Định lượng coliform bằng mpn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TIỂU LUẬN

ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP MPN

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TIỂU LUẬN

Định Lượng Coliform Bằng
Phương Pháp MPN

TP HỒ CHÍ MINH, 2022

2


BẢNG PHÂN CƠNG NHIỆM VỤ
MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ẢNH
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU
•
•

•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

iii
iv
v
vi
7
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
8
1.1. Tổng quan về Coliform
8
1.1.1. Các đặc tính sinh học của Coliform
8
1.1.2. Phân loại
8
1.1.3. Tác hại do Coliforms gây ra
9
1.2. Tổng quan về phương pháp MPN

9
1.2.1. Định nghĩa MPN
9
1.2.2. Nguyên tắc MPN
10
1.2.3. Phương pháp MPN
10
1.2.4. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp MPN
10
CHƯƠNG 2. ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN
11
2.1. Môi trường và hóa chất sử dụng
11
2.2. Vai trị của từng thành phần
11
2.2.1. Môi trường SPW (Saline Peptone Water)
11
2.2.2. Môi trường tăng sinh chọn lọc Lauryl Sulface Trytone Broth ( LSB)
12
3


•

2.2.3. Môi trường khẳng định Brilliant Green Lactose Bile Salt
12
•
2.3. Quy trình định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN
13
•

KẾT LUẬN
19
TÀI LIỆU THAM KHẢO
20
PHỤ LỤC
21
PHỤ LỤC A: BẢNG TRA MPN
21
PHỤ LỤC B: CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM CỦNG CỐ KIẾN THỨC
26
◦

4


•

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 .1. Vi khuẩn Coliforms

8

Hình 1.2 . Ống nghiệm đục do xuất hiện khí

15

Hình 1.3 . Khuẩn lạc sau khi cấy khẳng định

16

5


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮiT
TP.HCM:
MPN:
VSV:

Thành phố Hồ Chí Minh
Most Probable Number
Vi sinh vật

6


MỞ ĐẦU
Trong thời đại đất nước phát triển và hội nhập ngày nay, đời sống của con người ngày
một nâng cao thì nhu cầu ăn uống cũng phải được nâng cao. Tuy nhiên, cuộc sống
ngày càng bận rộn, quỹ thời gian dành cho bữa tối gia đình tự nấu ngày càng hạn hẹp
nên thức ăn nhanh, ăn hàng quán, thực phẩm chế biến sẵn luôn nhan nhản khắp nơi và
biến hóa là giải pháp được nhiều người lựa chọn.
Từ đó, đồ ăn sẵn đóng vai trị quan trọng trong xã hội, vừa đáp ứng nhu cầu nhanh
chóng, vừa tiết kiệm thời gian. Tuy nhiên, về vấn đề vệ sinh thì khơng có gì đảm bảo.
Do người dân khơng kiểm sốt được quá trình chế biến nên nếu sản phẩm chế biến có
vấn đề thì cũng khơng có cách nào biết được.
Điều này có thể dẫn đến nhiều vấn đề về sức khỏe, ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình
làm việc, thậm chí có thể gây tử vong do ngộ độc thực phẩm. Vấn đề kiểm soát mức
độ vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng được chú trọng. Đánh giá mức độ vệ sinh an
tồn thực phẩm khơng phải là một việc dễ dàng và địi hỏi phải có đủ lý thuyết và kinh

nghiệm thực tế.
Đề tài "Định lượng Coliform bằng phương pháp MPN" của nhóm chúng em với mong
muốn cho mọi người hiểu rõ hơn về sự nguy hiểm của trực khuẩn Coliform đối với sức
khoẻ của con người và cách phát hiện ra nó.

7


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
◦

Tổng quan về Coliform

▪

Các đặc tính sinh học của Coliform

Coliforms là các trực khuẩn Gram âm, có hình que, sống kị khí và khơng sinh bào tử.
Có khả năng lên men mạnh mẽ lactose thành axit và sinh khí ở nhiệt độ 35 ± 2°C trong
vịng 24 hoặc 48 giờ.
Từ xa xưa chúng được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị, việc phát hiện Coliform (sinh
vật chỉ thị) cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh tiềm tàng khơng chỉ trong
nước mà cịn trong thực phẩm và đồ uống nhất định như sữa,...
Không dừng lại ở đó trong những thập kỷ gần đây, quốc tế đã sự nỗ lực bền vững
nhằm phát triển các cơng nghệ có thể cho phép phân tích tại chỗ và thường xuyên sự
hiện diện của chúng trong các mẫu có mật độ thấp.

Hình 1.1. Vi khuẩn Coliforms

▪

Phân loại

Coliform được chia làm ba nhóm chính bao gồm: tổng số vi khuẩn Coliform (TC); Vi
khuẩn Coliform trong phân (FC); E.Coli.
Tổng số vi khuẩn Coliform (TC):
Nhóm này phần lớn bao gồm các vi khuẩn vơ hại, có quan hệ gần gũi với nhau. Ngoài
chất thải của con người và động vật, tổng số vi khuẩn coliform có thể được tìm thấy
trong các môi trường như nước, thảm thực vật và đất nơi chúng sống tự do.
Coliform chịu nhiệt là những ví dụ điển hình về tổng số vi khuẩn coliform. Đây là
những coliform có khả năng lên men đường lactose ở 45 độ.

8


Vi khuẩn Coliform trong phân:
Vi khuẩn coliform trong phân là một phân nhóm của tổng số vi khuẩn coliform có thể
tìm thấy trong ruột và phân của động vật máu nóng (người, lợn, bị, chó, lợn, v.v.).
E. coli là một ví dụ điển hình cư trú trong đường ruột của động vật máu nóng và do đó
dẫn đến có mặt trong phân của động vật.
Khi ở bên ngoài cơ thể vật chủ, các sinh vật này không thể sống lâu vì sự sống cịn của
chúng phụ thuộc chủ yếu vào vật chủ.
E.Coli (Coliform):
E. coli là một nhóm phụ của vi khuẩn coliform trong phân và phần lớn bao gồm E. coli
(Escherichia coli). So với các loại khác, E. coli hầu như chỉ được tìm thấy trong ruột
của động vật máu nóng, nơi chúng có thể sống và sinh sản.
Việc phát hiện những sinh vật này trong nước là dấu hiệu của sự nhiễm bẩn phân cũng
như sự hiện diện có thể có của các sinh vật gây bệnh khác có thể bao gồm vi-rút.
Ngoài ra một số lượng lớn vi khuẩn khác thuộc nhóm Coliforms, bao gồm:
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter và Proteus thuộc về nhóm

Coliform.
▪

Tác hại do Coliforms gây ra

Coliform là tác nhân chính gây ra các triệu chứng tiêu chảy, mất nước, suy thận, rối
loạn máu, thậm chí là tử vong nếu hàm lượng vi khuẩn Coliform không đạt chuẩn của
Bộ Y Tế.
Nếu uống nước hoặc ăn phải thực phẩm có chứa vi khuẩn Coliform. Cơ thể sẽ không
biểu hiện ngay lập tức. Phải mất 3 – 4 ngày bệnh mới bắt đầu. Sẽ có một loạt các triệu
chứng như tiêu chảy, sốt nhẹ hoặc tiêu chảy từng đợt mà không sốt. Đối với em bé
hoặc người già, sức đề kháng kém rất có thể sẽ mắc phải nhiều căn bệnh nghiêm trọng.
Trong một số trường hợp nguy hiểm, một số mầm bệnh có thể lây nhiễm sang phổi,
da, mắt, hệ thần kinh, thận hoặc gân. Các tác động cũng có thể nghiêm trọng hơn, mãn
tính hoặc thậm chí gây tử vong.
◦

Tổng quan về phương pháp MPN

▪

Định nghĩa MPN

“MPN” là từ viết tắt của Most Probable Number là một phương pháp dựa trên số có
khả năng xảy ra nhất, thường được áp dụng trong thí nghiệm định tính và định lượng
mẫu nước để xác định sự hiện diện của vi sinh vật (chủ yếu là Coliform phân).
9


E.coli là chất gây ơ nhiễm phân phổ biến có trong nước và nó có thể gây bệnh nghiêm

trọng nếu xâm nhập vào cơ thể. Vì vậy, trong hầu hết các phương pháp xác
suất, E.coli được sử dụng làm “Chỉ thị ơ nhiễm” để phân tích chất lượng nước.
▪

Ngun tắc MPN

Một số có thể xảy ra nhất là một phương pháp thống kê , trong đó các kết quả được so
sánh với các bảng thống kê tiêu chuẩn. Nó liên quan đến ba bộ pha lỗng có chứa nước
dùng lên men và mẫu nước. Sự hình thành axit và khí cho thấy kết quả dương
tính. Phân tích định lượng coliform được xác định bằng cách đếm số lượng ống cho
kết quả dương tính và so sánh mẫu kết quả dương tính với dữ liệu thống kê.
▪

Phương pháp MPN

Thử nghiệm MPN liên quan đến một loạt ống nghiệm chứa nước dùng lên men, trong
đó các mẫu nước được thêm vào theo tỷ lệ xác định. Chúng ta có thể phát hiện
coliform trong mẫu nước bằng cách quan sát ống lên men để tạo ra axit và khí gas. Sự
thay đổi màu sắc trong dịch lên men (từ đỏ sang vàng) cho thấy việc sản xuất axit. Bao
gồm ba quá trình như thử nghiệm giả định, xác nhận và hoàn thành.
▪

Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp MPN

Ưu điểm:
Có thể phân tích được nhiều mẫu như mẫu thức ăn hoặc các mẫu nước như nước
đục chứa cặn, chứa bùn, bùn,...
Dễ dàng giải thích kết quả bằng cách quan sát q trình sinh khí hoặc sự phát triển của
trực khuẩn hình que gram âm.
Có thể áp dụng cho tất cả các loại nước, đây là một lợi thế so với phương pháp lọc

màng.
Nhược điểm:
Mất nhiều thời gian để có kết quả vì để xác nhận được sự hiện diện của coliforms, phải
thực hiện ba q trình xét nghiệm và cần ít nhất 5 ngày.
MPN là một phương pháp rất nhạy cảm, đôi khi có thể cho kết quả sai.
Yêu cầu nhiều ống nghiệm và nhiều dụng cụ thủy tinh để chuẩn bị môi trường.

10


•

ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

◦

Mơi trường và hóa chất sử dụng

Thực hiện định lượng Coliform bằng phương pháp MPN sử dụng 3 mơi trường và 2
hóa chất chính.
Mơitrường&hóachất
SPW

Mụcđích
Phalỗng

(SalinePeptineWater)

mẫu

LaurylSulface

Nicấy

Trytone Broh(LSB)

Coliforms

BrillantGreenLactose
BileSalt(BGBL)

Khẳngđịnh

Vaitrị
Dùng để pha lỗng mẫu và hóa chất
Cung cấp chất dinh dưỡng và tạo điều kiện
cho các VSV cần phân tích trong mẫu
sinh trưởng và phát triển giải phóng khí.
Để đảm bảo chắc chắn VSV có trong mẫu
Điều chỉnh độ pH của môi trường để cho

HCL10%

ChỉnhpH

NaOH 10%

VSV phát triển thuận lợi.

◦

◦

Vai trị của từng thành phần

▪

Mơi trường SPW (Saline Peptone Water)

Thànhphần

Hàm lượng

NaCl

1g

Peptone

8,5g

Nướccất

1lít

Vaitrị
Để duy trì sự cân bằng thẩm thấu của môi trường
Cung cấp Nitơ và các dưỡng chất cần thiết
cho quá trình sinh trưởng của sinh vật.
Giúp cho quá trình trao đổi chất, các phản ứng
diễn ra thuận lợi.

11


▪

Môi trường tăng sinh chọn lọc: Lauryl Sulface Trytone Broth ( LSB)

Thànhphần

MTnồng

MTnồng

độkép

độđơn

40g

20g

Vaitrò

Dịch thủy phân
protein

sữa

và

Cung cấp nito, năng lượng và các khoáng

protein động vật

chất cần thiết cho sự phát triển của VSV.

bằng enzym
Lactoza

10g

Đường lên men và là nguồn cung cấp

5g

năng lượng và để tăng tỷ lệ sinh trưởng

(C12H22O11.H2O)

của VSV.
Làm hệ đệm ổn định pH cho môi trường,

K2HPO4

5,5g

2,75g

là thành phần đệm để kiểm sốt độ pH

trong q trình lên men Lactose, nguồn
cung cấp quan trọng thạch bổ sung kim

KH2PO4

5,5g

2,75g

Natriclorua

10g

5g

Natrilaurylsulfat

0,2g

0,1g

loại.
Cung cấp khoáng chất cần thiết cho MT
ni cấy VSV và đóng vai trị làm hệ đệm
duy trì 1 pH ổn định cho MT.
Giúp cho quá trình trao đổi chất, các phản

Nước

1000ml

1000ml

ứng diễn ra thuận lợi.

▪
▪

Môi trường khẳng định: Brilliant Green Lactose Bile Salt
Thànhphần
Dịchthủyphâncasein
Bằng enzym
Lactoza (C12H22O11.H2O)

Hàm lượng
10g

chất cần thiết cho sự phát triển của VSV.
Đường lên men và là nguồn cung cấp

10g

Mậtbịkhơ

20g

Lụcsáng

0,0133g

Vaitrị
Cung cấp nito, năng lượng và các khoáng

năng lượng và để tăng tỷ lệ sinh trưởng.
Kích thích sự phát triển của hệ VSV có
trong mơi trường.
Ức chế sự xuất hiện các VSV khơng
mong muốn
12


Nước

Giúp cho quá trình trao đổi chất, các

1000g

phản ứng diễn ra thuận lợi.

▪
◦

Quy trình định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN

Tham khảo theo TCVN 4882:2007 ISO 4831:2006 về VI SINH VẬT TRONG THỰC
PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH
LƯỢNG COLIFORM - KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CĨ XÁC SUẤT LỚN NHẤT nhóm
thực hiện quy trình định lượng gồm 4 bước:
- Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng
- Cấy và ủ

- Phép thử khẳng định
- Tính tốn và biểu thị kết quả
Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng
Giai đoạn chuẩn bị mẫu thử:
+ Tiến hành cân mẫu rắn hoặc đong mẫu lỏng của phần mẫu đại diện
+ Sau đó cho mẫu vào bao PE vơ trùng hoặc bình tam giác cùng với dung dịch pha
loãng SPW 90ml hoặc 225ml
+ Cuối cùng đồng nhất bằng máy dập mẫu trong một phút đối với mẫu huyền phù hoặc
lắc đều bình tam giác từ 2-3 phút đối với mẫu lỏng.
Giai đoạn pha loãng mẫu: Chuẩn bị một số độ pha loãng đủ để đảm bảo rằng các ống
tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính.
Vai trị của mơi trường Saline Peptone Water (SPW) ở bước pha loãng mẫu:
- Là môi trường tiền tăng sinh được sử dụng vào giai đoạn trước tăng sinh chọn lọc để
phân lập Coliforms từ mẫu thí nghiệm.
- Có thành phần Peptone là chất dinh dưỡng tốt để vi khuẩn, khuẩn lạc phát triển
mạnh.
Bước 2: Cấy và ủ mẫu
Tùy thuộc vào giới hạn phát hiện yêu cầu, mà ta lấy x ml mẫu thử dạng lỏng hoặc
huyền phù ban đầu chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng
độ kép khi 1ml lọc nồng độ đơn khi x<1ml.
13


Thông thường lấy một tổ hợp ba ống đối với mỗi độ pha loãng. Tuy nhiên, đối với một
số sản phẩm và/hoặc kết quả yêu cầu độ chính xác hơn, mà có thể cần thiết phải cấy
một loạt nhiều hơn ba ống (ví dụ: năm ống). Ở bài này, chúng ta sử dụng một tổ hợp
ba ống đối với mỗi độ pha lỗng cho các bước tiến hành dưới đây.
Vì có 2 trường hợp lấy mẫu, nên ta chia cách tiến hành cấy và ủ thành hai trường hợp
như sau:

- Lấy mẫu trong khoảng từ trên 1 ml đến 10 ml
+ Lấy 3 ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép. Dùng pipet vô trùng chuyển
10ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 10ml huyền phù ban đầu, nếu các sản phẩm ở
dạng khác vào từng ống trên.
+ Đối với mỗi độ pha loãng tiếp theo, tiếp tục như bước trên. Sử dụng mỗi pipet vô
trùng cho mỗi độ pha lỗng. Trộn kỹ dịch cấy với mơi trường.
+ Để trong tủ ấm ở 30⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.C hoặc 37⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.
- Lấy mẫu bé hơn hoặc bằng 1ml
+ Lấy 3 ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn. Dùng pipet vô trùng chuyển
1ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 1ml huyền phù ban đầu, nếu các sản phẩm ở dạng
khác vào từng ống trên.
+ Đối với mỗi độ pha loãng tiếp theo, tiếp tục như bước trên. Sử dụng mỗi pipet vô
trùng cho mỗi độ pha lỗng. Trộn kỹ dịch cấy với mơi trường.
+ Để trong tủ ấm ở 30⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.C hoặc 37⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h, hoặc nếu ở giai
đoạn này mà không thấy sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí thì ủ
tiếp 24h ± 2h.
Màu của khuẩn lạc trên môi trường LSB:
Coliforms tạo ra các khuẩn lạc có ánh kim loại màu xanh lục. Được hình thành dựa
trên việc dịch cấy được cấy trên môi trường khẳng định LSB - Canh thang mật lactoza
lục sáng.
Vai trò của môi trường Lauryl Sulface Trytone Broth (LSB) kép & đơn ở bước
cấy:
Là mơi trường có nồng độ muối cao đồng thời với sự kết hợp của vancomycin và natri
lauryl sulphat làm cho mơi trường có tính chọn lọc giúp ức chế sự phát triển của các vi
sinh vật khác và nhân lên sự phát triển của Coliform.
14


Vai trị của mơi trường (LSB) kép & đơn ở bước ủ mẫu: Với đệm phosphate có sẵn
trong thành phần đảm bảo sự tăng sinh nhanh chóng và tăng cường việc tạo khí của vi

khuẩn Coliform qua phản ứng “lên men chậm đường lactose”.
Bước 3: Phép thử khẳng định
Chuẩn bị mơi trường BGBL:
Hịa tan các thành phần trong nước cất, đun nóng nếu cần. Phân phối 10 ml mơi trường
vào từng ống nghiệm có chứa ống Durham úp ngược. Hấp khử trùng, ống Durham
khơng chứa bọt khí sau khi hấp.
Cấy và ủ mẫu:
- Dùng que cấy vòng cấy dịch cấy thu được từ ống môi trường nồng độ đơn đã đuợc ủ
ấm và có biểu hiện sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở phát hiện sinh khí, khi quan sát
lần thứ nhất (tức là sau 24h ± 2h hoặc 48h ± 2h) vào ống môi trường thử khẳng định.
Đặt vào tủ ấm ở 30⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.C hoặc 37⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.C trong 24h ± 2h, nếu khơng sinh khí ở giai đoạn này
thì ủ tiếp 24h ± 2h.
- Dùng que cấy vòng cấy dịch cấy thu được từ ống môi trường nồng độ kép sau ủ vào
ống môi trường thử khẳng định. Đặt vào tủ ấm ở 30⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.C hoặc 37 ⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.C trong 24h ± 2h, nếu
khơng sinh khí ở giai đoạn này thì ủ tiếp 24h ± 2h.
Dấu hiệu nhận biết:
Cấy riêng khuẩn lạc vào môi trường canh BGBL có ống durham, ủ ở 37 oC trong 24h.
Phản ứng là dương tính khi xuất hiện sự tạo khí (Thể tích bọt khí =1/10 thể tích ống).

Hình 1.2. Ống nghiệm đục do xuất hiện khí

Sau khi cấy và để yên khoảng 24h, khuẩn lạc màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính lớn
hơn 0,5mm, có vịng tủa muối mật

15


Hình 1.3. Khuẩn lạc sau khi cấy khẳng định

Giải thích dấu hiệu:

Khuẩn Coliform sử dụng đường trong môi trường BGBL để lên men tạo acid và khí.
Sự hiện diện của acid chứng minh qua phản ứng đổi màu, làm đục mơi trường và sự
tạo bọt khí.
Thành phần mơi trường có muối mật ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram (+) và
Brillant Green ức chế sự phát triển của lồi vi sinh vật khơng mong muốn khác.
Vai trị của môi trường khẳng định Brilliant Green Lactose Bile Salt (BGBL) ở
bước thử nghiệm khẳng định: Góp phần vào việc nhận biết, xác định đặc trưng sinh
khí của Coliforms sau khi tăng sinh tại môi trường tăng sinh chọn lọc LBS. Đồng thời
là mơi trường để phản ứng sinh khí tiếp tục diễn ra.
Bước 4: Diễn giải kết quả
Đối với mỗi độ pha loãng, đếm tổng số các ống quan sát thấy có sinh khí trong các ống
dương tính sau 24h ± 2h hoặc 48h ± 2h sau đó đem tra tại bảng MPN để xác định sự
có mặt hay khơng của Coliform và mật độ của chúng.
Xác định chỉ số MPN
Các Bảng tra MPN cung cấp các giá trị MPN và các giới hạn tin cậy 95 % cho phần
mẫu thử có 10, 15, 20 và 25 ống song song (giả sử mỗi ống được cấy cùng một thể tích
của một dung dịch pha loãng.
Để thể hiện kết quả trên lượng mẫu đối chứng (hoặc trên thể tích mẫu dạng lỏng), thì
nhân MPN và các giá trị giới hạn 95 % theo tỷ lệ khối lượng tham chiếu với khối
lượng phần mẫu thử. Không nhân độ không đảm bảo tiêu chuẩn logarit. Khối lượng
đối chứng trong phân tích vi sinh thực phẩm thường là 1 g. Khối lượng phần mẫu thử
tương ứng với lượng mẫu (tính bằng gam) có trong thể tích được dùng để cấy các ống,
ví dụ: 0,1 g nếu sử dụng 1 ml của huyền phù mẫu 10-1.
16


Ví dụ minh họa
Thực hiện phương pháp định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN dùng loạt 3
ống nghiệm ở 3 độ pha loãng liên tiếp trên mẫu sữa chua uống lên men. Qua các q
trình xử lý, ni cấy và ghi nhận phản ứng tại phép thử khẳng định ghi nhận được kết

quả như sau.
Tại 3 ống nghiệm mẫu nguyên chất ghi nhận thấy có 3 ống dương tính; tại 3 ống
nghiệm mẫu có độ pha lỗng 10 0 ghi nhận có 1 ống nghiệm dương tính và ở độ pha
lỗng 10-1 là 3 ống nghiệm dương tính.

Mang kết quả ghi nhận trên tra tại “Bảng MPN dùng cho loạt 3 ống nghiệm ở 3 độ pha
loãng liên tiếp” được số lượng Coliforms / 1ml mẫu sữa là 10,5.

17


Mang kết quả này đem tra tại Quyết Định Số: 46/2007/QĐ-BYT – Quy Định Giới Hạn
Tối Đa Ô Nhiễm Sinh Học Và Hóa Học Trong Thực Phẩm tại phần quy định giới hạn
VSV cho sản phẩm sữa lên men nhận thấy quy định chỉ tiêu Coliforms là 10/ 1ml sản
phẩm.

Từ đó kết luận được mẫu sữa chua uống lên men dùng làm thí nghiệm ko đạt yêu cầu
về chỉ tiêu Coliforms.

18


•

KẾT LUẬN

Phương pháp MPN là phương pháp sử dụng ước tính nồng độ các vi sinh vật khả thi
trong một mẫu bằng cách tái tạo sự tăng trưởng của vi sinh trong nước pha lỗng gấp
10 lần.
Phương pháp này tính toán dựa trên nguyên tắt xác suất thống kê sự phân bố vi sinh

vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu.
Qua những nội dung được tìm hiểu trên,chúng ta biết được môi trường cũng như các
tiến hành phương pháp định lượng Coliform bằng MPN.
Phương pháp định lượng bằng MPN có độ chính xác cao, được ứng dụng để kiểm tra
hàm lượng Coliform có trong các mẫu nước hoặc các mẫu thực phẩm. Với mục đích
kiểm tra hàm lượng Coliform có trong mẫu kiểm nghiệm để xác định tính an toàn của
mẫu.

19


•

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bộ môn Khoa học thực phẩm (2019), Bài giảng Phân tích vi sinh thực phẩm, Trường
Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM.
TCVN 4882:2007 ISO 4831:2006 về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn
nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng coliform - Kỹ thuật đếm số có xác suất
lớn nhất.
TCVN 11039-3:2015 về Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật Phần 3: Phát hiện và định lượng coliform và E.coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất
lớn nhất (Phương pháp chuẩn).
Williams, M. G., & Busta, F. F. (1999). TOTAL VIABLE COUNTS | Most Probable
Number
(MPN).
Encyclopedia
of Food
Microbiology,
2166–2168.
doi:10.1006/rwfm.1999.4000

Rowe R, Todd R, Waide J. Microtechnique for most-probable-number analysis. Appl
Environ Microbiol. 1977 Mar;33(3):675-80. doi: 10.1128/aem.33.3.675-680.1977.
PMID: 16345226; PMCID: PMC170744.
Edward (2010), Determination of Coliform bacteria by MPN method.
Professor Nagendra Shah (2004), School of Molecular Sciences Victoria University,
Food Microbiology Laboratory Manual.
Cara Gleeson and Nick Gray (1996) The Coliform Index and Waterborne Disease:
Problems of microbial drinking water assessment.
Microscope Master, Coliform Bacteria? Examples, Characteristics, Fecal/Total Count
Tests, Truy cập ngày 20/09/2022.

20