Tieu luan thiet bi va ky thuat cnsh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DROPLET DIGITAL PCR ĐỂ PHÁT
HIỆN NHIỄM TRÙNG VI KHUẨN Mycobacteria tuberculosis

Môn học : Thiết bị và kỹ thuật trong CNSH

Tp. Thủ Đức, ngày 27 tháng 10 năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DROPLET DIGITAL PCR ĐỂ PHÁT
HIỆN NHIỄM TRÙNG VI KHUẨN Mycobacteria tuberculosis

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện
TS. HUỲNH VĂN BIẾT MAI CƠNG THÀNH
Th.S. TRƯƠNG QUANG TOẢN TRƯỢNG HỒNG MINH YẾN
LƯU NGUYỄN TỨ ANH

Tp. Thủ Đức, ngày 27 tháng 10 năm 2023

DANH SÁCH NHÓM

STT Họ và tên Mssv Tỉ lệ hoàn thành
21126500 100%
1 Mai Công Thành 21126343 100%
21126274 100%
2 Trượng Hoàng Minh Yến

3 Lưu Nguyễn Tứ Anh

i

MỤC LỤC

Trang
DANH SÁCH NHÓM......................................................................................................i
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................... iii
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU...................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Muc tiêu....................................................................................................................1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................2
2.1. Giới thiệu về bệnh lao ..............................................................................................2
2.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis (MTB) ...................................2
2.1.2. Thực trạng bệnh lao trên toàn thế giới ..................................................................3
2.2. Áp dụng kỹ thuật phân tử vào chẩn đoán bệnh lao ..................................................4
2.3. Droplet Digital PCR (ddPCR) ..................................................................................4
2.3.1. Droplet Digital PCR – ddPCR là gì?.....................................................................5
2.3.2. Máy Bio-Rad® QX100™ Droplet Digital™ PCR................................................5
2.3.2.1. Nguyên lí cấu tạo................................................................................................5

2.3.2.2. Nguyên lí hoạt động ...........................................................................................5
2.3.3. Ưu điểm của Droplet Digital PCR (ddPCR) .........................................................7
CHƯƠNG 3. ỨNG DỤNG DROPLET DIGITAL PCR TRONG CHUẨN ĐOÁN
NHIỄM VI KHUẨN Mycobacteria tuberculos ..............................................................9
3.1. Định lượng Mycobacterrium tuberculosis ...............................................................9
3.2. Chuẩn đoán bệnh lao ở bệnh nhân nhiễm HIV ........................................................9
3.3. Phát hiện bệnh lao Mycobacteria trong các mẫu khác nhau ..................................10
3.4. Phát hiện nhiễm trùng lao tiềm ẩn..........................................................................10
3.5. Phát hiện nhiễm trùng Mycobacteria leprae ..........................................................11
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN .............................................................................................12
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................13

ii

ddPCR DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
PCR
TB : Droplet Digital PCR
MTB : Polymerase Chain Reaction
LTBI : Tuberculosis
WHO : Mycobacteria tuberculosis
HIV : Latent TB infection
RT-PCR : World Health Organization
DNA : Human Immuno-deficiency Virus
RNA : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
qPCR : Deoxyribonucleic acid
gyrB : Acid ibonucleic
LAM : Real-time Polymerase Chain Reaction
FFPE : Gyrase subunit B
IGRA : Lipoarabinomannan
PB : Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue

: Interferon-Gamma Release Assays
: Paucibacillar

iii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Lao phổi xảy ra khi vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis (M. tuberculosis) trực tiếp

tấn công phổi và phá hủy các mô tế bào của cơ quan này. Đây là một căn bệnh đe dọa
nghiêm trọng đến sức khỏe con người và giết chết gần hai triệu người mỗi năm.

Tuy nhiên, các cơng nghệ chẩn đốn và xét nghiệm độ nhạy hiện có cịn tốn nhiều
thời gian và do đó khó đạt được mục tiêu chẩn đốn sớm và phát hiện độ nhạy cảm của
thuốc. Qua đó sự phát triển nhanh chóng của cơng nghệ sinh học phân tử đã khắc phục được
những hạn chế về thời gian và độ nhạy thấp của phương pháp nhuộm và nuôi cấy nhanh
axit để chẩn đốn bệnh lao, do đó có thể dần dần đạt được chẩn đốn bệnh lao nhanh chóng
và chính xác. Các cơng cụ chẩn đốn tiên tiến với độ đặc hiệu, độ nhạy và tự động hóa cao
hơn đang được phát triển. Bài viết này giới thiệu một kỹ thuật chẩn đoán phân tử mới,

Droplet Digital PCR (ddPCR) và ứng dụng của nó trong bệnh lao, với hy vọng khơi dậy

những ý tưởng mới trong phòng ngừa và điều trị bệnh lao.
1.2. Mục tiêu

Dùng sinh học phân tử nhằm định lượng, chuẩn đoán sớm và phát hiện ra vi khuẩn
Mycobacteria tuberculosis (M. tuberculosis) là ngun nhân chính gây ra bệnh lao (hay cịn
gọi là Lao phổi) bằng phương pháp Droplet Digital PCR là phương pháp định lượng acid
nucleoic với độ nhạy cao và không cần đường chuẩn.

1

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về bệnh lao

Hình 2.1. Đường lây truyền chủ yếu của bệnh lao

Bệnh lao (TB), do nhiễm Mycobacteria tuberculosis (MTB), thường ảnh hưởng đến
phổi nhất nhưng vi khuẩn lao có thể tấn cơng bất kỳ bộ phận nào của cơ thể như thận, cột
sống và não. Không phải ai bị nhiễm vi khuẩn lao cũng bị bệnh. Kết quả là tồn tại hai tình
trạng liên quan đến bệnh lao: nhiễm lao tiềm ẩn (LTBI) và bệnh lao, là một bệnh truyền
nhiễm mãn tính đe dọa sức khỏe cộng đồng trong nhiều năm. Bệnh lao lây lan qua khơng
khí khi người mắc bệnh lao phổi ho, hắt hơi hoặc khạc nhổ. Một người chỉ cần hít phải
một vài vi trùng là có thể bị nhiễm bệnh.
2.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis (MTB)

Mycobacteria bệnh lao (MTB), còn được gọi là trực khuẩn Koch, là một loài vi khuẩn
gây bệnh thuộc họ Mycobacteriaceae và là tác nhân gây bệnh lao. Được phát hiện lần đầu
tiên vào năm 1882 bởi Robert Koch, Mycobacteria bệnh lao có một lớp phủ sáp bất thường
trên bề mặt tế bào của nó chủ yếu là do sự hiện diện của axit mycolic. Lớp phủ này làm cho
tế bào không bị nhiễm vi khuẩn Gram và kết quả là MTB có thể có biểu hiện Gram dương
yếu.

2

Hình 2.2. Vi Khuẩn Mycobacteria tuberculosis

Mycobacterium Tuberculosis là một trực khuẩn dài từ 3 - 5 μm, hai đầu trịn, khơng

có lơng và có đặc điểm là kháng cồn kháng acid (khơng bị cồn và acid làm mất màu đỏ của
thuốc nhuộm Fuchsin). Khả năng tồn tại trong điều kiện tự nhiên của Vi khuẩn trong khoảng
3 - 4 tháng.

Ở nhiệt độ 42oC vi khuẩn lao có thể ngừng phát triển, ở 100oC vi khuẩn sẽ chết sau
10 phút và bị tiêu diệt bởi cồn 90o.

2.1.2. Thực trạng của bệnh lao trên toàn thế giới

Khoảng một phần ba dân số thế giới bị nhiễm MTB. Khoảng 8 triệu ca nhiễm mới và
2 triệu ca tử vong do bệnh lao xảy ra hàng năm. Năm 2013, ước tính có khoảng 9 triệu ca
mắc và 1,5 triệu ca tử vong trên toàn thế giới. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và 194 quốc
gia thành viên Liên Hợp Quốc đã thông qua chiến lược của WHO nhằm chấm dứt bệnh lao
tại Đại hội đồng Y tế Thế giới năm 2014, nhằm giảm 95% số ca tử vong do bệnh lao và
giảm tỷ lệ mắc mới của bệnh lao. Tỷ lệ chẩn đoán bệnh lao là 90% trong khoảng thời gian
từ 2015 đến 2035. Theo Báo cáo bệnh lao toàn cầu năm 2020 của WHO, có gần 10 triệu
bệnh nhân lao mới và 2 tỷ bệnh nhân lao tiềm ẩn trên toàn thế giới vào năm 2019.

Những người bị nhiễm vi khuẩn lao có nguy cơ mắc bệnh lao từ 5–10% trong đời.
Những người có hệ thống miễn dịch bị tổn hại, chẳng hạn như người nhiễm HIV, suy dinh
dưỡng hoặc tiểu đường, hoặc những người sử dụng thuốc lá, có nguy cơ mắc bệnh cao hơn,

3

1,3 triệu ca tử vong ở những người âm tính với HIV (phạm vi, 1,2 triệu-1,5 triệu) và 0,38
triệu ca tử vong ở những người dương tính với HIV (phạm vi, 0,32 triệu-0,45 triệu).
2.2. Áp dụng kỹ thuật phân tử vào chuẩn đoán bệnh lao

Các xét nghiệm khuếch đại axit nucleic ngày càng được sử dụng để phát hiện nhanh
bệnh lao, đặc biệt là PCR định lượng dựa trên huỳnh quang thời gian thực (real-time PCR),

vì đây có thể là phương pháp chẩn đốn nhanh và nhạy. Kết quả RT-PCR cũng được sử
dụng như một yếu tố xác nhận có giá trị khi quyết định nên tiếp tục hay bỏ điều trị chống
lao. Mặc dù RT-PCR vẫn là tiêu chuẩn vàng để định lượng axit nucleic nhưng nó khơng
phù hợp để phát hiện những khác biệt nhỏ. Hơn nữa, việc định lượng RT-PCR nhìn chung
khơng chính xác vì nó phụ thuộc vào việc so sánh các mẫu chưa biết với đường cong chuẩn.
Do đó dùng một công nghệ mới nổi được gọi là Droplet Digital PCR (ddPCR) là một giải
pháp thay thế tiềm năng cho RT-PCR thông thường để phát hiện vi sinh vật.
2.3. Droplet Digital PCR (ddPCR)

Hình 2.3. Máy Bio-Rad® QX100™ Droplet Digital™ PCR

4

2.3.1. Droplet Digital PCR – ddPCR là gì?
Droplet Digital PCR (ddPCR) là một kỹ thuật được sử dụng trong sinh học phân tử

để định lượng và phân tích các mẫu DNA hoặc RNA. Đây là phương pháp PCR dựa trên
phân vùng, kỹ thuật số, chia mẫu thành hàng nghìn giọt có kích thước nanolit, mỗi giọt
chứa một số lượng nhỏ phân tử mục tiêu. Sự khuếch đại của các phân tử mục tiêu xảy ra
trong mỗi giọt, cho phép định lượng tuyệt đối các phân tử mục tiêu có trong mẫu ban đầu.
ddPCR thường được sử dụng trong nghiên cứu di truyền, chẩn đoán và y học chính xác.
2.3.2. Máy Bio-Rad® QX100™ Droplet Digital™ PCR
2.3.2.1. Nguyên lí cấu tạo

Máy QX100™ ddPCR bao gồm một phần mô-đun ngưng tụ, phần mô-đun nạp mẫu
và phần mô-đun đọc kết quả .

Phần mô-đun ngưng tụ: Đây là phần điều khiển chính của máy và chứa tất cả các thiết
bị điều khiển và cảm biến. Nó kiểm sốt q trình polymerase chain reaction (PCR) danh
định và tạo ra điều kiện để tạo ra các giọt digital (ddPCR) theo kỹ thuật tạo giọt.

Phần mô-đun nạp mẫu: Phần này chứa các ống nạp mẫu và bảng điều khiển đóng/mở
van tự động. Nó cho phép người dùng nạp mẫu DNA hoặc RNA cùng với các primers,
enzym và fluorophore vào hệ thống.

Phần mô-đun đọc kết quả: Đây là phần thu nhận tín hiệu quang phổ từ các giọt digital.
Nó sử dụng một laser cho phép phân loại các giọt dựa trên sự hiện diện và mức độ
fluorescence. Kết quả được đưa ra dưới dạng một biểu đồ sốt nhiệt digital cho biết số giọt
tích cực và số giọt âm tính, từ đó xác định mật độ của các tín hiệu gen trong mẫu.
2.3.2.2. Nguyên lí hoạt động

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

5

Kết hợp mẫu DNA, mồi và đầu dò với supermix Bio-Rad ddPCR để tạo ra tám mẫu
đã chuẩn bị. Nạp 20 l mẫu đã chuẩn bị vào các giếng lẻ của hộp tạo giọt nhỏ dùng 1 lần
tám kênh.

Bước 2: Tạo vi giọt

Bằng một thiết bị đặc biệt của hãng Bio-Rad gọi là Droplet Generator, một phản
ứng 20 μL ở trên sẽ được phân chia ngẫu nhiên thành 20.000 vi giọt có thể tích khoảng
1 nL. Mỗi vi giọt này chứa đầy đủ các thành phần của 1 phản ứng Real-time PCR như
trên và trở thành 1 phản ứng nhỏ. Các phân tử DNA sẽ được phân bố ngẫu nhiên vào các
vi giọt này.

Bước 3: Thực hiện PCR
Tất cả 20.000 vi giọt được tạo ra từ 1 phản ứng ban đầu sẽ được chuyển vào 1 giếng
trong đĩa PCR 96 giếng và được đặt vào máy PCR thông thường. Thực hiện PCR đến

điểm cuối (40 chu kỳ) bằng máy quay vịng nhiệt, DNA có trong mỗi vi giọt sẽ được nhân
bản như một phản ứng PCR thơng thường. Tín hiệu huỳnh quang tạo ra do mẫu dò hoặc
chất phát quang sẽ được tích tụ trong từng vi giọt, tùy vào số lượng DNA mục tiêu được
phân bố vào vi giọt.
Bước 4: Đọc giọt

Sau khi phản ứng PCR kết thúc, các vi giọt sẽ được phân tích bởi một thiết bị đọc
huỳnh quang. Thiết bị này hoạt động theo cơ chế giống như flow cytometer. Từng vi giọt

6

trong mỗi ống chứa ở bước 3 sẽ được hút vào đường ống của thiết bị và lần lượt đi qua
các đầu đọc tín hiệu huỳnh quang. Cường độ tín hiệu của mỗi màu huỳnh quang có trong
mỗi vi giọt sẽ được đầu đọc ghi nhận lại và bằng phát hiện quang học hai màu để xác định
giọt nào chứa mục tiêu (+) và giọt nào không chứa (-).

Bước 5: Phân tích kết quả
Kết quả đọc của tất cả vi giọt được tạo ra từ từng phản ứng ban đầu sẽ được chuyển sang
phần mềm ddPCR đọc các giọt dương tính và âm tính trong mỗi mẫu và vẽ biểu đồ từng
giọt huỳnh quang: khoảng 1,4 triệu giọt được đọc trên mỗi đĩa 96 giếng. Tổng số vi giọt
dương tính (chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang cao hơn hẳn so
với những vi giọt trong phản ứng chứng âm). Tổng số vi giọt âm tính (khơng chứa) DNA
mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang ngang ngửa với những vi giọt trong phản
ứng chứng âm).

2.3.3. Ưu điểm của Droplet Digital PCR (ddPCR)
PCR kỹ thuật số giọt vượt qua hiệu suất của các kỹ thuật PCR kỹ thuật số trước đó

bằng cách giải quyết tình trạng thiếu cơng nghệ thực tế và có thể mở rộng trước đây để triển
khai PCR kỹ thuật số. Việc pha lỗng hàng loạt tốn nhiều cơng sức và có thể xảy ra lỗi khi

sử dụng pipet; các hệ thống dựa trên chip cạnh tranh dựa vào sơ đồ chất lỏng phức tạp để
phân vùng. PCR kỹ thuật số giọt giải quyết những thiếu sót này bằng cách phân chia hàng
loạt mẫu trong pha lỏng trong một bước. Việc tạo ra hàng chục nghìn giọt có nghĩa là một

7

mẫu có thể tạo ra hàng chục nghìn điểm dữ liệu thay vì một kết quả duy nhất, mang sức
mạnh của phân tích thống kê vốn có của PCR kỹ thuật số vào ứng dụng thực tế. Hệ thống
PCR kỹ thuật số giọt dịch của Bio-Rad tự động hóa quy trình làm việc ddPCR bao gồm tạo
giọt dịch, chu trình nhiệt, đọc giọt dịch và phân tích dữ liệu, giúp phịng thí nghiệm nghiên
cứu đang làm việc có thể tiếp cận công nghệ này.

8

CHƯƠNG 3. ỨNG DỤNG DROPLET DIGITAL PCR
TRONG CHUẨN ĐOÁN NHIỄM VI KHUẨN Mycobacteria

tuberculosis

3.1. Định lượng Mycobacterium tuberculosis

Định lượng mầm bệnh là một chỉ số tiềm năng để xác định kết quả điều trị và dự đoán
tái phát, đồng thời định lượng ngày càng được đề xuất như một công cụ giúp quản lý nhiễm
trùng lao. Việc áp dụng ddPCR cung cấp một phương pháp mới để định lượng chính xác
mầm bệnh MTB. Phát hiện và định lượng thành công MTB trong huyết tương bệnh nhân
lao bằng ddPCR. ddPCR cũng có thể được sử dụng để định lượng các phân tử mục tiêu có
bản sao thấp với độ chính xác và độ nhạy cao hơn sử dụng ddPCR để phát hiện các mục
tiêu DNA đặc hiệu MTB (IS6110) trong các mẫu máu tồn phần. Kết quả cho thấy ddPCR
có thể được sử dụng để phát hiện các trình tự đặc hiệu MTB từ máu toàn phần. Đây là lần
đầu tiên ddPCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng bệnh lao, tạo cơ sở cho việc khám

phá ddPCR như một xét nghiệm chẩn đoán phân tử định lượng đối với các bệnh truyền
nhiễm. Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu cịn áp dụng ddPCR vào chẩn đốn bệnh nhân lao
trẻ sơ sinh. Họ phát hiện ra rằng ddPCR cũng cho thấy ưu điểm về định lượng tuyệt đối và
độ nhạy cao trong các mẫu máu toàn phần từ những trẻ sơ sinh khơng có các triệu chứng
hơ hấp sớm và khó lấy được đờm.

3.2. Chẩn đốn bệnh lao ở bệnh nhân nhiễm HIV

Sử dụng ddPCR để phát hiện MTB trong huyết tương của bệnh nhân bị suy giảm miễn
dịch nặng. Phương pháp nhuộm nhanh axit cũng như qPCR của các mẫu đờm, máu và nước
tiểu của bệnh nhân này đều không phát hiện thấy sự hiện diện của MTB, trong khi kết quả
ddPCR cho thấy sự khuếch đại dương tính của các trình tự đặc hiệu MTB (IS6110 và gyrB).
Sự hiện diện của nhiễm trùng MTB lan tỏa đã được xác nhận ở bệnh nhân khi khám nghiệm
tử thi sau đó. Đồng nhiễm MTB với virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) chiếm
8,2% số ca mắc lao mới và là nguyên nhân gây tử vong phổ biến nhất do bệnh lao. Vì nhiều
lý do khác nhau, mẫu đờm của bệnh nhân có thể khơng có hoặc mẫu đờm âm tính, dẫn đến

9

việc chẩn đốn bệnh lao khơng hiệu quả và kịp thời. Mặc dù việc phát hiện
lipoarabinomannan (LAM) trong nước tiểu đã được áp dụng trong chẩn đoán bệnh lao ở
bệnh nhân HIV nhưng các bộ dụng cụ thương mại hiện tại vẫn thiếu độ nhạy.

3.3. Phát hiện bệnh lao Mycobacteria trong các mẫu khác nhau

Có thể sử dụng ddPCR để phát hiện MTB trong các mẫu máu toàn phần, các nghiên
cứu về việc sử dụng ddPCR cho một loạt nghiên cứu điều tra việc phát hiện MTB trong các
mẫu bệnh lý, exosome và các mẫu vật khác đã được phát triển. Các nhà khoa học đã cung
cấp một phương pháp mới để phát hiện trình tự cụ thể MTB trong exosome (IS6110) bằng
ddPCR. Họ đã sử dụng ddPCR để phát hiện 190 mẫu đường hô hấp từ những bệnh nhân

nghi mắc bệnh lao. So với nuôi cấy, ddPCR cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu tốt hơn, và
xét nghiệm ddPCR sử dụng exoDNA có độ nhạy cao hơn tổng số DNA.

ddPCR còn được sử dụng để phát hiện các trình tự đặc hiệu của MTB (IS6110) trong
65 mẫu bệnh lý và đánh giá độ nhạy của ddPCR để phát hiện MTB trong các mẫu được cố
định bằng formalin và nhúng parafin (FFPE). Trong số 65 mẫu, 45 mẫu được xác định là
bệnh nhân có khả năng mắc bệnh lao (giá trị Ct nằm trong khoảng từ 37 đến 40) bằng cách
sử dụng qPCR. ddPCR đã cải thiện tỷ lệ dương tính của bệnh nhân lao có thể xảy ra lên
57,8%, điều này cho thấy độ nhạy cao hơn của ddPCR trong việc phát hiện MTB trong các
mẫu FFPE.

3.4. Phát hiện nhiễm trùng lao tiềm ẩn

Việc chứa MTB trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi CD34 + giúp khắc phục các điều
kiện bất lợi, bao gồm tình trạng thiếu oxy, tấn cơng miễn dịch và điều trị bằng thuốc, do đó
cho phép hiện diện lâu dài trong vật chủ. Các tế bào gốc tạo máu mang glycoprotein CD34
làm chất đánh dấu bề mặt có thể đại diện cho các hốc sinh thái của MTB trong quá trình
nhiễm lao tiềm ẩn và việc phát hiện sự hiện diện của MTB trong các tế bào này có thể cung
cấp thơng tin có giá trị cho việc chẩn đoán bệnh lao tiềm ẩn. Các nhà khoa học đã sử dụng
ddPCR để phát hiện MTB trong tế bào CD34 + đơn nhân máu ngoại vi từ những người
trưởng thành khơng có triệu chứng có kết quả xét nghiệm dương tính với IGRA. Điều này
cho thấy việc phát hiện DNA MTB trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi có tiềm năng ứng

10

dụng trong chẩn đoán, theo dõi và điều trị dự phòng nhiễm lao tiềm ẩn. Tuy nhiên, phương
pháp này đòi hỏi phải phân lập từng tế bào có nhân riêng lẻ, điều này rất phức tạp và hạn
chế ứng dụng lâm sàng.
3.5. Phát hiện nhiễm trùng Mycobacteria leprae

Ứng dụng ddPCR trong chẩn đoán nhiễm Mycobacteria leprae cũng đã được nghiên
cứu. Các nhà khoa học đã phát triển phương pháp phát hiện ddPCR để chẩn đoán bệnh
phong bằng cách sử dụng qPCR và ddPCR để phát hiện hai mục tiêu DNA nhạy cảm (RLEP
và GroEL) của trực khuẩn bệnh phong và sau đó đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của
phương pháp. Họ nhận thấy độ nhạy của ddPCR cao hơn so với qPCR trong việc phát hiện
Mycobacteria leprae trong các mẫu sinh thiết da có lượng vi khuẩn ít trực khuẩn (PB) từ
bệnh nhân (79,5% so với 36,4%).

11

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN

Sự kết hợp giữa công nghệ vi lỏng và PCR mang lại cho ddPCR những đặc tính độc
đáo và ngày càng được sử dụng trong các lĩnh vực lâm sàng như bệnh truyền nhiễm, khối
u, phân tích số lượng bản sao virus. ddPCR là phương pháp định lượng để phát hiện axit
nucleic với độ nhạy cao, độ tái lập cao và khơng có đường chuẩn. Việc áp dụng ddPCR
trong chẩn đốn bệnh lao để phát hiện các trình tự đặc hiệu MTB trong các mẫu có thể trở
thành một phương pháp mới để chẩn đoán bệnh lao và chuẩn đoán ở những bệnh nhẫn
nhiễm HIV.

Tuy nhiên, vẫn còn một số hạn chế cần khắc phục để sử dụng rộng rãi ddPCR trong
môi trường lâm sàng. Thứ nhất, mặc dù các dụng cụ và thuốc thử cho ddPCR đều có sẵn
trên thị trường nhưng giá thành cao hạn chế việc sử dụng rộng rãi. Thứ hai, việc lựa chọn
mục tiêu phát hiện và thiết lập ngưỡng phát hiện cũng là thách thức đối với việc ứng dụng
ddPCR vào thực hành lâm sàng. Việc thiết lập các đường ngưỡng cho giọt dương và giọt
âm có thể làm sai lệch kết quả. Để làm cho ddPCR trở nên hữu ích hơn trong việc phát hiện
MTB, phải đặt ngưỡng phát hiện phù hợp. Ngoài ra, tầm quan trọng của việc phát hiện
ddPCR dấu vết DNA trong chẩn đốn, điều trị và phịng ngừa các bệnh lâm sàng cần được
khám phá thêm. Tóm lại, việc giảm chi phí và tiêu chuẩn hóa các quy trình và điều kiện
ddPCR là cần thiết để ddPCR được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng.

Mặc dù có một số hạn chế, ddPCR có tiềm năng lớn trong việc kiểm sốt sự lây truyền
bệnh lao qua khơng khí, nhưng cần có những nỗ lực lớn hơn để khám phá phương pháp này
nhằm ngăn chặn MTB và bảo vệ sức khỏe con người.

12

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Fan Y, Chen J, Liu M, et al. Application of Droplet Digital PCR to Detection of
Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae Infections: A Narrative Review.
Infect Drug Resist. 2022;15:1067-1076. Published 2022 Mar 15.
doi:10.2147/IDR.S349607
Labrador, Jorge & Garberi, Federico & Garberi, Juan & Peneipil, Julian & Garberi, Miguel
& Scigliano, Luis & Troncoso, Alcides. (2011). Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis
using molecular biology technology. Asian Pacific journal of tropical biomedicine. 1. 89-
93. 10.1016/S2221-1691(11)60002-6
/> /> />
13