Tbktcnsh nhóm9

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

MÔN HỌC: THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

XÁC ĐỊNH CÁC GENE MÃ HÓA TINH THỂ ĐỘC CRY
CỦA CHỦNG VI KHUẨN Bacillus thuringensis var. kurstaki

BẰNG PCR

Giảng viên hướng dẫn Nhóm sinh viên thực hiện
TS. HUỲNH VĂN BIẾT
ĐẶNG QUỐC ĐẠI - 21126261

TRẦN LÊ HÙNG - 21126355

NGUYỄN TRỌNG KHÔI - 21126377

Thủ Đức, ngày 27 tháng 10 năm 2023

NỘI DUNG CHÍNH

1. Chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis
2. Gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
3. Vật liệu và nguyên lý
4. Khuếch đại trình tự 16S-rDNA và gen cry của các chủng vi khuẩn
B. thuringiensis var. kurstaki
5. Kết luận

1

1. Chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (viết tắt: Bt) là vi khuẩn Gram dương Bt có khả năng tổng
hợp protein gây tệ liệt ấu trùng của một số lồi cơn trùng gây hại

Bacillus thuringiensis var. kurstaki ( Btk ) là một nhóm vi khuẩn được sử dụng
làm tác nhân kiểm soát sinh học chống lại loài lepidopterans (bướm và bướm
đêm).

Giới (regnum) Eubacteria

Ngành (phylum) Firmicutes

Lớp (class) Bacilli

Bộ (ordo) Bacillales

Họ (familia) Bacillaceae

Chi (genus) Bacillus

Loài (species) B. thuringiensis

Bảng 1. Bảng phân loại khoa học của B. thuringiensis Hình 1. Cấu tạo vi khuẩn Bacillus thuringiensis

2

2. Gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Các chủng khác nhau thuộc loài B. thuringiensis sinh ra hai loại độc tố chính:

+ Độc tố tinh thể (cry) được mã hóa bởi các gen cry khác nhau
+ Các chất độc phân giải tế bào (cyt) tác động riêng rẽ và tổ hợp cùng cry làm tăng tác
dụng của tinh thể độc

Để xác định sự tồn tại gen cry trong các chủng B.
thuringiensis phân lập, sử dụng kỹ thuật PCR với các
cặp mồi đặc hiệu với các gen đó. Các tinh thể diệt côn
trùng cry được mã hóa bởi rất nhiều gen cry khác nhau.

Hình 2. Mơ hình cấu trúc protein tinh thể độc tố cry

3

Việc định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử nhằm xác định chính xác được dịng vi
khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki mang các gen cry

• Nhóm gen cry1 mã hóa protein tinh thể diệt cơn trùng bộ cánh vảy
• Nhóm gen cry2 mã hóa protein tinh thể có khả năng diệt côn trùng bộ cánh

vảy và hai cánh
• Nhóm cry4 mã hóa protein tinh thể có khả năng diệt cơn trùng bộ hai cánh
• Nhóm cry9 mã hóa protein tinh thể diệt cơn trùng bộ cánh vảy và cánh cứng

4

3. Vật liệu và nguyên lý

3.1. Vật liệu Hình 3. Máy luân nhiệt
(PCR)
• Các chủng vi khuẩn B. thuringiensis phân

lập từ mẫu đất

• Máy luân nhiệt (PCR)
• Máy điện di, máy vortex, máy chụp gel,

máy li tâm.

3.2. Nguyên lý

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép nhân bản in vitro một đoạn DNA
dựa vào cơ chế sao chép DNA trong tự nhiên ở sinh vật

5

4. Khuếch đại trình tự 16S-rDNA và gen cry của các chủng vi khuẩn
B. thuringiensis var. kurstaki

Ly trích DNA PCR Điện di
Đọc kết quả

6

Gen Tên mồi Trình tự Sản phẩm
16Sr PCR (bp)
Cry1 63F 5’ – CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC – 3’
1489R 5’ – TAC CTT GTT ACG ACT TCA – 3’ 1,5 kb
Cry2 Un1(F)
Un1(R) 5’ – CAT GAT TCA TGC GGC AGA TAA AC – 3’ 277
Cry4 Un2(F) 5’ – AAT GGG AAG CAG AAG TGT CAC AA – 3’ 701
Cry9 Un2(R) 5’ – GTT ATT CTT AAT GCA GAT GAA TGG G – 3’ 498

2AaR 5’ – CGG ATA AAA TAA TCT GGG AAA TAG T – 3’ 546
2AbR 725
5’ – GAG ATT AGT CGC CCC TAT GAG – 3’
2AcR 439
Un4(F) 5’ – TGG CGT TAA CAA TGG GGG GAG AAA T – 3’
Un4(R) 351
5 – GCG TTG CTA AT AGT CCC AAC AAC A – 3’
Un9(F) 5’- GCA TAT GAT GTA GCG AAA CAA GCC – 3’
Un9(R)
5’ – GCG TGA CAT ACC CAT TTC CAG GTC C – 3’

5’ – CGG TGT TAC TAT TAG CGA GGG GGG – 3’
5’ – GCT TGA GCC GCT TCA CAG CAA TCC – 3’

Bảng 2. Trình tự primer sử dụng khuếch đại gen cry của vi khuẩn B. thuringiensis var. kusrtaki

7

Hình 4. Kết quả điện di sản phấm PCR vùng 16S-rDNA M: thang chuẩn 1 Kb; (1) chủng VBt246.1, (2)
chủng VBT2119.1, (3) chủng VBt21110.1, (4) chủng VBt22210.2, (5) chủng VBt25211.1, (6) chủng
VBt283.2, (7) chủng VBt2847, (8) chủng VBt2735, (9) chủng VBt26310.1, (10) chủng VBt27322.2, (11)
chủng VBt27525.1, (12) chủng VBt27526.1, (13) chủng VBt2762.2, (14) chủng VBt27618.2, (15) đối
chứng âm, (16) đối chứng dương (vi khuẩn B. thuringiensis var. kurstaki)

8

5. Kết luận

Kết quả giải trình tự được kiểm tra có trùng khớp với vùng gen cry1, cry2, cry4, cry9
và đối chứng dương (chủng B. thuringiensis var. kurstaki) trên ngân hàng gene.

Trình tự DNA (sản phẩm Kích thước Mức độ tương Trình tự tham chiếu (số hiệu
PCR/primer giải trình tự) (bp) đồng (%) GenBank)

Bt var kurstaski (cry2A) 677 96 MH475907.1, CP009999.1
VBt2110.1 (cry1Aa, cry1Ac) MT892766
VBt27525.1 (cry1Aa, cry1Ac) 512 100
VBt27526.1 (cry1Aa, cry1Ac) MT892767
VBt2735 (cry1Aa, cry1Ac) 512 100 MT892768
VBt27611 (cry2A) MT892769
VBt21110.1 (cry2A) 512 100 MW194253
MW194254
512 100

672 100

672 100

Bảng 3. So sánh một số kết quả giải trình tự với dữ liệu gen của GenBank bằng
công cụ BLAST- NCBI

9

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Porcar, M., & Juárez-Pérez, V. (2003). PCR-based identification ofBacillus thuringiensispesticidal
crystal genes. FEMS Microbiology Reviews, 26(5), 419–432. doi:10.1111/j.1574-
6976.2003.tb00624.x

2. Cơ chế tác dụng của Bacillus thuringiensis, Viện công nghệ sinh học và ứng dụng vi sinh miền

Nam, năm 2018
3. Ben-Dov E.Q., Zaritsky A., Dahan E., Barak Z., Sina R., Manasherob R., 1997. Extended
screening by PCR for seven cry group genes from field collected strains of Bacillus thuringiensis.
Applied of environmental microbiolology, 63, 4883 – 4890.
4. Wang, J., Boets, A., Van Rie, J., Ren, G., 2003. Characterization of cry1, cry2, and cry9 genes in
Bacillus thuringiensis isolates from China. Journal of Invertebrate Pathology 82, 63 – 71.
5. Bravo, A., Sarabia, S., Lopez, L., Ontiveros, H., Abarca, C., Ortiz, A., Quintero, R., 1998.
Characterization of cry genes in a Mexican Bacillus thuringiensis strain collection. Applied of
environmental microbiolology, 64.
6. Katara, J. L., Kaur, S., Kumari, G. K., Singh, N. K. 2016. Prevalence of cry2- type genes in Bacillus
thuringiensis isolates recovered from diverse habitats in India and isolation of a novel cry2Af2 gene
toxic to Helicoverpa armigera (cotton boll worm). Canadian Journal of Microbiology, 62(12), 1003 –
1012.

10

CẢM ƠN THẦY
VÀ CÁC BẠN ĐÃ THEO DÕI!