Báo cáo thiết bị công nghệ và kỹ thuật công nghệ sinh học 1.2
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.89 MB, 16 trang )
<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">
<b>PHÁT HIỆN VIRUS FERALINE PAULEUKOPENIA (FPV) GÂY BỆNH GIẢM BẠCH CẦU Ở MÈO </b>
<b>BẰNG CÔNG NGHỆ nanoPCR</b>
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
<b>TRANG THỊ DIỆU HIỀN – 21126339MÔN HỌC: THIẾT BỊ & KỸ THUẬT CNSH</b>
<b>GVHD: TS. HUỲNH VĂN BIẾT</b>
<b> ThS. TRƯƠNG QUANG TOẢN</b>
1
</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3"><b>I. GIỚI THIỆU</b>
Giảm bạch cầu ở mèo (FP) hay còn gọi là bệnh viêm ruột truyền nhiễm ở mèo là một bệnh nhiễm trùng cấp tính, rất dễ lây lan do virus giảm bạch cầu ở mèo virus Feline Panleukopenia (FPV) gây ra.
FPV gây sốt nặng, nôn mửa và tiêu chảy ở động vật bị nhiễm bệnh, cũng như giảm lượng bạch cầu lớn.
Gây bệnh cho mèo ở tất cả các lứa tuổi, tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết cao.
<b>Hình: Tế bào virus Feline Panleukopenia (FPV)<sup>Hình: Hình ảnh mèo bị nhiễm virus FPV</sup></b>
3
</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4"><b>Phương pháp nanoPCR</b>
- NanoPCR là một phương pháp thêm các hạt nano vàng có đường kính nhỏ hơn 100 nm vào phản ứng PCR. Trong quá trình thay đổi nhiệt độ phản ứng, các hạt như vậy sẽ hình thành chất lỏng nano, tăng cường độ dẫn nhiệt ,giảm thời gian phản ứng, tăng cường sự tiếp xúc động học của các thành phần chất phản ứng
- Các hạt nano vàng liên kết thuận nghịch với enzyme Taq ở nhiệt độ thấp. Vật liệu này cũng có vai trị tương tự như protein liên kết chuỗi đơn (SSB), có thể hấp thụ có chọn lọc DNA chuỗi đơn
4
</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5"><b> Quá trình virus xâm nhiễm vào cơ thể:</b>
Quá trình virus xâm nhiễm
Ban đầu, virus nhân lên trong mô bạch huyết
hầu họng. FPV được thải ra từ tất
cả các chất bài tiết của cơ thể trong thời gian các tế bào ở pha S của
chu kỳ phân bào
5
</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6"><b> 1. Nguyên vật liệu:</b>
83 con mèo có triệu chứng lâm sàn điển hình nghi mắc giảm bạch cầu
Vật tư, hóa chất: bao gồm hệ thống máy móc và vật tư phục vụ thực hiện phương pháp nanoPCR: bộ kit MyTaq
<small>TM</small>Mix, plasmid mini kit; bộ kit tách chiết DNA QIAamp của hãng Qiagen (Đức), máy
PCR; máy điện di, máy chụp ảnh gel. Bộ kit chẩn đoán nhanh Feline Parvovirus Antigen Test do công ty Careside (Hàn Quốc) sản xuất.
<b> 2. Phương pháp nghiên cứu: </b>
<b>Thu thập thông tin và quan sát triệu chứng lâm sàng: </b>
Mèo được mang đến khám và điều trị tại phịng khám thú y đều thu thập thơng tin và lập hồ sơ
</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">7 <b>Chẩn đoán FPV bằng Kit chẩn đoán nhanh.</b>
<b>Phương pháp nanoPCR:</b>
<b>Tách chiết DNA virus:</b>
Chủng FPV YBYJ-1 đã được phân lập và bảo quản trước bằng bộ chiết DNA QIAamp của hãng Qiagen (Đức) và giữ ở -80
<small>o</small>C.
<b> Thiết kế primer:</b>
Trình tự gen FPV VP2 được lấy từ ngân hàng gene và các đoạn mồi để khuếch đại gen VP2 có chiều dài đầy đủ của FPV được xây dựng bằng phần mềm Oligo 7:VP2-F:
5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC-3’ và VP2-R: 5′- GTATACCATATAACAAACCTTC-3’, với độ dài khuếch đại dự đoán là 1932 bp.
Để xây dựng các plasmid mẫu dương tính tiêu chuẩn, các mồi đặc hiệu được thiết kế theo vùng bảo tồn của gen VP2: VP2-U: TATATAGCACATCAGATACG-3′ và VP2-L:
5′-TGCATCAGGATCATATTCATT-3′, mức khuếch đại dự kiến chiều dài đoạn là 698 bp.
</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8"><i><b>Hình: Quy trình nanoPCR. (a) DNA trộn với MPN; (b) chiếu đèn xanh lên MPN; (c) enzyme DNA polymerase được </b></i>
<i>thêm vào hỗn hợp; (d), (e), (f), (g) DNA theo cấp số nhân qua nhiều chu kỳ; (h), (i), (k), (l) nam châm được sử dụng tách MPN khỏi mẫu.; (m) tổng quan bên ngoài của máy nanoPCR</i>
</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9"><b>III. KẾT QUẢ:</b>
<b>1. Kết quả khi kiểm tra bằng Kit test nhanh:</b>
<i><b>Hình: Kết quả khi kiểm tra bằng Kit test nhanh. (a) Dương tính với FPV; (b) Kết </b></i>
<i>quả nghi ngờ; (c) Âm tính với FPV.</i>
</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10"><b>2. Kết quả phản ứng nanoPCR:</b>
10
</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11"><i><b>Hình: Kết quả phản ứng nanoPCR. Giếng 2 giếng 4: Mẫu test dương tính với FPV bằng Kit test nhanh; Giếng 5 </b></i>
<i>-giếng 7: Mẫu nghi ngờ FPV bằng Kit test nhanh; Giếng 8 - -giếng 10: mẫu âm tính với FPV bằng Kit test nhanh; Giếng 11: Đối chứng dương (DNA từ vacxin); Giếng 12: Đối chứng âm (free water DNA).</i>
11
</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12"><b>IV. THẢO LUẬN</b>
Tỷ lệ lây nhiễm và tử vong cao của căn bệnh này, sự nguy hiểm và thiếu phương pháp điều trị hiệu quả, nên cần có
</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13"><b>TÀI LIỆU THAM KHẢO</b>
1. Ikeda, Y.; Shinozuka, J.; Miyazawa, T.; Kurosawa, K.; Izumiya, Y.; Nishimura, Y.; Nakamura, K.; Cai, J.; Fujita, K.; Doi, K.; et al. Apoptosis in feline
<i><b>panleukopenia virus-infected lymphocytes. J. Virol. 1998, 72, 6932–6936. [Google Scholar] [CrossRef] [</b></i><b>PubMed][Green Version]</b>
<i><b>2. Johnson, R.H. Feline panleucopaenia. I. Identification of a virus associated with the syndrome. Res. Vet. Sci. 1965, 6, 466–471. [</b></i><b>Google Scholar</b>] [
<i>3. Steinel, A.; Munson, L.; Vuuren, M.V.; Truyen, U. Genetic characterization of feline parvovirus sequences from various carnivores. J. Gen. </i>
<i><b>Virol. 2000, 81, 345–350. [</b></i><b>Google Scholar</b>] [<b>CrossRef</b>]
4. Garigliany, M.; Gilliaux, G.; Jolly, S.; Casanova, T.; Bayrou, C.; Gommeren, K.; Fett, T.; Mauroy, A.; Lévy, E.; Cassart, D.; et al. Feline panleukopenia
<i><b>virus in cerebral neurons of young and adult cats. BMC Vet. Res. 2016, 12, 28. [</b></i><b>Google Scholar</b>] [<b>CrossRef</b>]
<i><b>5. Reed, A.P.; Jones, E.V.; Miller, T.J. Nucleotide sequence and genome organization of canine parvovirus. J. Virol. 1988, 62, 266–276. [</b></i>
6. Christensen, J.; Tattersall, P. Parvovirus initiator protein NS1 and RPA coordinate replication fork progression in a reconstituted DNA replication
<i><b>system. J. Virol. 2002, 76, 6518–6531. [</b></i><b>Google Scholar] [CrossRef][Green Version]</b>
7. Kariatsumari, T.; Horiuchi, M.; Hama, E.; Yaguchi, K.; Ishigurio, N.; Goto, H.; Shinagawa, M. Construction and nucleotide sequence analysis of an
<i><b>infectious DNA clone of the autonomous parvovirus, mink enteritis virus. J. Gen. Virol. 1991, 72 Pt 4, 867–875. [</b></i><b>Google Scholar] [CrossRef]</b>
8. Govindasamy, L.; Hueffer, K.; Parrish, C.R.; Agbandje-McKenna, M. Structures of host range-controlling regions of the capsids of canine and feline
<i><b>parvoviruses and mutants. J. Virol. 2003, 77, 12211–12221. [</b></i><b>Google Scholar] [CrossRef][Green Version]</b>
9. Mani, B.; Baltzer, C.; Valle, N.; Almendral, J.M.; Kempf, C.; Ros, C. Low pH-dependent endosomal processing of the incoming parvovirus minute virus
<i>of mice virion leads to externalization of the VP1 N-terminal sequence (N-VP1), N-VP2 cleavage, and uncoating of the full-length genome. J. </i>
<i><b>Virol. 2006, 80, 1015–1024. [</b></i><b>Google Scholar] [CrossRef][Green Version]</b>
13
</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">10. 10.Mullis, K.; Faloona, F.; Scharf, S.; Saiki, R.; Horn, G.; Erlich, H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain
<i><b>reaction. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986, 51 Pt 1, 263–273. [</b></i><b>Google Scholar</b>] [<b>CrossRef][Green Version]</b>
<i><b>11. Green, M.R.; Sambrook, J. Nested Polymerase Chain Reaction (PCR). Cold Spring Harb. Protoc. 2019, 2019, 436–456. [</b></i><b>Google Scholar</b>] [
12. Wang, S.; Yang, F.; Li, D.; Qin, J.; Hou, W.; Jiang, L.; Kong, M.; Wu, Y.; Zhang, Y.; Zhao, F.; et al. Clinical application of a multiplex genetic
<i><b>pathogen detection system remaps the aetiology of diarrhoeal infections in Shanghai. Gut Pathog. 2018, 10, 37. [</b></i><b>Google Scholar</b>] [<b>CrossRef</b>]
<i><b>13. Harshitha, R.; Arunraj, D.R. Real-time quantitative PCR: A tool for absolute and relative quantification. Biochem. Mol. Biol. Educ. 2021, 49, 800–</b></i>
812. [<b>Google Scholar</b>] [<b>CrossRef</b>]
14. Liu, Y.; Wu, H.; Zhou, Q.; Song, Q.; Rui, J.; Zou, B.; Zhou, G. Digital quantification of gene methylation in stool DNA by emulsion-PCR coupled
<i><b>with hydrogel immobilized bead-array. Biosens. Bioelectron. 2017, 92, 596–601. [</b></i><b>Google Scholar</b>] [<b>CrossRef</b>]
15. Wanzhe, Y.; Jianuan, L.; Peng, L.; Jiguo, S.; Ligong, C.; Juxiang, L. Development of a nano-particle-assisted PCR assay for detection of duck
<i><b>tembusu virus. Lett. Appl. Microbiol. 2016, 62, 63–67. [</b></i><b>Google Scholar] [CrossRef][Green Version]</b>
16. Hsieh, M.J.; Yang, W.C. A Field-Deployable Insulated Isothermal PCR (iiPCR) for the Global Surveillance of Toxoplasma gondii Infection in
<i><b>Cetaceans. Animals 2022, 12, 506. [</b></i><b>Google Scholar</b>] [<b>CrossRef</b>]
17. Song, S.; Liu, Z.; Abubaker, M.A.; Ding, L.; Zhang, J.; Yang, S.; Fan, Z. Antibacterial polyvinyl alcohol/bacterial cellulose/nano-silver hydrogels
<i><b>that effectively promote wound healing. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 2021, 126, 112171. [</b></i><b>Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]</b>
18. Liu, M.; Liu, T.; Chen, X.; Yang, J.; Deng, J.; He, W.; Zhang, X.; Lei, Q.; Hu, X.; Luo, G.; et al. Nano-silver-incorporated biomimetic
<i>polydopamine coating on a thermoplastic polyurethane porous nanocomposite as an efficient antibacterial wound dressing. J. </i>
<i><b>Nanobiotechnol. 2018, 16, 89. [</b></i><b>Google Scholar</b>] [<b>CrossRef</b>]
14
</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">19. Abram, S.L.; Fromm, K.M. Handling (Nano)Silver as Antimicrobial Agent: Therapeutic Window, Dissolution Dynamics, Detection Methods and
<i><b>Molecular Interactions. Chem. Eur. J. 2020, 26, 10948–10971. [</b></i><b>Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]</b>
20. Kumar, A.; Hosseindoust, A.; Kim, M.; Kim, K.; Choi, Y.; Lee, S.; Lee, S.; Lee, J.; Cho, H.; Kang, W.S.; et al. Nano-sized Zinc in Broiler
<i><b>Chickens: Effects on Growth Performance, Zinc Concentration in Organs, and Intestinal Morphology. J. Poult. Sci. 2021, 58, 21–29. [</b></i>
21. Swain, P.S.; Rao, S.B.N.; Rajendran, D.; Dominic, G.; Selvaraju, S. Nano zinc, an alternative to conventional zinc as animal feed supplement: A
<i><b>review. Anim. Nutr. (Zhongguo Xu Mu Shou Yi Xue Hui) 2016, 2, 134–141. [</b></i><b>Google Scholar</b>] [<b>CrossRef</b>]
<i><b>22. Li, M.; Lin, Y.C.; Wu, C.C.; Liu, H.S. Enhancing the efficiency of a PCR using gold nanoparticles. Nucleic Acids Res. 2005, 33, e184. [</b></i>
<i>23. Rudramurthy, G.R.; Swamy, M.K. Potential applications of engineered nanoparticles in medicine and biology: An update. JBIC J. Biol. Inorg. </i>
<i><b>Chem. 2018, 23, 1185–1204. [</b></i><b>Google Scholar</b>] [<b>CrossRef</b>]
<i>24. Li, H.; Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. </i>
<i><b>Acad. Sci. USA 2004, 101, 14036–14039. [</b></i><b>Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]</b>
