B. thuringiensis kurstaki
phân lập.

Điện di protein (SDS-PAGE) bào tử và tinh thể của các
chủng B. thuringiensis.
Chủng B. thuringiensis phát triển trên môi trường thạch T
3

đã được tạo hỗn dịch trong 5 ml dịch 0,02% Triton X-100.
Ly tâm trong 1 phút. Cặn được hoà tan với 30 l đệm SDS
(1x SDS gel- loading buffer). Các mẫu được đun sôi trong
5 phút, ly tâm ở 8000vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổi
và chạy điện di trên gel polyacryamide 10% ở 30 mA theo
phương pháp của Sambrook và Maniatis.

I.5. Phát hiện gen cry1Ab, cry1C bằng kỹ thuật PCR.







Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựng
trong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khử
ion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l, primer 2l, enzim
Tag-polymeraza 0,4l, MgCl
2
: 2l, ADN 2l ( nồng độ
50ng/l).

Sử dụng cặp mồi TY6(5’-
GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) và
TY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’); TYIC
(5’-CAAC CT CTAT TT G GTGCAGGTTC-3’) và
TYIUNI (5’-
ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTT CTC-3’)
theo thứ tự, để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gen
cry1Ab và cry1C. Các sản phẩm PCR được phân tích bằng
điện di trên gel agaroza 1%.

II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN:

II.1. Phân lập các chủng B. thuringiensis

PAGE of parasporal inclusions of the ten kurstaki isolates
showed two core fragments, 130 kDa and 70 kDa, and
several other minor proteins. Ten B. thuringiensis kurstaki
isolates were screened for cry1Ab and cry1C genes by PCR
method. Total DNA of these B. thuringiensis strains were
isolated then analyzed by electrophoresis on 1% agaroza
gel. The result showed that total DNA isolated was not
broken, it could be used as DNA template for the PCR.
Oligonucleotit primer pairs of TY6 and TY14, TYIC and
TYIUNI respectively were used to amplified the specific
DNA fragments of cry1Ab gene as well as of cry1C gene
by PCR. The PCR conditions were: denaturation at 94
0
C
for 3 min, followed by 30 amplification cycles (94
0
C, 50
sec; 60
0
C, 50 sec; 72
0
C, 1min and 20sec) and extension at
72
0
C for 8 min The content of 5l of PCR products were

analyzed by electrophoresis on 1% agaroza gel. The result
showed that all ten isolated B. thuringiensis var. kurstaki
strains produced only one PCR product of about 236 bp.
This result indicated that all of them harboured cry1Ab
gene, but no cry1C gene. Interestingly, B. thuringiensis var.
kurstaki 28S strain inspire of habouring cry1Ab gene but it






has no insecticidal activities to Plutella xylostella and
Spodoptera exiqua. We supposed that this strain contain
“silent” cry1C crystal toxin gene which is carried on the
genome and it was not expressed. Because of this, we are
interested in screening B. thuringiensis strains at the
molecular level for their gene content.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Lê Quang Huấn.