Luận Án Tiến Sĩ Nông Nghiệp Nghiên Cứu Chuyển Gen Theo Hướng Nâng Cao Năng Suất Hạt Ở Cây Đậu Tương (Glycine Max (L.) Merr.pdf
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (7.69 MB, 210 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
---------
án
tiế
Tài liệu rẻ
ận
Lu
NGUYỄN TRỊNH HỒNG ANH
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƢỚNG
n
NÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG
sĩ
(GLYCINE MAX (L.) Merr.)
ới
m
nh
ất
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP
Hà Nội - 2023
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
---------
NGUYỄN TRỊNH HỒNG ANH
ận
Lu
án
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƢỚNG
tiế
Tài liệu rẻ
NÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG
Mã số
: Công nghệ sinh học
sĩ
Chuyên ngành
n
(GLYCINE MAX (L.) Merr.)
: 9420201
ới
m
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
ất
nh
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP
1. PGS.TS. Khuất Hữu Trung
2. GS.TS. Ngơ Xn Bình
Hà Nội - 2023
i
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan, đây là cơng trình nghiên cứu của cá nhân tôi, các số liệu
và kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học
vị nào hoặc chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một cơng trình nghiên cứu nào.
Tơi xin cam đoan r ng, mọi sự gi p đ , hợp tác cho việc thực hiện luận án
này đ được cảm n và các thông tin tr ch d n trong luận án này đ u được ch d n
r ngu n gốc.
Lu
án
tiế
Tài liệu rẻ
ận
Nghiên cứu sinh
n
Nguyễn Trịnh Hoàng Anh
sĩ
ới
m
ất
nh
ii
LỜI CẢM ƠN
ể hồn thành luận án này, tơi đ nhận được sự quan tâm, gi p đ nhiệt tình
của các Th y, ô giáo, các tập thể, cá nhân, gia đình c ng b n b đ ng nghiệp.
Tơi xin bày tỏ lòng biết n sâu sắc đến PGS.TS. Khuất Hữu Trung, GS.TS
Ngơ Xn Bình - là th y giáo hướng d n khoa học, đ tận tình gi p đ , truy n tải
kiến thức và kinh nghiệm trong suốt q trình thực hiện đ tài và hồn thành luận án.
Tôi xin trân trọng cảm n Ban l nh đ o Viện Khoa học Nông nghiệp Việt
Lu
Nam; tập thể cán bộ Ban Thông tin và
ào t o; tập thể L nh đ o và cán bộ viên
ận
chức Trung Tâm chuyển giao công nghệ và khuyến nông đ giúp đ , hỗ trợ tận tình
cho tơi trong q trình học tập và thực hiện đ tài.
án
Tôi xin chân thành cảm n Khoa
i học Nông Lâm,
ông nghệ thực
i học Thái Nguyên là n i tôi triển khai thực
tiế
Tài liệu rẻ
phẩm, Trường
ông nghệ sinh học và
hiện đ tài, đ t o mọi đi u kiện thuận lợi v tài liệu khoa học, c sở vật chất, thiết
n
bị phục vụ nghiên cứu để tơi hồn thành luận án.
ơng nghệ sinh học và
sĩ
đến PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng, Khoa
ặc biệt, tôi xin bày tỏ sự biết n
ông nghệ thực
phẩm đ chia sẻ kiến thức và kinh nghiệm chun mơn để tơi hồn thành nghiên
ới
m
cứu trong thời gian sớm nhất.
uối cùng, tôi xin chân thành cảm n b n b , đ ng nghiệp trong và ngồi c
nh
quan và người thân trong gia đình ln hết lòng động viên, kh ch lệ và gi p đ tơi
trong suốt q trình thực hiện và hồn thành cơng trình trình nghiên cứu này.
ất
Tơi xin chân thành cảm n!
H N i, ng y
th ng
năm 2023
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Trịnh Hoàng Anh
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... ix
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... xi
Lu
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... xiv
ận
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................. 1
án
2. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................... 3
tiế
Tài liệu rẻ
2.1. Mục tiêu tổng quát .................................................................................... 3
2.2. Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 3
n
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ............................................... 3
sĩ
3.1. Ý nghĩa khoa học....................................................................................... 3
m
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ....................................................................................... 4
ới
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu.............................................................. 4
4.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 4
nh
4.2. Phạm vi, thời gian nghiên cứu ................................................................. 4
ất
5. Những đóng góp mới của luận án .............................................................. 4
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA
ĐỀ TÀI ............................................................................................................. 6
1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và Việt Nam .................... 6
1.1.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới ......................................... 6
1.1.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam ........................................... 8
1.2. Tổng quan về nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tƣơng trên thế giới . 9
1.2.1. Nghiên cứu về tái sinh in vitro ở cây đậu tương .................................. 9
iv
1.2.1.1. Vật liệu sử dụng trong t i sinh in vitro ở cây đậu tương ..................... 9
1.2.1.2. Phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây đậu tương ............... 10
1.2.1.3. Ph t sinh cơ quan thông qua mô sẹo trong t i sinh in vitro cây
đậu tương ....................................................................................................... 12
1.2.1.4. Ph t sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu nuôi cây (khơng qua việc hình
th nh mơ sẹo) .................................................................................................. 13
Lu
1.2.1.5. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy v điều kiện nuôi cấy đến khả
ận
năng t i sinh đậu tương .................................................................................. 14
1.2.2. Kết quả nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương trên thế giới ............... 15
án
1.2.2.1. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium ............................... 15
tiế
Tài liệu rẻ
1.2.2.2. Nghiên cứu chuyển gen bằng súng bắn gen ....................................... 18
1.2.2.3. Nghiên cứu chuyển gen bằng xung điện ............................................ 19
n
sĩ
1.2.2.4. Nghiên cứu chuyển gen qua ống phấn ............................................... 19
m
1.2.3. Các tính trạng được cải thiện thông qua chuyển gen ở cây đậu tương 20
ới
1.2.3.1. Đặc tính kh ng thuốc diệt cỏ ............................................................. 21
1.2.3.2. Đặc tính kh ng côn trùng................................................................... 21
nh
1.2.3.3. Chuyển gen nâng cao h m lượng dầu ............................................... 25
ất
1.2.3.4. Chuyển gen nâng cao tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh ............ 25
1.2.3.5. Chuyển gen nâng cao năng suất ........................................................ 26
1.2.3.6. Chuyển gen tạo cây trồng đa tính trạng ............................................ 26
1.2.4. Thành tựu về cây trồng chuyển gen trên thế giới .............................. 27
1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nƣớc ...................................... 31
1.3.1. Chọn tạo giống thông qua tuyển chọn vật liệu nhập nội và địa phương 31
1.3.2. Chọn tạo giống đậu tương mới bằng lai hữu tính ............................. 32
v
1.3.3. Chọn tạo giống mới bằng phương pháp xử lý đột biến...................... 32
1.3.4. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương ở Việt Nam........................... 33
1.3.4.1. Nghiên cứu t i sinh cây in vitro phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương ... 33
1.3.4.2. Nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương ................................................. 34
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu về tính trạng gen có khả năng nâng
cao năng suất hạt ở cây đậu tƣơng .............................................................. 35
1.4.1. Nghiên cứu về vai trò của gen kìm hãm già hóa bộ lá ....................... 35
Lu
1.4.2. Nghiên cứu gen điều khiển q trình tăng cường kích thước hạt ở
ận
cây đậu tương ................................................................................................. 38
1.5. Một số nhận xét rút ra từ tổng quan tài liệu ....................................... 40
án
Tài liệu rẻ
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
tiế
CỨU ................................................................................................................ 41
2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 41
n
2.1.1. Vật liệu thực vật ................................................................................... 41
sĩ
2.1.2. Vật di truyền ......................................................................................... 42
m
2.1.3. Hóa chất, thiết bị sử dụng.................................................................... 42
ới
2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 43
nh
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................... 44
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 44
ất
2.4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in
vitro và khả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tương để chọn lọc
nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen........................................................ 44
2.4.1.1. Nghiên cứu khả năng t i sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro của c c
giống đậu tương .............................................................................................. 44
2.4.1.2. Đ nh gi khả năng tiếp nhận gen của c c giống đậu tương ............. 48
vi
2.4.2. Nội dung 2: Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm
hãm già hóa lá Ore1 và đánh giá biểu hiện trên cây Arabidopsis ............... 50
2.4.2.1. Nghiên cứu tách dịng gen kìm hãm già hóa lá Atore1 ..................... 50
2.4.2.2. Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm gi hóa l Atore1 .... 51
2.4.2.3. Đ nh gi khả năng biểu hiện của gen kìm hãm gi hóa l Atore1 trên
cây mơ hình Arabidopsis thaliana .................................................................. 52
Lu
2.4.3. Nội dung 3: Chuyển gen kìm hãm già hóa lá Ore1 vào cây đậu tương
và đánh giá các dòng chuyển gen.................................................................. 55
ận
2.4.3.1. Nghiên cứu chuyển gen Atore1 v o cây đậu tương thông qua vi khuẩn
án
Agrobacterium tumefaciens ............................................................................ 55
tiế
Tài liệu rẻ
2.4.3.2. Chọn lọc v đ nh gi biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương
chuyển gen ....................................................................................................... 57
n
2.4.3.3. Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 v đ nh
sĩ
gi biểu hiện gen ............................................................................................ 58
m
2.4.3.4. Đ nh gi khả năng sinh trưởng, ph t triển của c c dòng đậu tương
ới
chuyển gen ....................................................................................................... 59
nh
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................... 60
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................. 61
ất
3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro
và khả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tƣơng để chọn lọc nguồn
vật liệu phục vụ cho chuyển gen .................................................................. 61
3.1.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro
của các giống đậu tương ................................................................................ 61
3.1.1.1. Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng ........................................................ 61
3.1.1.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng t i sinh chồi từ nốt l mầm ........ 62
vii
3.1.1.3. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng t i sinh chồi từ nốt lá mầm .... 68
3.1.1.4. Kết quả ảnh hưởng của h m lượng GA3 đến khả năng kéo d i chồi
của m t số giống đậu tương ............................................................................ 76
3.1.1.5. T i sinh rễ tạo cây ho n chỉnh ........................................................... 77
3.1.2. Đánh giá khả năng tiếp nhận gen của các giống đậu tương............. 79
3.2. Kết quả tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm
già hóa lá Ore1 và đánh giá biểu hiện trên cây Arabidopsis .................... 86
Lu
3.2.1. Tách dịng gen kìm hãm già hóa Atore1 ............................................. 86
ận
3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa lá Atore1 ... 90
3.2.2.1. Gắn gen Atore1 vào vector chuyển gen ............................................. 90
án
Tài liệu rẻ
3.2.2.2. Tạo chủng vi khuẩn E.coli v Agrobacterium tumefaciens mang gen
tiế
Atore1 .............................................................................................................. 92
n
3.2.3. Đánh giá khả năng biểu hiện của gen kìm hãm già hóa lá Atore1 trên
sĩ
cây mơ hình Arabidopsis thaliana ................................................................. 92
m
3.2.3.1. Chuyển gen Atore1 v o cây mơ hình Arabidopsis ............................. 92
ới
3.2.3.2. Chọn lọc cây Arabidopsis chuyển gen T1 mang gen Atore1 .............. 93
nh
3.2.3.3. Đ nh gi cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 bằng PCR ở thế hệ T1 94
3.2.3.4. Đ nh gi biểu hiện gen thơng qua hình th i của cây Arabidopsis
ất
chuyển gen Atore1 thế hệ T1............................................................................ 95
3.2.3.5. Đ nh gi cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 bằng PCR ở thế hệ T2 .96
3.2.3.6. Đ nh gi biểu hiện gen thơng qua hình th i l ở cây Arabidopsis
chuyển gen Atore1 thế hệ T2............................................................................ 97
3.3. Kết quả chuyển gen kìm hãm già hóa lá Atore1 vào cây đậu tƣơng và
đánh giá các dòng chuyển gen .................................................................... 100
viii
3.3.1. Nghiên cứu chuyển gen Atore1 vào cây đậu tương thông qua vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens ............................................................. 100
3.3.1.1. Nuôi cấy hạt đậu tương nảy mầm chuẩn bị để biến nạp gen ........... 100
3.3.1.2. Tạo dung dịch vi khuẩn biến nạp gen Atore1 .................................. 101
3.3.1.3. Ảnh hưởng của nồng đ vi khuẩn đến khả năng biến nạp ............... 102
3.3.1.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen. 105
Lu
3.3.1.5. Ảnh hưởng của nồng đ Acetosyringon (AS) đến khả năng biến nạp
ận
gen ................................................................................................................. 106
3.3.1.6. Ảnh hưởng của kh ng sinh chọn lọc đến khả năng chọn lọc sau
án
chuyển gen ở cây đậu tương.......................................................................... 108
tiế
Tài liệu rẻ
3.3.1.7. T i sinh v chọn lọc chồi chuyển gen Atore1 trên môi trường
kháng sinh ..................................................................................................... 110
n
3.3.1.8. Tạo cây đậu tương chuyển gen Atore1 ho n chỉnh ......................... 111
sĩ
3.3.1.9. Kết quả đưa cây đậu tương chuyển gen trồng trong vườn thí nghiệm 112
m
ới
3.3.2. Chọn lọc và đánh giá biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương
chuyển gen .................................................................................................... 113
nh
3.3.2.1. Chọn lọc v đ nh gi biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương
ất
chuyển gen thế hệ T0...................................................................................... 113
3.3.2.2. Chọn lọc v đ nh gi biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương
chuyển gen thế hệ thế hệ T1 ........................................................................... 116
3.3.2.3. Chọn lọc cây đậu tương chuyển gen kìm hãm gi hóa l Atore1 ở thế
hệ T2............................................................................................................... 121
3.3.3. Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 và đánh
giá biểu hiện gen ......................................................................................... 126
3.3.3.1. Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 ............. 126
ix
3.3.3.2. Đ nh gi biểu hiện gen của dòng đậu tương mang gen Atore1 đồng
hợp tử thơng qua hình thái ............................................................................ 129
3.3.3.3. Kết quả phân tích sự có mặt của gen chuyển ở c c dòng đậu tương
chuyển gen Atore1 đồng hợp tử bằng Southern blot .................................... 131
3.3.4. Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tương
chuyển gen đồng hợp tử T3 ........................................................................... 133
Lu
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 144
1. Kết luận .................................................................................................... 144
ận
2. Đề nghị ...................................................................................................... 145
án
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN
Tài liệu rẻ
ÁN ................................................................................................................. 146
tiế
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 147
n
PHỤ LỤC ..................................................................................................... 163
sĩ
ới
m
ất
nh
ix
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Diễn giải
AtBBX32
The Arabidopsis thaliana BBX32
Atore1
Arabidopsis thaliana Ore1
ặp baz
Bp
Base pairs
Bt
Bacillus thuringiensis
CBF
C-repeat/dehydration responsive element bingding factor
Lu
CBF1
DNA
ộng sự
x t Deoxyribonucleic
Deoxyribonucleic acid
tiế
/c
ông nghệ sinh học
án
cs
Co-Culture Medium
Tài liệu rẻ
CNSH
ận
CCM
C-repeat/DRE binding factor 1
ối chứng
Enzym-linked Immuno Sorbent Assay
FAOSTAT
GMO
Tổ chức Lư ng thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (Food and
Agriculture Organization)
Sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism)
GM
Germination Medium
GUS
Beta-Glucuronidase reporter gene
ISAAA
Tổ chức Dịch vụ quốc tế v ứng dụng công nghệ sinh học nông
n
ELISA
sĩ
ới
m
nh
Applications)
LSD
Maker
ất
nghiệp (International Service for the Acquisition of Agri-biotech
Least Significant Difference Test
h thị
mRNA
Messenger Ribonucleic acid
NN&PTNT
Nông nghiệp và phát triển nông thôn
ORE1
ORESARA1
PCR
Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)
x
RM
Root Medium
RNA
Ribonucleic acid
SEM
Shoot Elongation Medium
SAAT
SIM
Sonicate Assisted Agrobacterium - media Transformation Phư ng
pháp biến n p gen ở đậu tư ng
Shoot Inducing Medium
TB
Trung bình
án
n
tiế
Tài liệu rẻ
ận
Lu
sĩ
ới
m
ất
nh
xi
DANH MỤC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
1.1. Tình hình sản xuất đậu tư ng trên thế giới những năm g n đây .........................6
1.2. Tình hình sản xuất đậu tư ng của một số nước đứng đ u trên thế giới trong
những năm g n đây sản lượng trên 1 triệu tấn) ..................................................7
1.3. Tình hình sản xuất đậu tư ng Việt Nam giai đo n 2012-2021 ............................8
1.4. Tình hình nhập khẩu đậu tư ng của Việt 2020-2022) ........................................9
Lu
1.5. Một số môi trường tái sinh cây đậu tư ng in vitro ............................................14
ận
1.6. Diện t ch cây tr ng NSH toàn c u năm 2019 theo quốc gia .........................27
1.7. ác giống ậu tư ng tuyển chọn từ ngu n nhập nội ........................................31
án
2.1. Danh sách các giống đậu tư ng sử dụng trong nghiên cứu ...............................41
tiế
Tài liệu rẻ
2.2. Trình tự m i sử dụng tách dịng gen Atore1 ......................................................42
2.3. ông thức ảnh hưởng của B P đến khả năng t o ch i .....................................45
n
2.4. ông thức ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng t o ch i .................................45
sĩ
2.5. ông thức ảnh hưởng của G 3 đến khả năng kéo dài ch i ...............................45
m
2.6. ông thức ảnh hưởng của IB đến khả năng ra rễ ............................................46
2.7. Trình tự m i sử dụng trong nghiên cứu tách dòng gen Atore1 ..........................50
ới
2.8. Danh sách m i sử dụng để nhân gen Atore1 ......................................................54
nh
2.9. Thành ph n phản ứng P R nhân dịng gen Atore1 ............................................54
2.10. Thành ph n các mơi trường d ng cho chuyển gen ở cây đậu tư ng thông qua
ất
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ................................................................56
2.11. Danh sách m i sử dụng để nhân gen Atore1 ....................................................58
3.1. Ảnh hưởng của Na lO đến khả năng vô tr ng m u nuôi cấy ...........................61
3.2. Ảnh hưởng của B P đến tái sinh ch i từ nốt lá m m của các giống đậu tư ng
sau 14 ngày nuôi cấy .........................................................................................62
3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến tái sinh ch i từ nốt lá m m sau 14 ngày nuôi cấy .69
3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng G 3 đến khả năng kéo dài ch i của một số giống
đậu tư ng sau 30 ngày nuôi cấy ......................................................................76
xii
3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng IB đến khả năng ra rễ của một số giống đậu
tư ng sau 30 ngày nuôi cấy ............................................................................78
3.6. Biểu hiện nhuộm GUS của m u lây nhiễm Agrobacterium ..............................82
3.7. Kết quả chuyển gen Atore1 vào cây Arabidopsis thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 93
3.8. Kết quả chọn lọc cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 ......................................93
3.9. ặc điểm hình thái và sinh trưởng ở cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T1... 95
3.10. Hình thái lá của cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T2 .......................97
3.11. Kết quả nuôi cấy t o vật liệu biến n p gen ....................................................100
Lu
3.12. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng biến n p gen ........................105
ận
3.13. Ảnh hưởng của thời gian đ ng nuôi cấy đến khả năng biến n p gen ............106
3.14. Ảnh hưởng của n ng độ S đến khả năng biến n p gen ...............................107
án
3.15. Ảnh hưởng của PPT đến khả năng chọn lọc ch i chuyển gen ở cây đậu tư ng .108
tiế
Tài liệu rẻ
3.16. Kết quả chuyển gen tore1 ở cây đậu tư ng thông qua vi khuẩn A.tumefaciens . 109
3.17. Kết quả chọn lọc và tái sinh cây đậu tư ng chuyển gen Atore1 ....................110
n
3.18. Kết quả tái sinh cây đậu tư ng chuyển gen hoàn ch nh .................................111
sĩ
3.19. Kết quả đưa cây đậu tư ng chuyển gen T0 ra tr ng .......................................112
m
3.20. Kết quả sàng lọc cây đậu tư ng chuyển gen T0 ngoài đ ng ruộng ................114
3.21. Kết quả đánh giá s bộ cây đậu tư ng chuyển gen thế hệ T0 ........................115
ới
3.22. ánh giá biểu hiện gen ở cây đậu tư ng chuyển gen T0 b ng P R ..............115
nh
3.23. Kết quả chọn lọc các cây đậu tư ng chuyển gen tore1 thế hệ T1 b ng thuốc
diệt cỏ Basta ...................................................................................................116
ất
3.24. Kết quả phân t ch biểu hiện gen b ng P R ở T1............................................118
3.25. ặc điểm sinh trưởng bộ lá của các dòng cây đậu tư ng chuyển gen Atore1
thế hệ T1 .........................................................................................................119
3.26. Hàm lượng diệp lục của các cây đậu tư ng chuyển gen Atore1 thế hệ T1 ....120
3.27. Kết quả chọn lọc các cây đậu tư ng chuyển gen Atore1 thế hệ T2 b ng thuốc
diệt cỏ Basta ...................................................................................................122
3.28. ặc điểm sinh trưởng bộ lá của các dòng cây chuyển gen Atore1 thế hệ T2 .123
3.29. Hàm lượng diệp lục của các cây đậu tư ng chuyển gen Atore1 thế hệ T2 ....124
xiii
3.30. Kết quả sàng lọc dòng đậu tư ng chuyển gen Atore1 đ ng hợp tử ở thế hệ T2..127
3.31. Kết quả sàng lọc dòng đậu tư ng chuyển gen Atore1 đ ng hợp tử ở thế hệ T3..128
3.32. ặc điểm sinh trưởng bộ lá của các dòng cây đậu tư ng chuyển gen Atore1
đ ng hợp tử T3 ...............................................................................................130
3.33. Hàm lượng diệp lục của các cây đậu tư ng chuyển gen Atore1 đ ng hợp tử T3 130
3.34. Kết quả tách chiết DN tổng số ....................................................................131
3.35. ặc điểm sinh trưởng của dòng đậu tư ng chuyển gen Atore1 đ ng hợp tử 133
3.36. Một số yếu tố cấu thành năng suất của dòng đậu tư ng chuyển gen Atore1
Lu
đ ng hợp tử ....................................................................................................134
án
n
tiế
Tài liệu rẻ
ận
3.37. Hiện tr ng hc-mơn ở các dòng đậu tư ng chuyển gen đột biến Atore1 ....136
sĩ
ới
m
ất
nh
xiv
DANH MỤC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1. Một số vật liệu ni cấy trong nuôi cấy mô đậu tư ng .....................................10
1.2. Diện t ch cây tr ng NSH toàn c u năm 2019 [10] ..........................................29
1.3. Kiểu hình của cây chuyển gen kìm h m già hóa lá ore1 và cây đối chứng wild
type sau 50 ngày nảy m m ................................................................................37
1.4. Dòng đậu tư ng chuyển gen GmBS1 tăng k ch thước h t ................................39
Lu
2.1. S đ quy trình tái sinh cây đậu tư ng từ nốt lá m m .......................................48
ận
2.2. Vùng T-DN của vector p
MBI 3301 mang gen Bar và GUS, đi u khiển
bởi promoter 35S ...............................................................................................49
án
2.3. S đ tổng quát mô tả quá trình chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana .....54
tiế
Tài liệu rẻ
3.1. Một số hình ảnh thực hiện các bước tiến hành th nghiệm ................................75
3.2. Nuôi cấy t o đa ch i ở một số giống đậu tư ng nghiên cứu .............................75
1,0mg/l đến khả năng ra rễ ở giống T26 sau 3 tu n nuôi
n
3.3. Ảnh hưởng của IB
sĩ
cấy .......................................................................................................................79
m
3.4. Biểu hiện gen GUS và tái sinh cây chuyển gen .................................................80
3.5. Hình vẽ mơ phỏng cấu tr c vector pBS nhân dòng gen Atore1.........................88
ới
3.6. Kết quả kiểm tra khuẩn l c mang gen Atore1 b ng P R và enzyme cắt giới h n .88
nh
3.7. Kết quả giải trình tự gen tách dịng Atore1 và so sánh với trình từ gen At5g39610
b ng ph n m m BioEdit. Vị tr mũi tên trên hình ch đo n ch n thêm của gen
ất
Atore1 trên v ng m hóa của gen At5g39610 ....................................................89
3.8. Hình vẽ cấu tr c vector chuyển gen Atore1 .......................................................91
3.9. Kết quả kiểm tra khuẩn l c mang gen Atore1 b ng P R và enzyme cắt giới h n .91
3.10. Kết quả điện di sản phẩm P R kiểm tra sự có mặt của gen Atore1 ở cây Arabidopsis
chuyển gen thế hệ T1 ..........................................................................................94
3.11. Hình thái lá của cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T1 .......................96
3.12. Kết quả điện di sản phẩm P R kiểm tra sự có mặt của gen Atore1 ở cây Arabidopsis
chuyển gen thế hệ T2 ........................................................................................96
xv
3.13. Biểu đ so sánh hàm lượng diệp lục chlorophyll giữa cây Arabidopsis chuyển
gen Atore1 và cây Arabidopsis đối chứng ol-wt ở giai đo n thu ho ch ........98
3.14. H t đậu tư ng nảy m m và m u biến n p......................................................101
3.15. Vi khuẩn mang gen được nuôi trải trên mơi trường LB
sau đó được
chuyển sang mơi trường LB lỏng để thu tế bào. Tế bào vi khuẩn được hịa tan b ng
mơi trường
M lỏng B để sử dụng cho biến n p gen ........................................102
3.16. họn lọc ch i chuyển gen sau 14 ngày trên môi trường SIM PPT 10mg/l ...109
3.17. Một số hình ảnh m u biến n p gen sau 5 ngày trên môi trường đ ng ni cấy
Lu
CCM ...............................................................................................................110
ận
3.18. Một số hình ảnh cây đậu tư ng chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM chứa
kháng sinh 10mg/l PPT ..................................................................................111
án
3.19. Hình ảnh cây đậu tư ng chuyển gen trên môi trường ra rễ RM ....................112
tiế
Tài liệu rẻ
3.20. ây đậu tư ng chuyển gen Atore1 thế hệ T0 giai đo n cảm ứng trong phịng
ni ................................................................................................................113
n
3.21. Hình ảnh sàng lọc cây đậu tư ng chuyển gen sau 3 ngày b ng thuốc diệt cỏ
sĩ
Basta ...............................................................................................................114
m
3.22. Kết quả phân t ch P R cây đậu tư ng chuyển gen tore1 thế hệ T0 ............116
3.23. Kết quả chọn lọc đậu tư ng chuyển gen T1 b ng thuốc diệt cỏ Basta ...........117
ới
3.24. Kết quả phân t ch biểu hiện của gen chọn lọc Bar b ng P R của các cây đậu
nh
tư ng chuyển gen T1.......................................................................................117
3.25. Kết quả phân t ch biểu hiện gen Atore1 của các cây đậu tư ng chuyển gen T1 .118
ất
3.26. Kết quả lai Southern của các dòng đậu tư ng mang gen Atore1 thế hệ T1 ...121
3.27. Biểu hiện kết quả chọn lọc cây đậu tư ng chuyển gen T2 b ng thuốc diệt cỏ
Basta ...............................................................................................................122
3.28. Kết quả phân t ch P R các cây đậu tư ng chuyển gen Atore1 thế hệ T2 ......125
3.29. Kết quả lai Southern của các dòng đậu tư ng mang gen Atore1 và thế hệ T2 ....126
3.30. Hình ảnh sàng lọc các dòng đậu tư ng chuyển gen Atore1 thế hệ T2 b ng thuốc
diệt cỏ Basta ...................................................................................................127
3.31. Kết quả sàng lọc dòng đậu tư ng chuyển gen Atore1 đ ng hợp tử ở thế hệ T3
xvi
b ng thuốc diệt cỏ Basta .................................................................................129
3.32. Hình thái cây đậu tư ng mang gen Atore1 đ ng hợp tử giai đo n thu ho ch so
với cây đậu tư ng không chuyển gen
/c ...................................................130
3.33. Kết quả phân t ch biểu hiện của gen chọn lọc Bar b ng P R của các cây đậu
tư ng chuyển gen T3.......................................................................................131
3.34. Hình thái cây đậu tư ng mang gen Atore1 đ ng hợp tử giai đo n thu ho ch so
với cây đậu tư ng không chuyển gen
/c ...................................................132
3.35. Kết quả lai Southern của các dòng đậu tư ng mang gen Atore1 đ ng hợp tử ....132
Lu
3.36. Kiểu hình tuổi thọ của lá ở các dòng đậu tư ng Atore1 ở giai đo n thu ho ch R8 141
án
n
tiế
Tài liệu rẻ
ận
3.37. Năng suất h t của dòng đậu tư ng biểu hiện Atore1 đột biến .......................142
sĩ
ới
m
ất
nh
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
ậu tư ng [Glycine max (L.) Merrill] được xếp vào cây tr ng nông nghiệp
quan trọng nhất. H t đậu tư ng được xếp trong 8 lo i h t có d u có giá trị kinh tế
và nhu c u sử dụng cao, được sản xuất và giao dịch phổ biến trên thj trường quốc tế
[10], [46]. Ở Việt Nam, đậu tư ng được xếp vào nhóm cây tr ng quan trọng thứ ba
sau l a và ngơ.
ng thời Việt Nam có ngu n gen đậu tư ng rất phong ph , riêng
t i v ng mi n n i ph a Bắc, n i sản xuất đậu tư ng lớn của cả nước chiếm khoảng
Lu
h n 65% diện t ch , hiện có nhi u ngu n gen bản địa quý như giống đậu tư ng
c Hà Bắc,
ận
Sông M ,
ọc
h m
ao B ng, Vàng Mường Khư ng, đậu tư ng
Hữu Lũng, đậu tư ng h t vàng L ng S n… ác giống này có khả năng chống chịu
án
tốt với đi u kiện ngo i cảnh, nhưng năng suất thấp [2], [3].
tiế
Tài liệu rẻ
Một thực tế ở Việt Nam hiện nay là: trong khi nhu c u sử dụng h t đậu tư ng
ngày càng cao thì diện t ch tr ng đậu tư ng của Việt Nam ngày cang giảm. Theo
n
báo của Bộ NN&PTNT diện t ch và sản lượng đậu tư ng của Việt Nam liên tục
sĩ
giảm d n qua các năm: năm 2010, diện t ch tr ng đậu tư ng là 197.800 ha, đến năm
m
2021 ch còn khoảng 37.000 ha, diện t ch giảm h n 75% và sản lượng giảm trên
70% so với năm 2010. Nguyên nhân của việc giảm nhanh v diện tich sản xuất là do
ới
cây đậu tư ng bị sâu bệnh phá ho i nặng, việc áp dụng tiến bộ kỹ thuật chậm h n so
nh
v i các cây tr ng khác, vì vậy năng suất đậu tư ng rất thấp ch đ t khoảng 1,5
tấn/ha b ng 50% năng suất của thế giới . Thực tr ng đó d n đến việc Việt Nam
ất
thiếu hụt 3,5 - 5,0 triệu tấn đậu tư ng/năm, trở thành nước nhập khẩu đậu tư ng
rấtlớn với kim ng ch 2 - 3 t USD/năm, g n tư ng v i giá trị xuất khẩu l a g o của
Việt Nam hiện nay. Thực tế trên cho thấy, để phát triển sản xuất đậu tư ng, Việt
Nam c n đ u tư đẩy m nh nghiên cứu t o các giống đậu tư ng có năng suất và chất
lượng cao phổ biến cho sản xuất [2], [3], [46].
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công tác chọn t o giống cây tr ng nói
chung và cây đậu tư ng nói riêng là hướng mới và hiệu quả ở các quốc gia nơng
nghiệp trên thế giới. Trong đó, chọn t o giống b ng công nghệ chuyển gen để t o
