Seminar nhóm 1 chiều t7

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (367.27 KB, 17 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC </b>

<b>TIỂU LUẬN </b>

<b>ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS ĐẬU MÙA KHỈ TRONG CÁC MẪU XÉT NGHIỆM </b>

<b>Giáo viên hướng dẫn : TS. HUỲNH VĂN BIẾT Nhóm sinh viên thực hiện : NHÓM 1 - CHIỀU THỨ 7 </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC </b>

<b>TIỂU LUẬN </b>

<b>ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS ĐẬU MÙA KHỈ TRONG CÁC MẪU XÉT NGHIỆM </b>

<b>Người hướng dẫn thực hiện Nhóm sinh viên thực hiện </b>

NGUYỄN THỊ THUÝ KIỀU 21126383 NGUYỄN PHƯƠNG LAN NHI 21126443

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>TÓM TẮT </b>

Nghiên cứu được tiến hành để định tính virus đậu mùa khỉ bằng cơng nghệ RPA kết hợp với CRISPR-Cas 9 và định lượng virus đậu mùa khỉ bằng phương pháp qPCR. Trong hai phương pháp được đưa ra trên, nhóm chúng tơi ưu tiên chọn công nghệ RPA kết hợp với CRISPR - Cas9 trong trường hợp dịch bệnh đậu mùa khỉ lan rộng phức tạp khó kiểm sốt. Bởi vì phương pháp này tiện lợi, nhanh, dễ thao tác, kiểm soát, khoanh vùng nhanh phạm vi dịch bệnh. Còn đối với phương pháp qPCR, tuy nhạy, chính xác nhất hiện nay nhưng chí phí rất tốn kém, bố trí cơ sở rất tốn kém. Phương pháp qPCR sẽ hiệu quả, khi áp dụng để nghiên cứu sâu, chẳng hạn bệnh nhân đang ở quá trình điều trị virus đậu mùa khỉ.

<i>Từ khoá: RPA và CRISPR - Cas 9, qPCR, Orthopoxvirus, Monkey pox, Pocket Lab. </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ... 3

2.1. Phương pháp phát hiện nhanh virus đậu mùa khỉ bằng công nghệ rpa kết hợp với CRISPR-Cas 9 ... 3

2.2. Phát hiện virus đậu mùa khỉ trên các mẫu xét nghiệm bằng phương pháp qpcr ... 8

Tài liệu tham khảo ... 10

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>DANH SÁCH CÁC BẢNG </b>

Trang

<b>Bảng 2.1. Các trình tự được sử dụng trong hệ thống phịng thí nghiệm bỏ túi ... 6 </b>

<b>Bảng 2.2. Các đoạn mồi và đầu dò dành riêng cho Monkey pox ... 9 </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ </b>

Đậu mùa khỉ (Monkey pox) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus đậu mùa khỉ – họ hàng của virus đậu mùa – vốn đã bị xóa sổ vào những năm 1980. Đây là bệnh hiếm gặp ở người, nhưng đã và đang bùng phát ở gần 80 quốc gia trên thế giới với diễn biến vô cùng phức tạp. Sự xuất hiện của đợt bùng phát bệnh đậu mùa khỉ vào đầu năm 2022 đã đặt ra mối đe doạ sức khoẻ tồn cầu mới. Tính đến ngày 8 tháng 7 năm 2022, đã có 9069 trường hợp được phịng thí nghiệm xác nhận và hầu hết trong số đó đến từ các quốc gia khơng lưu hành bệnh. Dữ liệu từ điều tra dịch tễ cho thấy, nguyên nhân

<i>gây bệnh đậu mùa khỉ do virus đậu mùa khỉ thuộc giống Orthopoxvirus trong họ </i>

<i>Poxviridae. Virus này có hai chủng chính là Congo và Tây Phi. Trong đó chủng Congo </i>

thường gây bệnh nặng hơn, với tỷ lệ tử vong khoảng 10%, và chủng Tây Phi là khoảng 1%. Virus đậu mùa khỉ là một loại virus DNA sợi đôi, thuộc thuộc họ Poxviridae là

<i>thành viên của giống Orthopoxvirus (lây từ động vật sang người, vơ tình gây bệnh ở </i>

người tương tự như bệnh đậu mùa, mặc dù tỷ lệ tử vong thấp hơn đáng kể). Bệnh đậu mùa ở khỉ không phải là một căn bệnh mới. Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1958 trên khỉ, do đó có tên là “bệnh đậu mùa khỉ”. Được xác định ở người vào năm 1970 tại Congo ở một cậu bé 9 tuổi. Từ năm 1970 đến năm 1986, hơn 400 ca đậu khỉ được báo cáo ở châu Phi, 95% ở Zaire (Nay là Cộng hoà Dân chủ Congo). Cho đến khi dịch bùng phát ở Mỹ năm 2003. Đợt bùng phát này đã dẫn đến hơn 70 trường hợp mắc bệnh đậu mùa khỉ ở Mỹ. Các ca báo cáo ở Mỹ vào tháng 7 và tháng 11 năm 2021 liên quan đến khách du lich từ châu Phi. Vào tháng 5 - 7 năm 2022, nhiều trường hợp mắc bệnh đậu mùa khỉ đã được xác định ở 70 quốc gia không lưu hành (châu Âu, Úc, Mỹ, Á). Bệnh đậu mùa khỉ ở người ở Congo, thường biểu hiện các triệu chứng tương tự như bệnh đậu mùa thông thường. Sau khoảng 2 tuần ủ bệnh khơng có triệu chứng, người nhiễm bệnh sẽ bị sốt, sau đó phát ban lan rộng. Cả 2 bệnh đều lan truyền từ người sang người và có thể dẫn đến tử vong. Tỷ lệ tử vong do bệnh đậu khỉ (0 - 10%) thấp hơn nhiều so với đậu mùa (10 -30%). Trong đợt bùng phát hiện nay, lây truyền từ người sang người là phương thức lây truyền chính. Mặc dù tiếp xúc trực tiếp da kề da với các tổn thương trong hoạt động tình dục có thể lây lan vi-rút, nhưng vẫn chưa rõ liệu bệnh đậu khỉ có thể lây lan

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

qua quan hệ tình dục hay khơng, đặc biệt là qua chất dịch cơ thể bị ô nhiễm. Biểu hiện điển hình của bệnh đậu khỉ bao gồm các triệu chứng báo trước, sau đó là phát ban thường bắt đầu trong vòng 1-3 ngày kể từ khi xuất hiện triệu chứng, và các tổn thương trên da có thể kéo dài 2-4 tuần rồi khỏi dần. Tuy nhiên, đợt bùng phát bệnh đậu khỉ vào năm 2022 có thể biểu hiện những đặc điểm khơng điển hình. Chẩn đốn xác định nhiễm virus đậu khỉ địi hỏi xét nghiệm khuếch đại axit nucleic thơng qua phương pháp phản ứng chuỗi polymerase. Chăm sóc hỗ trợ là cần thiết và liệu pháp kháng vi-rút không được xem xét cho tất cả các bệnh nhân bị ảnh hưởng nhưng được khuyến nghị cho những người có nguy cơ cao mắc bệnh nặng. Việc giảm thiểu sự bùng phát bệnh đậu khỉ bao gồm tăng cường phát hiện ca bệnh, cách ly ca bệnh, truy tìm người tiếp xúc và tiêm chủng sau phơi nhiễm. Tóm lại, đợt bùng phát bệnh thủy đậu hiện nay là một mối đe dọa mới trong đại dịch COVID - 19. Các bác sĩ lâm sàng cho biết về tình huống mới này, nó đưa ra một kịch bản khác với những đợt bùng phát trước đó.

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU </b>

<b>2.1. Phương pháp phát hiện nhanh virus đậu mùa khỉ bằng công nghệ RPA kết hợp với CRISPR-Cas 9 </b>

<b> Với khả năng định tính và định lượng tuyệt đối, hiện nay, PCR vẫn là công nghệ </b>

giữ vai trị chính trong việc hỗ trợ phát hiện bệnh đậu mùa khỉ. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của công nghệ xét nghiệm PCR là yêu cầu chu kỳ nhiệt độ phải được kiểm sốt chính xác bằng các thiết bị chuyên dụng, nhân viên kỹ thuật được đào tạo, cơ sở phịng thí nghiệm chuyên biệt và các quy trình nhiều bước chặt chẽ. Việc khơng thể sàng lọc nhanh chóng và phát hiện tại chỗ đã cản trở đáng kể những nỗ lực toàn cầu nhằm ngăn chặn và giảm thiểu sự lây lan của virus một cách hiệu quả.

Phương án định tính virus khác có thể sử dụng là xét nghiệm miễn dịch (ví dụ xét nghiệm ELISA), phương pháp này có thể đơn giản hóa hoạt động phân tích, nhưng phản ứng chéo huyết thanh giữa các orthopoxvirus là một rào cản đáng kể. Do đó, nhu cầu cấp thiết tồn cầu về sàng lọc bệnh đậu mùa khỉ đòi hỏi phải nhanh chóng phát triển các cơng cụ xét nghiệm thay thế phù hợp với những nơi có nguồn bệnh hạn chế. Vậy nên, để đạt được mục tiêu này và tiếp cận các tiêu chí WHO's ASSURED của WHO, Jia Wei và các cộng tác viên đã phát triển một phịng thí nghiệm bỏ túi (pocket lab) để phát hiện nhanh chóng virus đậu mùa khỉ. Nhóm nghiên cứu đã áp dụng hai công nghệ RPA và CRISPR Cas 9 để tạo ra phịng thí nghiệm bỏ túi này.

Recombinase polymerase (RPA) là một trong những phương pháp khuếch đại axit nucleic đẳng nhiệt được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 2006 bởi Niall Armes từ ASM Scientific Ltd (Cambridge, Vương quốc Anh). Cơ chế phản ứng cơ bản của RPA dựa trên một quá trình tự nhiên của tế bào được gọi là tái tổ hợp tương đồng, một quá trình quan trọng trong q trình chuyển hóa DNA. Tái tổ hợp di truyền là sự trao đổi vật liệu di truyền giữa các sinh vật khác nhau dẫn đến việc tạo ra con cái với sự kết hợp các đặc điểm khác với những đặc điểm được tìm thấy ở cả bố và mẹ. Có nhiều dạng tái tổ hợp di truyền, nguyên lý của RPA được tạo thành dựa vào mơ hình tái tổ hợp giảm phân,

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

mơ hình này diễn tả sự bắt cặp giữa các nhiễm sắc thể tương đồng ở kỳ đầu I của quá trình giảm phân, bắt đầu bằng sự đứt gãy hoặc tạo khoảng trống giữa sợi đơi, sau đó là ghép cặp với một nhiễm sắc thể tương đồng và sự xâm lấn sợi để bắt đầu quá trình sửa chữa tái tổ hợp. Nghĩa là, DNA sợi đơn sẽ chèn vào giữa khoảng trống của DNA sợi đôi đứt gãy nằm trên nhiễm sắc thể tương đồng, sau đó, bắt đầu quá trình sửa chữa lại khoảng trống của DNA, quá trình này sẽ tạo thành một cấu trúc D-loop, đây là cấu trúc DNA trong đó hai chuỗi của phân tử DNA chuỗi kép được tách ra trong một khoảng thời gian và được giữ cách nhau bởi chuỗi DNA thứ ba

Dựa vào ngun lý của mơ hình tái tổ hợp giảm phân, công nghệ RPA đã sử dụng Recombinase (enzyme tái tổ hợp di truyền) để giúp đưa mồi xâm lấn vào DNA mẫu ở điều kiện thường. RPA tiêu chuẩn bao gồm ba protein chính (recombinase, yếu tố tải recombinase và protein liên kết chuỗi đơn (SSB)). Phản ứng RPA bắt đầu từ sự liên kết của recombinase với mồi nhờ sự trợ giúp của yếu tố tải. Điều này tạo thành một sợi nucleoprotein tìm kiếm trình tự tương đồng trong DNA sợi đơi. Sau khi xác định được

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

điểm tương đồng, phức hợp sẽ xâm chiếm DNA sợi đôi, tạo thành cấu trúc D-loop, mồi bắt cặp với một sợi DNA để bắt đầu phản ứng khuyếch đại, trong khi đó, đoạn DNA cịn lại không tạo liên kết Hidro với sợi mã nhờ các protein SSB. Recombinase tách khỏi sợi nucleoprotein sau khi quá trình trao đổi sợi được thực hiện và sẽ có sẵn cho cặp mồi tiếp theo. Tiếp theo, DNA polymerase kéo dài từ đầu 3' của mồi. Khi quá trình trùng hợp tiếp tục, hai chuỗi gốc bắt đầu tách ra và cuối cùng tạo thành hai sợi đơi, sau đó tồn bộ q trình lặp lại. Tồn bộ q trình được diễn ra ở một khoảng nhiệt độ duy nhất, từ 20-25<sup>o</sup>C.

Chỉnh sửa gen CRISPR-Cas 9 là một kỹ thuật di truyền trong sinh học phân tử mà nhờ đó bộ gen của các sinh vật sống có thể được sửa đổi. Cas 9 là một enzyme endonuclease, enzyme này có cả hai vị trí cắt, có thể đồng thời cắt 2 sợi của DNA tại một điểm. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR, dịch ra tiếng Việt là hệ thống lặp lại Palindromic xen kẽ ngắn. Mỗi sinh vật đều có một trình tự nucleotide lặp lại đặc trưng, từ đó, người ta thiết kế ra một RNA có trình tự bổ sung với những đoạn lặp lại này, RNA này sẽ dẫn đường cho Cas 9 đến được với trình tự gen

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

mục tiêu và thực hiện chức năng chỉnh sửa gen. Càng ngày người ta càng khám phá ra được những chức năng tuyệt vời của CRISPR-Cas 9, bằng cách bất hoạt một vị trí cắt của enzyme Cas 9, người ta có thể thêm vào đó những yếu tố điều hịa phiên mã dịch mã, hoặc có thể bất hoạt cả hai vị trí cắt và gắn chất phát huỳnh quang vào Cas 9, sử dụng CRISPR-Cas 9 như một hệ thống chỉ thị.

Trong bài báo cơng bố về phịng thí nghiệm bỏ túi của mình, Jia Wei và các cộng tác viên đã nói về nguyên tắc hoạt động của nó như sau: Trong hệ thống phịng thí nghiệm bỏ túi này, RPA hoạt động như một 'bộ khuếch đại tín hiệu' và CRISPR hoạt động như một 'bộ lọc tín hiệu'. Trình tự DNA của virus đậu mùa khỉ được sử dụng là gen B6R hoặc F3L, DNA sẽ được RPA khuếch đại theo cấp số nhân và các bộ khuếch đại được quét bởi RNA dẫn hướng CRISPR (gRNA) và enzyme Cas12a. Chỉ khi có sự hiện diện của mục tiêu virus, quá trình phân tách chuyển hóa qua trung gian CRISPR/Cas12a mới xảy ra, tạo ra huỳnh quang sáng. Mặc dù một số sản phẩm phụ RPA khơng đặc hiệu được hình thành, chúng sẽ khơng kích hoạt hoạt động phân tách

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

Cấu tạo của Pocket Lab gồm (nhìn trên hình 2.1, từ trên xuống dưới, từ trái sang phải): 1) Đầu tip pipet; 2) Túi đựng rác thải; 3) Khối gia nhiệt-A ở 80 °C; 4) Khối gia nhiệt-B ở 40 °C; 5) Ống dùng sẵn (sáu ống); 6) Ống lấy mẫu (sáu ống); 7) Pipet nhỏ 10 µL; 8) Đèn pin UV cầm tay (5W, bước sóng 365 nm); 9) Dung dịch đệm và primer trong ống màu nâu; 10) Đối chứng dương; 11) Đối chứng âm; 12) sạc dự phòng mini.

Về mặt vận hành, chỉ cần ba bước đơn giản để phân tích mẫu nghi ngờ: (1) Mẫu được thêm vào ống lấy mẫu và đun nóng ở 80 °C trong 5 phút để giải phóng DNA virus; (2) Trong khi chờ đun nóng, 20 µL dung dịch đệm Rehydrat đã được thêm vào ống dùng sẵn; (3) 10 μL hỗn hợp mẫu đã được làm nóng được chuyển vào ống dùng sẵn đã được

<b>Hình 2.3. Pocket Lab để phát hiện </b>

nhanh virus Monkeypox.

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

thêm dung dịch đệm và ống được đặt vào khối gia nhiệt-B ở 40 °C trong 20 phút. Sau đó, dưới sự kích thích của tia UV cầm tay, kết quả huỳnh quang đủ sáng có thể được đọc trong mơi trường ánh sáng tự nhiên. Thời gian hoàn thành là 25 phút, thao tác đơn giản, khơng cần máy móc q phức tạp và khơng cần gia nhiệt. Phịng thí nghiệm bỏ túi này được thiết kế chống nước, chống va đập và rất nhỏ gọn, nhét vừa túi áo khoác.

<b>2.2. Phát hiện virus đậu mùa khỉ trên các mẫu xét nghiệm bằng phương pháp qPCR </b>

Mpox là một bệnh lây truyền từ động vật sang người do virus, do virus đậu khỉ (MPXV) gây ra, trước đây xảy ra ở các quốc gia Tây và Trung Phi nơi có ổ chứa động vật. Tuy nhiên, nó đã được báo cáo trên tồn cầu như một phần của quá trình lây truyền kéo dài từ người sang người từ tháng 5 năm 2022.Chúng ta cần xác định, theo dõi và quản lý những người tiếp xúc với các ca bệnh mpox nhằm ngăn chặn sự lây truyền thêm và điều chỉnh các biện pháp phịng ngừa và kiểm sốt hiệu quả. . Do đó, các phương pháp PCR khác nhau chủ yếu dựa trên qPCR đã được đề xuất và sử dụng ở các vùng lưu hành bệnh đậu khỉ. Xác nhận của phịng thí nghiệm Mpox dựa vào các xét nghiệm khuếch đại axit nucleic (qPCR) trên vật liệu tổn thương da hoặc trong trường hợp khơng có tổn thương da trên mẫu bệnh phẩm hầu họng, hậu môn hoặc trực tràng.

Mẫu DNA: Năm mẫu DNA dương tính với MPXV được thu thập vào năm 2016 đã được cung cấp bởi Institut National de Recherche Biomédicale (INRB), Kinshasa (DRC). Các mẫu DNA này được chiết xuất cục bộ tại INRB từ các tổn thương da của bệnh nhân nhiễm MPXV. DNA vi-rút từ các tổn thương giống thủy đầu của bệnh nhân nghi ngờ MPXV ở Bỉ, được thu thập H vào tháng 5 năm 2022, được chiết xuất bằng bộ phần lập axit nucleic II mầm bệnh vi-rút MagMax cho hệ thống KingFisherTM Flex (ThermoFisher).

Thiết kế mồi và đầu dò: Việc lựa chọn các mồi và mẫu dò lai đặc hiệu MPXV được thực hiện dựa trên trình tự chọn lọc các bộ gen MPXV từ nhánh Trung Phi, được lấy ra từ cơ sở dữ liệu GenBank và được căn chỉnh nhiều lần bằng MUSCLE trong MEGA v7.0. Khung đọc mở O2L (dài 662 bp), một trong những vùng được bảo tồn của bộ gen MPXV, được sử dụng làm khuôn mẫu để thiết kế các đoạn mồi và đầu dị cụ thể thơng qua Cơng nghệ DNA tích hợp, cơng cụ PrimerQuest™. Các mồi oligonucleotide

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

và các đầu dò tương ứng được kiểm tra khả năng tự bổ sung và nhiệt độ nóng chảy tối ưu bằng chương trình trực tuyến Oligo Calc [22]. Đầu dò dành riêng cho MPXV chứa cặp thuốc nhuộm/chất khử 6-FAM/ZEN-IBFQ, có bước sóng phát xạ tối đa là 518 nm.

<b>Bảng 2.2. Các đoạn mồi và đầu dò dành riêng cho Monkey pox </b>

Viral ORF Type Oligonucleotide sequence

Quá trình khuếch đại PCR được tiến hành trên các thiết bị Mic qPCR (Hệ thống phân tử sinh học) và hệ thống qPCR nhanh ABT 7500 (Hệ thống sinh học ứng dụng, Hoa Kỳ).

Các phản ứng được thực hiện bằng cách sử dụng hỗn hợp phản ứng 20 µl chứa 5 ul 4x TaqMan™ Fast Virus 1-Step Master Trộn 900 nM của mỗi mồi thuận và mồi ngược, đầu dị 250 nM và 5 µl DNA mẫu. Mỗi phản ứng qPCR được thực hiện lặp lại. Phản ứng PCR được thực hiện trong các điều kiện sau: 20 giây ở 95°C và 45 chu kỳ 3 giây ở 95°C và 30 giây ở 60°C

Các sản phẩm PCR được tinh chế bằng bộ ExoSAP-IT (Hệ thống sinh học ứng dụng, Hoa Kỳ). Trình tự chu trình của các sản phẩm PCR tinh khiết được thực hiện bằng cách sử dụng hóa học BigDye Terminator (Hệ thống sinh học ứng dụng, Hoa Kỳ). Các phản ứng giải trình tự được tinh chế bằng phương pháp nội bộ nhanh sử dụng natri axetat thể tích 1:10 (3M, pH 5,5) trộn với 70% etanol. Các sản phẩm giải trình tự tinh khiết đã được chạy trên ABI PRISM 3100 (Hệ thống sinh học ứng dụng, Hoa Kỳ). Trình tự được phân tích và sửa lỗi bằng phần mềm SeqMan, phiên bản 7.0.0. Để xác nhận tính đặc hiệu của các đoạn mồi của chúng tơi, các trình tự thu được được so sánh với bộ gen tham chiếu MPXV bằng công cụ BLAST.

</div>