PCR và ứng dụng trong y học

• I. Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR

• II. Ngun lí hoạt động của PCR

• III. Một số ứng dụng của PCR trong y học
• Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR

trong việc lấy mẫu đem phân tích

• 1. Xác định quan hệ huyết thống

• 2. Xác định bệnh lao nhờ vsv

• 3. Xác định bệnh HIV, HBV, HCV, KST,
Dengue virus

• 4. Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định thành phần ,
cơ cấu ký sinh trùng sốt rét

I.Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR

• Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu
trong tế bào, nhà hóa sinh người Mĩ
Karry Mullis đã phát minh ra kĩ thuật
tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR)
vào năm 1985. PCR là phương pháp in
vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù
nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide
gắn vào 2 sợi đơi của đoạn DNA đích với
sự tham gia của DNA polymerase.

• Phản ứng PCR được thực
hiện qua 3 giai đoạn trong 1
chu kì:
- Giai đoạn biến tính
(denaturation)
- Giai đoạn bắt cặp
(annealing)
- Giai đoạn kéo dài
(elongaction)
Chu kì này được lặp đi
lặp lại từ 20 - 40 lần và cho ra
các sản phẩm cuối cùng của
PCR là các đoạn DNA hoặc
RNA phiên bản. Số lượng các
bản sao này được tính theo
hàm số mũ.

Máy PCR


II.Nguyên lí hoạt động của PCR

1. Các thành phần tham gia vào
phản ứng PCR ( PCR mix):

• - DNA khn
• - Taq. DNA polymerase.
• - d NTPs (dATP, dCTP, dGTP,

dTTP).

• - Primer ( oligonucleotide).
• - PCR buffer.

2. Ba giai đoạn phản ứng PCR
thực hiện trên máy luân nhiệt
(Thermalcycles)

- Giai đoạn biến tính
(denaturation): 92 – 98 độ C

- Giai đoạn bắt cặp (annealing)
45 thoi gian 20s-2phut

- Giai đoạn kéo dài
(elongaction) nhiệt độ 68-72

Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc lấy
mẫu đem phân tích

Các bệnh phẩm y học


Ly trích pre - nucleic acide


Ly trích acide nucleic tinh

khiết



PCR ( RT - PCR)

 Thực hiện xét nghiệm chẩn
Phân tích phát hiện sản phẩm đoán bằng PCR
PCR bằng quang phổ hay điện

di

Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR

• 1. Lấy mẫu: ADN có thể

tách chiết từ những mẫu

khác nhau, như máu tươi,

máu khô, tế bào niêm mạc,

nước xúc miệng, tóc, da,

phân, v.v... Mẫu có thể lấy

tại chỗ hoặc gửi từ xa hàng

nghìn kilơmet, mất nhiều Lấy mẫu đem phân tích
ngày, trong phong bì bình

thường, qua bưu điện, khơng

cần bảo quản lạnh.

• 2. Tách chiết ADN: Nhiều Tách chiết ADN
quy trình tách chiết ADN
khác nhau của thế giới đã
được nghiên cứu, thử
nghiệm và thích ứng với
điều kiện nước ta. Do vậy,
góp phần giảm giá thành,
tiết kiệm kinh phí. Với
mỗi loại mẫu có một quy
trình tách chiết thích hợp
riêng. Đảm bảo chất lượng
và số lượng ADN từ
những lượng mẫu nhỏ.

• 3. Nhân ADN đặc hiệu: Nhân ADN đặc hiệu
Đây là khâu quan trọng nhất
của quy trình. Các hỗn hợp
hoá chất khác nhau và các
chu trình nhiệt khác nhau đã
được thử nghiệm cho từng
cặp mồi. Trên cơ sở đó, đã
tối ưu hoá thành phần của
từng hỗn hợp, từng chu trình
nhiệt cho từng cặp mồi, dựa
vào những hố chất sẵn có
trên thị trường trong nước

• 4. Điện di: Điện di được Điện di
dùng để tách biệt các đoạn

ADN có độ dài ngắn khác
nhau. Độ tách biệt này phụ
thuộc nhiều yếu tố. Các yếu
tố đã được lựa chọn và tối
ưu hoá trên cơ sở vật liệu
sẵn có, hạ giá thành đáng kể
và tăng độ phân giải lên
hàng trăm lần, giúp phân
biệt rõ các đoạn ADN chỉ
chênh lệch nhau bốn
nucleotid.

• 5. Nhuộm màu ADN: Chất Nhuộm màu ADN
lượng điện di và kết quả
nhân ADN đặc hiệu chỉ có
thể hiện rõ trên bản gel với
quy trình nhuộm ADN
được tối ưu hố và phương
pháp nhuộm thích hợp
được lựa chọn. Ngồi ra,
kinh nghiệm và kỹ năng
của kỹ thuật viên cũng rất
cần thiết, góp phần hạ giá
thành chung

• 6. Phân tích kết quả: Bản gel Phân tích kết quả
sau khi nhuộm xong sẽ có
dạng như hình trên. Các đoạn
ADN có độ dài khác nhau
hiện rõ trên bản gel, có thể

quan sát bằng mắt thường và
đo đếm. Trong một số trường
hợp, có thể xác định trình tự
ADN để có kết luận cuối
cùng. Hàng nghìn bản gel
như thế đã được phân tích và
hiện được lưu giữ tại Phịng
thí nghiệm.

III. Một số ứng dụng của PCR
trong y học

1. Xách định quan hệ huyết thống

• Để xác đinh quan hệ huyết thống giữa hai
người, có thể lấy ADN tách chiết từ những
mẫu khác nhau như: máu tươi, máu khơ, tế bào
viêm mạc miệng...

• Có hai cách để lấy mẫu đem phân tích đó là:

Cách thu thập mẫu ADN bằng tăm bơng

•  Xúc miệng bằng nước sôi để nguội cho thật sạch,
khoảng mười lần.
 Lấy một que tăm bông trong phong bì có tên mình,
khơng chạm tay vào đầu có bơng. Há rộng miệng, đưa
đầu bơng vào phía trong má rồi chà xát đầu bơng vào
thành má lên xuống tối thiểu mười lần, vừa chà xát,
vừa xoay trịn đầu tăm bơng để tồn bộ các mặt của

đầu tăm được thấm tế bào má.
 Lấy xong que thứ nhất, đưa trả lại ngay vào phong bì
mà bạn vừa lấy ra.
 Lặp lại như thế với ba que tăm cịn lại (nên nhớ là có
bốn que thì hai que lấy tế bào má bên trái, hai que lấy
tế bào má bên phải).
 Với trường hợp trẻ còn nhỏ, khơng tự lấy được thì
người lớn lấy hộ

Việc lấy mẫu máu khô sẽ do y tá thực hiện, theo
tiến trình sau:

•  Chuẩn bị một miếng vải bông trắng sạch (mới),
kích thước khoảng 3x3 cm. Viết tên người cho mẫu
vào mép miếng vải trước khi lấy mẫu.

 Dùng cồn và bơng lau sạch đầu ngón tay. Dùng kim
chích máu chích vào đầu ngón tay. Nhỏ ba - bốn
giọt máu thấm vào giữa miếng vải. Sau đó, phơi
hoặc hong khơ.

 Sau khi khô, mỗi mẫu được cho vào một túi ny-
lông sạch, mới .

2. Xách định bệnh lao nhờ vsv

. Phát hiện M. tuberculosis:
• Lao phổi: tốt nhất là đờm (được lấy vào buổi

sáng sớm sau khi súc miệng thật sạch với

nước muối sinh lý hay nước lọc, tránh lấy quá
nhiều bọt).
• Lao ngoài phổi: lao màng não (dịch não tủy),
lao màng phổi (dịch màng phổi), lao màng
bụng (dịch màng bụng), lao xương/khớp (dịch
hay mủ), lao đường tiết niệu (nước tiểu), lao
hạch (chọc dịch hạch), lao màng tim (dịch
màng tim).

3. Xách định bệnh HIV, HBV, HCV, KST,
Dengue virus

• Máu bệnh nhân lúc đói Đờm Dịch cơ
• Mẩu sinh thiết mơ gan và dịch thể khác
• 2. Xử lí bệnh phẩm: Bệnh nhầy
Mẫu
phẩm phải đựng trong Làm sinh
biopure hay PCR tube đồng thiết
• Sau khi lấy để ngay ở nhất, khử
nhiệt độ 40C hay - 200C tạp Xử lí với
• Bệnh phẩm phải lấy proteinase K và
đúng vị trí, đúng phương thuốc tẩy rửa
pháp và đúng thời gian
Ly trích
DNA, RNA
tinh khiết

4. Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định
thành phần , cơ cấu ký sinh trùng sốt rét

• Xác định chính xác từng lồi KSTSR gây bệnh
trên người là một khởi đầu quan trọng cho việc
lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Một vấn đề
mà kỹ thuật viên xét nghiệm KSTSR cần biết là
P. faciparum kháng thuốc và sự biến đổi gen đã
làm biến dạng hình thái các chủng loại KST SR .
Hiện nay đối với sốt rét, ngoài phương pháp
nhuộm giemsa phát hiện KST SRcịn có nhiều
kỹ thuật mới đã và đang được áp dụng như :
nhuộm Acridine Orange (AO), Paracheck,
Para-sight F …và đặc biệt là kỹ thuật PCR.

Cách lấy mẫu phân tích

Tuỳ theo đối tượng nghiên cứu và ngẫu
nhiên về giới tính, tuổi, nghề nghiệp,
….mẫu được lấy khác nhau. Thường thì
mẫu được lấy máu đầu ngón tay nhỏ lên
giấy thấm Whatman 3MM (thể tích máu
30-50l) để khơ ở mơi trường thực địa và
cho vào các túi nhựa riêng biệt có đánh số
thứ tự

Phương pháp tiến hành

• *Vật liệu:
• -Hóa chất dùng để tách chiết DNA của hãng

Sigma
• -Hố chất dùng cho phản ứng PCR :

• + dATP , dTTP , dCTP , dGTP (Abgene)
• + Tag polymerase ( Abgene )

• + Primer ( mồi ) : PLU5, PLU6 (Poligo ) ,
FAL,VIV, MAL, OVA (Sigma )

• - Lam kính , thuốc nhuộm giêmsa
• - Giấy thấm Whatman 3MM
• Phương pháp được tiến hành qua 2 giai đoạn

đó là: