Định Lượng Enterobacteriaceae Bằng Phương Pháp Đếm Khuẩn Lạc.pptx

Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP HCM

ĐỊNH LƯỢNG
ENTEROBACTERIACEAE BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
GVHD: Đinh Thị Hải Thuận

SVTH: NHÓM 1

1


THÀNH VIÊN NHĨM 1

1.

Lê Võ Hồi Bảo

2005200304

2.

Nguyễn Thị Trúc Ly

2005200571

3.

Phan Thị Dương Hà

2005208384

4.

Lê Thị Tuyết Ngân

2005200635

5.

Nguyễn Lê Kiều Mị

2005200382

5
2


NỘI DUNG
Phạm vi áp dụng

1
Tổng quan về
Enterobacteriaceae
NEPTUNE

2

Quy trình tiến
hành

3
Mơi trường &
hóa chất

4

5
Kết quả

3


1. Enterobacteriaceae
Trực khuẩn gram (-), Khơng sinh nha bào, có thể di động
hoặc khơng
vi khuẩn đường ruột hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện
Lên men đường glucose có kèm theo sinh hơi hoặc khơng

Nguồn nhiễm
▪ Ống tiêu hóa người và
động vật
▪ Ngoại cảnh (đất, nước)
▪ Thức ăn

Tác hại
▪ Tiêu chảy
▪ Bệnh tiết niệu, hô hấp,
thần kinh
4

2. Phạm vi áp dụng
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 5518 - 2:2007
ISO 21528 -2:2004

Phương pháp này dùng để định lượng
Enterobacteriaceae:
- Các sản phẩm thực phẩm và thức ăn
chăn nuôi
- Các mẫu môi trường trong khu vực sản
xuất và chế biến thực phẩm.

5


3. Mơi trường & hóa chất
MƠI TRƯỜNG VÀ HĨA CHẤT

MỤC ĐÍCH

SPW (Saline Peptine Water)

Pha lỗng mẫu
Ni cấy Enterobacteriaceae

VRBG (Violet Red Bile Glucose)

NA/TSA

Phục hồi

Thạch glucoza
Khẳng định Enterobacteriacease
Thuốc thử oxidase
6


3. Mơi trường & hóa chất
SPW (Saline Peptine Water)
Thành phần

Vai trò

Sodium
chloride

Điều chỉnh trương lực

Peptone

Cung cấp nito, nguồn thức ăn cho vi sinh vật

Nước

Giúp cho quá trình trao đổi chất, các phản ứng
hóa sinh diễn ra thuận lợi


3. Mơi trường & hóa chất

VRBG (Violet Red Bile Glucose)
Thành phần

Vai trò

Peptone

Cung cấp Nitơ, nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật đặc biệt là amino acid

Cao nấm men

Cung cấp các dưỡng chất (acid amin..).

Muối mật

Ức chế chọn lọc.

Glucose

Cung cấp năng lượng cho sự sinh trưởng và trao đổi chất.

Sodium chloride

Duy trì áp suất thẩm thấu.

Đỏ trung tính

Chỉ thị pH.

Tím tinh thể (Crystal violet)

Ức chế chọn lọc

Thạch

Tác nhân làm đông cứng mơi trường.

Nước

Giúp cho q trình trao đổi chất, các phản ứng sinh hóa diễn ra thuận lợi.


4. Quy trình phân tích
MARS
1. Chuẩn bị mẫu

2. Pha lỗng mẫu

3. Cấy và ủ mẫu

4. Đếm và chọn các
khuẩn lạc

5. Khẳng định
Enterobacteriaceae

6.Tính kết quả


Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

Cân chính xác 10g (mẫu rắn) hoặc
10ml (mẫu lỏng)

Đồng nhất mẫu trong
vịng 2 - 3 phút
Dung dịch pha lỗng SPW 90ml
vô trùng

8


Bước 2. Pha loãng mẫu
1ml huyền phù
ban đầu

9 ml dịch pha lỗng
SPW vơ trùng

Lắc 5 - 10 s

1
m
l

dịch pha lỗng 10-2
Máy vortex
Mục đích : giảm bớt VSV trong mẫu để thuận tiện cho việc
quan sát sự phát triển của chúng

9


Bước 3. Cấy và ủ mẫu

10-15ml môi trường
VRBG

1ml mẫu thử dạng lỏng
hoặc 1ml huyền phù

Khi môi trường đã đông đặc lại thì phủ kín thêm một lớp dày 10ml
của cùng loại môi trường VRBG. Để cho đông đặc lại. Lật úp đĩa và ủ
ở 370C trong 24 giờ.
10


Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới
150 sau 24 giờ nuôi cấy

Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng
cấy ria lên môi trường dinh
dưỡng

Ủ các đĩa này ở 370C trong
24 giờ

11

Bước 5. Khẳng định Enterobacteriaceae

Phản ứng
oxidase

Lấy một phần sinh khối trên môi trường dinh dưỡng và cấy
ria lên giấy lọc đã được tẩm thuốc thử oxidase

Không dùng que cấy bằng niken/crom.

Âm tính khi màu của giấy lọc khơng chuyển sang màu sẫm
trong vòng 10s
12


Cấy đâm sâu vào các ống chứa thạch glucoza

Lên men
glucoza

Ủ ở 370C trong 24 giờ

Màu vàng lan rộng khắp ống thạch thì phản ứng được coi là
dương tính
13


Kết quả
Phản ứng oxidase: âm tính

Glucoza: dương tính
Catalase: dương tính
Thử nghiệm MR: âm tính

16


6. Kết quả
Các khuẩn lạc cho kết quả âm tính oxidase và dương tính glucoza được khẳng định là
Enterobacteriaceae.
Enterobacteriaceae trong 1g/1ml mẫu (X) được tính theo cơng thức:

C1,2,3,4: Số khuẩn lạc Enterobacteriaceae đếm được tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha lỗng liên tiếp
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp.
14


Tính tốn Enterobacteriaceae bằng PP đếm
KL xác định trong 1g sữa bột
Nồng độ
pha loãng
C
R

10-3
65

10-4
78

4

8

1

Theo 8-3:2007/BYT -Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia đối với
ô nhiễm VSV trong thực phẩm
Quy định các sản phẩm sữa dạng bột chỉ ở giới hạn cho
phép 101
⇒ Thực phẩm khơng an tồn


Kết luận
Họ vi khuẩn Enterobacteriaceae là loại vi khuẩn phổ biến
nhất ảnh hưởng đến ngành thực phẩm. Vi khuẩn trong nhóm
này được phát hiện và đếm bằng các xét nghiệm và phân tích
thơng thường được thực hiện trong phịng thí nghiệm. Trong bối
cảnh này, Số lượng vi khuẩn Enterobacteriaceae là một nghiên
cứu ngày càng quan trọng cho thấy chất lượng thực phẩm.

15


âu 1: Theo cách phân loại của Bergey’s Manual (1984) chia
Enterobacteriaceae làm bao nhiếu giống chính?

A.11
B.12
C.13
D.14
Câu 2: chọn câu đúng nơi cư trú của Enterobacteriaceae ?
A.Ống tiêu hóa ở người và động vật
B. Đất, nước
C. Thức ăn
D. Tất cả A B C đều đúng