Nghiên Ứu Khả Năng Phân Hủy Miroystin Ủa Vi Khuẩn Nướ Sphingomonas.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

Lê Th Hu

NGHIÊN CU KH NĂNG PHÂN HY MICROCYSTIN CA VI
KHUN NƯC Sphingomonas

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
K THUẬT MÔI TRƯNG

Hà Nội – Năm 2014

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17062857888481000000 1e4d8ec


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

Lê Th Hu

NGHIÊN CU KH NĂNG PHÂN HY MICROCYSTIN CA VI KHUN
NƯC Sphingomonas

Chuyên ngành : K THUẬT MÔI TRƯNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
K THUẬT MÔI TRƯNG

NGƯI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. TS. Nguyn Th Hoi H

Hà Nội – Năm 2014


LỜI CẢM ƠN
Đ hon thnh chương trnh cao hc v vit lun văn ny, ngoi s n lc ca
bn thân, tôi đ nhn được s hướng dẫn, gip đ, đng viên v góp ý nhiệt tình ca
nhiu tp th v c nhân.
Qua đây, tôi xin chân thành cm ơn cc thầy cô gio Viện Khoa hc v Công
nghệ Môi trưng - Đi hc Bch Khoa H Ni đ nhiệt tình ging dy và truyn đt
cho tôi những kin thức quý báu, bổ ích v gip đ tơi trong suốt khóa hc vừa qua
cũng như to điu kiện cho tơi hồn thành lun văn tốt nghiệp này.
Với lòng bit ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cm ơn ngưi hướng dẫn khoa hc:
TS. Nguyễn Thị Hồi Hà - Phịng Sinh hc To - Viện Vi sinh vt và Công nghệ Sinh
hc - Đi hc Quốc gia Hà Ni đ dnh rất nhiu thi gian và tâm huyt hướng dẫn và
giúp tôi hồn thành lun văn tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cm ơn TS. Đặng Minh Hằng - Viện Khoa hc v Công
nghệ Môi trưng - Đi hc Bch Khoa H Ni đ quan tâm, gip đ, to điu kiện đ
tôi thc hiện và hồn thành lun văn tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cm ơn Th.S Phm Thị Bích Đo cn b Phng sinh hc
To, nhóm tác gi đ tài mã số: 01C-09/01-2012-2 v cc cán b Viện Vi sinh vt và
Công nghệ Sinh hc - Đi hc Quốc gia Hà Ni đ to điu kiện, tn tình gip đ tơi
trong suốt q trình làm lun văn vừa qua..
Nhân đây, tơi xin chân thnh by tỏ lòng bit ơn tới gia đnh, bn bè cng cc
anh, chị, em đ đng viên, gip đ tơi trong suốt q trình hc tp, đ nhiệt tnh đóng
góp ý kin đ lun văn ca tơi thêm hon thiện.
Mặc d tơi đ có nhiu cố gắng hon thiện lun văn bằng tất c s nhiệt tnh v
năng lc ca mnh, tuy nhiên không th trnh khỏi những thiu sót, rất mong nhn

được những đóng góp quý bu ca quý thầy cô v cc bn.
Hà Ni, thng 03 năm 2014.
Hc viên

Lê Thị Huệ
󰈨󰈨

i


󰉼 󰈖󰈖 󰈖

MC LC
MỞ ĐẦU..................................................................................................................................................................... 2
Chương 1. TỔNG QUAN........................................................................................................................................ 5
1.1. To lam Microcystis ............................................................................................................................................ 5
1.2. Đc tố mcirocystin (MC) ................................................................................................................................... 8
1.2.1. Đặc đim, cấu trc ca microcystin .............................................................................................................. 8
1.2.2. Đc tính ca microcystin...............................................................................................................................11
1.2.2.1. Ảnh hưởng đc hi ca microcystin lên cc loi đng vt thy sinh ..................................................13
1.2.2.2. Ảnh hưởng đc hi ca microcystin lên cơ th ngưi...........................................................................14
1.3. Loi bỏ MC ha tan trong cc qu trnh xử lý nước.....................................................................................15
1.3.1. Quang phân .....................................................................................................................................................15
1.3.2. Qu trnh khử bằng ozon ...............................................................................................................................15
1.3.3. Khử bằng clo ...................................................................................................................................................15
1.3.4. Lc bằng carbon hot tính.............................................................................................................................17
1.3.5. Lc chm .........................................................................................................................................................19
1.3.6. Phân hy sinh hc MC..................................................................................................................................21
1.4. Vi khuẩn phân hy MC....................................................................................................................................21
1.4.1. Vi khuẩn dị dưng Sphingomonas.............................................................................................................21

1.4.2. Cơ ch phân hy đc tố microcystin ca Sphingomonas ........................................................................24
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................................................26
2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................................................................26
2.1.1. Đối tượng v thi gian nghiên cứu...............................................................................................................26
2.1.2. Hóa chất ...........................................................................................................................................................26
2.1.3. Mơi trưng ni cấy.......................................................................................................................................26
2.1.4. My móc, dụng cụ..........................................................................................................................................27
2.2. Phương php nghiên cứu..................................................................................................................................27
2.2.1. Phân lp VKDD từ nước hồ nở hoa............................................................................................................27
2.2.2. Nghiên cứu đặc đim sinh lý, sinh ho........................................................................................................27
2.2.2. 1. Nhum Gram..............................................................................................................................................27
2.2.2.2. Phn ứng Catalase .......................................................................................................................................28
2.2.2.3. Phn ứng Oxidase .......................................................................................................................................29
2.2.3. Phân loi 16S rDNA ......................................................................................................................................29
2.2.4. Phương php nghiên cứu enzyme protease ...............................................................................................31
2.2.4.1. Nuôi VKDD đ thu nhn enzyme ..........................................................................................................31
2.2.4.2. Xc định hot đ protease theo phương php Anson ci tin ..............................................................31
2.2.4.3. Điện di protease trên gel polyacrylamit có SDS (SDS-PAGE) theo phương php Heusen v
Dowdle [27] ...................................................................................................................................................32
2.2.5. Nghiên cứu nh hưởng ca cc điu kiện nuôi đn s phân hy microcystin......................................33
2.2.5.1 Ảnh hưởng ca nhiệt đ..............................................................................................................................33
󰈨󰈨

ii


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

2.2.5.2. Ảnh hưởng ca nồng đ microcystin.......................................................................................................33
Xc định hm lượng microcystin trên my quang phổ.......................................................................................34

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................................................................35
3.1. Kho st mức đ ph dưng trong hồ Hon Kim......................................................................................35
3.2. Sng lc v tuyn chn VKDD phân hy microcystin từ nước hồ Hon Kim, H Ni ....................36
3.2.1. Phân lp cc chng VKDD từ nước hồ Hon Kim...............................................................................36
3.2.2. Sng lc VKDD có kh năng phân hy đc tố microcystin ...................................................................39
3.2.3. Đặc đim sinh hc v hnh dng t bo ca VKDD S1..........................................................................42
3.2.3.1. Đặc đim hnh thi t bo ca VKDD S1 ..............................................................................................42
3.2.3.2. Ảnh hưởng ca điu kiện nuôi cấy đn sinh trưởng ca VKDD S1 .................................................42
3.2.4. Xc định trnh t đon gen 16S rDNA ca VKDD S1 .........................................................................45
3.3. Nghiên cứu enzyme phân hy đc tố microcystin ca Sphingomonas sp., S1 .......................................48
3.3.1. Ảnh hưởng ca pH đn hot đ protease ...................................................................................................48
3.3.2. Ảnh hưởng ca nhiệt đ đn hot đ protease...........................................................................................49
o
C .............................................................................................51
3.3.3. Đ bn với nhiệt theo thi gian xử lý ở 60
3.3.4. Ảnh hưởng ca cc chất ức ch đặc hiệu đn hot tính enzyme protease .............................................52
3.3.5. Ảnh hưởng ca ion kim loi đn hot tính enzyme protease...................................................................53
3.3.6. Phân tích thnh phần protease bằng điện di................................................................................................54
3.4. Kh năng phân hy MC ca VKDD Sphingomonas sp., S1 ....................................................................56
3.4.1. Ảnh hưởng ca nhiệt đ................................................................................................................................56
3.4.2. Ảnh hưởng ca số lượng vi khuẩn...............................................................................................................59
3.4.3. Ảnh hưởng ca nồng đ microcystin..........................................................................................................60
KẾT LUẬN...............................................................................................................................................................63
KIẾN NGHỊ..............................................................................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................................................................65
PH LC 1...............................................................................................................................................................69

󰈨󰈨

iii

 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

DANH MC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Các chữ vit tắt

Tên đầy đ

BOD

Biochemical oxygen dermand - Nhu cầu oxy sinh hc

COD

Chemical oxygen demand - Nhu cầu oxy hóa hc

DO

Oxygen demand – Hm lượng oxy hịa tan

DNA

Deoxyribonucleic acid

DMSO

Dimethyl Sulfoxide

EDTA

Ethylen diamine tetraacetic acid
Median lethal dose – Liu lượng gây cht 50% số sinh vt
thí nghiệm

LD50
MC

Microcystin

MC-LR

Leucine and arginine in the positions of X and Z of
microcystin

MC-RR

Arginine and arginine in the positions of X and Z of
Microcystin

MC-YR

Tyrosine and arginine in the positions of X and Z of
Microcystin

Ophe

O –Phenanthroline

PCMB

p- Chloromer curibenzoate

PCR

Polymerase chain reaction – Phn ứng trùng hợp

PMSF
PP1 và PP2A

Phenyl methyl sulfonyl fluoride
Protein Photphataza 1 và 2A

RNA

Ribonucleic acid

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

SS
SDS

Suspended solids – Các chất lơ lửng
Sodium Dodecyl Sulphate

VKDD

Vi khuẩn dị dưng

WHO

World Heath Organisation – Tổ chức y t th giới

󰈨󰈨

iv


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

DANH MC CÁC BẢNG
Bng 1.2. Ảnh hưởng ca microcystin đn cá [28] ....................................................... 12
Bng 3.1. Đặc đim hình thái ca 5 chng VKDD phân lp từ hồ Hoàn Kim............ 37
Bng 3.2. Đặc đim sinh lý, sinh hoá ca 5 chng VKDD phân lp từ hồ Hoàn Kim 38
Bng 3.3. Ảnh hưởng ca pH đn hot đ protease ca Sphingomonas sp., S1 ........... 48
Bng 3.4. S thay đổi hot đ protease ca Sphingomonas sp., S1 theo nhiệt đ......... 50
Bng 3.5. S thay đổi hot đ protease ca Sphingomonas sp., S1 theo thi gian . xử lý
ở 60oC............................................................................................................. 51
Bng 3.6. Nồng đ microcystin còn li với s phân hy ca VKDD Sphingomonas sp.,
S1 ở các nhiệt đ khác nhau. ......................................................................... 57
Bng 3.7. Nồng đ microcystin còn li với s phân hy ca VKDD Sphingomonas sp.,
S1 có số lượng vi khuẩn khác nhau ............................................................... 59
Bng 3.8. Lượng microcystin còn li với s phân hy ca VK Sphingomonas sp., S1 ở
các nồng đ MC khác nhau............................................................................ 61

󰈨󰈨

v

 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

DANH MC CÁC HNH V Đ THỊ
Hình 1.1. Microcystis to thành váng dày nổi trên mặt nước [27] ................................. 5
Hình 1.2. Tp đon t bào Microcystis (×40) .................................................................. 5
Hình 1.3. Mơ hình cấu trúc hóa hc ca microcystin [11] .............................................. 9
Hình 1.4. Mơ hình cấu trúc hoá hc ca đc tố MC – LR [46] ..................................... 10
Hình 1.5. Mơ hình cấu trúc hố hc ca đc tố MC – RR [46] ..................................... 10
Hình 1.6. Mơ hình cấu trúc hố hc ca đc tố MC – YR [46] .................................... 11
Hình 1.7. Vi khuẩn dị dưng Sphingomonas dưới kính hin vi điện tử [45] ............... 22
Hnh 1.8. Con đưng phân hy microcystin bằng Sphingomonas [39] ........................ 25
Hnh 2.1. Địa đim thu mẫu hồ Hoàn Kim - Địa đim A [47]. ................................... 26
Hnh 3.1. Hnh thi khuẩn lc chng VKDD S1 ........................................................... 37
Hnh 3.2. Hnh thi khuẩn lc chng VKDD S2 ........................................................... 37
Hnh 3.3. Hnh thi khuẩn lc chng VKDD S3 ........................................................... 38
Hnh 3.4. Hnh thi khuẩn lc chng VKDD S4 ........................................................... 38
Hnh 3.5. Hnh thi khuẩn lc chng VKDD S5 ........................................................... 38
Hnh 3.6. Kh năng phân hy MC ca 7 VKDD phân lp từ hồ Hoàn Kim ............... 41
Hnh 3.7. Hnh dng t bo VKDD S1 dưới kính hin vi điện tử (SEM×60.000) ....... 42
Hnh 3.8. Đng thi sinh trưởng VKDD S1 .................................................................. 43
Hnh 3.9. Ảnh hưởng ca nhiệt đ nuôi cấy đn VKDD S1 ......................................... 43
Hnh 3.10. Ảnh hưởng ca pH lên VKDD S1 .............................................................. 44
Hnh 3.11. DNA tổng số ca VKDD S1........................................................................ 45
Hnh 3.12. Sn phẩm PCR nhân đon gene 16S rDNA ca VKDD S1 ........................ 45
Hnh 3.13.Cây ph hệ da trên phân tích gii trình t 16S rDNA ca
VKDD S1, S2 và các lồi có quan hệ h hàng gần(2*) ................................ 47
Hnh 3.14. Ảnh hưởng ca pH đn hot đ protease ở Sphingomonas sp.,S1 .............. 49
Hình 3.15. Ảnh hưởng ca nhiệt đ đn hot đ protease ở Sphingomonas sp.,S1 ...... 50

󰈨󰈨

vi


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

Hnh 3.16. S bin đổi hot đ protease ca Sphingomonas sp., S1 theo thi gian xử lý
ở 60oC .......................................................................................................... 51
Hnh 3.17. Ảnh hưởng ca chất ức ch đặc hiệu nhóm đn hot đ protease ca
Sphingomonas sp.,S1 ................................................................................... 53
Hnh 3.18. Ảnh hưởng ca các ion kim loi hóa trị hai đn hot đ protease
Sphingomonas sp.,S1(3*) ............................................................................... 54
Hnh 3.19. Điện di trên gel polyacrylamit 10% có SDS và gelatin 0,1% các protease
ca Sphingomonas sp., S1 ........................................................................... 55
Hnh 3.20. Điện di trên gel polyacrylamit 10% có SDS và gelatin 0,1% các protease
ca Sphingomonas sp., S1 được khôi phục bởi ion Ca2+ ............................. 55
Hnh 3.21. Điện di trên gel polyacrylamit 10% có SDS và gelatin 0,1% các protease
ca Sphingomonas sp., S1 được khôi phục bởi ion Mg2+(3*) ....................... 56
Hnh 3.22. S phân hy microcystin bởi VKDD Sphingomonas sp. S1 ở
nhiệt đ 10, 15, 20, 25, 30 và 35°C ............................................................. 58
Hnh 3.23. Tốc đ phân hy sinh hc microcystin bởi số lượng VKDD Sphingomonas
sp. S1 khác nhau .......................................................................................... 59
Hnh 3.24. Phân hy sinh hc microcystin bởi VKDD Sphingomonas sp., S1 nồng đ
MC khác nhau (1, 10, 20 và 50 µg/ml) ........................................................ 61
PH LC
Hình 1. Bin đng pH trung bình ca mẫu nước hồ Hoàn Kim tháng 3, 4, 5/2012 ...... 2
Hình 2. Bin đng DO trung bình ca mẫu nước hồ Hoàn Kim tháng 3, 4, 5/2012 ..... 3
Hnh 3.Bin đng COD trung bình ca mẫu nước hồ Hồn Kim tháng 3, 4, 5/2012 .. 4

Hình 4. Bin đng BOD
5 trung bình ca mẫu nước hồ Hồn Kim tháng 3, 4, 5/2012 . 5
+
Hình 5. Bin đng NH
4 trung bình ca mẫu nước hồ Hồn Kim tháng 3, 4, 5/2012 ... 6
Hình 6. Bin đng NO
2 trung bình ca mẫu nước hồ Hoàn Kim tháng 3, 4, 5/2012 .. 6
2Hình 7. Bin đng NO
3 trung bình ca mẫu nước hồ Hoàn Kim tháng 3, 4, 5/2012 .. 7
3Hnh 8. Bin đng PO
4 trung bình ca mẫu nước hồ Hồn Kim tháng 3, 4, 5/2012 .. 8

Hnh 9. Bin đng SS trung bình ca mẫu nước hồ Hồn Kim tháng 3, 4, 5/2012...... 8

󰈨󰈨

vii


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

MỞ ĐẦU
Hiện nay, trên th giới xử lý đc tố vi to lam trong thi kỳ nở hoa nước đang
được các quốc gia quan tâm đặc biệt. Đ có khơng ít cc cơng trnh nghiên cứu hiện
tượng nở hoa nước và gim thiu tác hi ca đc tố to lam gây đc, tuy nhiên kt qu
vẫn còn ở các mức đ khác nhau. Hồ Hồn Kim_ địa danh nổi ting ca th đơ là mt
hồ nơng, kín, chất lượng nước thay đổi dẫn tới s suy gim mt số loài vi to đặc hữu,
đồng thi gia tăng mt đ ca vi to lam sinh đc tố và gây nên những lo ngi v môi
trưng cho khu hệ đng thc vt sống trong hồ.
Trong số các loài vi to lam gây nở hoa nước hồ Hoàn Kim, Microcystis

aeruginosa Kutzing là loài bắt gặp thưng xuyên và phổ bin nhất. Microcystis
aeruginosa chứa đc tố thuc nhóm hepatotoxin (đc tố gan) cấu to từ các peptid
mch vòng có tên gi là microcystin (MC) [27,43]. Chng l cc heptapeptide mch
vng có chứa 1 amino acid đặc hiệu (Adda) chui bên. Cho đn nay, đây l những
dng cấu trc đặc biệt chỉ gặp ở microcystin. Microcystin có hơn 90 đồng phân, chúng
khc nhau ở cc nhóm methyl (R1 v R2) v 2 amino acid (ở vị trí X v Z) bên trong
chui. Từ đó dẫn đn s khc nhau v cấu trc bc 4, tính đc cũng như cc đặc tính ưa
nước hoặc kỵ nước. Có 4 loi đc tố MC-YR, MC-RR, MC-YA, MC-LR, trong đó
MC-LR phổ bin v có tính đc cao nhất. Khi vo gan, microcystin sẽ ức ch
hepatocyte protein photphat PP1 v PP2A, từ đó gây ra siêu phosphoryl ho
cytokeratin v dẫn đn s ph v cc vi sợi, thot dịch t bo v chy mu gan đng
vt. S tip xc lâu di với nồng đ microcystin thấp trong nước uống làm nh hưởng
đn cc cấu trc t bo, qu trnh nguyên phân dẫn đn kích thích gây ung thư gan ở
ngưi. Năm 1989, WHO đ triệu tp mt nhóm chuyn gia Quốc t đ có ci nhn tổng
quan nhất v lĩnh vc ny v đưa ra mức giới hn nồng đ đc MC-LR trong nước
uống l 1,5g/l. Song công bố gần đây nhất, mức giới hn MC-LR trong nước uống
được lm trn xuống mt chữ số là 1,0g/l, đ đm bo sức khoẻ con ngưi.
Microcystin thưng tích luỹ trong ni quan t bào hoặc dưới dng t do trong
nước. Việc loi bỏ microcystin trong nước có th thc hiện bằng nhiu phương php
khc nhau trong đó phương php sinh hc đang được th giới quan tâm. Xử lý
microcystin trong nước bằng vi khuẩn dị dưng (VKDD) bn địa sẽ không làm thay
󰈨󰈨

2


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

đổi thành phần loi qua đó gip gim thiu nguy cơ suy gim đa dng sinh hc. Ngồi
ra, việc tìm ra VKDD bn địa có kh năng phân hy microcystin cao sẽ mở ra trin

vng xử lý microcystin ti nguồn, gim thiu s lưu hnh ca đc tố này, gim nguy cơ
đối với sức khỏe con ngưi và hệ sinh thái. Từ những yu tố trên cho thấy, xử lý
microcystin bằng biện pháp sinh hc mang tính bn vững cao.
Với mong muốn góp thêm mt công cụ trong xử lý đc tố to lam ở hồ Hồn
Kim, tơi thc hiện đ tài: “Nghiên cứu kh năng phân hy microcystin ca vi
khun nưc Sphingomonas”. Lun văn ny được thc hiện trong khuôn khổ đ tài
cấp Thành phố Hà Ni “Nghiên cu xây dng quy trnh phân hy đc t microcystin
ca to lam Microcystis aeruginosa bng vi khun d dưng nhm bo v nưc hồ
Hoàn Kiếm, Hà Ni” mã số đ tài: 01C-09/01-2012-2, ch nhiệm đ tài TS. Nguyễn
Thị Hồi Hà.
A. Mục tiêu
Tìm và tuyn chn vi khuẩn dị dưng (VKDD) Sphingomonas trong nước hồ
Hoàn Kim, đnh gi kh năng phân hy đc tố microcystin ca chúng.
B. Nội dung
Lun văn gồm các phần mở đầu, kt lun, kin nghị v 03 chương ni dung:
Tổng quan, phương php nghiên cứu, kt qu và tho lun. Kt qu được trình bày
trong chương 3, trong đó:
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. To lam Microcystis
1.2. Đc tố mcirocystin (MC)
1.3. Loi bỏ MC hịa tan trong các q trình xử lý nước
1.4. Vi khuẩn phân hy MC
Đ vit phần tổng quan tác gi đ nhn được s chỉ dẫn, góp ý nhiệt tình, tn
tâm ca ngưi hướng dẫn khoa hc TS. Nguyễn Thị Hồi Hà, Th.S Phm Thị Bích
Đo, nhóm tc gi đ tài 01C-09/01-2012-2 và các thành viên ca phòng Sinh hc To,
Viện Vi sinh vt và Công nghệ Sinh hc, Đi hc Quốc Gia Hà Ni. Ni dung phần
tổng quan tác gi đ trnh by có mang tính k thừa đ tài 01C-09/01-2012-2.

󰈨󰈨

3


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trình bày các phương pháp được tác gi sử dụng trong quá trình nghiên cứu.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kho st v đnh gi mức đ ph dưng ca hồ Hoàn Kim (Bng 1 phụ lục 2)
tác gi k thừa kt qu ca nhóm tác gi đ tài 01C-09/01-2012-2;
3.2. Sàng lc và tuyn chn VKDD phân hy microcystin từ nước hồ Hoàn Kim, Hà
Ni: tác gi phân lp tuyn chn được 5 chng VKDD từ nước hồ HOàn Kim có kh
năng phân hy MC. Định danh được 2 VKDD thuc chi Sphingomonas
- Mục 3.2.4. Xc định trình t đon gen 16S rDNA v định danh VKDD S1, S2
tác gi tham gia cùng Th.S.. Phm Thị Bích Đo, TS. Nguyễn Thị Hồi Hà
3.3. Nghiên cứu enzyme phân hy đc tố microcystin ca Sphingomonas sp., S1:
Nghiên cứu tính chất, hot đ protease ca enzyme VKDD Sphingomonas sp., S1
- Mục 3.3.5. Ảnh hưởng ca ion kim loi đn hot tính enzyme protease ca
Sphingomonas sp., S1
- Mục 3.3.6. Phân tích thành phần protease bằng điện di tác gi tham gia cùng
Th.S. Phm Thị Bích Đo, TS. Nguyễn Thị Hoài Hà
3.4. Kh năng phân hy MC ca VKDD Sphingomonas sp., S1
Các kt qu tác gi trình bày trong lun văn đ được s đồng ý cho phép ca
ch nhiệm và nhóm tác gi đ tài mã số 01C-09/01-2012-2.
Trong quá làm lun văn tác gi tin hành thí nghiệm cùng nhóm đ tài 01C09/01-2012-2 và nhn được s giúp đ ca TS. Nguyễn Thị Hồi Hà, Th.S Phm Thị
Bích Đào cùng các thành viên trong nhóm đ tài 01C-09/01-2012-2.
Lun văn đ sng lc, tuyn chn được 5 chng vi khuẩn dị dưng có kh
năng phân hy microcystin từ nước hồ Hon Kim, trong đó có 2 chng thuc chi
Sphingomonas; Nghiên cứu tính chất, hot đ protease ca enzyme VKDD
Sphingomonas sp., S1 và kh năng phân hy đc tố microcystin ca VKDD

Sphingomonas sp., S1 được phân lp từ nước hồ Hon Kim.
Từ kt qu thu được, lun văn góp phần to tin đ cơ sở cho các nghiên cứu
sâu hơn đ xử lý đc tố microcystin trong hồ Hồn Kim nói riêng và các thy vc
ngồi t nhiên nói chung.
󰈨󰈨

4


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tảo lam Microcystis
Trong các loài to lam sinh ra microcystin thì Microcystis là loi thưng gặp
nhất trong các thy vc. Chi Microcystis khác với các chi khác ca to lam ở đặc đim
cơ th là mt tp đon gồm nhiu t bào dính, giống nhau, nằm trong mt bc nhày,
mắt thưng có th nhìn thấy tp đon như những ht trứng cá lơ lửng trong nước. Đó l
những tp đon có kích thước từ 40 – 250μm, gồm nhiu t bào hình cầu hợp li [43].

Hình 1.1. Microcystis to thnh vng dy Hnh 1.2. Tp đon t bo Microcys
nổi trên mặt nước [27]
(×40)
T bào ca chi Microcystis tồn ti trong nước như những sinh vt phù du.
Microcystis thuc chi không có kh năng cố định nitơ ca to lam. Khi nở hoa thì to
thành những lớp váng nổi trên mặt nước, được lan rng ra bởi gió, bn vững trên mt
vùng nhất định và chim ưu th trong suốt c năm. Các t bào ca Microcystis rất đơn
gin và có th thay đổi trong suốt cc giai đon sinh trưởng khc nhau. Cc đặc đim
siêu cấu trc dưng như kh tương đồng cho tất c các loi hình thái [27]. Thành t bào
được chia thành 3 phần, to thành 3 dng tầng peptidoglycan. Đó l cc tầng có tác
dụng bo vệ phía ngồi, sàng lc phân tử, bẫy các ion và phân tử, thc đẩy q trình

bám dính ca t bo. Nó cũng l lớp vỏ vững chắc, l cc khung đ định dng và duy
trì hình dng t bào [27].
Các ht trong ni bào hầu như chứa toàn b các vt chất d trữ ca t bào
Micorocystis. Các không bào khí là mt đim đặc trưng ca chi Microcystis, chức năng
chính ca khơng bào là làm cho t bào nổi lên, thích nghi với s thay đổi ca cc điu
󰈨󰈨

5


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

kiện môi trưng trong ct nước. Không bào được phát trin từ các cấu trúc có hình nón
đơi nhỏ, những cấu trc ny được to thành từ q trình mã hóa protein phức tp bởi
các gen ở trong nhân. B mặt các không bào cho phép các khí ngoi bào thấm qua t
do cho đn khi thành phần các khí ni bào và ngoi bào cân bằng nhau. Khơng bào khí
là những cấu trúc rắn chắc, chim th tích lớn trong t bào, có th gim đi khi áp suất
thấp, còn khi áp suất cao hơn th chng bị v ra v khi đó t bào mất đi kh năng nổi
lên. Microcystis sinh sn theo hình thức phân đơi t bào. S sinh sn ca Microcystis
chỉ được nhn thấy khi có s phân rã ca các t bo ban đầu, trong các tp đon to nhỏ
và c trong các t bo đơn.
Cc điu kiện thun lợi cho s sinh trưởng phát trin ca to lam dẫn đn s nở
hoa ca Microcystis trong nước là s kt hợp ca các yu tố: điu kiện chiu sng đầy
đ, nhiệt đ nước phù hợp (khong 15 – 30ºC), pH ca nước có giá trị từ trung tính đn
kim (pH = 6 – 9), nước trong các thy vc bị t đng, thy vc trong tình trng nước
thiu oxy, hm lượng chất dinh dưng cao, hm lượng N và P lớn, trong điu kiện gió
nhẹ hoặc khơng có gió dẫn đn s phân tầng nước trong thy vc. Nước chứa các lồi
Microcystis gây đc thưng có mùi tanh, sinh khối ca Microcystis sau khi sấy khơ có
mùi tanh hắc.
Các hợp chất trong to lam là các chất giàu hot tính sinh hc, nó có th là các

chất gây cn trở s phân bào, chống ung thư, ức ch enzyme, kháng sinh, chống virus
và chống nấm. Vi to lam được bit đn nhiu nhất trong vai trò là chất to ra đc tố
gây ra các nh hưởng có hi đối với con ngưi. Cc đc chất to lam có th được phân
loi thành 3 nhóm lớn theo cấu trúc hóa hc như sau: cc peptid vng, cc alkaloid và
các lipopolysaccharide. Tuy nhiên, cc đc chất cũng có th được phân loi thành 5
nhóm lớn da vo cc đặc tính sinh lý, cc cơ quan, b phn, các t bào chịu tc đng
ban đầu, bao gồm: các chất đc thần kinh, các chất đc gan, các chất đc t bào, các
chất đc da, các chất kích thích và các chất đc đưng tiêu hóa [8,10,43].
Phân tích mẫu nước ca hồ Ha Kim H Ni xc định được 35 taxon loài
thuc 26 chi trong đó:To lam (Cyanophyta): 10 chi, 12 lồi; To lục (Chlorophyta):
12 chi, 19 loài; To silic (Diatomae): 2 chi, 2 loài; To mắt (Euglenophyta): 2 chi, 2

󰈨󰈨

6


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

lồi [3]. Trong đó, các vi to lam thuc chi Microcystis là những b chỉ thị ô nhiễm v
l vi to gây nở hoa nước ở hồ Hon Kim.
Loại bỏ tế bào tảo lam trong các quá trình xử lý nước
Mt cch đơn gin đ gim thiu tối đa microcystin trong thy vc là loi bỏ
các t bào to lam trong phm vi xử lý nước lớn bằng cách sử dụng các vt cn hn ch
s di chuyn ca các váng hoặc các dụng cụ vớt đ thu gom lượng lớn t bào. Có
những phương php khc đ loi bỏ các t bào to lam, được thit k đ gim s phá
v t bào và gii phóng đc chất. Q trình xử lý nước sử dụng s kt tụ (s đng tụ/s
kt ta bông) và lc là có hiệu qu trong loi bỏ các t bào to lam, nhưng cc MC ha
tan được gii phóng từ các t bo, khơng được loi bỏ mt cách hiệu qu bởi những
phương php ny [16]. Các chất hóa hc tốt nhất cho s kt tụ là những chất ngăn ngừa

s phá v t bào và gii phóng đc chất vo nước. S kt tụ liên quan đn việc làm mất
tính ổn định ca các thành phần, như l cc t bào to lam, bằng cách trung hòa s trao
đổi b mặt ca chúng, to ra s kt tụ trong mt lượng lớn các t bào. Các chất hóa hc
như cc hợp chất ca bazơ – Fe v bazơ – Al được sử dụng [12]. Chow đ chứng minh
rằng s kt ta bông sử dụng FeCl
3 không gây phá v các t bào to lam, hoặc lm tăng
hm lượng MC ha tan đối với Microcystis aeruginosa và Anabaena circinalis[16].
Hơn nữa, hm lượng tối ưu ca những hợp chất hóa hc này trong việc loi bỏ các t
bào to lam mà không làm v t bo, v gia tăng hm lượng đc chất ngoi bào [19].
Lc là mt bước quan trng trong loi bỏ các t bào to lam và các thành phần
vt chất to lam. Hầu ht thit bị lc thưng sử dụng các thnh phần như l ct thô,
than antracid nghin nhỏ, hoặc granit. Phương php lc ct nhanh được sử dụng sau khi
thc hiện quá trình đông tụ, lưu giữ khong 14% các t bào to lam được loi bỏ, lc
chm có th loi bỏ tới hơn 85% cc t bào to lam cũng như là mt lượng đng k các
chất đc ca chng, như MC-LR, MC-RR và MC-YR (tốc đ loi bỏ từ 43 đn 99%)
[14]. Tuy nhiên, trong mt vi trưng hợp xử lý nước có nhiu thc vt có th lc m
khơng kt hợp cng keo tụ, và các t bào to lam, nu có mặt với hm lượng cao, có
th gây tắc hệ thống lc [12]. Đầu lc không đ thô đ chống li s tắc nghẽn mt cách
nhanh chóng, sẽ khơng giữ li hiệu qu các t bào to lam, trong khi đó đầu lc tốt đ
đ giữ li các t bào sẽ gây tắc nghẽn nhanh chóng trong thi gian ngắn sử dụng. Do
󰈨󰈨

7


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

đó, phương php chỉ lc thôi th không được khuyn nghị sử dụng trong việc loi bỏ
các t bào to lam [12].
Tuyn nổi, là mt phương php xử lý nước thay th đ làm lắng đng, là

phương php hiệu qu đối với việc loi bỏ các vt chất kt ta, keo tụ ở mt đ thấp,
bao gồm c các t bào to lam. Tuyn nổi khơng khí hịa tan (DAF) là mt trong những
phương php thưng được sử dụng đ loi bỏ 40-80% t bào to lam [12].
S loi bỏ được thc hiện bằng cách sục khí ở áp suất khí quyn trong mt b
tuyn nổi to ra mt dịng bong bóng nhỏ, tham gia vào làm huyn phù các vt chất
hoặc các t bào, to ra s trôi nổi hoặc to thành các váng nổi trên b mặt trên các thy
vc, ti nơi m chng có th sau đó được loi bỏ bằng các thit bị vớt [16].
1.2. Độc tố mcirocystin (MC)
1.2.1. Đặc điểm, cấu trúc ca microcystin
Microcystin (MC) là các peptid vòng, có chứa 7 amino acid, cấu trúc hóa hc
(hình 1.3) là vịng (-D-Ala 1 -X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-D-Glu6-Mdha7). Trong đó, X v
Z là các L-amino acid (như Leucine (L), Arginine (R), Tyrosine (T), Alanine (A), hoặc
Methionine (M)), D-MeAsp là acid D-erytho-β-methylaspartic và Mdha là Nmethyldehydroalanin,

Adda

biu

thị

3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-

phenyldeca-4,6-dienoic acid [8,11].
S thay đổi trong cấu trúc là s thay đổi vị trí ca tất c 7 amino acid, nhưng s
thay đổi lớn nhất là s thay th ca L-amino acid tương ứng ở vị trí 2 và 4, và s tách
methyl ca D-MeAsp v Mdha tương ứng ở vị trí 3 và 7 [8,35]. Các vị trí được thay th
ở trên to ra các chất đc khác nhau trong h MC. Có hơn 90 bin th ca MC, bao
gồm các bin th chứa các amino acid và các nhóm thay th. Trng lượng phân tử ca
MC trong khong từ 900 đn 1100 Daltons (trng lượng phân tử).

󰈨󰈨

8


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

Hình 1.3. Mơ hnh cấu trc hóa hc ca microcystin [11]
Bốn loi MC được xem xét chính có nhóm amino acid khác nhau ở vị trí X và
Z. MC được đặt tên theo chữ cái vit tắt ca các amino acid X và Z ở vị trí thay th
tương ứng. Cc đc tố MC phổ bin nhất là MC – LR, MC – RR và MC –YR. Trong
đó, MC – LR là chất được nghiên cứu nhiu nhất v có tính đc mnh.
Bng 1.1. Các amino acid xuất hiện trong cấu trúc ca microcystin [11]
Các loi đc tố

Amino acidvị trí X

Amino acid vị trí Z

Trng lượng phân tử

Microcystin LA

Leucine (L)

Alanine (A)

910,06

Microcystin YR

Tyrosine (Y)

Arginine (R)

1045,19

Mi
ti RR
Microcystin LR

A i i (R)
Leucine (L)

A i i (R)
Arginine (R)

1038 2
995,17

Hầu ht đc tố MC là những loi có chứa L-amino acid kỵ nước. S thay th
các L-amino acid kỵ nước trong các vị trí X bởi các L-amino acid kỵ nước khác
(alanine, phenylanine hoặc tryptophan) duy tr tính đc, nhưng s thay th bởi các
amino acid ưa nước (như arginine) sẽ làm gim đng k đc tính. Các MC có các phần
phân cc (ưa nước) trong các vị trí ca các amino acid thay th, như MC-RR (arginine󰈨󰈨

9


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

arginine) và MC-M(O)R (methionine sulfoxyde, arginine), có đc tính thấp nhất. S
thay đổi trong những phần cịn li có th hoặc khơng nh hưởng đn tính đc [8,35,43].

Hnh 1.4. Mơ hnh cấu trc ho hc ca đc tố MC – LR [46]

Hnh 1.5. Mô hnh cấu trc ho hc ca đc tố MC – RR [46]
MC rất bn và không bị tc đng bởi các phn ứng hóa hc thơng thưng như:
phn ứng thy phân, phn ứng oxy hóa – khử, dưới cc điu kiện được tìm thấy trong
hầu ht các thy vc t nhiên. Những chất đc này bị phân hy chm ở nhiệt đ cao
(khong 40o C hoặc 104oF) cùng với pH trong khong thấp hơn 1 hoặc cao hơn 9. Cc
󰈨󰈨

10


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

phn ứng thy phân chỉ xy ra nhanh khi trong điu kiện phịng thí nghiệm khi thêm
HCl 6M và nhiệt đ cao [43].

Hnh 1.6. Mô hnh cấu trc ho hc ca đc tố MC – YR [46]
1.2.2. Độc tính ca microcystin
MC thuc nhóm đc tố gan (hepatotoxin), gây xuất huyt gan. Hầu ht các nhn
bit v đc tính ca MC là da trên những nghiên cứu trên chut nhắt và chut cống,
thí nghiệm được tin hành bằng cách tiêm MC – LR qua màng bụng chut, hoặc tiêm
trc tip vào khoang bụng chut. Trong các nghiên cứu này, MC gây cht đng vt thí
nghiệm chỉ trong vài gi. Tổn thương gan v s phá hy t bo được quan sát bằng
kính hin vi sau 20 pht khi tiêm vo đng vt thí nghiệm mt liu MC gây cht. Trong
vòng 1 gi, t bào bị phá v, mất đi cc liên kt và cấu trc bnh thưng ca gan [28].

Các nghiên cứu dịch tễ đ chỉ ra rằng, tip xúc với MC trong thi gian dài có
th gây ra ung thư gan. Trong số các MC, MC-LR là chất đc mnh, vì vy tổ chức Y
t Th giới (WHO) đ đưa ra mức nồng đ tối đa đối với MC – LR trong nước uống là
1μg/L. Gi trị LD50 _liu lượng gây cht 50% sinh vt thí nghiệm ca MC – LR đối với
chut nhắt thí nghiệm được xc định trong khong 25 đn 150 µg/kg trng lượng cơ
th (tip xúc tiêm qua màng bụng). Giá trị LD
50 đối với chut nhắt trong thí nghiệm
tip xc qua đưng tiêu hóa (uống nước) là 5000 µg/kg trng lượng cơ th, đối với mt

󰈨󰈨

11


 󰉼 󰈖   󰈖 󰈖

chng chut nhắt khác thì giá trị LD50 được xc định là 10900 µg/kg trng lượng cơ
th, và giá trị cao hơn đối với chut cống [22].
Chưa nhn thấy MC bị thy phân trong d dày bởi men peptidaza, nhưng mt
lượng lớn đng k MC – LR đ vượt qua s ngăn cn ca các men trong hệ tiêu hóa đ
được hấp thụ vào. LD 50 ca mt số loi MC khc như MC-LA, -YR, -YM tương t
như ca MC-LR, nhưng LD50 ca MC-RR cao hơn MC-LR khong 10 lần [22].
Mt số nghiên cứu đ khuyn nghị rằng MC có kh năng thc đẩy q trình to
khối u, mt số tác nhân có th khơng gây ra ung thư nhưng kích thích s phát trin ca
mt số khối u. Thng 6/2006, Cơ quan nghiên cứu Ung thư (IARC) đ xc định rằng
“MC – LR có th gây ung thư trên ngưi”, nhưng “cc chit xuất ca Microcystis
không được phân loi là chất gây ung thư đối với con ngưi”. Tuy nhiên, cc MC có
kh năng kích thích s tăng trưởng ca các t bo ung thư [28].
Bng 1.2. Ảnh hưởng ca microcystin đn cá [28]
Liu lượng

(µg/kg)

Số
lượng
liu

Thi gian
tip xúc (ngày)

Tổng liu
lượng
(µg/kg)

50

28

28

1400

Tổn thương
gan nặng

Cá chép
(chưa lớn)

400

1

1

400

Tổn thương gan
và thn nặng

Cá hồi

550

8

4

4400

Tổn thương
gan nặng

Cá rô

1150

8

4

9200

Tổn thương
gan nặng

Cá rơ phi

1200

21

21

25200

Dấu hiệu ức ch
oxy hóa trong gan

Loi cá
Cá chép
(lớn)

S nh hưởng

MC gây đc theo cơ ch như sau:
MC ức ch protein nhân chuẩn serine/threonine photphotaza I và 2A (thành
phần quan trng đ duy trì cân bằng ni mơi trong t bo) qua tương tc với các nhóm
xúc tác nhỏ ca các enzyme. Quá trình phosphoryl và dephosphoryl protein là mt quá
trình liên tục thay đổi v l con đưng quan trng trong điu chỉnh hot đng ca
protein trong t bo. Nó được xúc tác bởi men phosphataza v kinaza, do đó việc
󰈨󰈨

12