Đề cương Nghiên cứu phát triển thuốc mới từ dược liệu

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN THUỐC MỚI TỪ DƯỢC LIỆU
Câu 1: Nguồn gốc, phân loại và ý nghĩa của các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên.
NǴN GỚC:
Nguồn gốc
"Các sản phẩm tự nhiên" là để chỉ các hợp chất có nguồn gốc sinh học lấy từ tự nhiên. Chúng có
nguồn gốc từ:
(1) các sản phẩm được chiết xuất từ thực vật, động vật hoặc vi sinh vật, khoáng vật
(2) được lấy từ một phần hoặc toàn bộ cơ thể sinh vật, ví dụ như lá hoặc hoa của thực vật, các tổ
chức cơ thể động vật…
(3) đó có thể là dịch chiết toàn phần, dịch chiết phân đoạn hoặc là chất tinh khiết.
Sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên còn gọi là Hợp chất thứ cấp
– khối lượng phân tử nhỏ hơn (thường < 2000 Da)
– sự có mặt là khơng hiển nhiên, khơng bắt buộc trong cơ thể thực vật và được phân bố
giới hạn theo nguồn gốc
– thường có một vài lớp chất thứ cấp trong các sinh vật cụ thể như alcaloid, flavonoid,
terpenoid, tinh dầu...
– được tạo ra trong q trình chuyển hóa ví dụ như sự thiếu hụt về dinh dưỡng, cơ chế tự
bảo vệ của cơ thể, đến nay chưa biết rõ vai trò của chúng trong cơ thể sinh vật
Phân biệt vs Hợp chất sơ cấp:
– là các chất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và tồn tại của sinh vật ví dụ:
polysaccharid, protein, acid nucleic, lipid
– thuộc vào lớp chất “sống còn” của cơ thể sinh vật và thường có khối lượng phân tử lớn
Phân loại
• Sản phẩm tự nhiên có thể được chiết xuất từ nhiều nguồn khác nhau
– thực vật
– động vật
– vi sinh vật
– sinh vật biển
– cơn trùng và các lồi lưỡng thể
– có thể hình thành ở trên cạn hoặc dưới nước
• Bản chất hóa học

Ý nghĩa
- Tự nhiên là một nhà thiết kế kỳ diệu, chúng cung cấp các cấu trúc hóa học độc đáo mà
đơi khi những nhà hóa học vĩ đại nhất cũng khơng thể nào hình dung ra được.
- Khối lượng phân tử của chúng thường nhỏ (<2000 Da) điều này phù hợp với ứng dụng
vào việc làm thuốc.
- Chúng đã tồn tại trong cơ thể sống do đó phù hợp với hấp thu, chuyển hóa hay thải trừ
của cơ thể.

1


Câu 2: Trình bày những thuận lợi trong việc phát triển các sản phẩm có nguồn gốc từ tự
nhiên ở Việt Nam.
- Đất nước ta có nguồn tài nguyên cây cối, hệ sinh thái phong phú
- Điều kiện tự nhiên thuận lợi, có vị trí tự nhiên hiếm có, một mặt gắn liền với lục địa, mặt khác
thông với đại dương và nằm trong vành đai nhiệt đới gió mùa, khí hậu nhiều nét độc đáo và đa
dạng.
- Việt Nam có nền y học dân tộc cổ truyền lâu đời với tri thức sử dụng các loại dược liệu, các loại
thuốc có giá trị dùng để chữa bệnh thơng thường và y nan.
- Dược liệu cây thuốc có giá trị kinh tế to lớn nên không chỉ Việt Nam mà trên thế giới đều có xu
hướng "trở về thiên nhiên", nhu cầu về dược liệu cũng như cây thuốc ngày càng tăng nên sẽ thuận
lợi cho nước ta có thể mở rộng tầm nhìn về dược liệu.
Câu 3: Xu hướng hiện nay trong việc phát triển các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên.
• Xu hướng cũ
– Tập trung chủ yếu vào hóa học các hợp chất được phân lập từ tự nhiên hơn là chú ý
đến hoạt tính sinh học.
– Phân lập và xác định các hợp chất từ tự nhiên theo các thử nghiệm hoạt tính sinh học
(chủ yếu là các thử nghiệm in vivo).
– Thực hiện các điều tra về hóa thực vật
– Lựa chọn đối tượng nghiên cứu dựa trên thông tin từ dược lý dân tộc học, kinh nghiệm

dân gian hay cách dùng truyền thống.
• Xu hướng mới
– Phân lập và xác định các thành phần có hoạt tính dựa trên hoạt tính sinh học dẫn đường
(chủ yếu là các thử nghiệm in vitro)
– Tạo ra thư viện các hợp chất từ tự nhiên (ví dụ DNP)
– Chiết xuất các hợp chất từ cơng nghệ nuôi cấy mô, công nghệ tế bào, di truyền, quá
trình lên men, sinh tổng hợp...
– Tập trung nhiều hơn vào hoạt tính sinh học.
– Sử dụng dấu vân tay hóa học và đi sâu vào phân tích cơ chế, chuyển hóa hóa học hoặc
chuyển hóa sinh học.
– Việc lựa chọn đối tượng nghiên có thể đi từ con đường lựa chọn ngẫu nhiên, sàng lọc
từ ngân hàng mẫu lựa chọn ngẫu nhiên.
Câu 4: Mô tả các bước cơ bản trong tiến trình nghiên cứu thuốc mới từ dược liệu. (Ver 1)
B1: Xác định đối tượng nghiên cứu
B2: Lựa chọn mục tiêu phân tử
B3: Lựa chọn phương pháp thử sinh học
B4: Nghiên cứu sản xuất ở quy mô pilot
B5: Nghiên cứu độ ổn định và tuổi thọ của thuốc
B6: Nghiên cứu chuyển hóa
B7: Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm
B8: Thử tiền lâm sàng
2


B9: Nghiên cứu tổng hợp quy mô công nghiệp
B10: Thử lâm sàng
B11: Đăng ký sản xuất và lưu hành
B12: Đăng ký bảo hộ bản quyền phát minh sáng chế
B13: Chuyển giao cơng nghệ, ứng dụng
 Phân tích các bước

1) xác định đối tượng nghiên cứu
- Đốitượng hướng đến làđộng vật, thực vật, khống vật
- Có 2 cách tiếp cận đối tượng
+ Lựa chọn bệnh: dược liệu sẽ được lựa chọn sàn lọc trên mục đích tác dụng đã được xác
định
+ Lựa chọn dược liệu tiềm năng: dựa trên dược lí dân tộc học, các thông tin trên sách báo
và tạp chí khoa học,tri thức bản địa,.. dựa vào các test sàng lọc để lựa chọn dược liệu
nghiên cứu.
2) Lựa chọn mục tiêu phân tử
- Địi hỏi phải có sự tham gia của nhiều nhà khoa học cùng với sự hỗ trợ của nhiều ky thuật
y sinh học hiện đại
- Khi xác định được mục tiêu phân tử là các receptor, enzym, nucleic, protein sẽ nâng cao
hiệu quả điều trị đặc hiệu của thuốc
3) Lựa chọn phép thử sinh học
- Việc lựa chọn các phép thử sinh học sẽ tương ứng với mục đích nghiên cứu của nhà sản
xuất. Vấn đè quan trọng là xác định ngưỡng tác dụng, nếu chỉ số này quá thấp thì mẫu
được lựa chọn quá nhiều, phải qua test sàng lọc lần 2 sẽ mất time, chi phí, nếu ngưỡng tác
dụng q cao thì số mẫu đại tiêu chuẩn q ít có thể bỏ qua các dược liệu tiềm năng.
- Có thể lựa chọn dịch chiết toàn phần, dịch chiết phân đoạn hoặc chất tinh khiết để thử tác
dụng, thường tiến hành thử sàng lọc in vitro trước
- Thử nghiệm trên các môi trường nuôi cấy: vi sinh vật ký sinh trùng,tế bào ưng thư, virus.
- Thử nghiệm trên các tác dụng đích: receptor, enzym, cảm ứng gen, AND
4, 5) Nghiên cứu sản xuất quy mô pilot của thuốc và độ ổn định
Sau khi đã lựa chọn đói tượng, dược liệu nghiên cứu, tiến hành xác định dạng bào chế và xây
dựng công thức bào chế của sản phẩm. Dạng bào chế có thể là: dung dịch thuốc, thuốc cốm viên
năng, cao thuốc, và tùy theo dạng bào chế để thiết kế xây dựng công thức cho phù hợp
6) Nghiên cứu chuyển hóa
- Thơng thường 1 chất sau khi đua vào cơ thể sẽ chịu tác động của enzym chuyển hóa. Qúa
trình chuyển hóa gồm 2 pha chính.
+ pha 1: Liên quan đến các phản ứng OXH, khử, thủy phân.

+ Pha 2: Gồm các phản ứng liên hợp để tạo các chất phân cực để thải trừ ra ngoài qua
thận.
- Trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới trước khi thử lâm sàng các chất ứng cử viên phải
được nghiên cứu chuyển hóa ở động vật và người để khẳng định khơng có chất chuyển
hóa độc sinh ra trong cơ thể
- Xác định số phận trong cơ thể: có chuyển hóa? Dạng chuyển hóa có hoạt tính và khơng có
hoạt tính.
7) Tiêu chuẩn hóa ngun liệu, bán thành phẩm và thành phẩm
3


Kết hợp các loại chỉ tiêu:
- Chỉ tiêu phản ánh về công dụng của thuốc (độ tinh khiết và hàm lượng)
- Chỉ tiêu về mức độ tin cậy và độ an tồn (độc tính, độ bền, hạn dùng)
- Tiêu chuẩn về sinh lý (dạng thuốc, đường dùng)
- Chỉ tiêu về thẫm mỹ (hình thức trình bày, đóng gói, bảo quản)
Dựa trên các nội dung chính của yêu cầu kỹ thuật, căn cứ vào thực tế, lựa chọn ra các chỉ tiêu
thích hợp, khơng q nhiều hoặc q ít nhưng đủ nói lên đặc trưng chất lượng thuốc, phù hợp với
nhiều điều kiện cụ thể.
Xây dựng được mức cho các chỉ tiêu trên.
8) Thử tiền lâm sàng
- Là bước thử cần thiết để đánh giá độc tính của thuốc, đảm bảo tính an tồn của thuốc trước
khi dùng cho người.
- Độc tính cấp: dùng 1 liều, với các mức liều khác nhau, xét khả năng gây chết động vật thí
nghiệm.
- Độc tính bán trường diễn: dùng một liều thơng thường hoặc gấp 3-10 lần liều sử dụng cho
người để đánh giá sự gây tổn thương trên các cơ quan, các chỉ số sinh hóa trên động vật,
thường thử trong 1 tháng.
- Độc tính trường diễn: thời gian thử ít nhất 6 tháng có gây ra độc tính gì hay khơng.
- Độc tính trên sinh sản: trứng, tinh trùng trên di truyền ảnh hưởng đến nhiễm sắc thể.

- Thuốc có bản chất kháng nguyên: có thể gây sốc phản vệ, cần đánh giá độc tính trên sinh
miễn dịch.
9) Nghiên cứu tổng hợp quy mô công nghiệp
10) Thử lâm sàng
Khi đã đáp ứng yêu cầu của phép thử tiền lâm sàng, thuốc sẽ chuyển sang giai đoạn thử
nghiệmlâm sàng. Đây là 1 giai đoạn tốn nhiều thời gian, kinh phí và phải theo đúng quy định của
pháp luật về thử thuốc trên lâm sàng.
11) Đăng ký sản xuất và lưu hành
Tiến hành lập hồ sơ đăng ký theo quy định nếu kết quả lâm sàng pha III của thuốc tốt. Sau khi
được cơ quan có chức năng quản lý phê duệt, thuốc mới chính thức được sản xuất và lưu hành
trên thị trường.
12) Đăng ký bảo hộ bản quyền phát minh sáng chế
13) Chuyển giao công nghệ, ứng dụng
Câu 4: Mô tả các bước cơ bản trong tiến trình nghiên cứu thuốc mới từ dược liệu. (Ver 2)
B1: Lựa chọn đối tượng đưa vào nghiên cứu
B2: Qúa trình thu mẫu và xác định tên khoa học
B3: Nghiên cứu về thành phần hóa học (Qúa trình làm khơ và làm mịn, lựa chọn phương pháp
chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc, định lượng, tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, cao nguyên liệu)
B4: Thử tiền lâm sàng (thử độc tính và tác dụng sinh học trên động vật thí nghiệm)
B5: Nghiên cứu chiết xuất ở quy mô công nghiệp
B6: Nghiên cứu dạng bào chế sản phẩm
B7: Thử nghiệm lâm sàng
B8: Đăng kí sản xuất, lưu hành
4


B9: Đăng kí sở hữu trí tuệ
 Phân tích các bước
1) Lựa chọn đối tượng đưa vào nghiên cứu
 Lựa chọn mẫu hoàn toàn ngẫu nhiên

- Dễ bắt gặp kết quả mới
- Tốn kém và khả năng thành công không cao
 Lựa chọn từ các bài thuốc giân dan hoặc thông qua kiến thức Y học dân tộc cổ
truyền
- Thực hiên điều tra
- Sử dụng tài liệu liên quan đến cây thuốc, tri thức làm thuốc
- Chia sẻ lợi ích
 Lựa chọn thơng qua tài liệu tham khảo
- Các lồi trong cùng 1 chi hoặc các chi trong cùng 1 họ thì có thể chứa các nhóm hợp chất tương
đồng
- Khảo sát các loài trong 1 họ, 1 chi, 1 vùng địa lí cụ thể hoặc tại 1 địa phương
 Lựa chọn bệnh
- Phụ thuộc vào mục tiêu kinh tế (bệnh phổ biến, thị trường tiềm năng mang lại giá thành cao)đầu tư từ các công ty Dược
- Bệnh hiếm gặp- cần sự đầu tư từ Chính phủ
2) Thu mẫu và xác định tên khoa học
 Mẫu đạt chất lượng từ các cá thể khỏe mạnh không bị nhiêm sâu bệnh (vi khuẩn,
nấm, virut…)
 Mẫu thu nên lưu ý các điều kiện môi trường sống như nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa,
lượng chiếu sáng, tính chất đất, độ cao về mặt địa lý
- Trường hợp chúng ta cần thu lại hoặc trồng lại các mẫu đó để đảm bảo giữ nguyên được
bản chất và hàm lượng các hoạt chất mục tiêu
- Đảm bảo an toàn nhất trong việc lấy lại mẫu là nên tiến hành ở cùng một địa điểm, cùng
thời gian thu hái trong năm so với mẫu gốc
- Cần để ý thu hái hợp lý để không phá vỡ hệ sinh thái hợp của địa phương
- Việc thu mẫu ở những khu vực khó như rừng mưa nhiệt đới hay trong rừng sâu cũng nên
cân nhắc trong trường hợp nhiều khả năng phải thu lại mẫu
 Thu mẫu
- Đúng bộ phận
+ Theo thông tin đã tham khảo
+ Thu mẫu để sàng lọc thì nên tách riêng nếu có thể

- Tuổi cây
- Thời điểm mùa vụ thu hái
Làm mẫu lưu và xác định tên khoa học
 Chuẩn bị các tiêu bản thực vật: mẫu khô, mẫu tươi ngâm và ảnh chụp
- Cơ quan sinh sản là hoa và quả

5


 Lưu mẫu tại các phịng thí nghiệ có chức năng lưu trữ tiêu bản (có thể là cấp quốc
gia hoặc cấp địa phương
- Có kí hiệu mẫu số
- Có lưu giữ trong điều kiện phù hợp để bảo quản lâu dài và có thể đối chiếu tham khảo lại khi cần
thiết
 Nhãn tiêu bản yêu cầu có đầy đủ thông tin
- nơi thu mẫu
- độ cao
- điều kiện môi trường
- tính chất mẫu lưu
- bộ phận thu mẫu
- tên người thu mẫu
- thời gian thu mẫu
Xác định chính xác tên khoa học
 Định hướng nghiên cứu về thành phần hóa học
- Thơng tin các hợp chất đã được tách chiết từ các lồi đó hoặc các lồi gần trong chi, trong họ
- Sẽ giúp lựa chọn các phương pháp chiết xuất phân lập phù hợp, rút ngắn được thời gian và kinh
phí nghiên cứu
 Giúp cho cơng bố chính xác
 Chuyên gia chuyên ngành thực vật học nên tham gia vào q trình này
 Có thể kèm theo biên bản giám định tên khoa học cho mẫu nghiên cứu

3) Nghiên cứu về thành phần hóa học
Qúa trình làm khơ và làm mịn, lựa chọn phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc, định
lượng, tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, cao nguyên liệu,…
4) Thử tiền lâm sàng
- Trước khi đưa vào thử lâm sàng, các thuốc phải trải qua một bước thử độc tính tiền lâm
sàng, đây là bước thử cần thiết để đánh giá độc tính của thuốc, đảm bảo thuốc khi đưa vào
thử lâm sàng là an tồn.
- Thơng thường phép thử độc tính đầu tiên được tiến hành trên in vitro, tiếp theo là các phép
thử trên động vật thực nghiệm như thỏ, chó, lợn, khỉ để kiểm tra độc tính in vivo của thuốc.
- Thuốc được đưa vào động vật thí nghiệm với các liều khác nhau trong các thời gian khác
nhau, sau đó phân tích mơ học và sinh hóa để xác định các dấu hiệu của độc tính, biến dị tế
bào hay ung thư.
- Thử độc tính tiền lâm sàng bao gồm xác định độc tính cấp và độc tính trường diễn.
- Độc tính của thuốc thường được đánh giá qua giá trị LD50. Tuy nhiên, giá trị này chỉ phản
ánh độc tính cấp của thuốc chứ khơng phản ánh các độc tính mãn.
- Vì vậy để đánh giá độc tính tồn diện của thuốc hiện nay phải dùng nhiều loại phép thử in
vitro và in vivo khác nhau.
5) Nghiên cứu chiết xuất ở quy mô công nghiệp
- Cung cấp đủ lượng dịch chiêt cho bào chế dạng thuốc dùng trong thử lâm sàng

6


Xác định quy trình chiết suất tối ưu: với các thông số chiết xuất tối ưu như độ mịn của
dược liệu, loại dm, tỷ lệ dung môi/dược liệu, phương pháp chiết => đảm bảo chất lượng
cao chiết tốt nhất, hiệu quả kinh tế nhất
6) Nghiên cứu dạng bào chế sản phẩm
Xác định dạng bào chế, xây dựng và tối ưu hóa cơng thức. Tùy theo dạng bào chế mà chọn lựa
dược chất, tá dược, bao bì đóng gói thích hợp.
Khi thiết kế dạng thuốc phải xem xét mối tương quan giữa các thành phần trong dạng thuốc dưới

sự tác động của kĩ thuật bào chế nhằm tìm ra phương pháp tối ưu cho sản phẩm
Xác định độ ổn định của thuốc
Xđ lượng cao đưa vào các phân liều phù hợp mà vẫn đảm bảo được hiệu lực điều trị
7) Thử nghiệm lâm sàng
Khi đã đáp ứng yêu cầu của phép thử tiền lâm sàng, thuốc sẽ chuyển sang giai đoạn thử nghiệm
lâm sàng. Đây là 1 giai đoạn tốn nhiều thời gian, kinh phí và phải theo đúng quy định của pháp
luật về thử thuốc trên lâm sàng.
Thử nghiệm lâm sàng thuốc là hoạt động khoa học nghiên cứu một cách hệ thống trên người
nhằm:
- Đánh giá hiệu quả lâm sàng,
- Nhận biết và phát hiện các phản ứng bất lợi,
- Nghiên cứu sự hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ của thuốc
>>> Nhằm mục đích chứng minh sự an toàn và hiệu quả của thuốc thử nghiệm.
- Trung bình đối với một nghiên cứu thuốc mới, thời gian nghiên cứu lâm sàng kéo dài từ 5
– 10 năm và trải qua 4 giai đoạn (pha I, pha II, pha III và pha IV).
- Phải tuân thủ các quy định nghiêm ngặt khi thử nghiệm trên người cũng như các quy định
về y đức.
3 pha lâm sàng cần phải thử:
- Pha I: thử để xác định liều trên người tình nguyện, thường là người khỏe mạnh.
- Pha II: thử để xác định hiệu quả điều trị trên người bệnh
- Pha III: thử để so sánh với các phác đồ điều trị hiện có
- Pha IV: đánh giá tác dụng phụ lâu dài (nghiên cứu post-marketing)
8) Đăng kí, sản xuất, lưu hành
Tiến hành lập hồ sơ đăng kí thuốc theo đúng quy định nếu kết quả lâm sàng pha III của thuốc tốt.
Sau khi được cơ quan có chức năng quản lý phê duyệt, thuốc mới chính thức được sản xuất và lưu
hành trên thị trường
Việc xem xét đánh giá hồ sợ được thực hiện bởi Hội đồng chuyên gia tư vấn độc lập khơng có
mâu thuẫn về quyền lợi đối với nhà đăng kí
9) Đăng kí sở hữu trí tuệ
Đăng kí bảo hộ độc quyền phát minh sáng chế ngay sau khi tổng hợp được và thử tác dụng thấy

có triển vọng với Cục sở hữu trí tuệ. Thời gian bảo hộ là 20 năm tính từ thời điểm đăng kí.
-

Câu 5: Phân tích vai trị và ý nghĩa của quá trình lựa chọn đối tượng nghiên cứu trong tiến
trình nghiên cứu thuốc mới từ dược liệu.
* Vai trị: Tùy từng mục tiêu lựa chọn mà có vai trị khác nhau:
7


- Lựa chọn ngẫu nhiên:
+ Tìm ra những chất mới với hoạt tính mới, nghiên cứu tạo ra sản phẩm thuốc mới  đáp ứng
nhu cầu sử dụng của con người.
+ Tìm ra những cấu trúc mới, chiết xuất làm ngun liệu hoặc đóng vai trị chất dẫn đường 
tổng hợp, bán tổng hợp thuốc có tác dụng mạnh hơn.
+ Có thể vận dụng tối đa nguồn nguyên liệu thiên nhiên sẵn có, tránh lãng phí.
- Lựa chọn nhờ tai nguyên tham khảo: Các loài thuốc cùng một chi, họ thường tương tự nhau về
thành phần hóa học và tác dụng sinh học.
+ Giúp chọn lựa được những đối tượng với hoạt tính tốt, ít độc tính để thay thế những đối
tượng khơng phù hợp.
+ Hoặc đóng vai trị như tiền chất để bán tổng hợp thuốc mới.
- Lựa chọn từ bài thuốc dân gian, y học dân tộc: Giúp duy trì và phát huy được những tri thức của
dân tộc, vận dụng một cách phù hợp hơn với xã hội hiện đại ngày nay. Không làm mất những kiến
thức hữu ích đã tồn tại hàng trăm năm qua.
- Lựa chọn bệnh:
+ Nhằm cung cấp những thuốc đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cấp thiết, phổ biến.
+ Đối với bệnh hiếm gặp: tạo cơ hội sống cho nhiều người, sản phẩm mang tính độc quyền cho
nhà sản xuất.
+ Theo mục tiêu kinh tế: Vừa đáp ứng nhu cầu xã hội, vừa mang lại tiềm năng kinh tế lớn, hay
có thể giảm được chi phí sản xuất đối với những thuốc đã sản xuất với chi phí cao.
* Ý nghĩa:

- Có ý nghĩa quyết định thành cơng của q trình nghiên cứu, các bước sau của quy trình nghiên
cứu đều phụ thuộc vào đối tượng nghiên cứu.
- Điều hướng cho các bước nghiên cứu tiếp theo trong trình tự nghiên cứu:
+ Là cơ sở định danh xác định đặc tính về thực vật học  từ đó thu hái đúng đối tượng.
+ Quy trình chiết xuất phân đoạn
+ Lựa chọn mơ hình thử nghiệm
- Đây là một bước vơ cùng quan trọng trọng trong quy trình nghiên cứu, vì vậy phải được tiến
hành một cách kỹ càng, thỏa mãn, đáp ứng các nhu cầu của cộng đồng, xã hội.
Câu 6: Thử nghiệm in vitro là gì? hãy nêu ưu và nhược điểm của thử nghiệm in vitro? Thử
nghiệm in vitro có vai trò như thế nào trong sàng lọc dược liệu? Thiết kế thử nghiệm in vitro
bao gồm những bước cơ bản nào?
1. Thử ngiệm in vitro là gì?
- Thử nghiệm in vitro là phép thử thường được tiến hành trong ống nghiệm, đĩa peptri…
và không liên quan đến động vật mà chỉ sử dụng tế bào, enzym…
- Thử nghiệm in vitro có thể thử trên :
+ Mơi trường ni cấy như vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm…), tế bào (tế bào ung thư...), virus..
+ Đích tác dụng : enzym, receptor…
2. Ưu nhược điểm.
- Ưu điểm
8


+ Ít tốn kém, dễ thiết lập.
+ Có độ lặp lại và độ nhạy cao
+ Có thể tiến hành trong các hệ thống thử nghiệm ít phức tạp.
+ Có thể tự động hóa
+ Tính tốn kết quả nhanh
+ Dễ kiểm sốt chất lượng thí nghiệm
+ Có thể sử dụng tế bào người nên hạn chế được yếu điểm phải ngoại suy từ động vật sang người.
- Nhược điểm.

Còn nhiều hạn chế:
- Nghiên cứu thường được đánh giá trên các đích độc lập, không cung cấp được các yếu tố thể hiện
được sự đáp ứng của cơ thể sống với thuốc,
- Không thể hiện tác dụng trên cơ thể nguyên vẹn nên kết quả nghiên cứu thường mang tính chất
gợi ý, tham khảo nhiều hơn là để chứng minh đánh giá tác dụng thuốc.
So sánh thử nghiệm Invitro và Invivo
Invitro
- Đơn giản, nhanh
- Chi phí thấp
- Cần ít dịch chiết
- Dễ dàng so sánh nhiều dịch
chiết trong các điều kiện đồng
nhất
- Độ lặp lại cao
- Độ nhạy cao
- Có thể tự động hóa
Nhược - Thử các tác dụng cấp, khơng
đánh giá được tác dụng lâu dài
Ưu

- Không thấy được ảnh hưởng
của q trình trao đổi chất
- Khơng nghiên cứu được khả
năng hấp thu hoặc sinh khả
dung

Invivo
- Thử nghiệm trên cơ thể toàn vẹn (sinh khả
dụng, hấp thu, trao đổi chất…)
- Quan sát đồng thời được nhiều thông số

- Cần thiết cho một số nghiên cứu không thể
thực hiện được trên in vitro hoặc cho nghiên
cứu các bệnh mãn tính
- Chi phí tốn kém
- Đòi hỏi các trang thiết bị phức tạp hơn
- Khó tự động hóa
- Cần lượng chất thử lớn hơn
- Sự đáp ứng khác nhau giữa các cá thể
- Vấn đề về đường dùng và liệu lượng
- Vấn đề đạo đức trong thử nghiệm trên súc
vật

- Vấn đề về độ tan
Vai trò của thử nghiệm in vitro trong sàng lọc tự nhiên
- Thế giới
9


+ <2500/800000 loài thực vật được nghiêm cứu một cách đầy đủ, các nghiên cứu về động vật làm
thuốc cũng như sinh vật biển còn khá hạn chế.
+ tiềm năng cung cấp các hợp chất mới với cấu trúc vô cùng đa dạng mà các nhà tổng hợp không
thể nghĩ tới.
- Việt nam
+ Hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng.
+ Đường bờ biển dài trên 3260km, phát hiện có khoảng 11000 lồi sinh vật cư trú.
 Cịn một khối lượng vô cùng lớn dành cho các nhà nghiên cứu
 Thử nghiệm in vitro thường được lựa chọn trong nghiên cứu sàng lọc ban đầu, góp
phần định hướng cho các nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học cũng như tác
dụng sinh học.
3. Thiết kế thử nghiệm in vitro bao gồm các bước cơ bản sau.

- Lựa chọn đối tượng nghiên cứu
- Lựa chọn tác dụng cần thử nghiệm in vitro.
- Mơ hình nghiên cứu tác dụng in vitro có thể có nhiều phương pháp -> xác định phương pháp
thử nghiệm.
- Lựa chọn thuốc đối chiếu (chứng dương) cho mơ hình đã lựa chọn.
- Chuẩn bị mẫu thử, dung mơi, hóa chất và thuốc thử cần thiết sử dụng trong thử nghiệm.
- Chuản bị hỗn hợp phản ứng
- Lựa chọn phương pháp phát hiện (đánh giá kết quả trước và sau khi them mẫu thử thì có gì
thay đổi hay khơng, nếu có thay đổi thì mức độ thay đổi như thế nào)
- Xử lí số liệu và đánh giá kết quả.
Câu 7: Mục đích nghiên cứu tác dụng chống oxi hóa in vitro? Nguyên tắc của mơ hình
nghiên cứu chống oxi hóa in vitro bằng phương pháp sử dụng DPPH? Thiết kế nghiên cứu
tác dụng chống oxi hóa in vitro bằng phương pháp sử dụng DPPH gồm những bước cơ bản
nào?
- Mục đích.
Xác định mẫu thử nghiên cứu có tác dụng chống oxi hóa hay khơng, mức độ tác dụng in vitro như
thế nào và cơ chế tác dụng là gì.
- Ngun tắc mơ hình nghiên cứu tác dụng chống oxi hóa in vitro bằng phương pháp sử
dụng DPPH
+ DPPH là hợp chất có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa. Khi
cho các chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét các gốc tự do thì sẽ có
khả năng làm giảm cường độ hấp thụ của các gơc tự do DPPH.
+ hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thơng qua giá trị hấp thụ ánh sang của dung dịch thử
nghiệm so với chất đối chứng, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 517nm

10


- Thiết kế nghiên cứu gồm các bước:

B1: Lựa chọn đối tượng nghiên cứu
B2: Xác định mơ hình thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa in vitro, lựa chọn thuốc đối chiếu
(Chọn mơ hình DPPH).
B3: chuẩn bị mẫu thử và các dung mơi, hóa chất, thuốc thử cần thiết sử dụng trong mơ hình
đã lựa chọn thuốc đối chiếu. Cụ thể:
+ Chuẩn bị dung dịch DPPH
+ Chuẩn bị dung dịch thử
+ Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (chứng dương): thường sử dụng rutin, quercetin, acid
ascorbic, acid gallic, catechin, glutathione….
+ Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng ( dung dịch thử + dung dịch DPPH + dung mơi)
Ví dụ về chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
ống
Dung dịch thử (ml)
MeOH (ml)
Dung dịch DPPH (ml)
Trắng
0
4
0
Chứng
0
3.5
0.5
Thử
0.5
3
0.5
Chứng dương
0.5
3

0.5
+ lắc đều các ống, để ổn định trong bóng tối, ở nhiệt độ phịng trong 30 phút.
B4: Phương pháp đánh giá: Phương pháp đo quang, đo độ hấp thụ của mẫu thử, mẫu trắng,
mẫu chứng, chứng dương tại λ = 517nm.
B5: Tính kết quả và sử lý số liệu:
● Tính tốn kết quả:

HTCO(%) =

𝑶𝑫𝒄𝒉ứ𝒏𝒈−𝑶𝑫𝒕𝒉ử
𝑶𝑫𝒄𝒉ứ𝒏𝒈

∗ 𝟏𝟎𝟎%

OD : mật độ quang
● Xử lí số liệu: dùng phần mền excel, spss...
Câu 8: mục đích của nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào in vitro ? ngun tắc của mơ hình
nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào bằng phương pháp MTT? Thiết kế nghiên cứu tác dụng
gây đọc tế bào bằng phương pháp MTT bao gồm những bước cơ bản nào?
- Mục đích

11


Xác định mẫu thử nghiên cứu có tác dụng gây độc tế bào hay không, mức độ tác dụng in vitro như
thế nào và cơ chế tác dụng là gì.
- Ngun tắc của mơ hình nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào bằng phương pháp MTT
+ Đánh giá khả năng sống sót của tế bào thong qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành
phức hợp formazan( màu tím) bởi hoạt động của enzyme dehydrogenase trong ty thể của tế bào
sống

+ Lượng formazan tạo ra tỉ lệ thuận với lượng tế bào sống trong môi trường nuôi cấy và được
xác định bằng phương pháp đo quang.
+ Nếu chất thử nghiệm có hoạt tính gây độc tế bào thì số lượng tế bào sống giảm và giá trị
OD giảm.

Dehydrog
enase
MTT
(vàng)

Formazan
(tím đen)

Hoạt lực của thuốc tương ứng với lượng
giảm Formazan
- Các bước cơ bản của phương pháp MTT

B1: lựa chọn đối tượng nghiên cứu
B2: Xác định mơ hình thử nghiệm hoạt tính gây độc TB in vitro : Phương pháp MTT
Chọn thuốc đối chiếu: ellipticine, doxorubicin, vincristine,…
B3 : Lựa chọn dòng TB ung thư cần nghiên cứu và tiến hành nuôi cấy TB ung thư
+ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào
+ Cho TB và môi trường nuôi cấy TB vào giếng, ủ trong tủ ấm ở 37oC, 5% CO2 trong 24h
B4: Chuẩn bị mẫu thử và các thuốc thử, dung mơi, hóa chất cần thiết
B5: Cho mẫu thử/mẫu chứng / mẫu chứng dương (thuốc đối chiếu) vào các giếng có TB đã
ni cấy
+ Cho chất thử vào giếng, ủ ở 37oC, 5% CO2 sau 24 – 72h, loại bỏ môi trường nuôi cấy ( sử
dụng phương pháp ly tâm)
+ Cho MTT vào giếng, ủ ở 37oC/4h
+ Thêm dung mơi (DMSO/SDS/DMF…) để hịa tan formazan tạo thành

B6: Đo quang ở bước sóng thích hợp ( 540nm, 570nm, 595nm…)
B7: Tính tốn kết quả, xử lí số liệu
𝑶𝑫𝒄𝒉ứ𝒏𝒈 − 𝑶𝑫𝒕𝒉ử
𝐈% =
∗ 𝟏𝟎𝟎%
𝑶𝑫𝒄𝒉ứ𝒏𝒈
IC50 : là giá trị nồng độ (tính tốn theo lí thuyết) tại đó mẫu thử ức chế 50% sự phát triển
của tế bào.

12


Câu 9: Mục đích của nghiên cứu tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro? Ngun
tắc của mơ hình nghiên cứu tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro theo phương
pháp của Noro? Thiết kế nghiên cứu tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro theo
phương pháp của Noro bao gồm những bước cơ bản nào?
 Mục đích: xác định mẫu thử nghiên cứu có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric hay
không và mức độ tác dụng in vitro như thế nào
 Nguyên tắc của mơ hình nghiên cứu:
Dựa trên phản ứng :
Xanthin +H2O +O2 → acid uric + H2O2
Hoạt độ XO được xác định thông qua việc định lượng acid uric tạo thành,được đo độ hấp thụ ở
λ=290nm ở 25oC
 Các bước tiến hành:
1. Lựa chọn đối tượng nghiên cứu
2. Chuẩn bị mẫu thử và các thuốc thử, dung mơi, hóa chất cần thiết
- Chuẩn bị mẫu thử: hịa tan trong dung mơi thích hợp, sau đó pha lỗng bằng dung
dịch đệm thành các dung dịch có nồng độ cần nghiên cứu.
- Chuẩn bị dung dịch enzym xanhthin oxidase (pha trong đệm phosphat, pH=7.5, được
chuẩn bị ngay trước khi sử dụng) và dung dịch xanhthin

- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng:
mẫu thử / mẫu chứng / mẫu đối chiếu + dung dịch đệm + dung dịch enzym →ủ ở
15oC/15 phút, sau đó thêm xanhthin → ủ ở 25oC/30 phút. Ngừng phản ứng bằng cách
cho thêm HCl 0.1N
- Mẫu trắng của thử / chứng / đối chiếu được tiến hành tương tự nhưng thay đổi trình tự
enzym cho vào (enzym được cho vào sau HCl 0.1N)
3. Đo quang ở λ=290nm
4. Tính tốn kết quả, xử lý số liệu.
∆𝐎𝐃 𝐜𝐡ứ𝐧𝐠 − ∆𝐎𝐃 𝐭𝐡ử
%Ứ𝐜 𝐜𝐡ế =
∗ 𝟏𝟎𝟎
∆𝐎𝐃 𝐜𝐡ứ𝐧𝐠
∆OD chứng=OD chứng-OD trắng chứng
∆OD thử=OD thử-OD trắng thử
Câu 10: Mục đích của nghiên cứu tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro?
Ngun tắc của mơ hình nghiên cứu tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro
theo phương pháp của Elliman? Thiết kế nghiên cứu tác dụng ức chế enzym
acetylcholinesterase in vitro theo phương pháp của Elliman bao gồm những bước cơ bản
nào?
 Mục đích: xác định mẫu thử nghiên cứu có tác dụng ức chế acetylcholinesterase hay
khơng và mức độ tác dụng in vitro như thế nào.
 Nguyên tắc (Ellman):
Cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin. Thiocholin phản ứng
với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid (có màu vàng). Hợp chất
này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412nm.
13


 Thiết kế nghiên cứu:
1. Lựa chọn đối tượng nghiên cứu

2. Chuẩn bị mẫu thử và các thuốc thử, dung mơi, hóa chất cần thiết
- Chuẩn bị dung dịch enzym, dung dịch đệm, dung dịch đối chiếu
- Chuẩn bị mẫu thử
- Thêm lần lượt dung dịch gồm: dung dịch đệm tris-HCl ph=8, dung môi hoặc mẫu thử và
dung dịch enzym vào từng giếng của đĩa 96 giếng. Hỗn hợp các dung dịch này được trộn
đều và ủ ở 25oC/15 phút
- Dung dịch thuocs thử DTNB và dung dịch cơ chất ATCI lần lượt được thêm vào hỗn hợp
và trộn đều. Tiếp tục ủ hỗn hợp trong một khoảng thời gian nhất định ở 25oC
3. Đo độ hấp thụ ở 412nm
4. Tính tốn kết quả và xử lý số liệu:
𝟏 − 𝐀 𝐭𝐡ử
𝑰% =
𝒙 𝟏𝟎𝟎%
𝑨 đố𝒊 𝒄𝒉ứ𝒏𝒈
Câu 11 phương pháp tính diện tích bề mặt cơ thể (BSA)
– Xác định diện tích bề mặt cơ thể bằng cơng thức
Diện tích bề mặt cơ thể người theo cân nặng và chiều cao, cơng thức DuBois (1916):

BSA=a*W0,425*H0.725
Trong đó: BSA:diện tích bề mặt cơ thể(cm2)
a : hằng số đối với mỗi loài động vật, với người a=71.84
W: khối lượng cơ thể(kg)
H: chiều cao (cm)
– Xác định diện tích cơ thể bằng tốn đồ:
Trong phương pháp này, có thể sử dụng chung một toan đồ cho cả trẻ em va người lớn. Tuy
nhiên, để kết quả tính được chính xác hơn, người ta cịn xây dựng toán đồ cho trẻ em. Để sử dụng
toán đồ cần sử dụng một thước thẳng, đặt mép thước vào giá trị chiều cao và cân nặng của người
cần xác định, điểm giao với cột diện tích ở giữa cho biết diện tích bề mặt cơ thể tương ứng. Trong
thực hành sử dụng thuốc, nếu tính liều theo tuổi thì thường phải ghi chi tiết liều cho người lớn là
bao nhiêu, liều của trẻ em, chẳng hạn 1-2 tuổi, 3-5 tuổi, 6-9 tuổi là bao nhiêu. Còn khi hướng dẫn

liều dùng theo diện tích bề mặt cơ thể thì chỉ có một liều chung cho tất cả các lứa tuổi.
Câu 12: Phương pháp xác định độc tính của thuốc (theo tác giả Đỗ Trung Đàm (2014))
1. Các định nghĩa liên quan
2. Các phương pháp xác định LD50
+ Tầm quan trọng
+ Nguyên tắc chung
+ Bước nhảy liều
+ Phương pháp tính liều LD50
1. Các định nghĩa liên quan
 Độc tính của thuốc
14


Độc tính(toxicity) của thuốc là tính chất được biểu hiện bằng tác dụng khơng mong muốn, có hại
cho cơ thể.độc tính của thuốc có thể nhẹ như thay đổi hành vi, thay đổi vận động, buồn nơn , mẩn
ngứa, có thể rất nặng, thậm chí gây chết
 Độc tính cấp của thuốc
Độc tính cấp của thuốc là độc tính xảy ra sau khi dùng thuốc một lần hoặc vài ba lần trong ngày.
Nghiên cứu độc tính của thuốc trên động vật thí nghiệm có mục đích chính là xác định liều chết
trung bình
 Liều chết
Liều gây chết cho con vật dùng thuốc, ký hiệu LD. Liều chết không áp dụng thử cho người mà chỉ
thử trên các con vật thí nghiệm
 Liều chết tuyệt đối
Liều chết tuyệt đối, thường được kí hiệu LD100, đó là liều nhỏ nhất gây chết 100% các con vật thí
nghiệm. Tất nhiên, nếu dùng liều cao hơn LD100 thì tất cả các con vật đều chết
 Liều chết trung bình
Liều chết trung bình thường được kí hiệu LD50, đó là liều làm chết 50% số con vật thí nghiệm
 Liều chết tối thiểu
Là liều khi thử trên một lơ con vật thấy có một con chết.do đó,nếu thử 20 con có một con chết thì

liều chết tôi thiểu là liều gây chết 5%(LD5), nếu thử 10 con có một con chết thì liều chết tơi thiểu
là liều gây chết 10%(LD10), thử 4 con có một con chết thì liều chết tối thiểu là liều gây chết
25%(LD25)
 Liều dưới liều chết
Còn gọi là liều dung nap tơi đa, kí hiệu LD0, là liều lớn nhất mà không làm chết con vật nào, liều
dung nap tối đa có thể gây độc nhẹ hoặc nặng cho con vật nhưng khơng gây chết.
 Liều an tồn
Là mức liều cao nhất khơng gây ra bất kì tai biến nào có thể quan sát được
2. Phương pháp xác định LD50
 Tầm quan trọng:
LD50 là một thông số rất quan trọng để đánh giá độc tính của một thuốc
Biết LD50 sẽ có phương hướng dùng liều thí nghiệm dược lý một cách đúng đắn. Liều có tác
dụng dược lý thường vào khoảng 1/10 cua LD50, và trong giới hạn từ 1/20 đến 1/5 của LD50 . do
đó nên xác định LD50 trước khi nghiên cứu dược lý.
Liều LD50 và liều có tác dụng dược lý (ED) trên động vật thí nghiệm là một trong những cơ sở
để suy ra liều dùng trong điều trị ở người dựa vào một số phương pháp tính ngoại suy.
Biết LD50 mới xác định được chỉ số điều trị, một thông số quan trọng để quyết định xem có nên
đưa thuốc vào dùng trên người hay khơng.
Chỉ số điều trị(TI) là tỉ số giữa liều chết trung bình LD50 và liều hữu hiệu trung bình( liều có hiệu
lực ở 50% số con vật thí nghiệm,kí hiệu ED50)

TI=

𝑳𝑫𝟓𝟎
𝑬𝑫𝟓𝟎

Chỉ số điều trị được tính ở cùng một lồi động vật thí nghiệm và cho khái niệm về phạm vi điều
trị. Nếu thử trên các động vật khác nhau thi phải dùng phép ngoại suy.
Một chất có TI≥ 10 dùng được trong điều trị và ít gây độc khi dùng ở liều điều trị. Nếu TI càng
lớn thì phạm vi điều trị càng lớn và độc tính càng thấp.

Một chất có TI≤ 10 chỉ dùng trong điều trị nếu:
15


 Có tác dụng điều trị rất rõ rệt
 Chưa có thuốc nào an tồn hơn để thay thế
 Khi dùng phải rất thận trọng, theo dõi sát tác dụng có hại, ví dụ glycosid tim, nhiều
thuốc chống ung thư
 Nguyên tắc chung
 Xác định LD50 là tìm liều gây chết 50% số con vật thí nghiệm
 Con vật được chia thành nhiều lơ tương tự nhau về giới tính, khối lượng
 Mỗi lơ dùng một liều(tính theo kg cân nặng). Các lô khác nhau dùng liều khác nhau của
chất định nghiên cứu
 Đánh giá theo nguyên tắc” tất cả hoặc không”(chết hoặc sống)
 Ghi lại các điều kiện thử nghiệm: ngày, tháng, năm thí nghiệm, nhiệt độ, độ ẩm, nắng,
mưa. Các thông số này đôi khi cũng hỗ trợ cho việc đnhs giá kết quả
 Bước nhảy liều
Là khoảng cách giữa 2 liều kế tiếp. Khoảng cách này có thể bằng nhau hoặc xấp xỉ bằng
nhau.thường dùng liều nhỏ bằng 80% liều lớn kề sát( như vậy liều lớn bằng 125% liều nhỏ kề
sát). Nói chung chênh lệch giữa 2 liều kế tiếp so với liều lớn vào khoảng 10-30%. Nếu mỗi liều
nhỏ bằng một tỉ lệ % nhất định của liều lớn kề sát thì bước nhảy liều tính theo logarit của liều đều
bằng nhau. Vì vậy, khuynh hướng hiện nay thường dung bước nhảy liều bằng nhau tính theo
logarit liều
 Phương pháp tính liều LD50
- Biểu thị kết quả LD50:
Có 3 cách:
+ Chỉ biểu thị trị số: LD50 = a (mg/kg)
+ Biểu thị bằng trị số của LD50 và sai số chuẩn SE:
LD50= LD50 ± SE (1)
+ Biểu thị bằng trị số của LD50 và giới hạn tin cậy (ngưỡng xác xuất P = 0,05):

LD50 = LD50 (ld÷lt) ở P = 0,05 (2)
ld: giới hạn tin cậy dưới; lt: giới hạn tin cậy trên; µ: khoảng tin cậy
µ = t x SE (3)
ld = LD50 - µ (4); lt = LD50 + µ (5)
Để tính t , ta sử dụng bảng tra cứu, trong đó cần biết 2 thông số là bậc tự do (Btd) và ngưỡng
xác suất P (probability)
Bậc tự do: Btd = N’ hoặc Btd ≈ N (số con vật thử nghiệm độc tính cấp)
Nếu N (số con vật thử nghiệm độc tính cấp) khá lớn nên Btd lớn hơn 30 nhiều. Vì vậy t
thường được tra ở hàng cuối bảng tra cứu, với Btd = ∞.
Ngưỡng xác suất P: Thường độ tin cậy được chọn là 95% => hệ số sai lầm (ngưỡng xác suất
P) là 5% hoặc P = 0,05
Với Btd = ∞ và P = 0,05, tra bảng giá trị t ta sẽ có:
t = 1,96 và µ = 1,96 x SE (6)

- Cách tính LD50:
+ Tính LD50:
Áp dụng cơng thức:
16


LD50 = LD100 -

∑(𝒂 𝒙 𝒅)
𝒏𝒕𝒃

(7); ntb =

∑ 𝒏𝒊
𝑲

(8)

Trong đó: ntb là số trung bình các con vật của mỗi lơ; K là số lơ thí nghiệm; a: số chết trung
bình ở 2 liều kế tiếp; d: hiệu 2 liều kế tiếp.
+ Tính sai số chuẩn của LD50:
Vẽ đồ thị (sử dụng Excel) tỉ lệ chết theo liều dùng, trong đó trục hồnh là liều dùng, trục tung
là tỉ lệ chết. Tỉ lệ chết sử dụng là tỉ lệ % chết theo thực nghiệm ở mỗi lô. Từ đồ thị này cũng có
thể xác định được LD50.
Để tính sai số chuẩn, trên đồ thị, ta xác định LD16 và LD84. Từ đó tính phân phối chuẩn s theo
cơng thức:

s=

𝑳𝑫𝟖𝟒 − 𝑳𝑫𝟏𝟔
𝟐

(5)

Sai số chuẩn của LD50 được tính tốn theo cơng thức:

SELD50 = √

𝒌.𝒔.𝒅
𝒏

(9)

Trong đó: k = 0,564 là hằng số Behrens-Karber.
s: phân phối chuẩn
n: số chuột trong mỗi lô, nếu số chuột trong các lơ khơng bằng nhau thì lấy n trung bình theo

cơng thức (4)
d: bước nhảy liều tính theo trị số. Nếu các bước nhảy liều không bằng nhau thì lấy bước nhảy
liều trung bình:

dtb =

∑ 𝒅𝒊
𝑲−𝟏

(10)

+ Tính giới hạn tin cậy:
Áp dụng cơng thức (3) µ = t x SE, tra bảng t với bậc tự do Btd = ∞ và P = 0,05 thì
t = 1,96.
Rồi áp dụng cho (4) và (5)

ld = LD50 - µ ; lt = LD50 + µ
Kết luận: LD50 = LD50 (ld÷lt)

Câu 13: phương pháp xác định liều hiệu quả ED50:
1. Các khái niệm
2. Ngưỡng có hiệu quả
3. Nguyên tắc chung
4. Bước nhảy liều
5. Thăm dị liều
6. Tính liều ED50
1.Các khái niệm:
1.1. ED50
Theo quy ước, liều hiệu quả ở 50% con vật thí nghiệm được gọi là ED50.
17

1.2 ED0 : Là liều lớn nhất của một thuốc khơng gây tác dụng trong thí nghiệm ở một lồi động vật
nào đó.
1.3.ED100 : Là liều thấp nhất gây ra tác dụng hoặc gây ra hiệu quả ở tất cả các con vật thí nghiệm.
Tuy nhiên,cũng có trường hợp khi tăng liều lên, số con vật thể hiện tác dụng vẫn không được
100%, nhưng nếu tiếp tục tăng liều sẽ gây độc, thậm chí gây chết .Đó thường là những thuốc có
liều hiệu quả gần với liều độc và liều chết.
2.Xác định ngưỡng có hiệu quả(tác dụng)
Cần phải quy định như thế nào là có hiệu quả để có thể xác định được ED50. Chẳng hạn thí
nghiệm hạ sốt, ta quy định, ví dụ như nhiệt độ giảm 0,80C trở lên là có hiệu quả, thì những con vật
có nhiệt độ giảm dưới 0,80C gọi là khơng có hiệu quả.
3.Ngun tắc chung
- Xác định ED50 là tìm liều có hiệu quả ở 50% số con vật thí nghiệm.
- Các con vật được chia thành nhiều lô tương tự nhau.
- Mỗi lơ dùng một liều tính theo kg thể trọng. Các lô khác nhau dùng liều khác nhau đối với chất
định nghiên cứu.
- Đánh giá theo nguyên tắc “ Có hoặc khơng” (có hiệu quả hoặc khơng có hiệu quả) ở mỗi lô.
4. Bước nhảy liều: Là khoảng cách giữa hai liều kế tiếp nhau. Thông thường liều lớn bằng khoảng
1,5l liều nhỏ kề sát, hoặc liều nhỏ bằng khoảng 70% liều lớn kề sát.
5.Thăm dò liều ban đầu:
Để thăm dò dùng 2 con vật thí nghiệm với 1 liều lượng nào đó. Nếu kết quả cả 2 đều có tác dụng,
thì thử với liều = ½ liều ban đầu cho 2 con tiếp theo.
Ngược lại thì, nếu cả 2 khơng có tác dụng thì thăm dị 2 con tiếp theo với liều gấp đơi.
Thăm dị đến khi thấy một liều làm 1 con có tác dụng và 1 con khơng có tác dụng thì lấy liều đó
làm liều cơ sở, rồi dùng 1 liều lớn hơn theo cấp số nhân với hệ số là 1,5; cho đến 1 liều gây tác
dụng ở tất cả thí nghiệm ( ED100) hoặc bắt đầu gây độc cho con vật.
Đồng thời dùng 1 liều nhỏ hơn theo cấp số nhân có hệ số là 0,7,cho đến 1 liều tất cả các con vật
đều có tác dụng, khi giảm liều còn 1 nửa, cả 2 đều khơng có tác dụng. Khi đó, ta lấy liều có tác
dụng làm liều cơ sở, rồi tiến hành như trên.

6. Tính ED50
Có nhiều phương pháp khác nhau.Để đơn giản, có thể áp dụng phương pháp Behrens-Karber:

ED50=ED100 -

∑ 𝒂.𝒅
𝒏𝒕𝒃

∑ 𝒏𝒊

ntb =

𝑲

ntb: số tb các con vật của mỗi lô.
K là số lơ thí nghiệm
Nếu số con vật ở mỗi lơ bằng nhau thì ntb =ni.
Câu 14: các bước xác định tính an tồn của thuốc
B1: Tính liều có hiệu quả tương đương cho con vật đã thử độc tính cấp. Nếu dùng ĐVTN khác,
cần phải ngoại suy.
B2: tính chỉ số điều trị (TI)
18


TI=

𝐿𝐷50
𝐸𝐷50

B3: Kết luận tính an tồn của thuốc dựa trên TI.

T> 10 dùng được trong điều trị và ít gây độc khi dùng ở liều điều trị.
TI càng lớn thì phạm vi điều trị càng lớn và độc tính càng thấp.
+ 1 chất có TI ≤10 chỉ dùng trong điều trị nếu:
- Chưa có thuốc nào an tồn hơn để thay thế
- Có tác dụng điều trị rất rõ rệt
- Khi dùng phải rất thận trọng,theo dõi tác dụng có hại.
Câu 15: trình bày các nội dung chính về định lượng hoạt chất khi xây dựng tiêu chuẩn dược
liệu?
Việc xác định hàm lượng các hoạt chất trong dược liệu bao giờ h cũng gồm các bước chính sau:
B1: Chiết kiệt hoạt chất có trong mẫu dược liệu cần định lượng.
B2: Loại tối đa các tạp chất có thể ảnh hưởng tới kết quả của phép định lượng.
B3: Chọn phương pháp thích hợp để xác định hàm lượng của chất trong mẫu.
Các phương pháp thường được sử dụng trong định lượng là:
- Phương pháp khối lượng
- Pp thể tích
- Pp quang phổ
- Pp kết hợp sắc kí – quang phổ
- Pp sinh vật
B4: Tính tốn kết quả định lượng.
Câu 16: Sự cần thiết phải xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu và sản phẩm từ dược liệu?
Đảm bảo tính an tồn-hiệu quả-hợp lí trong sử dụng thuốc
- Tính an tồn và hiệu quả điều trị là yêu cầu cao nhất đối với 1 dược phẩm
- 1 dược phẩm tốt: là 1 dược phẩm
o Khơng có tác dụng có hại (do bản chất, khơng khống chế được thành phẩn, hoặc tạp
chất)
o Có hiệu quả điều trị cao và ổn định (theo thời gian, trên các lô sản xuất khác nhau,
trên các cá thể khác nhau)
- Tác dụng của 1 DL, 1 thuốc đi từ DL quyết định = thành phẩn các chất có trong DL đó
o Các hoạt chất mang lại tác dụng dược lý
o Chất có tác dụng hỗ trợ

o Chất khơng có tác dụng
o Chất mang lại tác dụng khơng mong muốn
- Các yếu tố nội tại của cây thuốc (lồi, chủng hóa học, giống cây trồng), tác nhân bên ngoài
(địa lý phân bố, thời gian thu hái, phương pháp chế biến, bảo quản,…) : thay đổi thành
phần và tỷ lệ tương đối
=> Thay đổi tác dụng điều trị hoặc tác dụng phụ
=> Ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả trị liệu và tính an tồn
19


-

-

Do đó cần đánh giá và thống nhất được các chuẩn mực đánh giá cho 1 nguyên liệu có thể
được sử dụng làm thuốc hoặc thành phẩm khi đưa ra thị trường
Bằng cách xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, các phương pháp thử.
Cơ chế thị trường: hội nhập, khu vực hóa, tồn cầu hóa.
Hiện nay các sản phẩm cần đáp ứng được yêu cầu chất lượng cao để cạnh tranh với các sản
phẩm nhập khẩu hoặc để xuất khẩu nước ngồi.
Xây dựng tiêu chuẩn là địi hỏi cấp bách của thị trường đối với các nhà sản xuất kinh doanh
trong bối cảnh thị trường đang được khu vực hóa, tồn cầu hóa.

Quản lí nhà nước về chất lượng dược liệu
- Trong ngành y tế, tiêu chuẩn của NL làm thuốc, các chế phẩm được cơ quan quản lý NN
cao nhất ban hành là tiêu chuẩn được tập hợp trong DĐVN do Bộ Y tế ban hành. Đây chỉ
là tiêu chuẩn tối thiểu cần đạt được
- Số lượng các DL lưu hành trên thị trường là khá lớn. Không phải tất cả DL đều có tiêu
chuẩn. DL thơng dụng, được sử dụng nhiều, có độc tính cao hoặc có giá trị cao là có tiêu
chuẩn

- Cần xây dựng tiêu chuẩn DL để các cơ quan NN quản lý được chất lượng DL trên thị
trường.
Nâng cao uy tín, sức cạnh tranh của các doanh nghiệp dược
- Trên thực tế, số lượng DL mà các cơ sở sx sử dụng làm thuốc cao hơn nhiều so với số
lượng đã ghi trong Dược điển.
- Trong xu thế cạnh tranh, các cơ sở cũng có nhu cầu có các tiêu chuẩn riêng cho các sản
phẩm của mình, cao hơn các tiêu chuẩn chung, phản ánh tốt hơn CL sp của cơ sở mình.
→ Phải xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng và các phương pháp thử để đánh giá các tiêu chí đó.
Câu 17: Các thức xây dựng tiêu chuẩn thuốc từ dược liệu?
Các dạng thuốc từ dược liệu thông dụng là thuốc sắc, thuốc cao, viên hoàn, viên tễ, thuốc tán và
thuốc rượu. hiện nay thuốc cổ truyền đã có cả những dạng mới như các loại viên tròn, viên nén,
viên nhộng, siro, cao dán, dầu xoa và cả thuốc tiêm. Tiên chuẩn thuốc từ dược liệu gồm các vấn
đề sau:
+ Tính xác thực của thuốc đối với các tiêu chuẩn cảm quan, thực vật, hóa lý và nếu có thể cả
tiêu chuẩn sinh học.
+ Đánh giá chất lượng thuốc qua việc xác định hàm lượng tạp chất, hàm lượng hoạt chất
hoặc nhóm hoạt chất của dược liệu.
+ Đánh giá hiệu quả của quy trình bào chế cổ truyền về mặt lý hóa(
+ Và cả mặt sinh học tùy trường hợp) dẫn tới sự thay đổi về hiệu lực của thuốc, về độc tính
cảu thuốc và về thời gian bảo quản thuốc.
Đối với các lồi thuốc gồm nhiều vị, phải chọn ít nhất 2, 3 vị chủ yếu để xác định sự có mặt của
hoạt chất đặc trưng. Nếu có thể xác định hàm lượng một số hoạt chất lựa chọn, đặc biệt đối với
những bài thuốc có những vị đắt tiền( để tránh giả mạo) và những vị có độc( để đảm bảo sự an
toàn cho người dùng)

20