Nghiên cứu phân tích genome có khả năng khử nitrat của vi khuẩn phân lập từ ruột của ấu trùng protaetia brevitarsis seulensis

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH GENOME CĨ
KHẢ NĂNG KHỬ NITRAT CỦA VI

KHUẨN PHÂN LẬP TỪ RUỘT CỦA ẤU
TRÙNG

Protaetia brevitarsis seulensis
Mã số: T2022-06-06

Chủ nhiệm đề tài: TS. Trần Thị Ngọc Thư

Đà Nẵng, 11/2023


DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU

STT Họ và tên Đơn vị công tác và lĩnh vực

01 TS. Nguyễn Thị Đông Phương chuyên môn
Khoa CNHH-MT, chuyên ngành

Công nghệ Sinh học

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC.......................................................................................................................ii
DANH MỤC BẢNG BIỂU............................................................................................iv
DANH MỤC HINH ẢNH...............................................................................................v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................vii
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................................viii
INFORMATION ON RESEARCH RESULTS.............................................................xi
MỞ ĐẦU.........................................................................................................................1
1.Tổng quan nghiên cứu trong và ngồi nước.................................................................1
2.Tính cấp thiết của đề tài................................................................................................2
3.Mục tiêu, đối tượng nghiên cứu của đề tài:..................................................................3
Mục tiêu...........................................................................................................................3
Đối tượng nghiên cứu......................................................................................................3
Phạm vi nghiên cứu.........................................................................................................3
4.Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu...................................................................3
Cách tiếp cận...................................................................................................................3
Phương pháp nghiên cứu.................................................................................................3
Nội dung nghiên cứu.......................................................................................................4
CHƯƠNG 1.....................................................................................................................5
1.1. Chu trình Ni tơ...........................................................................................................5
1.2. Vi khuẩn khử Nitrat.................................................................................................12
1.3. Cellulosimicbium....................................................................................................21
1.4. Phân tích tin sinh...................................................................................................22
1.4.1. Tin sinh học.........................................................................................................22
1.4.2. Phân tích metagenomics......................................................................................24
1.4.3. Sự phát triển của cơng nghệ giải trình tự thơng lượng cao..................................26
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................33
2.1. Nguyên liệu.............................................................................................................33

2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................33
2.2.1. Phân lập vi sinh vật từ ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis...........................34
2.2.2. Tách chiết DNA của vi khuẩn.............................................................................36

ii

2.2.3. Giải trình tự gen 16S rRNA của các vi khuẩn phân lập......................................36
2.2.4. Phân tích tin sinh học về khả năng khử nitrat của vi khuẩn phân lập..................38
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................39
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn từ ruột ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis trên
môi trường đặc hiệu.......................................................................................................39
3.1.1. Phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu.......................................39
3.1.2. Định danh các vi khuẩn phân lập bằng phương pháp sinh học phân tử..............40
3.2. Giải trình tự tồn bộ gen của chủng vi khuẩn có khả năng khử nitrat thuộc chi
Cellulosimicrobium........................................................................................................44
3.3. Phân tích con đường khử nitrat và so sánh bộ gen.................................................44
3.4. Dự đoán cụm gen sinh tổng hợp.............................................................................47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................................54
Kết luận.........................................................................................................................54
Kiến nghị.......................................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................55
PHỤ LỤC......................................................................................................................58
Một số đoạn 16S rRNA.................................................................................................58
Hình ảnh của đoạn gen kí gửi QJW35564.1 trên NCBI................................................60
Hình ảnh của Cellulosimicrobium protaetiae BI34 kí gửi trên NCBI...........................61
THUYẾT MINH ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
HỢP ĐỒNG TRIỂN KHAI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
PHỤ LỤC HỢP ĐỒNG
BẢNG MỤC LỤC MINH CHỨNG SẢN PHẨM ĐỀ TÀI
BỘ MINH CHỨNG SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI

iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1. Môi trường phân lập đặc hiệu...................................................................39
Bảng 3.2. Các chủng phân lập thuộc Cellulosimicrobium........................................41
Bảng 3.3. Bảng tổng hợp đặc điểm chung của các chủng Cellulosimicrobium phân lập
.................................................................................................................................. 45
Bảng 3.4. Dữ liệu bộ gen của Cellulosimicrobium và dự đoán các cụm gen sinh tổng
hợp............................................................................................................................. 47

iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Chu trình biến đổi N do sinh học điều khiển xảy ra trong môi trường biển và
đất liền tự nhiên và chịu ảnh hưởng của con người (Zhang et al. 2020).....................6
Hình 1 2. Quá trình cố định đạm tự nhiên...................................................................7
Hình 1 3. Sơ đồ q trình nitrat hóa............................................................................8
Hình 1 4. Loại bỏ nitơ bằng vi sinh vật trong xử lý nước thải (Kuypers et al. 2018).11
Hình 1 5. Cây phát sinh lồi dựa trên trình tự gen 16S rRNA một phần (1.334 bp) sử
dụng MEGA 5.2. Mối quan hệ phát sinh gen của các chất khử nitơ hiếu khí được báo
cáo khác nhau đã được tạo ra bằng phương pháp nối hàng xóm (1.000 lần lặp lại). Giá
trị Bootstrap trên 50% được hiển thị ở mỗi nút.(Ji et al. 2015)................................13
Hình 1 6. Tóm tắt con đường xác định, tương tác, loại bỏ nitơ của vi khuẩn khử nitơ dị
dưỡng-khử khí hiếu khí từ nước ni trồng thủy sản bằng cách sử dụng nuôi cấy tế bào
và metagenomics (Huang et al. 2020).......................................................................14
Hình 1 7. Định danh 80 chủng hoang dã và đánh giá an toàn sinh thái - sinh học của
chủng S16 và DS'5....................................................................................................15
Hình 1 8. Phản ứng tổng quát quá trình khử nitrat ở vi khuẩn(Albina et al. n.d.). 17

Hình 1 9. Sơ đồ biểu diễn chuỗi hơ hấp chính của q trình khử nitrat (Albina et al.
n.d.)........................................................................................................................... 18
Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn q trình điều hịa phiên mã sự biểu hiện của các gen mã
hóa các enzyme khác nhau liên quan đến quá trình khử nitrat ở P. denitrifican.......19
Hình 1.11. Sơ đồ trình bày các bước chính cần thiết để phân tích dữ liệu có nguồn gốc
metagenomics của WGS...........................................................................................25
Hình 1 12. Lịch sử phát triển giải trình tự.................................................................27
Hình 2.1. Ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis....................................................33
Hình 2.2. Bộ kit DNA NucleoSpin...........................................................................33
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu.......................................................................................34
Hình 2.4. Dung dịch mẫu được pha lỗng để cấy ria................................................35
Hình 2.5. Ngun lý tách chiết DNA sử dụng bộ kit DNA NucleoSpin...................36
Hình 2.6. Cấu trúc và mồi thiết kế cho 16S rRNA....................................................37
Hình 3 1. Kh̉n lạc trên mơi trường kị khí AB.......................................................39

v

Hình 3 2. Các chủng được tách ra từ các chủng phân lập và được xác định dựa trên
trình tự tương tự 16S rRNA......................................................................................41
Hình 3 3. Cây phát sinh lồi dựa trên trình tự gen 16S rRNA..................................43
Hình 3 4. Con đường chuyển hóa nitơ chính trong Cellulosimicrobium BI34 và các
gen liên quan. 1, nitrat khử (9); 2, men khử nitrit (5); 3, tổng hợp glutamine (2); 4,
glutamat dehydrogenaza (3); 5, tổng hợp glutamat (2). *Các số trong ngoặc minh họa
số lượng CDS liên quan đến gen...............................................................................46
Hình 3 5. Quy trình khử nitrat tổng quát của VSV phân lập từ Cellulosimicrobium52

vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BGCs: biosynthetic gene clusters

CDSs: Protein coding genes
COG: clusters of orthologous groups of proteins
HGAP: hierarchical genome assembly process
ncRNA: non-coding RNA
NRP: non-ribosomal peptide
SMRT: single-molecule real-time
RAST: rapid annotation subsystems technology
rRNA: ribosomal RNA
tRNA: transfer RNA
T3PKS: type III polyketide synthase

NRPS: Nonribosomal Peptide Synthetases

vii

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung:

-Tên đề tài: Nghiên cứu phân tích genome có khả năng khử nitrat của vi khuẩn
phân lập từ ruột của ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis

- Mã số: T2022-06

- Chủ nhiệm: TS. Trần Thị Ngọc Thư

- Thành viên tham gia: TS. Nguyễn Thị Đông Phương

- Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật, ĐH Đà Nẵng

- Thời gian thực hiện: là 09 tháng, từ tháng 03 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023

2. Mục tiêu:
 Phân lập được vi khuẩn Cellulosimicrobium sp. từ ruột ấu trùng Protaetia

brevitarsis seulensis.
 Phân tích các đoạn gen có khả năng khử nitrat của vi khuẩn phân lập được bằng

cách tiếp cận tin sinh.
3. Tính mới và sáng tạo:
Nghiên cứu sự đa dạng vi sinh vật trong ruột của ấu trùng Protaetia brevitarsis
seulensis và phân lập được chủng vi khuẩn khử nitrat bằng tiếp cận tin sinh để dự đốn
đặc tính khử nitrat và các đặc tính khác của chúng là một nghiên cứu mới, có ý nghĩa
thực tiễn và làm giảm quá trình thực nghiệm khi nghiên cứu xác định đặc tính này

4. Tóm tắt kết quả nghiên cứu:
Hiện nay ấu trùng của Protaetia brevitarsis seulensis đã được nghiên cứu như
một nguồn thực phẩm bổ dưỡng và cũng tập trung vào tác động môi trường của chúng.
Trong nghiên cứu này, hệ vi sinh vật đường ruột của ấu trùng của Protaetia
brevitarsis seulensis đã được nghiên cứu để làm sáng tỏ tác động và vai trò của chúng
đối với môi trường. Trong số các giống vi khuẩn phong phú được xác định dựa trên
gen 16S rRNA từ các chủng phân lập trong ruột của ấu trùng côn trùng Protaetia

viii

brevitarsis seulensis, sáu trong số các chi nổi bật được xác định là Bacillus (40,2%),

Cellulosimicrobium (33,5%), Microbacteria (2,8%), Streptomyces (3%),
Krasilnikoviella (17,5%) và Isoptericola (3%); và độ giống nhau của đoạn 16S rRNA
từ 99% thành 100%. Cellulosimicrobium protaetiae BI34T cho thấy hoạt tính khử
nitrat và phân hủy cellulose mạnh mẽ. Trình tự bộ gen mới hoàn chỉnh của BI34T và
bộ gen của năm lồi được cơng bố trong chi Cellulosimicrobium, tập trung vào các gen
khử nitrat và gen chuyển hóa thứ cấp. Để làm sáng tỏ mối quan hệ giữa chủng BI34T
và ấu trùng cơn trùng chủ, tồn bộ trình tự bộ gen được phân tích, sau đó so sánh với
bộ gen của 5 chủng trong cùng chi Cellulosimicrobium được nạp từ GenBank. Kết quả
của nghiên cứu cho thấy thành phần hệ vi sinh vật đường ruột của ấu trùng côn trùng
và phân tích dữ liệu bộ gen của chủng mới để dự đốn các đặc điểm của nó và hiểu
được con đường chuyển hóa nitơ.

5. Tên sản phẩm:

Bài báo đăng trên tạp chí có tên tạp chí thuộc danh mục SCIE/Q2: 01 bài báo

6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp
dụng:

 Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu
 Đối với lĩnh vực giáo dục và đào tạo: Hướng dẫn sinh viên nghiên cứu
khoa học và tốt nghiệp Đại học
 Đối với lĩnh vực kinh tế-xã hội: Thu thập được chủng vi khuẩn khử nitrat
để đưa vào ứng dụng xử lý.
 Phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu: Bàn giao trực tiếp sản phẩm
của đề tài cho Khoa Công nghệ Hóa học-Mơi trường, trường Đại học Sư
phạm Kỹ thuật, Đại học Đà Nẵng.

 Địa chỉ ứng dụng:
 Là tài liệu tham khảo giảng dạy cho các học phần Kỹ thuật phân tích trong

Công nghệ Sinh học/ Công nghệ Thực phẩm, Vi sinh thực phẩm cho các
sinh viên Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Cơng nghệ Hóa học-Mơi
trường, trường ĐH Sư phạm Kỹ thuật (100 sinh viên)
 Ứng dụng cho các trường Đại học và Cao đẳng trong địa bàn TP Đà
Nẵng.

ix


Mẫu 4. Thông tin kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh
INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1. General information:
Project title: Research on genome analysis of denitrifying bacteria isolated

from the gut of Protaetia brevitarsis seulensis larvae
Code number: T2022-06-06
Coordinator: Dr. Nguyen Thi Dong Phuong
Implementing institution: University of Technology and Education, The

University of Danang
Duration: from March, 2023 to November, 2022

2. Objective(s):
 Isolate the bacteria Cellulosimicrobium sp. from the larval gut of Protaetia
brevitarsis seulensis.
 Analyze gene segments capable of denitrification of isolated bacteria
using a bioinformatics approach.

3. Creativeness and innovativeness:

Studying the microbial diversity in the intestine of Protaetia brevitarsis
seulensis larvae and isolating a denitrifying bacterial strain using a bioinformatics
approach to predict their denitrifying properties and other properties is a new study.
has practical significance and reduces the experimental process when researching to
determine this characteristic

4. Research results:
The insect larvae Protaetia brevitarsis seulensis have been researched as a source of
nutritious food and also concentrated on their environmental impacts, recently. Therefore,
their gut microbiota have been studying to elucidate their effects and roles on environment. Of
the abundance bacterial genus identified based on the 16S rRNA genes from isolates of the
gut of insect larva Protaetia brevitarsis seulensis, six of the prominent genus were identified
as Bacillus (40.2%), Cellulosimicrobium (33.5%), Microbacterium (2.8%), Streptomyces
(3%), Krasilnikoviella (17.5%) and Isoptericola (3%); and their similarity of 16S rRNA blast
changed from 99 % to 100%. Cellulosimicrobium protaetiae BI34T showed strong
denitrification and cellulose degradation activity. The newly complete genome sequence of
BI34T and the genomes of five species published in the genus Cellulosimicrobium, with
emphasis on the denitrification genes and secondary metabolite genes. To elucidate the

xi

relationship between the strain BI34T and the host insect larva, the whole genome sequence
was analyzed, then was compared with the genomes of five strains in the same genus
Cellulosimicrobium loaded from GenBank. Our results revealed the composition of gut
microbiota of the insect larvae, and analyzing the genomic data for the new strain to predict
its characteristics and to understand the nitrogen metabolism pathway.

5. Products:
01 article published in the Journal of Molecular Biotechnology in the SCIE/Q2
category

6. Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability:
Guide students in scientific research and university graduation in the field of
education and training.
- Collect denitrifying bacteria strains to apply for treatment.
- Method of transferring research results: Directly hand over the project's
products to the Department of Chemical and Environmental Technology, University of
Technical Education, University of Danang.
- Application address:
o Used as a teaching material for Analytical Techniques courses in
Biotechnology/Food Technology, Food Microbiology for students of the Department
of Food Technology, Faculty of Chemical and Environmental Technology, University
of Technical Education and for Universities and Colleges in Da Nang City.

xii

MỞ ĐẦU

1. Tổng quan nghiên cứu trong và ngoài nước

Vi khuẩn khử nitrat sử dụng cả ba nguồn năng lượng có sẵn cho vi khuẩn bao
gồm các hợp chất carbon hữu cơ , hợp chất ni tơ vơ cơ và ánh sáng để hồn tất chu
trình chuyển hóa Ni tơ. Vi khuẩn khử nitrat chiếm 10–15% quần thể vi khuẩn trong
đất, nước và đá trầm tích [1]. Khử nitrat là một đặc điểm chức năng được tìm thấy
trong hơn 50 chi. Hầu hết các vi khuẩn có đặc điểm chức năng như các lồi
Alcaligenes, Pseudomonas[3] và Bacillus[4] cũng như Actinobacteria (đặc biệt là
Streptomycetes). Ngoài ra, trên một số nấm Fusarium và các chi biến hình có liên quan
(Gibberella và Nectria) cũng cho thấy khả năng khử nitrat[2]. Thông thường các chi
khử nitrat được phân lập từ đất, nước ao hồ, rễ cây họ đậu, bắp[5] nhưng chưa có
nhiều cơng bố về phân lập từ ruột các ấu trùng, trong khi ấu trùng hoặc cơn trùng
chính là một trong những tác nhân quan trọng làm tơi xốp đất đai. Các nghiên cứu các

chủng vi khuẩn từ ruột của ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis mới được nghiên
cứu gần đây đã cho thấy sự đa dạng các chủng vi sinh vật, nhất là chi
Cellulosimicrobium [6,7] có khả năng phân hủy cellulose mà chưa có nghiên cứu đề
cập đến khả năng khử nitrat.

Tại Việt Nam, các hợp chất nitơ trong môi trường nước nuôi thủy sản là amoni,
nitrit và nitrat, là những hợp chất gây độc cho cá, động vật thân mềm, giáp xác và cực
kỳ độc cho tôm. Các hợp chất ni tơ vô cơ này nếu không được xử lý sẽ tăng lên theo
cấp số nhân trong suốt thời vụ ni tơm. Do đó những năm gần đây, các nhà khoa học
trong nước cũng đã và đang nghiên cứu ứng dụng vi kh̉n khử nitrat, nitrat hóa vào
cơng nghiệp xử lý nước thải thủy hải sản, thực phẩm nhằm giảm thiểu các gốc chứa ni
tơ độc hại chủ yếu là các gốc amoni. Hoàng Phương Hà và cộng sự (2008) cũng đã
công bố đặc điểm sinh học 17 chủng vi kh̉n nitrat hóa phân lập từ nước lợ ni tơm
tại Quảng Bình và Hà Tĩnh [3], có các đặc điểm thuộc chi Nitrosomonas,
Nitrosobacteria và Nitrospira. Gần đây, nhóm tác giả này (2020) cũng đã công bố phân
lập được chủng BL 5 được xác định là Pseudomonas sp. BL5 ở hồ ni tơm nước lợ
tại Bạc Liêu, có khả năng khử nitrIte trong cả hai điều kiện kỵ khí và hiếu khí bằng
thực nghiệm hóa sinh và giải trình đoạn gen 16s RNA. Nguyễn Văn Minh và cộng sự
(2012) đã phân lập và sàng lọc vi khuẩn nitrat hóa từ 15 mẫu nước ao nuôi tôm thẻ
chân trắng và ao ni cá tra. Trong 3 chủng được lựa chọn có những đặc điểm phù hợp
với nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit dị dưỡng, thuộc chi Bacillus [4]. Võ Thị Xuân

1

Hương và cộng sự (2018) đã phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải nitrat trong dưa
cải muối chua bằng phương pháp thực nghiệm, đã ứng dụng vi khuẩn khử nitrat phân
lập được vào sản phẩm dưa cải muối chua nhằm giảm thiểu hàm lượng nitrat [5]. Các
nghiên cứu trong nước đều phân lập được các chủng vi khuẩn nitrat hóa từ các nguồn
thơng thường thơng qua các kỹ thuật thực nghiệm hóa sinh. Những nghiên cứu phân
lập chủng vi khuẩn khử nitrat cũng như sử dụng công cụ tin sinh cịn hạn hẹp.

2. Tính cấp thiết của đề tài

Nitơ là một trong những chất dinh dưỡng quan trọng cần thiết để tạo ra các
thành phần quan trọng như acid amin, protein, acid nucleic, v.v.. Ngay cả những cây to
lớn cũng cần được cung cấp Nitơ đầy đủ để phát triển và sản xuất. Nitơ chủ yếu được
hấp thụ qua rễ nhỏ dưới dạng amoni hoặc nitrat. Vì thế, quá trình khử nitrat là một quá
trình cơ bản trong các chu trình nitơ, và là cơ chế quan trọng để giải phóng nitơ trong
tự nhiên. Q trình này được xúc tác bởi bốn loại enzyme khử nitơ: nitrat reductase,
nitrit reductase, nitric oxide reductase và nitrous oxide reductase. Tuy nhiên, các
enzyme này hạn chế trong tự nhiên và cần được tổng hợp để bổ sung vào đất. Một số
lượng lớn vi sinh vật có thể khử nitrat và q trình này là phản ứng đối với sự thay đổi
nồng độ oxy trong môi trường xung quanh chúng. Khi nồng độ oxy bị hạn chế, vi sinh
vật sẽ chuyển từ hô hấp hiếu khí sang hơ hấp kỵ khí bằng cách sử dụng nitrat làm chất
nhận điện tử.

Vi sinh vật phổ biến tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình khử nitrat là các vi
khuẩn kỵ khí tùy tiện ví dụ như Alcaligenes, Pseudomonas và Bacillus, được phân lập
từ các vùng ao hồ, đất… là nơi chứa nhiều nitrat và được đưa vào nghiên cứu, ứng
dụng từ nhiều thập niên qua. Trong khi đó, ấu trùng hoặc cơn trùng chính là một trong
những tác nhân quan trọng làm tơi xốp đất đai, rất đa dạng chủng vi kh̉n nhưng chưa
có nhiều cơng bố về phân lập vi khuẩn khử nitrat từ nguồn này.

Ấu trùng của Protaetia brevitarsis seulensis đã được sử dụng làm thuốc truyền
thống của Hàn Quốc để điều trị một số bệnh hiểm nghèo như ung thư, bệnh viêm
nhiễm và viêm gan. Ấu trùng của Protaetia brevitarsis seulensis được Bộ An toàn
Thực phẩm và Dược phẩm Hàn Quốc phê duyệt là nguồn thực phẩm và ấu trùng cũng
chứa protein chất lượng cao làm nguồn thực phẩm trong tương lai. Do đó, nghiên cứu
sự đa dạng vi sinh vật trong ruột của ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis và phân
lập được chủng vi khuẩn khử nitrat bằng tiếp cận tin sinh để dự đốn đặc tính khử

2

nitrat và các đặc tính khác của chúng là một nghiên cứu mới, có ý nghĩa thực tiễn và
làm giảm quá trình thực nghiệm khi nghiên cứu xác định đặc tính này.

3. Mục tiêu, đối tượng nghiên cứu của đề tài:

Mục tiêu
 Phân lập được vi khuẩn Cellulosimicrobium sp. từ ruột ấu trùng Protaetia brevitarsis
seulensis.
 Phân tích các đoạn gen có khả năng khử nitrat của vi khuẩn phân lập được bằng
cách tiếp cận tin sinh.

Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn khử nitrat được phân lập từ ruột của ấu trùng Protaetia brevitarsis

seulensis, được thu thập ở Jeongeup, Hàn Quốc.

Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu phân tích genome có khả năng khử nitrat thuộc chi

Cellulosimicrobium từ ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis

4. Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

Cách tiếp cận
Trong nghiên cứu này, ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis được sử dụng để

phân lập vi khuẩn khử nitrat. Thông qua công cụ tin sinh, nghiên cứu sẽ thu thập các

chủng chứa bộ gen khử nitrat.

Phương pháp nghiên cứu
 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn từ ruột ấu trùng Protaetia brevitarsis
seulensis trên mơi trường đặc hiệu (MRS, hiếu khí, kị khí)… để thu nhận các
kh̉n lạc có sắc tố màu vàng, hình tròn và lồi để nghiên cứu.
 Giải trình tự gen 16S rRNA của các vi khuẩn phân lập
 Phương pháp sử dụng cơng cụ phân tích dữ liệu metagenomic Rapid
Annotation using Subsystem Technology (MR-RAST) phiên bản 4.0. Các giá
trị lai DNA-DNA kỹ thuật số (dDDH) được xác định thơng qua trình duyệt web
Genome Blast Distance Phylogeny phiên bản 2.1 từ DSMZ (//ggdc.dsmz.de) để
định danh và xây dựng cây phát sinh loài genome bằng phần mềm MEGA7.
 Lựa chọn và giải trình tự tồn bộ gen của chủng vi khuẩn có khả năng khử
nitrat thuộc chi Cellulosimicrobium bằng cách sử dụng kết hợp các công nghệ

3

giải trình tự RSII single molecule, real time (SMRT) của Pacific Bioscatics
(PacBio) và công nghệ giải trình tự Illuminate.
 Phương pháp dự đốn đặc tính khử nitrat của chủng vi khuẩn phân lập và dự
đoán cụm gen sinh tổng hợp bằng phần mềm antiSMASH phiên bản 5.0.
Nội dung nghiên cứu
 Nghiên cứu này thực hiện theo các bước sau ở quy mơ phịng thí nghiệm:
 Xây dựng đề cương nghiên cứu phân tích genome khả năng khử nitrat của vi
khuẩn phân lập
 Nghiên cứu lý thuyết phân tích genome khả năng khử nitrat của vi khuẩn phân
lập từ ruột của ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis
 Phân lập các chủng vi khuẩn từ ruột ấu trùng Protaetia brevitarsis seulensis
trên môi trường đặc hiệu
 Tiến hành nuôi cấy sàng lọc các chủng vi khuẩn trích ly từ ruột ấu trùng trên

các môi trường kị khí, hiếu khí, MRS, các kh̉n lạc có sắc tố màu vàng, hình
trịn và lồi là hình thái thơng thường của các chủng vi khuẩn khử nitrat, được
sàng lọc để nghiên cứu.
 Giải trình tự gen 16S rRNA của các vi khuẩn phân lập được
 Lựa chọn và giải trình tự tồn bộ gen của chủng vi khuẩn có khả năng khử
nitrat thuộc chi Cellulosimicrobium
 Phân tích tin sinh đặc tính khử nitrat của chủng vi khuẩn phân lập và dự đoán
cụm gen sinh tổng hợp
Cấu trúc báo cáo của đề tài nghiên cứu
Kết quả của đề tài được tóm lược qua 3 chương như sau:
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu các nghiên cứu trong và ngoài nước
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Kết luận và kiến nghị

4

CHƯƠNG 1

1.1. Chu trình Ni tơ

Nitơ là nguyên tố có nhiều nhất trong bầu khí quyển Trái đất. Bầu khí quyển
chứa gần 79% Nitơ. Nitơ có mặt trong tất cả các sinh vật sống, dưới dạng protein, axit
amin và axit nucleic DNA và RNA, trong khi trong khí quyển, nó hiện diện ở dạng
phân tử (N₂) và ở dạng một số oxit. Ở dạng nguyên tố, nó là một loại khí khơng màu
và khơng mùi, thực vật và động vật không thể sử dụng, nhưng sau khi kết hợp với Oxy
và các nguyên tố khác, nó có thể được các sinh vật sống sử dụng làm chất dinh dưỡng.
Chu trình nitơ được gọi là “chu trình hồn hảo” trong sinh quyển vì nó duy trì tổng
hàm lượng nitơ trong khí quyển, đất và nước (Zilli et al. 2019)(Zhang, Ward, and

Sigman 2020).

Định nghĩa chu trình nitơ
Chu trình Nitơ có thể được định nghĩa là dịng Nitơ tuần hồn từ khí nitơ tự do

trong khí quyển đến Nitrat trong đất, và cuối cùng quay trở lại Nitơ khí quyển. Chu
trình Nitơ là một phần của Sinh học và nó đóng vai trị quan trọng trong việc duy trì sự
cân bằng nitơ trong mơi trường và có liên quan chặt chẽ với chu trình Carbon. Một
phần protein thực vật được động vật tiêu thụ và chuyển hóa thành protein động vật,
phần cịn lại bị phân hủy sau khi cơ thể thực vật phân hủy, giải phóng nitơ vào khí
quyển. Những protein này cũng phân hủy thành chất thải chứa nitơ như urê, axit uric
và amoniac ở động vật và được bài tiết ra ngồi. Sau đó, các chất phân hủy sẽ tác động
lên xác chết và chất thải của động vật, giải phóng nitơ tự do trở lại khí quyển. Nitơ
được tuần hồn từ mơi trường đến sinh vật và sau đó quay trở lại môi trường bằng
nhiều con đường (Zilli et al. 2019)(Zhang et al. 2020).

Hình 1.1. là Chu trình biến đổi N do sinh học điều khiển xảy ra trong môi trường
biển và đất liền tự nhiên và chịu ảnh hưởng của con người bao gồm các bước:

- Cố định nitơ (N2) (bước 1)
- đồng hóa Nitơ (từ amoni, nitrat hoặc N hữu cơ)
- Các q trình đồng hóa, trong khi khống hóa (bước 3),
- Nitrat hóa (bước 4−6), DNRA (bước 7,15 ),
- Khử nitrat (bước 7−11)
- Anammox (oxy hóa amoni kỵ khí, bước 12−14)

5

Các nguồn N cố định phi sinh học đi vào chu trình N sinh học dưới dạng amoni
và nitrat (Zhang et al. 2020).

Hình 1.1. Chu trình biến đổi N do sinh học điều khiển xảy ra trong môi trường biển và
đất liền tự nhiên và chịu ảnh hưởng của con người (Zhang et al. 2020).

(1) Cố định đạm:
Nitơ có mặt trong khoảng 79% bầu khí quyển trái đất, nhưng hầu hết các sinh
vật sống không thể sử dụng trực tiếp dạng nitơ này. Quá trình khử nitơ trong khí quyển
(N₂) thành ion amoni được gọi là cố định Nitơ.
Cố định nitơ vật lý:
Trong tổng số nitơ được cố định bởi các cơ quan tự nhiên, khoảng 10% trong số
này xảy ra do các quá trình vật lý như sét (tức là phóng điện), giơng bão và ơ nhiễm
khí quyển.
Sét và bức xạ tia cực tím trong khí quyển tạo điều kiện cho sự kết hợp giữa khí
nitơ và oxy để tạo thành oxit nitric (NO). Các oxit nitric lại bị oxy hóa bằng oxy để tạo
thành nitơ peroxide (NO2).

N2+O2 ————> 2NO (Khi có sấm chớp)

2NO+O2 ————–> 2NO2 (Sự oxy hóa)
Nitơ peroxide này có thể kết hợp với nước trong mưa để tạo thành axit nitơ và
axit nitric. Các axit rơi xuống đất cùng với nước mưa và phản ứng với các gốc kiềm để
tạo ra nitrat hòa tan trong nước (NO3–) và nitrit (NO2–).

6