Định lượng enterobacteriaceae bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

TRƯỜNG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN HỌC PHẦN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG ENTEROBACTERIACEAE
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

GVHD:
Nhóm: 1

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022


TRƯỜNG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN HỌC PHẦN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG ENTEROBACTERIACEAE
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

GVHD:
Nhóm: 1
SVTH:

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022


,3
LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi cam đoan rằng báo cáo bài tiểu luận này là do chính chúng tơi thực hiện dưới
sự hướng dẫn của cô Đinh Thị Hải Thuận. Các số liệu và kết quả phân tích trong báo cáo
là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào.
TP.HCM, tháng 10 năm 2022

3


,3
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bài tiểu luận này, trước hết chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
quý thầy, cô giáo trong khoa Công nghệ thực phẩm trường Đại học Cơng nghiệp thực
phẩm Tp Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho chúng em
trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường.
Trong quá trình thực hiện đề tài chúng em đã gặp khơng ít khó khăn. Nhưng với sự động
viên giúp đỡ của quý thầy cô, người thân và bạn bè, chúng em cũng đã hoàn thành tốt đề
tài nghiên cứu của mình và có được những kinh nghiệm, kiến thức hữu ích cho bản thân.
Đặc biệt chúng em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đinh Thị Hải Thuận, người đã trực
tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ chúng em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Dù đã cố gắng nhưng không thể tránh khỏi những sai sót. Rất mong sự thơng cảm và
đóng góp ý kiến của q thầy cơ và các bạn để bài tiểu luận được hồn thiện.
Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô và các bạn sức khỏe, luôn thành công trong công
việc và cuộc sống
Chúng em xin chân thành cảm ơn!

TP HỒ CHÍ MINH, Tháng 10, 2022

4

,3
MỤC LỤC
1. MỞ ĐẦU

5

1.1 Lý do chọn đề tài

6

1.2 Mục tiêu của đề tài

6

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiêm cứu

6

1.4 Phương pháp nghiêm cứu chính

6

1.5 Ý nghĩa thực hiện của đề tài này

7

2. Tổng Quan Enterobacteriaceae

7

2.1. Nơi cư trú

7

2.2. Hình thể

8

2.3. Ni cấy

8

2.4 Tính chất sinh vật hóa học

8

2.5 Phân loại

9

3. Định lượng Enterobacteriaceae bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
3.1 Phạm vi áp dụng

9
9

3.2 Nguyên tắc

10

3.3. Môi trường và hóa chất

10

3.4. Quy trình phân tích

11

3.5 Các bước tiến hành

12

3.6 Kết quả

14

4. Kết luận

15

5


,3
1. MỞ ĐẦU
1.1 Lý do chọn đề tài
Tình trạng kháng kháng sinh tại các cơ sở y tế đang gia tăng một cách đáng báo động
trong những năm gần đây. Ths. Nguyễn Quốc Thái, Phó trưởng phịng Truyền nhiễm Cấp
cứu (Trung tâm Bệnh Nhiệt đới) đã đề cập đến Enterobacteriaceae, một họ vi khuẩn

trong các vi khuẩn gây kháng sinh phổ biến trong cộng đồng và bệnh viện. Chúng có mặt
chủ yếu ở đường tiêu hố dưới, ngồi ra có trong đường sinh dục, tiết niệu và cả họng
miệng. Tuy nhiên, vi khuẩn này có thể gây bệnh ở bất kỳ cơ quan nào của cơ thể, gây
nhiễm khuẩn cả trong cộng đồng và trong môi trường bệnh viện. Một số vi khuẩn hay
gặp và quan trọng trên lâm sàng như Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae….Những trường hợp người bệnh dễ mắc nhiễm khuẩn gây ra bởi họ vi
khuẩn này bao gồm người bệnh ghép tuỷ, suy gan, ghép tạng, đái tháo đường, bệnh phổi,
thận nhân tạo chu kỳ, nhiễm HIV, đang điều trị thuốc corticoid…. Các mầm bệnh gây lây
nhiễm có thể có trong dịch truyền, ống thơng (catheter) và các dụng cụ y tế khác. Qua
đó, cho thấy sự nguy hiểm của vi khuẩn Enterobacteriaceae đối với con người chúng ta
nên nhóm em muốn tìm hiểu thêm về Enterobacteriaceae để giúp chúng em hiểu về
nguyên tắc, môi trường và hóa chất, định lượng được nó. Đó là lý do nhóm em chọn đề
tài định lượng Enterobacteriaceae.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Biết cách tiến hành định lượng Enterobacriaceae.
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiêm cứu
Đối tượng nghiêm cứu: vi khuẩn Enterobacriaceae.
Phạm vi nghiêm cứu: định lượng Enterobacriaceae trong các sản phẩm thực phẩm, thức
ăn chăn nuôi, các mẫu môi trường trong khu khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm.
1.4 Phương pháp nghiên cứu chính

6


,3
Phương pháp phân tích và tổng hợp lý thuyết: Tìm hiểu và thu thập thông tin qua sách, tài
liệu tham khảo và tổng hợp lại để hoàn chỉnh bài làm.
Phương pháp so sánh-đối chiếu: Nhóm tác giả đã đưa các nội dung nghiên cứu từ nhiều
nguồn tài liệu tham khảo khác nhau liên quan đến vấn đề đang chứng minh, nhằm giúp
cho bài luận thêm hấp dẫn và xây dựng nên cơ sở lý thuyết vững chắc cho vấn đề đang

bàn luận.
1.5 Ý nghĩa thực hiện của đề tài này
Giúp hiểu biết thêm một loại vi khuẩn Enterobacriaceae ( vi khuẩn đường ruột ).
2. Tổng Quan Enterobacteriaceae

hình 1: Vi khuẩn Enterobacteriaceae
7


,3
2.1. Nơi cư trú
Các vi khuẩn đường ruột thường sống ở ống tiêu hóa của người và động vật, có thể gây
bệnh hoặc khơng gây bệnh. Ngồi ra chúng có thể sống ở ngoại cảnh (đất, nước) và trong
thức ăn.
2.2. Hình thể
Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là những trực khuẩn gram âm, không sinh nha
bào. Một số giống vi khuẩn thường không di động (Klebsiella, Shigella), một số vi khuẩn
khác di động nhờ có lơng ở xung quanh thân tế bào. Một số giống có vỏ nhìn thấy được
nhờ kính hiển vi thường như Klebsiella.
2.3. Ni cấy
Các vi khuẩn đường ruột hiếu khí kỵ khí tùy tiện, phát triển được trên các môi trường
nuôi cấy thông thường.
Trên các môi trường đặc, các khuẩn lạc của các vi khuẩn đường ruột thường nhẵn, bóng
(dạng S). Tính chất này có thể biến đổi sau nhiều lần nuôi cấy liên tiếp thành các khuẩn
lạc có bề mặt khơ và xù xì (dạng R).
Các khuẩn lạc của các vi khuẩn có vỏ như Klebsiella là khuẩn lạc nhầy, lớn hơn khuẩn
lạc dạng S và có xu hướng hịa lẫn vào nhau.
Nghiên cứu các tính chất sinh vật hóa học giúp cho việc định loại vi khuẩn.
2.4 Tính chất sinh vật hóa học
Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae lên men glucose, có sinh hơi hoặc khơng sinh

hơi, oxidase âm tính, catalase dương tính, khử nitrate thành nitrite. Lên men hoặc không
lên men một số đường (ví dụ lactose). Có hay khơng có một số enzyme như urease,

8


,3
tryptophanase. Khả năng sinh ra H2S khi dị hóa protein, axít amin hoặc các dẫn chất có
lưu huỳnh...
2.5 Phân loại
Có nhiều cách phân loại họ Enterobacteriaceae. Theo cách phân loại của Bergey’s
Manual (1984) chia Enterobacteriaceae làm 13 giống chính như sau:
Các giống :
I.Escherichia

II.Shigella

III.Edwardsiella

IV.Citrobacter

V.Salmonella

VI.Klebsiella

VII.Enterobacter

VIII.Serratia

IX.Proteus

X.Providencia

XI.Morganella

XII.Yersinia

XIII.Erwinia
Trong các giống kể trên thì các giống vi khuẩn có ý nghĩa y học nhất
là : Escherichia; Shigella; Salmonella; Klebsiella; Enterobacter; Proteus; Yersinia; cịn
các giống khác ít ý nghĩa.

9


,3
3. Định lượng Enterobacteriaceae bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
3.1 Phạm vi áp dụng
Phương pháp định lượng Enterobacteriaceae được tham chiếu theo TCVN 5518 – 2:2007
ISO 21528 – 2:2004 dùng để định lượng Enterobacteriaceae mà không cần phải qua giai
đoạn tiền tăng sinh. Phương pháp này có thể áp dụng cho:
- Các sản phẩm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi
- Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm.
Việc định lượng được thực hiện bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc
sau khi ủ ấm ở 37oC (hoặc 30oC)
Khi số lượng khuẩn lạc dự kiến có mặt nhiều hơn 100 trong một mililit hoặc một gam
mẫu thử, thì nên dùng kỹ thuật này.
3.2 Nguyên tắc
3.2.1 Chuẩn bị
- Chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo

-Từ mẫu thử chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân
tiếp theo.
3.2.2 Phân lập
+ Cấy một lượng xác định của mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyền phù
ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác vào hai đĩa petri (dùng kỹ thuật đổ đĩa) chứa thạch
glucoza mật đỏ tím. Phủ lên trên bằng một lớp môi trường thạch này.
+ Chuẩn bị các cặp đĩa thạch khác trong cùng điều kiện, sử dụng các dung dịch
pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
+ Ủ các đĩa thạch này ở 37oC (hoặc 30oC) trong 24 h ± 2 h
3.2.4 Tính tốn
Tính số lượng Enterobacteriaceae có trong một mililit hoặc trong một gam mẫu thử từ số
lượng khuẩn lạc điển hình đã khẳng định trên mỗi đĩa.
3.3. Mơi trường và hóa chất
10


,3
Mơi trường và hóa chất

Mục đích

SPW (Saline Peptine Water)

Pha lỗng mẫu

VRBG (Violet Red Bile Glucose)

Nuôi cấy Enterobacteriaceae

NA/TSA

Phục hồi

Thạch glucoza

Khẳng định Enterobacteriacease

Thuốc thử oxidase

3.4. Quy trình phân tích

11


,3

x

Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60 giây

Pha loãng
Dịch mẫu

Dịch mẫu

VRBG
02 đĩa

(VRBG đã đun chảy và làm

02 đĩa

nguội đến 47℃ )

Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật ngược
đĩa và ủ ở tủ ấm trong 24 giờ

Đọc kết quả
Chọn các đĩa mọc khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp
Khẳng định sinh hóa thạch glucoza và oxidase

Tính và biểu thị kết quả

12


,3

3.5 Các bước tiến hành
Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu lỏng
của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa vô trùng (bình
tam giác).
Cho dung dịch pha lỗng SPW 90ml (sai số cho phép ± 5% ) vô trùng vào túi nhựa
(bình tam giác) chứa mẫu.
Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều
bình tam giác có mẫu và dịch pha lỗng trong 2-3 phút.
Bước 2. Pha lỗng mẫu
Dùng pipet vơ trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số

± 5% cho vào một ống

nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vơ trùng ở nhiệt độ thích hợp.
Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với
các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1). Nếu cần, lặp
lại thao tác trên để có được dung dịch pha lỗng 10 -3, 10-4, 10-5,... cho đến khi thu được
lượng vi khuẩn thích hợp.
Bước 3. Cấy và ủ mẫu
Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 1ml huyền phù ban đầu đối với
sản phẩm ở dạng khác cho vào giữa đĩa petri. Lặp lại qui trình với các dung dịch pha
lỗng thập phân tiếp theo, nếu cần. Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2
đĩa petri. Rót vào mỗi đĩa 10-15ml mơi trường VRBG, trộn đều bằng cách xoay nhẹ từng

13


,3
đĩa. Khi mơi trường đã đơng đặc lại thì phủ kín thêm một lớp dày 10ml của cùng loại mơi
trường VRBG. Để cho đông đặc lại. Lật úp đĩa và ủ ở 37°C trong 24 giờ.
Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy. Các khuẩn lạc đặc trưng có
màu hồng đến màu đỏ hoặc đỏ tía (có hoặc khơng có quầng tủa) trên mơi trường VRBG.
Đếm các khuẩn lạc Enterobacteriaceae trên những đĩa có số đếm phù hợp.
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy ria lên môi trường dinh dưỡng để thử khẳng định, ủ các
đĩa này ở 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy thực hiện các phép thử khẳng định sau:
- Phản ứng oxidase: dùng que cấy hoặc đũa thủy tinh, lấy một phần sinh khối trên
môi trường dinh dưỡng và cấy ria lên giấy lọc đã được tẩm thuốc thử oxidase hoặc lên
các đĩa bán sẵn. Không dùng que cấy bằng niken/crom. Phép thử được coi là âm tính khi
màu của giấy lọc không chuyển sang màu sẫm trong vòng 10s. Cần theo hướng dẫn của
nhà sản xuất khi sử dụng đĩa có bán sẵn.

- Lên men glucoza: dùng que cấy lấy cùng một loại sinh khối đã được chọn trong
phép thử oxidase, cấy đâm sâu vào các ống chứa thạch glucoza, ủ ở 37 0C trong 24 giờ.
Nếu màu vàng lan rộng khắp ống thạch thì phản ứng được coi là dương tính.
3.6 Kết quả
Các khuẩn lạc cho kết quả âm tính oxidase và dương tính glucoza được khẳng định là
Enterobacteriaceae.
Enterobacteriaceae trong 1g/1ml mẫu (X) được tính theo cơng thức:
X=

(C 1×R 1)+(C 2×R 2)+(C 3×R 3 )+(C 4×R 4 )
V ×(n1 +0,1×n2 )×d

14

(CFU/g hay CFU/ml)


,3
C1,2,4: Số khuẩn lạc Enterobacteriaceae đếm được tương ứng trên 4 đĩa cđộ pha lỗng
liên tiếp
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp.
4. Kết luận
Họ vi khuẩn Enterobacteriaceae là loại vi khuẩn phổ biến nhất ảnh hưởng đến ngành thực
phẩm. Vi khuẩn trong nhóm này được phát hiện và đếm bằng các xét nghiệm và phân tích
thơng thường được thực hiện trong phịng thí nghiệm. Trong bối cảnh này, Số lượng vi
khuẩn enterobacteriaceae là một nghiên cứu ngày càng quan trọng cho thấy chất lượng

thực phẩm.

15


,3
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Giáo trình phân tích vi sinh. Khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Công
nghiệp Thực phẩm TP.HCM, 2002.
[2]. TCVN: 5518-2:2007 (ISO 21528-1:2004) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn
chăn nuôi- Phương pháp phát hiện và định lượng Enterobactericeae-Phần 2: Ktx thuật
đếm khuẩn lạc

16


,3
CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM
Câu 1: Theo cách phân loại của bergey’s manual (1984) chia Enterobacteriaceae làm bao
nhiếu giống chính?
A. 11
B. 12
C. 13
D. 14
Câu 2: chọn câu đúng nơi cư trú của enterobacteriaceae ?
A. Ống tiêu hóa ở người và động vật
B. Đất, nước
C. Thức ăn
D. Tất cả A B C đều đúng
Câu 3: Chọn câu phát biểu sai?

A. Các vi khuẩn Enterobacteriaceae đều di chuyển được
B. Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là những trực khuẩn gram âm, không sinh
nha bào.
C. Một số giống vi khuẩn thường không di động (Klebsiella, Shigella), một số vi khuẩn
khác di động nhờ có lông ở xung quanh thân tế bào.
D. Một số giống có vỏ nhìn thấy được nhờ kính hiển vi thường như Klebsiella.
Câu 4: các giống vi khuẩn họ Enterobacteriaceae có ý nghĩa y học nhất là?
A. Escherichia
B. Shigella
C. Salmonella
D. tất cả các đáp án trên

17


,3
Câu 5: Vi khuẩn đường ruột là vi khuẩn?
A. hiếu khí
B. kỵ khí tùy tiện
C. kỵ khí bắt buộc
D. hiếu khí kỵ khí tùy tiện
Câu 6: Điền vào chỗ trống: Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae lên men glucose,
có sinh hơi hoặc khơng sinh hơi, oxidase … tính, catalase … tính, khử … thành nitrite.
A. Dương; âm; nitrate
B. Âm; dương; nitrate
C. Âm; dương; nitrite
D. Dương; âm; nitrite
Phạm vi áp dụng của phương pháp định lượng Enterobacteriaceae?
A. TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2006)
B. TCVN 5518-2:2007 (ISO 21528-2:2004)

C. TCVN 4884:2005 (ISO 7937:2004)
D. TCVN 4830-1:2005 (ISO 6888-1:1999)
Cần chọn đĩa có bao nhiêu khuẩn lạc để khẳng định kết quả
A.≤ 150
B.≥ 150
C.300
D.< 300
Các loài vi khuẩn nào sau đây thuộc họ Enterobacteriaceae?
18


,3
A. E.coli, Shigella, Proteus,Salmonella,V.cholerae.
B. Liên cầu ruột, Shigella, Klebsiella, Yersinia.
C. E.coli, Shigella, Salmonella, Klebsiella ,Yersinia pestis.
D. Shigella, Klebsiella E.coli, Pseudomonas.
E. Salmonella, Shigella, E.coli, Proteus, Brucella.
Những chủng thuộc họ Enterobacteriaceae có tính chất di động thì?
Có nhiều lơng ở xung quanh thân tế bào vi khuẩn.
Có một chùm lơng ở một đầu tế bào vi khuẩn
Có lơng ở 2 đầu tế bào vi khuẩn.
Có một lơng ở một đầu tế bào vi khuẩn
Trong định lượng Enterobacteriaceae,phép thử phản ứng oxidase xuất hiện màu gì thì
phản ứng được khẳng định là âm tính?
Màu của giấy lọc khổng chuyển sang màu sẫm trong vòng 10s
Màu của giấy lọc chuyển sang màu sẫm trong vòng 10s
Màu của giấy lọc giữ nguyên màu sẫm trong vịng 10s
Màu của giấy lọc chuyển sang màu đỏ tía trong vịng 10s
Khẳng định Enterobacteriaceae bằng mơi trường và hóa chất gì?
Thạch glucoza và thuốc thử oxidase

Blood agar base
Arginine dehydrolase
Cả 3 mơi trường trên
Câu 13: Mục đích của mơi trường SPW là:
Phục hồi
Pha lỗng mẫu
Khẳng định
Ni cấy
Câu 14: Thành phần của môi trường VRBG:

19


,3
Cao nấm men, dịch thủy phân mô động vật bằng enzyme, muối mật No.3, glucoza, Natri
Clorua
Cao nấm men, dịch thủy phân mô động vật bằng enzyme, muối mật No.3, glucoza, Natri
Clorua, đỏ trung tính
Cao nấm men, dịch thủy phân mơ động vật bằng enzyme, muối mật No.3, glucoza, Natri
Clorua, đỏ trung tính, tím tinh thể(crystal violet)
Dịch thủy phân mơ động vật bằng enzyme, muối mật No.3, glucoza, Natri Clorua, đỏ
trung tính
Câu 15: Mục đích của NA/TSA:
Pha lỗng mẫu
Khẳng định
Ni cấy
Phục hồi
Câu 16: Mục đích thạch glucoza và oxidaza:
A.Pha lỗng mẫu
B. Khẳng định

C. Nuôi cấy
D. Phục hồi
Câu 17: Thành phần của SPW:
Cao thịt
Dịch thủy phân mô động vật bằng enzyme
Natri clorua
Nước
Thạch
Cao nấm men
Đỏ trung tính
1, 2, 3, 4, 5, 6
1, 3, 4, 5, 6, 7
1, 2, 3, 4, 5
1,3,5,7
Câu 18: Mục đích của VRBG:
Pha lỗng mẫu
Phục hồi
Khẳng định
20