luận án tiến sĩ sự lưu hành và khả năng ly giải của thực khuẩn thể tả vibriophage ở môi trường nước ngoại cảnh tại một số tỉnh miền bắc việt nam

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.25 MB, 160 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b> B</b>à GIÁO DĀC VÀ ĐÀO TắO B Y Tắ

<b>VIặN Vặ SINH DấCH T TRUNG ¯¡NG </b>

<b>---*--- </b>

<b>L¾I Vi KIM </b>

<b>SĀ L¯U HÀNH VÀ KHÀ NNG LY GIÀI </b>

<b>TR¯äNG N¯âC NGO¾I CÀNH T¾I MT Sị TẩNH MIN BC VIặT NAM </b>

<b>LUN N TI¾N S) Y T¾ CƠNG CàNG </b>

<b>HÀ NàI – 2023</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

Bà GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O B Y Tắ

<b>VIặN Vặ SINH DấCH T TRUNG ĂNG </b>

<b>---*--- L¾I VŨ KIM </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

Đây là cơng trình nghiên cąu khoa học căa riêng tôi, tÃt cÁ các k¿t quÁ và sß liệu trong lu¿n án do chính tơi thực hiện. TÃt cÁ các sß liệu trình bày trong lu¿n án là trung thực, mát phần ã °ÿc cơng bß trên t¿p chí khoa học trong n°ßc. Phần cịn l¿i trong lu¿n án ch°a °ÿc ai cơng bß trong bÃt kỳ cơng trình nghiên cąu nào khác.

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

Lái ầu tiên tơi mn bày tỏ lũng bit Ân sõu sc nht tòi TS. Nguyn Đáng Tú, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung °¢ng, và PGS. TS Đặng Đąc Nhu, Khoa Y t¿ công cáng, Tr°áng Đ¿i học Y D°ÿc, Đ¿i học Qußc gia Hà Nái là những ng°ái thầy h°ßng dẫn khoa học, ã ln giúp ỡ tơi, t¿n tình truyền ¿t những ki¿n thąc và kinh nghiệm q báu ể tơi có thể hồn thành lu¿n án.

Tơi xin chân thành cÁm ¢n các Thầy/Cơ trong các Hái áng khoa học chÃm ề c°¢ng, chÃm các chuyên ề và lu¿n án ã óng góp nhiều ý ki¿n q báu ể tơi có thêm ki¿n thąc và hoàn thiện lu¿n án ¿t chÃt l°ÿng tòt hÂn.

Tụi xin by t lỏi cm Ân chõn thành tßi Trung tâm Đào t¿o và QuÁn lý Khoa học, Bá môn Y t¿ công cáng căa Viện. Các Thầy/Cô căa Trung tâm và Bá môn ã h°ßng dẫn, giúp ỡ tơi tć khi bÁt ầu khố học Nghiên cąu sinh, trong quá trình học t¿p và ¿n khi hồn thành lu¿n án này.

Tơi xin bày tỏ lái cÁm ¢n sâu sÁc ¿n các anh chị và các b¿n căa Phịng thí nghiệm Vi khuẩn °áng ruát, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung °¢ng ã ln quan tâm, giúp ỡ, hß trÿ tơi trong q trình thực hiện nghiên cąu và hồn thành lu¿n án.

Ci cùng con xin khÁc ghi cơng ¢n sinh thành, ni d°ỡng, d¿y dß căa cha mẹ hai bên gia ình; sự ăng há, áng viên, th°¢ng u, chăm sóc, khích lệ căa vÿ và các con; các anh, chị, em, áng nghiệp, những ng°ái luôn bên tôi và là chß dựa vững chÁc ể tơi n tâm học t¿p và hoàn thành lu¿n án.

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>Nghiên cąu đ°ÿc hß trÿ kinh phí tć các đÁ tài/dā án: </b>

- Đề tài quỹ phát triển khoa học và cơng nghệ qc gia (Nafosted) <Nghiên cąu sÁn xuÃt ch¿ phẩm sinh học dùng trong iều trị và xử lý các nguán n°ßc nhiễm các chăng vi khuẩn tÁ a kháng thußc= (Mã sß: 108.06-2017.04) do TS. Nguyễn Đáng Tú chă nhiệm.

- Đề tài nhánh <Nghiên cąu ặc iểm dịch tễ học phân tử và ặc tính kháng kháng sinh c<i>ăa các chăng vi khuẩn tÁ O1, O139 và V. parahaemolyticus </i>

phân l¿p tć bệnh nhân tiêu chÁy và mơi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh= thuác dự án <Nghiên cąu nâng cao năng lực nghiên cąu các bệnh truyền nhiễm ã Việt Nam và chuyển giao kỹ thu¿t, công nghệ: 2020-2025= gia Vin V sinh dch t Trung Âng vòi Tr°áng Đ¿i học Nagasaki, Nh¿t BÁn do TS. Nguyễn Đáng Tú chă nhiệm.

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

1.1. Mỏt sò khỏi niệm liên quan ... 3

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

1.2.1.4. Phòng bệnh tÁ và vÁc xin ... 9

1.2.1.5. Kháng kháng sinh ... 10

1.2.2. Tình hình dịch tÁ trên th¿ gißi và Việt Nam ... 12

1.2.2.1. Tình hình dịch tÁ trên th¿ gißi ... 12

1.2.2.2. Tình hình dịch tÁ t¿i Việt Nam ... 13

1.3. Tình hình nghiên cąu về sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ ... 13

1.3.1. Đặc iểm hình thái, cÃu trúc căa thực khuẩn thể tÁ ... 14

1.3.1.1. Thực khuẩn thể tÁ hình cầu (spherical phages) ... 14

1.3.1.2. Thực khuẩn thể tÁ d¿ng sÿi ... 18

1.3.2. Sự l°u hành căa thực khuẩn thể và thực khuẩn thể tÁ ... 20

1.3.3.1. Sự l°u hành căa thực khuẩn thể ... 20

1.3.3.2. Sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ ... 21

1.4. Tình hình nghiên cąu về khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ ... 23

1.4.1. Các ph°¢ng pháp phát hiện và ánh giá khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ ... 23

1.4.1.1. Ph°¢ng pháp phân l¿p thực khuẩn thể tÁ t mu nòc ... 23

1.4.1.2. PhÂng phỏp phõn lp filamentous phage ... 23

1.4.1.3. Ph°¢ng pháp xác ịnh hình d¿ng thực khuẩn thể tÁ d°ßi kính hiển vi iện tử ... 24

1.4.1.4. Kỹ thu¿t PCR ... 24

1.4.1.5. Kỹ thu¿t Southern blot ... 26

1.4.1.6. Cách xác ịnh khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ ... 26

1.4.2. Liệu pháp phage ... 27

1.4.2.1. Liệu pháp phage là gì? ... 28

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

1.4.2.2. Áp dāng liệu pháp phage ... 29

1.4.3. Ąng dāng trong dự phịng, kiểm sốt bệnh/dịch tÁ ... 35

1.5. Đặc iểm chung ịa bàn nghiên cąu ... 37

<b>CH¯¡NG 2. PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU ... 39 </b>

2.1. Đßi t°ÿng, ịa iểm, thái gian nghiên cąu ... 39

2.1.1. Đßi t°ÿng nghiên cąu ... 39

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

2.6. Xử lý, phân tích sß liệu ... 53

2.7. VÃn ề ¿o ąc trong nghiên cąu ... 54

2.8. SÂ ỏ nghiờn cu ... 55

<b>CHĂNG 3. KắT QU NGHIÊN CĄU ... 56 </b>

3.1. Sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ trong mơi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh t¿i mát sß tỉnh miền BÁc Việt Nam, 2018 3 2019 ... 56

3.1.1. Mát sß ặc iểm chung căa các mẫu n°ßc ngo¿i cÁnh thu th¿p .... 56

3.1.2. K¿t q xét nghiệm mẫu n°ßc, mái g¿c tơm bằng ph°¢ng pháp ni cÃy phân l¿p ... 57

3.1.3. K¿t quÁ xét nghiệm mẫu n°ßc bề mặt, mái g¿c tơm bằng ph°¢ng pháp PCR ... 65

3.2. KhÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ trong phòng thí nghiệm và trên thực ịa cáng áng ã các mơi tr°áng n°ßc khác nhau ... 73

3.2.1. K¿t quÁ thử nghiệm khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ vßi mát sß chăng vi khuẩn tÁ và vi khuẩn °áng ruát khác ... 73

3.2.2. KhÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể ã các iều kiện pha loãng m¿t

4.1. Sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ trong mơi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh ... 86

4.1.1. Mát sß ặc iểm chung về mẫu nghiên cąu ... 86

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

4.1.2. Sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ trong mơi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh

5.1. Sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ trong mơi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh t¿i mát sß tỉnh miền BÁc Việt Nam ... 110 5. KhÁ năng ly giÁi căa các thực khuẩn thể tÁ ... 110

<b>KHUY¾N NGHÊ ... 112 CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ắN LUN N CễNG Bị .... 113 TI LIỈU THAM KHÀO </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

ATCC American Týp Culture Collection

Bá s°u t¿p chăng chuẩn Mỹ

CIP Ciprofloxacin Kháng sinh Ciprofloxacin CsCl Ceessi Clorua

Fs1 Filamentous phage 1 Thực khuẩn thể d¿ng sÿi FS1 Fs2 Filamentous phage 2 Thực khuẩn thể d¿ng sÿi FS2

Náng á kháng sinh tßi thiểu ąc ch¿ sự phát triển căa vi khuẩn

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

NAG Non-agglutinable Vibrios Chăng phẩy khuẩn không

Trung tâm Thơng tin Cơng nghệ Sinh học Qc gia, Hoa Kỳ

NICED National Institute of Cholera and Enteric

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

BÁng 2. 1. Sß l°ÿng cặp mẫu n°ßc bề mặt mẫu mái g¿c tôm thu th¿p ... 45 BÁng 3. 1. Sß l°ÿng mẫu n°ßc theo cặp mẫu (mẫu n°ßc bề mặt và mẫu mái g¿c tôm) thu th¿p °ÿc trong giai o¿n 2018-2019 ... 56 BÁng 3. 2. Tỷ lệ phân bß mẫu n°ßc bề mặt, mẫu mái g¿c tôm theo thể lo¿i mẫu, 2018 - 2019... 56 BÁng 3. 3. K¿t quÁ nuôi cÃy phân l¿p thực khuẩn thể tÁ theo mẫu n°ßc... 57 BÁng 3. 4. K¿t q ni cÃy phân l¿p thực khuẩn thể tÁ theo mẫu mái g¿c tôm, BÁng 3. 9. K¿t quÁ xét nghiệm PCR mẫu n°ßc bề mặt theo thái gian, ... 67 BÁng 3. 10. K¿t quÁ xét nghiệm PCR mẫu mái g¿c tôm theo thái gian, BÁng 3. 13. Thử nghiệm khÁ năng ly giÁi căa các thực khuẩn thể vßi mát sß lo¿i vi khuẩn gây bệnh tiêu chÁy khác ... 76

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

BÁng 3. 14. KhÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể ã các iều kiện pha loãng khác nhau ... 77 BÁng 3. 15. KhÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể vßi các iều kiện pH mơi tr°áng khác nhau ... 78 BÁng 3.16. K¿t quÁ thử nghiệm khÁ năng ly giÁi căa các thực khuẩn thể ã các iều kiện nhiệt á khác nhau ... 80 BÁng 3. 17. Thái gian tán t¿i căa thực khuẩn thể VP04 trong mơi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh cáng áng, năm 2020 ... 81

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

Hình 1. 1. Hình Ánh Myoviridae quan sát d°ßi kính hiển vi iện tử ... 16

Hình 1. 2. Hình Ánh Syphoviridae quan sát d°ßi kính hiển vi iện tử ... 17

Hình 1. 3. Hình Ánh Podoviridae d°ßi kính hiển vi iện tử ... 18

Hình 1. 4. Hình Ánh kappa phage gÁn vào các gen nßi giữa flaA và flaC căa vi khuẩn tÁ O1 và O139 ... 19

Hình 1. 5. Hình Ánh ¿i diện căa filamentous phage ... 20

Hình 1. 6. Hình vệt tan (plaque) ể phát hiện thực khuẩn thể MJ1 ... 27

Hình 1. 7. Hình Ánh vệt tan căa thực khuẩn thể tÁ t¿i HÁi Phịng và Thái Bình năm 2007-2008 ... 27

S¢ á 2. 1. Vị trí lÃy mẫu t¿i Nam Định ... 40

S¢ á 2. 2. Vị trí lÃy mẫu t¿i Thái Bình ... 40

S¢ á 2. 3. Vị trí lÃy mẫu t¿i HÁi Phịng ... 41

S¢ á 2. 4. Vị trí lÃy mẫu t¿i Hà Nái ... 41

S¢ á 4. 1. S¢ á giám sát cÁnh báo dịch tÁ dựa trên xét nghiệm mẫu n°ßc ngo¿i cÁnh ... 105

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

Biểu á 1. 1. Mßi liên quan giữa các lo¿i vi khuẩn và môi tr°áng ngo¿i cÁnh9 Biểu á 1. 2. Tình hình dịch tÁ và tiêu chÁy cÃp tính trên tồn cầu ¿n 01/2/2023 ... 12 Biểu á 1. 3. Các ca bệnh tÁ trên toàn cầu °ÿc báo cáo tć 1989 - 2021 ... 13 Biểu á 3. 1. K¿t quÁ nuôi cÃy phân l¿p thực khuẩn thể tÁ theo lo¿i mẫu n°ßc Biểu á 3. 4. K¿t quÁ PCR thực khuẩn thể tÁ theo lo¿i nguán mẫu n°ßc ... 69 Biểu á 3. 5. K¿t quÁ PCR thực khuẩn thể tÁ theo chăng, 2018-2019 (n=186) Biểu á 3. 8. K¿t quÁ thử nghiệm khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể VP04 ßi vßi các nguán n°ßc ngo¿i cÁnh cáng áng, năm 2020 ... 85

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

Bệnh tÁ là mát hái chąng lâm sàng 3 dịch tễ gây ra bãi chăng vi khuẩn t<i>Á nhóm O1 hoặc O139 °ÿc ghi nh¿n lần ầu tiên năm 1817 t¿i áng bằng </i>

sông Hằng căa tiểu lāc ịa Ân Đá. Tć khi phát hiện ra bệnh tÁ, trên th¿ gißi ã xÁy ra 07 vā ¿i dịch. Dịch tÁ ã trã thành mát bệnh dịch nguy hiểm và bÁt bc phÁi báo cáo tồn cầu [6].

Dự phịng và iều trị bệnh tÁ bằng vÁc xin tiêm (1880) và nay °ÿc thay th¿ bằng vÁc-xin tÁ ußng là mát biện pháp dự phòng °ÿc sử dāng phổ bi¿n hiện nay. Sử dāng kháng sinh ể iều trị tÁ là mát biện pháp quan trọng; tuy nhiên, ngày càng xuÃt hiện nhiều báo cáo về tình tr¿ng kháng thußc căa vi khuẩn tÁ ßi vßi các lo¿i kháng sinh thơng th°áng; ngay cÁ nhóm quinolone - mát nhóm kháng sinh rÃt có hiệu quÁ trong iều trị tÁ cũng ã °ÿc báo cáo bị vi khuẩn tÁ kháng thußc [11], [15].

â Việt Nam, bệnh tÁ °ÿc ghi nh¿n là nguyên nhân gây tiêu chÁy hàng ầu tć h¢n mát th¿ kỷ qua vßi nhiều ÿt dịch xÁy ra trong lịch sử. Mặc dù ã có nhiều thành tựu trong phịng và iều trị bệnh tÁ nh°ng tỷ lệ mÁc tÁ có những diễn bi¿n bÃt th°áng, khơng theo quy lu¿t. Năm 2007, dịch tiêu chÁy cÃp bùng phát ầu tiên ã thă ơ Hà Nái sau ó lan ra 13 tỉnh, thành phß phía BÁc. Viện Vệ sinh dịch tễ Trung °¢ng ã phân l¿p °ÿc phẩy khuẩn tÁ trong n°ßc cßng, n°ßc há quanh nhà ng°ái bệnh ... Điều ó chąng tỏ vi khuẩn tÁ ã có mặt trong mơi tr°áng n°ßc ã khu vực dân c° qua ó làm ơ nhiễm ngn n°ßc và các lo¿i thực phẩm [18], [17].

Trong iều kiện xuÃt hiện nhiều chăng vi khuẩn kháng vßi nhiều lo¿i kháng sinh kể cÁ các kháng sinh th¿ hệ mßi, các nhà nghiên cąu bÁt ầu nghiên cąu trã l¿i về thực khuẩn thể (bacteriophage) [74]. Thực khuẩn thể là vi rút ặc biệt bao gám 02 nhóm: thực khuẩn thể tan (lytic) và tiềm tan (lysogenic) và l°u hành ráng rãi trong tự nhiên vßi sß l°ÿng lßn [83], [46], [63]. Nghiên cąu sự l°u hành căa

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

thực khuẩn thể tÁ trong mơi tr°áng n°ßc có ý nghĩa quan trọng trong giám sát môi tr°áng, phát hiện và ịnh týp chăng tÁ qua ó góp phần kiểm sốt bệnh tÁ [60], [87]. Liệu pháp thực khuẩn thể vßi ặc tr°ng là khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể ßi vßi vi khuẩn ặc hiệu ã °ÿc nghiên cąu tć ầu th¿ kỷ 19. Trong nghiên cąu tỷ lệ thực khuẩn thể tÁ trong môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh và mßi liên quan căa chúng vßi vi khuẩn tÁ ã Calcutta (Ân Đá), các nhà khoa học ã nh¿n thÃy tỷ lệ mÁc và tử vong cao căa bệnh nhân mÁc tÁ ầu vā dịch ã giÁm nhanh chóng khi thực khuẩn thể tÁ °ÿc phân bß ráng rãi trong mơi tr°áng ngo¿i cÁnh. Tuy nhiên, chúng ít °ÿc quan tâm khi có sự xuÃt hiện căa nhiều lo¿i kháng sinh. T¿i các n°ßc phát triển thực khuẩn thể ã và ang °ÿc sử dāng hiệu quÁ trong công nghệ sinh học hiện ¿i, bên c¿nh ó thực khuẩn thể còn °ÿc bi¿t ¿n nh° mát lo¿i vi sinh v¿t có vai trị dự báo dịch; chẩn ốn các vi khuẩn gây bệnh và tham gia vào sÁn xuÃt vÁc xin [19].

Việc l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ trong mơi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh có ý nghĩa th¿ nào trong việc phát hiện, cÁnh báo nguy c¢ bùng phát dịch tÁ và có thể sử dāng chăng thực khuẩn thể tÁ nào t¿i Việt Nam ể xử lý ngn n°ßc ơ nhiễm cũng nh° khßng ch¿ vi khuẩn tÁ ßi vßi các chăng tÁ a kháng thußc? Để nghiên cąu sự l°u hành, ti¿n hành phân l¿p cũng nh° ánh giá khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ ã mơi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh t¿i những tỉnh ã tćng xÁy ra d<i><b>ịch tÁ ã miền BÁc Việt Nam, chúng tôi triển khai nghiên cąu ề tài: <Sự lưu hành và khả năng ly giải cÿa thực khuẩn thể tả (Vibriophage) ở môi trường nước ngoại cảnh tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam=. </b></i>

<i><b>Mục tiêu 1: Mô tÁ sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ (Vibriophage) trong </b></i>

môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh t¿i mát sß tỉnh miền BÁc Việt Nam, 2018-2019.

<i><b>Mục tiêu 2: Đánh giá khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ trong phịng </b></i>

thí nghiệm và trên thực ịa cáng áng ã các môi tr°áng n°ßc khác nhau.

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

Bệnh tÁ là mát hái chąng lâm sàng - dịch tễ gây ra bãi phẩy khuẩn tÁ

<i>(Vibrio cholerae</i>). Mát ca bệnh tÁ nặng iển hình có ặc iểm i ngồi phân nhiều n°ßc, màu phân gißng nh° n°ßc vo g¿o và nhanh chóng dẫn ¿n tình tr¿ng mÃt n°ßc. Bệnh tÁ hiện nay vn cũn xy ra ti nhiu nÂi trờn th giòi. Theo sß liệu căa Tổ chąc Y t¿ th¿ gißi, cịn khng 36 n°ßc vẫn cịn có bệnh tÁ. Bệnh tÁ n¿u không °ÿc iều trị kịp thái và úng cách th°áng có tỷ lệ mÁc/ch¿t rÃt cao, khng 40%. Mßi năm °ßc tính có trung bình khoÁng 1 triệu tr°áng hÿp bị mÁc bệnh tÁ, sß tử vong là khoÁng 200.000 ã châu Phi và khoÁng 100.000 ã châu Á. Mát phần ba sß tử vong ó là trẻ em d°ßi 05 tuổi, mát phần

Theo Quy¿t ịnh sß 4283/QĐ-BYT ngày 08/8/2016 căa Bá tr°ãng Bá Y t¿ ban hành tài liệu <Định nghĩa tr°áng hÿp bệnh truyền nhiễm=[4] thì bệnh tÁ là bệnh truyền nhiễm thuác nhóm A trong Lu¿t Phịng, chßng bệnh truyền nhiễm năm 2007. Mát tr°áng hÿp bệnh tÁ xác ịnh °ÿc ịnh nghĩa nh° sau:

<i>- Phân lập được phẩy khuẩn tả V. cholerae nhóm huyết thanh 01 hoặc 0139 từ mẫu phân hoặc chất nôn của bệnh nhân tiêu chảy cấp, hoặc </i>

<i>- Xác định được đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn tả bằng kỹ thuật sinh học phân tử=. </i>

<i><b>1.1.2. Phẩy khuẩn tả </b></i>

<i>Phẩy khuẩn tÁ (Vibrio cholerae) là vi khuẩn hình cong dÃu phẩy, khơng </i>

bÁt mầu gram, khơng sinh nha bào, di áng nhanh nhá có mát lông. Phẩy khuẩn

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

tÁ dễ nuôi cÃy trong môi tr°áng nghèo dinh d°ỡng, pH kiềm (pH tć 8,5-9,0) và mặn.

Phẩy khuẩn tÁ có khoÁng 140 nhóm huy¿t thanh ã °ÿc xác nh¿n, nh°ng chỉ có nhóm huy¿t thanh O là gây °ÿc bệnh tÁ. Phẩy khuẩn tÁ °ÿc chia thành vi khuẩn tÁ O1 và không O1 (vi khuẩn tÁ không ng°ng k¿t vßi O1 cịn °ÿc gọi là chăng NAG). Vi khuẩn tÁ gám 2 týp sinh học (biotype) là vi khuẩn tÁ cổ iển và vi khuẩn tÁ El tor. Mßi týp sinh học l¿i °ÿc chia thành các týp huy¿t thanh nh° Ogawa, Inaba và Hikojima. Vi khuẩn tÁ cổ iển °ÿc Robert Koch phát hiện năm 1883 và là nguyên nhân gây ra 6 vā ¿i dịch tÁ trên th¿ gißi tć 1816-1926. Vi khuẩn tÁ El tor do Gotschlich tìm ra năm 1905 ã khu vực El tor 3 Ai C¿p, ây là nguyên nhân gây ra ¿i dịch tÁ lần thą 7 bÁt ầu tć 1961 ¿n nay. Tć cußi năm 1992, chăng tÁ O139 lần ầu tiên °ÿc phát hiện trong mát vā dịch tÁ lßn ã miền nam Ân Đá và Bangladesh (trong 3 tháng có 100.000 ng°ái mÁc). Đ¿n ci năm 1994, ng°ái ta cũng ã phát hiện ra vi khuẩn tÁ O139 trong mát vài vā dịch tÁ ã mát sß n¢i khác (Pakistan, Nepal, Malaysia, Thái Lan, và miền tây Trung Qußc) [7]

Là dịch luụn cú ó a phÂng hay mỏt nhúm dõn sò nào ó vßi tỷ st hiện mÁc và tỷ sut mòi mc tÂng òi cao so vòi a phÂng, nhóm dân sß khác [1] .

<i><b>1.1.4. Thực khuẩn thể </b></i>

<i>Thực khuẩn thể (Bacteriophage) th°áng gọi tÁt là phage, °ÿc Twort </i>

<i>phát hiện năm 1915 và d9Herelle ặt tên là <bacteriophage= năm 1917. Bacteriophage °ÿc ghép bãi <bacterium= (vi khuẩn) và <phagein= (ăn, nußt) </i>

hay là thực khuẩn thể là vi rút mà t¿ bào cÁm thā là vi khuẩn, nghĩa là nó có khÁ năng ly giÁi vi khuẩn, do ó ng°ái ta cịn gọi thực khuẩn thể là vi rút căa

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

<i><b>vi khuẩn [125]. </b></i>

<i><b>1.1.5. Thực khuẩn thể tả </b></i>

<i><b>Thực khuẩn thể tÁ (Vibriophage) là vi rút có khÁ năng ly giÁi vi khuẩn </b></i>

thuác họ Vibrionaceae. Những vi rút này ¿i diện cho mát nhóm vi rút dị d°ỡng a d¿ng về mặt di truyền và trao ổi chÃt, có mặt khÁp n¢i trong các ¿i dÂng. Chỳng cú th sòng t do, tuy nhiờn, chúng có nhiều h¢n trong trầm tích hoặc k¿t hÿp vßi các sinh v¿t biển hoặc các h¿t hữu cÂ khỏc. HÂn na, nhúm ny

<i>bao gỏm mỏt sò mầm bệnh, bao gám V. anguillarum, V. parahaemolyticus, V. </i>

<i>harvey và V. vulnificus. Những mầm bệnh này lây nhiễm sang h¢n 50 lồi cá, </i>

áng v¿t thân mềm và áng v¿t giáp xác. Chúng có thể gây ra bệnh Vibriosis, mát căn bệnh ác tính Ánh h°ãng ¿n ngành ni tráng thăy sÁn trên tồn cầu và gây ngá ác thực phẩm ã những ng°ái tiêu thā hÁi sÁn sßng bị nhiễm bệnh. K¿t quÁ là, các thể thực khuẩn tiêu hăy °ÿc ặc biệt quan tâm do tiềm năng sử dāng căa chúng trong liệu pháp thể thực khuẩn, nh° là ph°¢ng pháp iều trị bệnh vibriosis [126]

Ly giÁi hay chu trình tan (lytic cycle) căa thực khuẩn thể (phage) là chu trình phân rã vi khuẩn và phóng thích phage tr°ãng thành. BÁt ầu là phage bám vào vách t¿ bào vi khuẩn và phân giÁi nhá hệ thßng enzyme ể xâm nh¿p vào bên trong, phá hăy ADN t¿ bào vi khuẩn. Ti¿p theo là quá trình sinh tổng hÿp, t¿o ra các tiểu thể vi rút mßi, làm phân rã vi khuẩn và phóng thích các phage tr°ãng thành. Các phage có khÁ năng phân rã vi khuẩn trong thái gian ngÁn gọi là phage ác, là tác nhân diệt khuẩn chính xác, ặc hiệu và không Ánh h°ãng ¿n vi khuẩn không phÁi v¿t chă.

<i><b>1.1.7. Môi trường </b></i>

Theo khn 1, Điều 3, Lu¿t BÁo vệ mơi tr°áng sß 72/2020/QH14 ngày 17/11/2020 căa Qc hái, có hiệu lực kể tć ngày 01/01/2022 thì mơi tr°áng

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

bao gám các y¿u tß v¿t chÃt tự nhiên và nhân t¿o quan hệ m¿t thi¿t vßi nhau, bao quanh con ng°ái, có Ánh h°ãng ¿n ái sßng, kinh t¿, xã hái, sự tán t¿i, phát triển căa con ng°ái, sinh v¿t và tự nhiên [16]

<i><b>1.1.8. Môi trường nước ngoại cảnh </b></i>

Trong nghiên cąu này, môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh °ÿc hiểu là n°ßc bề mặt t¿i các ngn n°ßc: n°ßc sơng, si; n°ßc ao, há, ầm; n°ßc gi¿ng; n°ßc máy; n°ßc m°a.

<i><b> 1.1.9. Nguồn truyền nhiễm </b></i>

Là tác nhân gây ra các bệnh truyền nhiễm bao gám vi khuẩn, vi rút hoặc vi sinh v¿t [42].

Nguán truyền nhiễm có thể là ng°ái bệnh, ng°ái mang trùng, hay áng v¿t. Mát tiêu iểm dịch hay ổ dịch trong cáng áng hay mát ổ dịch trong thiên nhiên có thể là iểm khãi phát căa nhiễm trùng [1].

<i><b>1.1.10. Đường truyền nhiễm </b></i>

C¢ ch¿ truyền nhiễm căa mát bệnh nhiễm trùng ặc tr°ng bằng °áng truyền nhiễm vßi lßi ra căa tác nhân gây bệnh khỏi ký chă và lßi vào căa tác nhân ó ã ký ch mòi, cựng vòi phÂng thc tỏn ti ca tỏc nhân ã bên ngồi c¢ thể ký chă. Các y¿u tß truyền nhiễm nh°: khơng khí, Ãt, n°ßc, thực phẩm, ti¿t túc có vai trị trung gian trong mát khoÁng thái gian nào ó giúp vi sinh v¿t gõy bnh sòng sút khi ra khi cÂ th ký chă và °a vi sinh v¿t gây bệnh xâm nhp vo cÂ th ký ch mòi [1].

<i>Phẩy khuẩn tÁ (V. cholerae) là tác nhân gây bệnh tÁ bằng bằng ác tß ruát. </i>

Đác tß ruát gÁn vào niêm m¿c ruát non, ho¿t hoá enzyme adenylcyclase dẫn ¿n tăng AMP vòng, làm giÁm hÃp thu Na<small>+</small>, tăng ti¿t Cl<small>- </small>và n°ßc gây tiêu chÁy

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

cÃp tính. Phẩy khuẩn tÁ dễ bị tiêu diệt bãi nhiệt á (80<small>0</small>C/5 phút), bãi hố chÃt (Clo 1 mg/lít) và môi tr°áng axit. Khô hanh, ánh nÁng mặt trái cũng làm ch¿t phẩy khuẩn tÁ. Nó có thể tán t¿i lâu trong phân, Ãt ẩm, n°ßc, thực phẩm. [7].

<i>1.2.1.1. Phương thức lây truyền </i>

N°ßc là y¿u tß lây truyền dịch tÁ; phÁy khuẩn tÁ theo n°ßc bị nhiễm bẩn bãi phân ng°ái hoặc phân áng v¿t và qua thực phẩm bị nhiễm các tác nhân gây bệnh trong quá trình ch¿ bi¿n hoặc bÁo quÁn, bãi n°ßc bẩn, qua bàn tay bẩn và ruái, nhặng nhiễm phÁy khuẩn tÁ. Những y¿u tß làm tăng nguy cÂ lan truyn bnh t l ỏi sòng kinh t¿ xã hái và dân trí thÃp, phong tāc t¿p quán sinh ho¿t l¿c h¿u, thái ti¿t nóng ẩm, thi¿u n°ßc s¿ch và nhà tiêu hÿp vệ sinh, không Ám bÁo các iều kiện về vệ sinh an toàn thực phẩm ặc biệt là thąc ăn °áng phß, tình tr¿ng mÃt vệ sinh ã những vùng sau lũ lāt, thÁm họa, tr¿i tị n¿n [7], [6].

<i>1.2.1.2. Tính cảm nhiễm và miễn dịch </i>

Phẩy khuẩn tÁ chỉ gây bệnh ã ng°ái. Mọi ląa tuổi ều có thể mÁc bệnh tÁ. Tuy nhiên, tính cÁm nhiễm bệnh phā thuác vào mßi cá thể và liều nhiễm khuẩn. C¢ thể sau khi mÁc bệnh hoặc nhiễm khuẩn khơng triệu chąng ều có miễn dịch ặc hiệu vßi chăng tÁ gây bệnh có thể ¿n 3 năm. Nhìn chung, miễn dịch thu °ÿc trong bệnh tÁ là vững chÁc nh°ng không lâu bền nh° trong th°¢ng hàn và sãi. Khơng có miễn dịch chéo giữa các chăng phẩy khuẩn tÁ nhóm O1 và O139, giữa các týp huy¿t thanh (Ogawa và Inaba), giữa các týp sinh học (cổ iển và El tor) [7].

<b>a. Ngußn truyÁn nhiÅm </b>

Ng°ái bệnh và ng°ái lành mang vi khuẩn tÁ là nguán truyền nhiễm chă y¿u. Vi khuẩn tÁ tìm thÃy chă y¿u trong phân ng°ái bệnh, ít tìm thÃy trong chÃt nôn. Phân căa ng°ái bệnh gây ô nhiễm thąc ăn, n°ßc ußng, các v¿t dāng, bàn

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

tay, tć ó lây lan tć ng°ái này sang ng°ái khác qua °áng tiêu hóa [12]. Ng°ái lành mang vi khuẩn gám ng°ái nhiễm khuẩn không triệu chąng và ng°ái khỏi bệnh mang vi khuẩn tÁ. Ng°ái nhiễm tÁ không triệu chąng là nguán truyền nhiễm nguy hiểm, làm lây lan bệnh tć ịa phÂng ny tòi a phÂng khỏc v lm dch lan ráng tć mát n°ßc ra nhiều n°ßc [10].

Vi khuẩn tÁ có thể tán t¿i trong nhiều lo¿i áng v¿t sßng ã các vùng n°ßc ngọt, n°ßc lÿ và n°ßc mặn, ặc biệt là trong tơm, cua, ßc, h¿n, sị .v.v. Mát sß nghiên cąu cho thÃy sự tán t¿i ổ chąa vi khuẩn tÁ ngồi mơi tr°áng ã các áng v¿t thăy sinh, các sinh v¿t phù du sßng trong vùng n°ßc cửa sơng [10].

Trong 20 năm qua, những nghiên cąu ã Australia và Mỹ ã chąng minh cÁ hai lo¿i chăng vi khuẩn tÁ O1 khơng sinh ác tß và sinh ác tß là những thành viên căa hệ sinh thái n°ßc. Vi khuẩn tÁ O1 trong mơi tr°áng ngo¿i cÁnh dễ bị ly giÁi khi gặp iều kiện khơng thu¿n lÿi hoặc d¿ng sßng nh°ng khơng thể nuôi cÃy °ÿc (Viable but non culture 3 VNBC), khi gặp iều kiện thu¿n lÿi có thể gây dịch. Tình tr¿ng VNBC có thể giÁi thích mát phần tính chÃt ngÁt quãng căa các vā dịch tÁ, trong iều kiện có ít chÃt dinh d°ỡng, các t¿ bào vi khuẩn gram âm trong ó có vi khuẩn tÁ trÁi qua những thay ổi hình thể, nhỏ i và chuyển thành hình cầu. Mát sß nghiên cąu căa các tác giÁ cũng ề c¿p ¿n những thay ổi về hình thể t¿ bào căa vi khuẩn tÁ [48], [58], [68].

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

<i><b>Biểu đồ 1. 1. Mối liên quan giữa các loại vi khuẩn và môi trường ngoại cảnh </b></i>

<i><b>b. Đường truyền nhiễm </b></i>

N°ßc là y¿u tß lây truyền bệnh chă y¿u trong dịch tễ học bệnh tÁ ã °ÿc John Snow khẳng ịnh năm 1854. Tć ó ¿n nay ã có nhiều nghiên cąu dịch tễ học khẳng ịnh vai trị quan trọng căa n°ßc ßi vßi sự lan truyền dịch tÁ. Sử dāng n°ßc khơng hÿp vệ sinh và khơng °ÿc khử trùng óng vai trị chă y¿u trong lan truyền bệnh tÁ. K¿t quÁ iều tra các mẫu n°ßc trong khu vực ang có dịch nh° ã Bangladesh cho thÃy có 12% mẫu n°ßc có vi khuẩn tÁ O139 và 1% mẫu n°ßc có vi khuẩn tÁ O1. Vi khuẩn tÁ có trong mơi tr°áng n°ßc chă y¿u là do nhiễm phân căa bệnh nhân tÁ [6], [59].

<i>1.2.1.4. Phòng bệnh tả và vắc xin </i>

<b>Phịng bÇnh tÁ: (1) Tun truyền giáo dāc cáng áng trên các ph°¢ng </b>

tiện thơng tin ¿i chúng các ki¿n thąc về bệnh tÁ và tiêu chÁy cÃp, các biện pháp thực hành vệ sinh cá nhân, vệ sinh mơi tr°áng; an tồn vệ sinh thực phẩm; bÁo vệ nguán n°ßc và dùng n°ßc s¿ch; khi có ng°ái bị tiêu chÁy cÃp, nhanh chóng

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

báo cáo cho c¢ sã y t¿ gần nhÃt ể °ÿc h°ßng dẫn và iều trị kịp thái; (2) Tăng c°áng cung cÃp n°ßc s¿ch và vệ sinh môi tr°áng; (3) Tăng c°áng việc thanh kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm, ặc biệt là t¿i các c¢ sã ch¿ bi¿n thực phẩm, chÿ, nhà hàng, b¿p ăn t¿p thể, tr°áng học, thąc ăn °áng phß...; (4) Duy trì th°áng xuyên việc giám sát các tr°áng hÿp tiêu chÁy cÃp, ặc biệt chú ý các vùng trọng iểm và vào mùa dịch, kịp thái phát hiện các ca bệnh ầu tiên; (5) Ln sẵn sàng có ái c¢ áng phịng chßng dịch ã tćng tuy¿n. Chuẩn bị các cÂ sò d tr cho chòng dch t; (6) Gây miễn dịch chă áng bằng vÁc xin [7].

<b>VÃc xin phũng bầnh t: T chc Y t Th giòi chính thąc khuy¿n nghị </b>

sử dāng vÁc xin tÁ trong những khu vực khẩn cÃp (thiên tai, ịch họa) nh° là biện pháp y t¿ công cáng bổ trÿ cho các biện pháp phòng bệnh nh° cÁi thiện hệ thßng cÃp n°ßc hÿp vệ sinh và giáo dāc sąc khoẻ. Cần ti¿n hành song song vßi các biện pháp tăng c°áng giám sát và cÁnh báo sßm [7].

Tuy nhiên, theo Lopez và cáng sự (2014), vÁc xin tÁ °áng ng khơng nên °ÿc coi là biện pháp phịng ngća duy nhÃt trong việc kiểm sốt bệnh tÁ tách biệt khỏi các biện pháp khác [25].

<i>1.2.1.5. Kháng kháng sinh </i>

Kháng sinh dùng cho iều trị tÁ có tác dāng rút ngÁn q trình bệnh và rút ngÁn thái gian ào thÁi vi khuẩn qua °áng phân. Nhóm quinolon th¿ hệ mßi nh° norfloxacin và ciprofloxacin có tác dāng rÃt tßt trong thực t¿ iều trị bệnh tÁ [6].

Tuy nhiên, theo Phùng ĐÁc Cam, tình tr¿ng kháng thc căa vi khuẩn tÁ ngày mát tăng, gen kháng thußc nằm ã Plasmid IncC. Việc kháng thc khơng chỉ xÁy ra ã tetracyclin mà còn ßi vßi chloramphenicol, trimethoprim-sulfamethoxazol [6]. K¿t quÁ cho thÃy phẩy khuẩn tÁ ã kháng mąc á vća vßi tetracycline và chloramphenicol; kháng ã mąc á m¿nh vßi sulfamethoxazole-trimethoprim [55].

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

Nguyễn Thị ĐÃu và cáng sự (2015) ã nghiên cąu sự nh¿y cÁm và ề kháng kháng sinh căa các chăng vi khuẩn tÁ phân l¿p °ÿc t¿i tỉnh Trà Vinh thì thÃy rằng vi khuẩn tÁ kháng vßi vancomycin (67%), steptomycin (50%), tetracycline (33%) [11].

Nghiên cąu về kháng kháng sinh căa vi khuẩn tÁ phân l¿p °ÿc ã miền BÁc Việt Nam tć năm 2007 ¿n 2010 thÃy rằng vi khuẩn tÁ kháng tetracycline (29%), nh¿y cÁm vßi chlorampenicol (100%) [144].

K¿t quÁ nghiên cąu căa Devarati Dutta và cáng sự (2013) cho thÃy hầu h¿t những chăng không ng°ng k¿t (NAG) ều ề kháng vßi nalidixic acid (57.6%), ampicillin (55.5%); nh¿y cÁm vßi gentamicin (96%), tetracycline (80%) và chloramphenicol (80.4%) [54].

Brain (2011) cho rằng kháng kháng sinh là vÃn ề lßn ßi vßi việc phịng, chßng bệnh tÁ do ch°a có nhóm kháng sinh mßi °ÿc phát triển và do ó ngày càng có nhu cầu về mát giÁi pháp thay th¿ kháng sinh [35]. Theo Barrow (2001), Matsuzaki Uchiyama và cáng sự (2014), mát ph°¢ng pháp iều trị thay th¿ nh° v¿y là kiểm soát vi khuẩn tÁ bằng cách sử dāng thể thực khuẩn ặc hiệu ßi vßi v¿t chă [28], [93]. Khơng gißng kháng sinh phổ ráng có tác dāng tiêu diệt các vi khuẩn có lÿi trong °áng ruát, thể thực khuẩn chỉ tiêu diệt vi khuẩn māc tiêu. Nghiên cąu căa Weinbauer (2004) cho thÃy các thực khuẩn thể tan (lytic) h¿n ch¿ sß l°ÿng vi khuẩn trong mơi tr°áng n°ßc lên tßi 80% [151]. Các nghiên cąu căa Faruque, Islam và cáng sự (2005), Jensen, Faruque và cáng sự (2006), Nelson, Chowdhury và cáng sự (2008) cho thÃy bằng chąng về việc vi khuẩn tÁ trong môi tr°áng n°ßc °ÿc kiểm sốt bãi các thực khuẩn thể tÁ tan [57], [77], [105].

Các báo cáo tr°ßc ây căa Asheshow, Saranjam và cáng sự (1930), Morison (1932), Monsur, Rahman và cáng sự (1970), Marcuk, Nikiforov và cáng sự (1971) về việc sử dāng liệu pháp thể thực khuẩn cho bệnh tÁ cho thÃy

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

có sự thành cơng nhÃt ịnh [26], [97], [96], [92].

Theo báo cáo căa WHO, năm 2021 có 23 qc gia báo cáo dịch tÁ bùng phát, chă y¿u ã khu vực Châu Phi và Đông Địa Trung HÁi. Năm 2022, có 30 qc gia trên 5 trong sß 6 khu vực trên th¿ gißi báo cáo các tr°áng hÿp mÁc bệnh tÁ hoặc bùng phát dịch tÁ; trong ó có 14 qc gia khơng báo cáo năm 2021. Tính ¿n ngày 01/02/2023, có ít nhÃt 18 qc gia ti¿p tāc báo cáo các tr°áng hÿp mÁc tÁ (Hình 1, 2). Theo mơ hình thái vā, phần lßn các qc gia có tr°áng hÿp mÁc tÁ hiện ang trong giai o¿n lây truyền thÃp hoặc giữa các ÿt dịch. Tỷ xuÃt ch¿t thô (Crude fatality rate 3 CFR) t¿i nhiều quòc gia bỏo cỏo cao hÂn nhng nm tròc. Tỷ lệ CFR °ÿc báo cáo trên toàn cầu năm 2021 là 1,9% (2,9% ã Châu Phi) [158].

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

Bệnh tÁ lần ầu tiên xuÃt hiện ã Việt Nam năm 1850 vßi 2 triệu tr°áng hÿp bệnh °ÿc thông báo. Tć năm 1910-1938, hàng năm sß bệnh nhân mÁc tÁ °ÿc thông báo dao áng tć 5.000 - 30.000 ng°ái. Bệnh tÁ El tor lần ầu tiên xuÃt hiện ã miền Nam năm 1964 vßi 20.009 ng°ái mÁc bệnh trong ó 821 ng°ái tử vong. Tć ó ¿n năm 1975, ã miền Trung và miền Nam, bệnh tÁ xÁy ra d°ßi d¿ng dịch l°u hành. Hàng năm có hàng trăm bệnh nhân bị bệnh tÁ °ÿc thông báo. Năm 1994, bệnh tÁ xuÃt hiện ã khu vực Tây Nguyên vßi 1.459 bệnh nhân. Sau năm 1975, do việc thơng th°¢ng giữa hai miền Nam, BÁc, bệnh tÁ ã lây lan ra miền BÁc và gây ra những vā dịch tÁ rÁi rác ã HÁi Phòng. Tć năm 1993 -2004, dịch xÁy ra ã cÁ ba miền BÁc, Trung, Nam vßi khng vài nghìn ca bệnh °ÿc báo cáo hàng năm. Tuy nhiên, bệnh khơng bùng phát thành dịch lßn, có rÃt ít tr°áng hÿp tử vong. Các năm 2005-2006, cÁ n°ßc khơng ghi nh¿n tr°áng hÿp nào. Tć ci năm 2007, dịch l¿i bùng phát ã 19 tỉnh/thành phß phía BÁc, hàng ngàn tr°áng hÿp mÁc nh°ng khơng có tr°áng hÿp nào tử vong [7].

<b>1.3. Tình hình nghiên cąu vÁ sā l°u hành căa thāc khuÁn thÃ tÁ </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

<i>Thực khuẩn thể tÁ (Vibriophage) °ÿc Felix8d Herelle phát hiện ầu tiên </i>

vào những năm 1920 [141]. Tuy nhiên, tr°ßc ó 20 năm, Enest Hankin, nhà sinh v¿t học ng°ái Anh phát hiện thÃy có 1 nguán ch°a xác ịnh rõ có khÁ năng chßng l¿i vi khuẩn tÁ trên sơng Ganges và Jumne t¿i Ân Đá. Năm 1919, Felix8d Herelle ã sử dāng thực khuẩn thể ể kiểm soát quần thể vi khuẩn và sự lây lan căa các bệnh truyền nhiễm. Ông và cáng sự ã thực hiện liệu pháp thể thực khuẩn ã nhiều n°ßc trên th¿ gißi vßi những nß lực lßn ã Ân Đá, Ai C¿p, Hoa Kỳ và Liên Xô. Nhiễm khuẩn ã °ÿc khßng ch¿ thành cơng khi sử dāng liệu pháp th<i>ể thực khuẩn căa các vi khuẩn Shigella, Staphylococcus, Streptocooccus, </i>

<i>Klebsiella, E. coli, Salmonella, V. cholerae, Pesudomonas và Proteus [52], [51], </i>

[137].

<i><b>1.3.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc cÿa thực khuẩn thể tả </b></i>

Phân lo¿i thực khuẩn thể tÁ chă y¿u dựa vào hình thái bên ngồi. Có hai nhóm chính ó là: thực khuẩn thể hình cầu và thực khuẩn thể gÁn vào filamentous.

Các thực khuẩn thể tÁ ¿n các vị trí thā thể ặc hiệu trên thành t¿ bào vi khuẩn. â các vi khuẩn gram (-) các thā thể °ÿc phát hiện là các protein và lipopolysacharide cÃu t¿o nên màng ngồi bao quanh lßp vỏ peptidoglican. Các thực khuẩn thể tÁ sg ¿n gÁn vào các vị trí ặc hiệu căa t¿ bào vi khuẩn. Các thực khuẩn thể tÁ chỉ ho¿t áng ặc hiệu trên các t¿ bào vi khuẩn ích căa nó [47] các thực khuẩn thể tÁ khác nhau sg °ÿc gÁn vào các vị trí khác nhau căa t¿ bào vi khuẩn. Do v¿y, trên bề mặt t¿ bào vi khuẩn có nhiều d¿ng thā thể khác

<i>nhau, mßi d¿ng thā thể °ÿc gÁn nhiều các bÁn sao căa thực khuẩn thể tÁ [122]. </i>

Thực khuẩn thể tÁ có 2 d¿ng: (1) Thực khuẩn thể tÁ hình cầu. (2) Thực khuẩn thể tÁ d¿ng sÿi.

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

Thực khuẩn thể tÁ hình cầu °ÿc phân theo 3 họ chính:

- Hình thái: Thực khuẩn thể tÁ bao gám mát ầu và mát i, khơng có vỏ bao quanh. Phần ầu °ÿc nßi vßi i bãi phần cổ rái ¿n phąc hÿp i, phần i bao gám mát ßng trung tâm và mát vỏ có thể co rút °ÿc, nßi vòi mỏt c, a cÂ bn, 6 gai ngn và 6 sÿi dài. Sự co rút căa thực khuẩn thể tÁ là cần thi¿t ể cung cÃp ATP. Thực khuẩn thể tÁ này có mát i d¿ng xn ßc và mát ầu vßi ßi xąng hai m°¢i mặt hoặc ßi xąng bÁt nguán tć mát cÃu trúc hai m°¢i mặt c¢ bÁn thêm vào hàng các Ân v ca lòp v capsid (capsomer) lòp v protein căa vi rút (capsid) (T=13). Đầu là d¿ng áng phân ể kéo dài về hình d¿ng và có °áng kính 50 3 110nm. Lßp vỏ capsid có hình lāc lăng bên ngồi, bao gám 152 ¢n vị capsome. Phần i cąng, dài và dầy, phần ßng co rút °ÿc và °ÿc ngăn cách bằng dÃu chữ th¿p, hoặc có các v¿t nhăn có hình d¿ng các °áng dÃu chéo có chiều dài (80-) 95-111(-455)nm vßi chiều ráng 16-20nm.

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

<i><b>Hình 1. 1. Hình ảnh Myoviridae quan sát dưới kính hiển vi điện tử </b></i>

- Đặc tính hóa lý: Các h¿t virion này có tỉ trọng nổi trong CsCl là 1.41 3 1.51 gcm<small>-3</small>.

- Axit nucleic: Khßi l°ÿng phân tử căa genome hình thành 48% trọng l°ÿng căa h¿t virion. Genome không bị cÁt tćng o¿n và chąa mát Ân phõn t chuòi kộp ADN. Genome hoàn chỉnh chi¿m 33600 3 170000 nucleotid chiều dài. Genome có guanin + cytosin chi¿m 35 %. Chußi kép ADN °ÿc hốn vị trịn.

- Protein: Genome vi rút mã hóa các protein cÃu trúc và các protein không cÃu trúc.

<b>b. Họ Siphoviridae [129] </b>

- Hình thái: Thực khuẩn thể tÁ bao gám mát ầu và mát uôi, không có vỏ. Thực khuẩn thể tÁ có ầu ßi xąng 20 mặt và mát i vßi mát ßi xąng 6 ã i và ßi xąng 20 mặt ã ầu (T=7). Đầu có °áng kính 60nm. Lßp vỏ capsid có hình lāc lăng bao quanh, gám 72 capsomer. Đuôi không co rút °ÿc là d¿ng filamentous, t¿p hÿp thành dÃu th¿p vßi mát chiều dài (65-) 150 (-570)nm và mát chiều ráng (7-) 8 (-10)nm. Đuôi có d¿ng sÿi, ngÁn, các sÿi ã phần ci hoặc nửa ci.

- Đặc tính hóa lý: Các h¿t virion có tỉ trọng nổi trong CsCl là 1.46 3 1.56 gcm<small>-3</small>.

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

- Axit nucleic: Khßi l°ÿng phân tử căa genome hình thành 54% trọng l°ÿng căa virion. Genome không phân o¿n và chąa mỏt Ân phõn t chuòi kộp ADN. Genome hon chỉnh có chiều dài 48500 nucleotit. Genome chąa tổng l°ÿng guanin + cytosin chi¿m 52%. Chi kép ADN khơng hốn vị, trình tự genome có iểm ci cùng vßi ầu dính liền.

- Protein: Genome vi rút mã hóa các protein cÃu trúc và khơng cÃu trúc. - Các vi rút Siphoviridae có mát capsid vßi °áng kính khng 55 3 60nm và mát i dài tßi 570nm. Chi kép ADN căa nó d¿ng thẳng. Họ này bao gám: phage λ, phage χ, phage φ80.

<i><b>Hình 1. 2. Hình ảnh Syphoviridae quan sát dưới kính hiển vi điện tử </b></i>

<b>c. Họ Podoviridae [128] </b>

- Hình thái: Thực khuẩn thể tÁ bao gám mát ầu, mát i và khơng có vỏ. Thực khuẩn thể tÁ có mát ầu ßi xąng 20 mặt và mát i ßi xąng 6 c¿nh, °ÿc biểu hiện ã d¿ng ßi xąng 20 mặt (T=7). Phần ầu có °áng kính 60nm. Đầu có d¿ng lāc lăng bên ngồi và bao gám 72 capsomer. Phần uôi thẳng ngÁn và dầy, khơng co rút °ÿc, i có 6 sÿi ngÁn và các sÿi ã nửa ci.

- Đặc tính hóa lý: Khßi l°ÿng phân tử viron khng 48 x 10<small>6</small>. Các h¿t virion có tỉ trọng nổi trong CsCl là 1.44 3 1.51gcm<small>-3</small>. Các h¿t virion không nh¿y

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

<b>cÁm khi xử lý vßi ether và chloroform. </b>

- Axit nucleic: Khßi l°ÿng phân tử căa genome hình thành 50% trọng l°ÿng căa virion. Genome khơng bị phân o¿n và chąa mát ¢n phân tử căa chußi kép ADN. Genome ã °ÿc giÁi trình tự hồn tồn vßi chiều dài nucleotit là 42000 nucleotid. Genome có guanine và cytosine chi¿m 50%. Chi kép ADN khơng hốn vị.

- Protein: Các protein hình thành khoÁng 50% trọng l°ÿng căa h¿t virion. - Genome vi rút mã hóa các protein cÃu trúc và không cÃu trúc. Các h¿t virion bao gám ít nhÃt 9 protein cÃu trúc nằm trong vỏ capsid.

<i><b>Hình 1. 3. Hình ảnh Podoviridae dưới kính hiển vi điện tử </b></i>

<i>1.3.1.2. Thực khuẩn thể tả dạng sợi </i>

Th<i>ực khuẩn thể tÁ d¿ng sÿi bao gám kappa phage, filamentous 1 (fs1) và filamentous 2 (fs2). </i>

Kappa phage có thể k¿t nßi vßi chăng vi khuẩn tÁ O1 El tor hoặc chăng tÁ O139 gây dịch. Phát hiện kappa phage gián ti¿p qua việc phát hiện iểm nßi căa phage kappa nằm giữa gen flaA và flaC và v¿t chă là vi khuẩn tÁ; các v¿t chă vi khuẩn tÁ sg bị ly giÁi, vßi vi khuẩn tÁ O1 týp El tor và chăng tÁ O139

<b>°ÿc quá trình này °ÿc thực hiện dễ dàng, chính xác h¢n. </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

<i><b>Hình 1. 4. Hình ảnh kappa phage gắn vào các gen nối giữa flaA và flaC cÿa vi khuẩn tả O1 và O139 </b></i>

Kappa phage gÁn vào nhiễm sÁc thể nằm giữa các gen flaA và flaC và v¿t chă là vi khuẩn tÁ<i>, </i>v¿t chă vi khuẩn tÁ gÁn vßi mát kappa phage sg bị ly giÁi. S¢ á mơ tÁ trên cho thÃy chỉ có các chăng tÁ El tor và các chăng tÁ O139 có thể gÁn vßi kappa phage cịn chăng cổ iển khơng gÁn.

Th<i>ực khuẩn thể tÁ mßi là fs1 và fs2 mßi °ÿc phân l¿p tć chăng vi khuẩn tÁ O139 MDO14 [55]. Thực khuẩn thể tÁ fs2 là các h¿t sÿi dài 1200nm và ráng </i>

7nm. Ho¿t áng hình thành các vòng vệt tan ổn ịnh ã nhiệt á 70<small>0</small>C nh°ng bị

<i>ąc ch¿ khi xử lý vßi chloroform. Thực khuẩn thể tÁ fs2 có hệ gen là chi Ân </i>

ADN, c chuyn thnh chuòi kộp v sao chộp trong t¿ bào v¿t chă. Hầu h¿t các chăng tÁ O139 và O1 týp sinh học El tor nh¿y cÁm vßi thực khuẩn thể tÁ này, nh°ng phần lßn các chăng tÁ O1 cổ iển và non-O1 hay non-O139 kháng

<i>l¿i thực khuẩn thể tÁ fs2. Các nhà nghiên cąu cho rằng trình tự CTXΦ cần thi¿t </i>

cho thực khuẩn thể tÁ gÁn vào nhiễm sÁc thể căa vi khuẩn tÁ ã vị trí ặc hiệu. V<i>ề hình d¿ng, fs1 khơng thể phân biệt vßi fs2 do kích cỡ hồn tồn gißng </i>

nhau (7nm chi<i>ều ráng và 1.0 3 1.2 �㕛m chiều dài); hầu h¿t fs1 và fs2 °ÿc t¿o </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

<i>ra là polyphage. Hệ gen căa fs1 °ÿc mã hóa hình thành ác tß ruát mßi tiềm </i>

năng áng nhÃt vßi ác tß ZOT (zonula occludens toxin). Týp 4 fimbriae căa vi khuẩn tÁ O1 nh¿y vßi D 3 glucose và D 3 mannose °ÿc giÁ thi¿t là thā thể

<i><b>Hình 1. 5. Hình ảnh đại diện cÿa filamentous phage 1.3.2. Sự lưu hành cÿa thực khuẩn thể và thực khuẩn thể tả </b></i>

<i>1.3.3.1. Sự lưu hành của thực khuẩn thể </i>

Thực khuẩn thể là những vi rút ký sinh trên vi khuẩn. Gißng nh° tÃt cÁ các lo¿i vi rút khác, chúng bÁt buác phÁi ký sinh trong nái bào căa vi khuẩn, khơng có sự trao ổi chÃt nái bào và ịi hỏi bá máy chuyển hóa căa v¿t chă hß trÿ cho quá trình sinh sÁn căa chúng. Thực khuẩn thể có mặt khÁp n¢i trên trái Ãt và °ÿc tìm thÃy vßi sß l°ÿng lßn trong tự nhiên [46], [63], [83]. Có °ßc tính 10<small>31 </small>thực khuẩn thể, chúng phân bổ gần nh° khÁp n¢i, trong bÃt cą n¢i nào có vi khuẩn; °ÿc tìm thÃy trong hầu h¿t mọi môi tr°áng cũng nh° trong ruát áng v¿t và con ng°ái [99], [113], [139], [44]. Theo Jonczyk. E và cáng sự (2011) trong môi tr°áng bÃt lÿi, các thực khuẩn thể vẫn tán t¿i [81].

Theo Miller và Day (2008), các thực khuẩn thể có 03 chu kỳ: tan (lytic cycle), tiềm tan (lysogen cycle) và giÁ tiềm tan (pseudolysogen cycle) [94]. Trong chu kỳ tan, thực khuẩn thể lây nhiễm vào t¿ bào, nhân lên và thoát khỏi

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

t¿ bào ể tiêu hăy t¿ bào vi khuẩn. Trong chu kỳ tiềm tan, thực khuẩn thể không sao chép nh°ng bá gen căa nó bi¿n thành tr¿ng thái không ho¿t áng, gọi là prophage và tích hÿp vào bá gen căa v¿t chă hoặc °ÿc duy trì nh° mát plasmid ngo¿i bào [83] (Guttman, Raya et al, 2003). Trong chu kỳ giÁ tiềm tan, thực khuẩn thể khơng trÁi qua q trình tan, q trình tiềm tan nh°ng nó vẫn ã tr¿ng thái không ho¿t áng [120] (Ripp and Miller, 1997). Chu kỳ giÁ tiềm tan xÁy ra trong iều kiện khi nguán cung cÃp chÃt dinh d°ỡng không ă, khi ă nguán, thực khuẩn thể có thể quay l¿i chu kỳ tan hoặc tiềm tan.

Nh° v¿y, có thể thÃy thực khuẩn thể l°u hành rÃt phổ bi¿n trong tự nhiên, theo sự có mặt căa v¿t chă.

<i>1.3.3.2. Sự lưu hành của thực khuẩn thể tả </i>

Năm 1896, Ernest Hankin ã báo cáo về sự hiện diện căa mát chÃt kháng khuẩn rõ rệt, chßng l¿i vi khuẩn tÁ quan sát thÃy ã vùng n°ßc sơng Hằng và sơng Yamuna, Ân Đá [71] Hai năm sau ó, vào năm 1898, Gamaleya ã quan

<i>sát thÃy hiện t°ÿng t°¢ng tự khi ang thử nghiệm vßi vi khuẩn Bacilus subtilis </i>

<i>[123]</i>. Năm 1915, Frederick Twort ã báo cáo mát hiện t°ÿng t°¢ng tự và °a ra giÁi thuy¿t nó có thể là vi rút [145] . Tuy nhiên, ng°ái chính thąc phát hiện và ặt tên cho thực khuẩn thể là Felix d9Herelle vào năm 1917 [53], [51], [52]. Madico, G. và cáng sự (1996) khi nghiên cąu về sự hiện diện căa vi khuẩn tÁ O1 và thực khuẩn thể tÁ trong nguán n°ßc thÁi t¿i Peru tć năm 1993 ¿n năm 1996 trong ch°¢ng trình giám sát dịch tÁ t¿i thă ô Lima ã nh¿n thÃy khÁ năng dịch tÁ bùng phát cao h¢n 7,6 lần khi vi khuẩn tÁ O1 có mặt trong n°ßc thÁi trong bßn tuần tr°ßc ó so vßi khi khơng có. KhÁ năng bùng phát dịch bệnh

<i>cao gÃp 2,4 lần khi có thực khuẩn thể tÁ trong n°ßc thÁi trong 04 tuần tr°ßc so </i>

vßi khi khơng có. Nh° v¿y, việc phát hiện vi khuẩn tÁ O1 và thực khuẩn thể tÁ trong n°ßc thÁi 01 tháng tr°ßc khi bùng phát dịch có thể có tính dự báo sự bùng

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

phát căa dịch tÁ sau ú [91].

õ nhiu quòc gia nÂi cú dch tÁ hoành hành, thực khuẩn thể tÁ °ÿc phát hiện trong n°ßc thÁi và °ÿc coi nh° là dÃu hiệu chỉ iểm sự có mặt căa thực

<i>khuẩn thể tÁ và giúp cho việc ịnh týp chăng tÁ O1 và O139. Sự có mặt căa </i>

thực khuẩn thể tÁ trong mơi tr°áng n°ßc bị nhiễm vi khuẩn tÁ O1 phā thuác vào khÁ năng thực khuẩn thể tÁ gây nhiễm và ly giÁi t¿ bào vi khuẩn tÁ [77]. â nhiều n°ßc có dịch tÁ l°u hành theo mùa, giám sát mơi tr°áng óng vai trị quan trọng trong kiểm soát bệnh tÁ [60], [87].

Faruque, S.M và cáng sự (2005), Naser, I.B và cáng sự (2017) ã tìm thÃy thực khuẩn thể tÁ trong mẫu n°ßc t¿i Bangladesh [59], [103], ã °ÿc Seed, K.D và cáng sự (2011) xác ịnh là thể thực khuẩn chi¿m °u th¿ trong các mẫu phân căa bệnh nhân tÁ kể tć năm 2001 [130]. Angermeyer, A. và cáng sự (2018) ã ti¿n hành phân tích bá gen căa các thực khuẩn thể tÁ ã °ÿc bÁo tán tć năm 2001 ¿n năm 2012 ể nghiên cąu về sự áng ti¿n hóa căa các thực khuẩn thể tÁ °ÿc bÁo tán vßi vi khuẩn tÁ góp phần trong việc xác ịnh sự bùng phát căa dịch tÁ [24].

Năm 2014, Al-Fendi, A. và cáng sự ã phân l¿p °ÿc 03 thể thực khuẩn tÁ tan họ Myoviridae tć các nguán n°ßc khỏc nhau (hỏ, ao, sụng, mÂng v nòc thi) ã Kelantan, Malaysia; các thực khuẩn thể tÁ phân l¿p °ÿc ã nghiên cąu này có ph¿m vi v¿t chă hẹp và chỉ có khÁ năng lây nhiễm ßi vßi vi khuẩn tÁ O1 El tor Inaba [23].

Solis-Sanchez, A. và cáng sự (2016) khi lÃy mẫu n°ßc t¿i mát con ¿p ã Mexico ã phân l¿p °ÿc 16 thực khuẩn thể nh°ng chỉ có thực khuẩn thể ØVC8 là có khÁ năng ly giÁi chßng l¿i vi khuẩn tÁ O1. T¿i thái iểm phát hiện ra các thực khuẩn thể tÁ này, ịa iểm ó khơng có dịch tÁ l°u hành; tuy nhiên sự hiện diện căa vi khuẩn tÁ non-O1/O139 gÿi ý về khÁ năng căa chăng vi khuẩn tÁ có thể tán t¿i mát khoÁng thái gian dài trong ngn n°ßc thÁi bị ơ nhiễm [134].

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

<b>1.4. Tình hình nghiên cứu vß khả năng ly giải của thực khuẩn thá tả </b>

<i><b>1.4.1. Các phương pháp phát hiện và đánh giá khả năng ly giải cÿa thực khuẩn thể tả </b></i>

<i>1.4.1.1. Phương pháp phân lập thực khuẩn thể tả từ mẫu nước </i>

- Nguyên lý: dựa vào khÁ năng thích ąng căa vi khuẩn tÁ có men chitinase có khÁ năng phân huỷ lßp vỏ chitin căa các lồi giáp xác trong ó có tôm chúng tôi ti¿n hành sử dāng g¿c tôm làm mái ể tăng khÁ năng tóm bÁt vi khuẩn tÁ trong mơi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh.

- Các mẫu g¿c tôm °ÿc ặt qua êm t¿i vị trí giám sát, sáng hơm sau thu th¿p vào ßng pép tơn kiềm.

- Ă tć 6 3 8 h/ 37<small>0</small>C, sử dāng chloroform ể gi¿t vi khuẩn.

- Nhỏ lên ĩa th¿ch dinh d°ỡng và nhỏ thực khuẩn thể tÁ chuẩn, ĩa th¿ch dinh d°ỡng có láng vi khuẩn chỉ iểm ể tìm thực khuẩn thể tÁ.

Tăng sinh mẫu n°ßc bằng pepton kiềm 10X, ă qua êm, sau ó °ÿc xử lý chloroform ể gi¿t vi khuẩn, nhỏ lên ĩa th¿ch dinh d°ỡng có láng vi khuẩn ch<i>ỉ iểm ể tìm thực khuẩn thể tÁ . </i>

<i>1.4.1.2. Phương pháp phân lập filamentous phage </i>

- Mẫu phân: lÃy 1ml mẫu phân, ly tâm 15.000 vòng/5 phút/4<small>0</small>C. - Tć dịch nổi nuôi cÃy.

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

nổi ã 4<small>0</small>C.

+ Chuẩn bị mát chăng chỉ thị, là chăng Vibrio nào không t¿o ra filamentous phage.

+ Nuôi cÃy chăng này ã 37<small>0</small>C trong 4-5h lÁc m¿nh.

+ Pha lỗng dịch ni cÃy (canh khuẩn) khoÁng 100 lần vßi canh thang AT.

+ Trán 0,3 ml căa canh thang (canh khuẩn) pha lỗng vßi 3ml th¿ch mềm ổ lên ĩa th¿ch, ÿi tć 10-15 phút cho ¿n khi th¿ch mềm cąng l¿i.

- Phát hiện filamentous phage.

+ Nhỏ 15 3 20µl dịch ni cÃy hoặc dịch nổi căa phần trên ĩa th¿ch vća phă th¿ch mềm.

+ Phân biệt các vệt tan: Vệt tan trong °ÿc hình thành bãi mát sß các thực khuẩn thể tÁ có d¿ng hình cầu; d¿ng vệt tan āc °ÿc hình thành bãi các thực

- Sau khi thực khuẩn thể tÁ °ÿc phân l¿p bằng ph°¢ng pháp ni cÃy. Gặt thực khuẩn thể tÁ vào n°ßc mußi sinh lý. Các mẫu °ÿc gÁn lên lên l°ßi vàng, mặt trên l°ßi dùng ể thÃm mẫu, sau ó rửa qua n°ßc cÃt 02 lần, thÃm lên giÃy thÃm, nhuám bằng Uranyl acetat 2% (pH = 4,5) trong n°ßc cÃt 02 lần tć 1-2 phút, thÃm l¿i trên giÃy thÃm mẫu, chuyển sang ĩa ể ặt mẫu, ể khô trong 05 phút, ặt lên giá ể soi d°ßi kính hiển vi iện tử.

<i>1.4.1.4. Kỹ thuật PCR </i>

</div>