Nhom 10 báo cáo thiết bị và kĩ thuật cnsh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

SỬ DỤNG KĨ THUẬT LAMP PHÁT HIỆN
Toxoplasma Gondii KÍ SINH TRONG RUỘT MÈO

Ngành học : Cơng nghệ sinh học
Nhóm thực hiện : 10
Mã môn học : 211402
Niên khóa : 2021-2025

TP. HCM, tháng 10 năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

SỬ DỤNG KĨ THUẬT LAMP PHÁT HIỆN
Toxoplasma Gondii KÍ SINH TRONG RUỘT MÈO

Giảng viên hướng dẫn : TS. Huỳnh Văn Biết
Ths. Trương Quang Toản

Sinh viên thực hiện :

Nguyễn Thị Kiều Vân 21126575 DH21SHA
21126576 DH21SHA
Nguyễn Thúy Vân 21126589 DH21SHA

Võ Thị Tường Vy

TP. HCM, tháng 10 năm 2023

MỤC LỤC

1.Đặt vấn đề.....................................................................................................................1
2. Nguyên lí của kĩ thuật LAMP .....................................................................................2
2.1 Mục đích, của kĩ thuật LAMP ...................................................................................2
2.2 Thành phần của phản ứng LAMP .............................................................................2
2.3 Nguyên lí của phản ứng LAMP.................................................................................2
3. Kết quả.........................................................................................................................4
3.1. Đánh giá thông qua độ đục của hỗn hợp phản ứng ..................................................4
3.2. Sử dụng thuốc nhuộm...............................................................................................4
4. Ưu điểm và nhược điểm ..............................................................................................5
5.Tài liệu tham khảo ........................................................................................................6

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1. Q trình hình thành cấu trúc vịng ở hai đầu của 2 cặp trình tự với nhau 3
Hình 2. Quá trình tổng hợp nhiều đoạn DNA .........................................................3
Hình 3. Biểu đồ thể hiện độ đục của sản phẩm LAMP.. .........................................4
Hình 4. Sử dụng thuốc nhuộm Calcein để quan sát kết quả của phản ứng LAMP…..
................................................................................................................................. .5

1.Đặt vấn đề:
Toxoplasma gondii, là loại ký sinh trùng trong cơ thể sinh vật sống, gây ra bệnh

toxoplasmosis lây truyền qua thực phẩm ở người và động vật.Thường gặp ở những

người có hệ miễn dịch kém gây ra những vấn đề nghiêm trọng như viêm não, nhiễm
trùng mắt hoặc có thể sinh non, sảy thai, gặp cái bệnh về mắt, não bộ đối với người
mang thai nhiễm loại ký sinh trùng này.
Mèo, là vật chủ của T. gondii ,sinh sản hữu tính trong đường ruột mèo, sau đó qua q
trình bài tiết của mèo hàng triệu nang trứng đi ra môi trường. Con người, động vật nhiễm
bệnh thơng qua đất, nước, thực vật, thực phẩm có chứa nang trứng do mèo thải ra.
Vì vậy, việc phát hiện nhanh những con mèo bị nhiễm bệnh là rất quan trọng để tránh
lây truyền bệnh toxoplasmosis. Người ta sử dụng PCR, Real-time PCR để chẩn đoán T.
gondii tuy nhiên có những hạn chế, bao gồm giá thành cao, thiết bị đắt tiền, không thể
sử dụng trong điều kiện thường.
Thay vào đó, kĩ thuật LAMP dùng để khuếch đại DNA ở điều kiện đẳng nhiệt được ứng
dụng trong phát hiện T. gondii,có ưu điểm nhanh, đặc hiệu và nhạy, chỉ cần môi trường
ổn nhiệt để thực hiện khuếch đại trong 1 giờ rồi phát hiện gen mục tiêu.

1

2. Nguyên lí của kĩ thuật LAMP

2.1 Mục đích, của kĩ thuật LAMP
Mục đích: khuếch đại DNA ở điều kiện đẳng nhiệt thông qua cấu trúc móc hay kẹp

tóc.

2.2 Thành phần của phản ứng LAMP
Thành phần bao gồm: DNA khuôn mẫu, DNA polymerase, Primer, dNTPs, dung

dịch đệm, MgCl2, H2O (free nuclease).

* Điểm khác biệt so với phản ứng PCR:

Bảng 1.Đặc điểm khác biệt của phản ứng PCR và phản ứng LAMP

Phản ứng PCR Phản ứng LAMP

+ Primer: 1 cặp (1F+1R) nhận biết 2 vị trí + Primer: 2 cặp (2F+2R) nhận biết 6 vị trí

+ DNA polymerase: Nhiều loại + DNA polymerase: Chỉ dùng Bst

(Bacillus stearothermophilus)
+ Chu trình nhiệt: Biến tính, bắt cặp, kéo + Chu trình nhiệt: ~ 65oC

dài

2.3 Nguyên lí của phản ứng LAMP
Các bước phản ứng diễn ra như sau:

Bước 1: Mồi xi FIP chứa trình tự F2 sẽ bổ sung vào mạch DNA ở vị trí F2c.
Bước 2: DNA polymerase thực hiện kéo dài sợi DNA mới từ mồi FIP.
Bước 3: Mồi ngoài F3 bổ sung vào F3c và được kéo dài. Sự tổng hợp sợi DNA mới bởi
mồi này và DNA polymerase dẫn đến giải phóng sợi DNA tổng hợp từ mồi FIP.
Bước 4: Sợi đơi DNA được hình thành từ sợi khuôn và mồi F3.
Bước 5: Sợi đơn DNA được tổng hợp từ mồi FIP và khuôn được giải phóng. Vì đầu 5’
của sợi này có chứa 2 trình tự bổ sung nhau là F1c và F1 nên hình thành cấu trúc vịng
Bước 6: Sợi DNA được tạo ra từ bước 5 sẽ làm khuôn cho mồi BIP tổng hợp sợi mới và
mồi B3 sẽ có chức năng như F3 là tổng hợp sợi mới và giải phóng sợi DNA mồi BIP.
Bước 7: Sợi đơi DNA được hình thành từ mồi B3 và sợi được tổng hợp từ bước 5.
Bước 8: Sợi DNA được tổng hợp từ mồi BIP và sợi chứa mồi FIP sẽ hình thành cấu trúc
vòng ở 2 đầu do sự bổ sung của 2 cặp trình tự với nhau.

2

Hình 1.Q trình hình thành cấu trúc vịng do sự bổ sung ở hai đầu của 2 cặp trình tự với nhau
Bước 9: F2 của FIP bám vào F2c của mạch đơn trong đoạn DNA vòng và tổng hợp kéo dài.
Bước 10-11: Cịn đoạn mạch đơn cịn lại từ trình tự 3’ của đầu B1 cũng tổng hợp kéo dài và
giải phóng cấu trúc quả tạ (cấu trúc này ngược với cấu trúc tạo ở bước 8). Tiếp tục giống như
từ bước 8 đến bước 11, cấu trúc ở bước 11 dẫn đến quá trình tổng hợp DNA tự mồi bắt đầu từ
đầu 3’ trong đoạn B1. Kết quả của quá trình này là nhiều cấu trúc DNA kép bao gồm các trình
tự lặp đi lặp lại luân phiên đảo ngược trình tự đích được ngăn cách với nhau bởi các loop trong
cùng một sợi trên 1 phân tử DNA kép.

Hình 2.Quá trình tổng hợp nhiều đoạn DNA

3

3. Kết quả
3.1. Đánh giá thông qua độ đục của hỗn hợp phản ứng

Khi DNA đích được khuếch đại bởi LAMP, một chất kết tủa trắng bắt nguồn từ
magnesiun pyrophosphate - một sản phẩm phụ của phản ứng LAMP - sẽ xuất hiện. Có
thể quan sát và so sánh độ đục với mẫu âm tính, nếu đục hơn là dương tính; hoặc tiến
hành đo độ hấp thụ ở 650 nm, nếu đạt đến 0,1 là dương tính.

Hình 3. Biểu đồ thể hiện độ đục của sản phẩm LAMP. PP là đối chứng dương được lấy từ
plasmid chứa gen B1, NC là đối chứng âm chứa H2O. Trục tung là độ đục của sản phẩm LAMP,
trục hồnh là thời gian phản ứng tính bằng phút.
3.2. Sử dụng thuốc nhuộm

Trong bài viết này, người ta sử dụng thuốc nhuộm Calcein - một chất fluorophore
liên kết ion kim loại, được thêm vào trước khi ủ đẳng nhiệt. Calcein trong hỗn hợp phản
ứng ban đầu kết hợp với ion Mn2+ và khơng phát tín hiệu. Khi phản ứng khuếch đại diễn

ra, ion Mn2+ tách khỏi Calcein và kết hợp với pyrophosphate (sản phẩm phụ của phản
ứng LAMP) tạo ra phức hợp muối khơng hịa tan là mangan – pyrophosphate. Lúc này
có sự phát huỳnh quang.

Calcein tự do có khả năng kết hợp với ion Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng và tăng
cường phát huỳnh quang. Có thể dễ dàng quan sát được dưới ánh sáng tia cực tím ở

4

bước sóng 365 nm. Phản ứng giữa Mg2+ và Calcein còn làm biến đổi màu từ cam sang
xanh, có thể quan sát được bằng mắt thường dưới ánh sáng tự nhiên. Phản ứng LAMP
dương tính được biểu thị bằng màu xanh lá cây, trong khi phản ứng LAMP âm tính được
biểu thị bằng màu cam.

Chỉ cần một giờ hoạt động trong môi trường đẳng nhiệt và hiệu ứng khuếch đại
có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Điều quan trọng là không cần phải tháo nắp ống phản
ứng để quan sát kết quả và điều này ở một mức độ nhất định có thể tránh được tình trạng
ơ nhiễm khí dung của mẫu trong quá trình khuếch đại LAMP.

Hình 4. Sử dụng thuốc nhuộm Calcein để quan sát kết quả của phản ứng LAMP. PP là đối
chứng dương được lấy từ plasmid chứa gen B1, NC là đối chứng âm chứa H2O.
4. Ưu điểm và nhược điểm
- Ưu điểm:

+ Nhanh, đặc hiệu và nhạy
+Chỉ cần môi trường ổn nhiệt để thực hiện khuếch đại trong 1 giờ để phát hiện
gen mục tiêu
+ Kết quả có thể được quan sát ngay dưới ánh sáng thường hoặc soi dưới tia UV
+ Khơng u cầu thiết bị như máy ln nhiệt, có thể khơng cần đến năng lượng
điện do có thể sử dụng túi ấm hoặc túi giữ nhiệt

 Phát hiện nhanh, có tính di động cao, hiệu quả kinh tế cao và giảm thời gian vận
chuyển.
- Nhược điểm: dễ bị ơ nhiễm khí dung và có khả năng dẫn đến kết quả dương tính giả

5

5. Tài liệu tham khảo
1. Sheng, L., et al. (2023). "Rapid and visual detection of Toxoplasma gondii oocyst

in cat feces using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay."
Scientific Reports 13(1): 17269.
2. Wong, Y. P., Othman, S., Lau, Y. L., Radu, S., & Chee, H. Y. (2018). Loop-
mediated isothermal amplification (LAMP): a versatile technique for detection
of micro-organisms. Journal of applied microbiology, 124(3), 626–643.
/>
6