Tb và kt cnsh

Đại học Nông Lâm TPHCM

THIẾT BỊ VÀ
KỸ THUẬT CNSH

Giáo viên hướng dẫn: TS. Huỳnh Văn Biết
1

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT
DROPLET DIGITAL PCR

ĐỂ PHÁT HIỆN NHIỄM
TRÙNG VI KHUẨN

Mycobacteria tuberculosis

2

THÀNH Lưu Nguyễn Tứ Anh - 21126274
VIÊN Trượng Hoàng Minh Yến - 21126343
Mai Cơng Thành - 21126500
NHĨM
3

1 2

ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ GIỚI THIỆU VỀ
MỤC TIÊU BỆNH LAO

Nội 3 4
dung

chính DROPLET ỨNG DỤNG
DIGITAL PCR

(ddPCR)

5

KẾT LUẬN

4

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ

• Lao phổi xảy ra khi vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis (M. tuberculosis)
trực tiếp tấn công phổi và phá hủy các mơ tế bào của cơ quan này.

• Sự phát triển nhanh chóng của cơng nghệ sinh học phân tử đã khắc
phục được những hạn chế về thời gian và độ nhạy thấp của phương
pháp nhuộm và nuôi cấy nhanh axit để chẩn đốn bệnh lao.

• Droplet Digital PCR (ddPCR) và ứng dụng của nó trong bệnh lao, với hy
vọng khơi dậy những ý tưởng mới trong phòng ngừa và điều trị bệnh
lao.

5

1.2. MỤC TIÊU

Dùng sinh học phân tử nhằm định lượng, chuẩn đoán sớm
và phát hiện ra vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis (M.

tuberculosis) là nguyên nhân chính gây ra bệnh lao (hay
còn gọi là Lao phổi) bằng phương pháp
Droplet Digital PCR là phương pháp định lượng acid
nucleoic với độ nhạy cao và không cần đường chuẩn.

6

2. GIỚI THIỆU VỀ
BỆNH LAO

7

2.1. Bệnh lao là
gì?

• Bệnh lao (TB), do nhiễm Mycobacteria
tuberculosis (MTB), thường ảnh hưởng
đến phổi nhất.

• Bệnh lao lây lan qua khơng khí khi người
mắc bệnh lao phổi ho, hắt hơi hoặc khạc
nhổ.

• Tồn tại hai tình trạng liên quan đến bệnh
lao: nhiễm lao tiềm ẩn (LTBI) và bệnh lao

8

2.2. Giới thiệu về vi khuẩn
Mycobacteria tuberculosis

(MTB)

• Mycobacteria tuberculosis (MTB), còn
được gọi là trực khuẩn Koch, là một loài
vi khuẩn gây bệnh thuộc họ
Mycobacteriaceae và là tác nhân gây
bệnh lao.

9

3.1. MỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA CÁC KỸ
THUẬT PCR ĐỜI TRƯỚC

1. Kết quả định lượng hoàn toàn phụ thuộc vào đường chuẩn
2. Chỉ phân biệt được sự khác biệt về hàm lượng DNA giữa 2

mẫu khi sự khác biệt này lớn hơn 2 lần

3. Kết quả bị sai lệch lớn khi có chất ức chế phản ứng trong
mẫu DNA hoặc RNA.

10

3.2. Droplet • Kỹ thuật được sử dụng trong sinh học phân tử để
Digital PCR định lượng và phân tích các mẫu DNA hoặc RNA.
– ddPCR là gì?
• Dựa trên phân vùng, kỹ thuật số, chia mẫu
thành hàng nghìn giọt có kích thước nanolit, mỗi
giọt chứa một số lượng nhỏ phân tử mục tiêu.

• Sự khuếch đại của các phân tử mục tiêu xảy ra
trong mỗi giọt, cho phép định lượng tuyệt đối
các phân tử mục tiêu có trong mẫu ban đầu

• ddPCR thường được sử dụng trong nghiên cứu di
truyền, chẩn đốn và y học chính xác.

11

3.3. Nguyên lý hoạt động của Droplet Digital PCR (ddPCR)

12

4. ỨNG DỤNG DROPLET
DIGITAL PCR TRONG

CHUẨN ĐOÁN NHIỄM VI
KHUẨN Mycobacteria
tuberculosis

13

Định lượng Chẩn đoán bệnh lao
Mycobacterium ở bệnh nhân nhiễm

tuberculosis HIV

• Phát hiện và định lượng thành cơng MTB • Sự khuếch đại dương tính của các trình tự
trong huyết tương bệnh nhân lao đặc hiệu MTB (IS6110 và gyrB) trong huyết
tương của bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch

• Định lượng các phân tử mục tiêu có bản sao nặng.
thấp với độ chính xác và độ nhạy cao hơn,
phát hiện các mục tiêu DNA đặc hiệu MTB 14
(IS6110) trong các mẫu máu tồn phần

• Định lượng tuyệt đối và độ nhạy cao trong
các mẫu máu tồn phần từ những trẻ sơ
sinh khơng có các triệu chứng hơ hấp sớm
và khó lấy được đờm.

Phát hiện bệnh lao Mycobacteria Phát hiện nhiễm trùng lao
trong các mẫu khác nhau tiềm ẩn

• Trong các mẫu máu tồn phần • Phát hiện MTB trong tế bào CD34 + đơn nhân
• Trong exosome (IS6110) máu ngoại vi từ những người trưởng thành
• Phát hiện trong mẫu đường hô hấp không có triệu chứng có kết quả xét nghiệm
• Trong mẫu bệnh lý và đánh giá độ nhạy của dương tính với IGRA

ddPCR để phát hiện MTB trong các mẫu được • Cần phân lập từng tế bào có nhân riêng lẻ,
cố định bằng formalin và nhúng parafin (FFPE) điều này rất phức tạp và hạn chế ứng dụng
lâm sàng.

Phát hiện nhiễm trùng Mycobacteria leprae

• Sử dụng qPCR và ddPCR để phát hiện hai mục tiêu DNA nhạy cảm
(RLEP và GroEL) của trực khuẩn bệnh phong và sau đó đánh giá độ
nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp.

15

5. KẾT LUẬN

Sự kết hợp giữa công nghệ vi lỏng ddPCR là phương pháp định lượng
và PCR mang lại cho ddPCR những để phát hiện axit nucleic với độ nhạy
đặc tính độc đáo và ngày càng được cao, độ tái lập cao và khơng có
sử dụng trong các lĩnh vực lâm sàng đường chuẩn

Trở thành một phương pháp mới để
chẩn đoán bệnh lao và chuẩn đoán
ở những bệnh nhẫn nhiễm HIV.

16

MỘT SỐ
HẠN CHẾ

• Mặc dù các dụng cụ và thuốc thử cho ddPCR
đều có sẵn trên thị trường nhưng giá thành
cao hạn chế việc sử dụng rộng rãi

• Việc lựa chọn mục tiêu phát hiện và thiết lập
ngưỡng phát hiện cũng là thách thức đối với
việc ứng dụng ddPCR vào thực hành lâm
sàng.

• Việc thiết lập các đường ngưỡng cho giọt
dương và giọt âm có thể làm sai lệch kết
quả.

17

Tài Fan Y, Chen J, Liu M, et al. Application of Droplet Digital PCR to Detecti
liệu on of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae Infection
THAM s: A Narrative Review. Infect Drug Resist. 2022;15:1067-1076. Publishe
KHẢO d 2022 Mar 15. doi:10.2147/IDR.S349607

Labrador, Jorge & Garberi, Federico & Garberi, Juan & Peneipil, Julian &
Garberi, Miguel & Scigliano, Luis & Troncoso, Alcides. (2011). Diagnosis of
Mycobacterium tuberculosis using molecular biology technology. Asian
Pacific journal of tropical biomedicine. 1. 89-93. 10.1016/S2221-
1691(11)60002-6

/> phoi/

/>
/>
18

THANK YOU FOR LISTENING

Have a good day

19