Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.3 MB, 210 trang )
<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">
<b>LâI CAM ĐOAN </b>
Tơi xin cam oan, ây là cơng trình nghiên cāu cÿa cá nhân tôi, các số liệu và kết qu¿ trong luận án là trung thực và ch°a từng °ợc sử dụng ể b¿o vệ một học vị nào hoặc ch°a từng °ợc ai công bố trong bÁt kỳ một cơng trình nghiên cāu nào.
Tơi xin cam oan r ng, mọi sự gi p , hợp tác cho việc thực hiện luận án này °ợc c¿m n và các thông tin tr ch d n trong luận án này u °ợc ch d n
</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4"><b>LâI CÀM ¡N </b>
ể hoàn thành luận án này, tôi nhận °ợc sự quan tâm, gi p nhiệt tình cÿa các Th y, ô giáo, các tập thể, cá nhân, gia ình c ng b n b ng nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết n sâu sắc ến PGS.TS. KhuÁt Hữu Trung, GS.TS Ngô Xuân Bình - là th y giáo h°ớng d n khoa học, tận tình gi p , truy n t¿i kiến thāc và kinh nghiệm trong suốt quá trình thực hiện tài và hồn thành luận án.
Tơi xin trân trọng c¿m n Ban l nh o Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; tập thể cán bộ Ban Thông tin và ào t o; tập thể L nh o và cán bộ viên chāc Trung Tâm chuyển giao công nghệ và khuyến nông giúp , hỗ trợ tận tình cho tơi trong q trình học tập và thực hiện tài.
Tôi xin chân thành c¿m n Khoa ông nghệ sinh học và ông nghệ thực phẩm, Tr°ßng i học Nông Lâm, i học Thái Nguyên là n i tôi triển khai thực hiện tài, t o mọi i u kiện thuận lợi v tài liệu khoa học, c sá vật chÁt, thiết bị phục vụ nghiên cāu ể tôi hồn thành luận án. ặc biệt, tơi xin bày tỏ sự biết n ến PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng, Khoa ông nghệ sinh học và ông nghệ thực phẩm chia sẻ kiến thāc và kinh nghiệm chuyên môn ể tôi hồn thành nghiên cāu trong thßi gian sớm nhÁt.
uối cùng, tôi xin chân thành c¿m n b n b , ng nghiệp trong và ngồi c quan và ng°ßi thân trong gia ình ln hết lịng ộng viên, kh ch lệ và gi p tơi trong suốt q trình thực hiện và hồn thành cơng trình trình nghiên cāu này.
Tôi xin chân thành c¿m n!
</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5"><i><b>DANH MĀC CHĀ VIÀT TÂT </b></i>
AtBBX32 The Arabidopsis thaliana BBX32 Atore1 <b>Arabidopsis thaliana Ore1 </b>
Bt Bacillus thuringiensis
CBF C-repeat/dehydration responsive element bingding factor CBF1 C-repeat/DRE binding factor 1
ELISA Enzym-linked Immuno Sorbent Assay
FAOSTAT Tổ chāc L° ng thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (Food and Agriculture Organization)
GMO Sinh vật biến ổi gen (Genetically Modified Organism)
GUS Beta-Glucuronidase reporter gene
ISAAA Tổ chāc Dịch vụ quốc tế v āng dụng công nghệ sinh học nông nghiệp (International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications)
LSD <b>Least Significant Difference Test </b>
mRNA Messenger Ribonucleic acid
NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn
PCR Ph¿n āng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)
</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">RM Root Medium
SAAT Sonicate Assisted Agrobacterium - media Transformation Ph° ng pháp biến n p gen á ậu t° ng
</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14"><b>DANH MĀC BÀNG </b>
1.1. Tình hình s¿n xuÁt ậu t° ng trên thế giới những năm g n ây ... 6
1.2. Tình hình s¿n xuÁt ậu t° ng cÿa một số n°ớc āng u trên thế giới trong những năm g n ây s¿n l°ợng trên 1 triệu tÁn) ... 7
1.3. Tình hình s¿n xuÁt ậu t° ng Việt Nam giai o n 2012-2021 ... 8
1.4. Tình hình nhập khẩu ậu t° ng cÿa Việt 2020-2022) ... 9
1.5<i>. Một số mơi tr°ßng tái sinh cây ậu t° ng in vitro ... 14 </i>
1.6. Diện t ch cây tr ng NSH toàn c u năm 2019 theo quốc gia ... 27
1.7. ác giống ậu t° ng tuyển chọn từ ngu n nhập nội ... 31
2.1. Danh sách các giống ậu t° ng sử dụng trong nghiên cāu ... 41
2.2<i>. Trình tự m i sử dụng tách dịng gen Atore1 ... 42 </i>
2.3. ông thāc ¿nh h°áng cÿa B P ến kh¿ năng t o ch i ... 45
2.4. ông thāc ¿nh h°áng cÿa Kinetin ến kh¿ năng t o ch i ... 45
2.5. ông thāc ¿nh h°áng cÿa G 3 ến kh¿ năng kéo dài ch i ... 45
2.6. ông thāc ¿nh h°áng cÿa IB ến kh¿ năng ra rễ ... 46
2.7<i>. Trình tự m i sử dụng trong nghiên cāu tách dòng gen Atore1 ... 50 </i>
2.8<i>. Danh sách m i sử dụng ể nhân gen Atore1 ... 54 </i>
2.9<i>. Thành ph n ph¿n āng P R nhân dòng gen Atore1 ... 54 </i>
2.10. Thành ph n các mơi tr°ßng d ng cho chuyển gen á cây ậu t° ng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ... 56
2.11<i>. Danh sách m i sử dụng ể nhân gen Atore1 ... 58 </i>
3.1. ¾nh h°áng cÿa Na lO ến kh¿ năng vô tr ng m u ni cÁy ... 61
3.2. ¾nh h°áng cÿa B P ến tái sinh ch i từ nốt lá m m cÿa các giống ậu t° ng sau 14 ngày ni cÁy ... 62
3.3. ¾nh h°áng cÿa kinetin ến tái sinh ch i từ nốt lá m m sau 14 ngày nuôi cÁy . 69 3.4. ¾nh h°áng cÿa hàm l°ợng G 3 ến kh¿ năng kéo dài ch i cÿa một số giống ậu t° ng sau 30 ngày nuôi cÁy ... 76
</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">3.5. ¾nh h°áng cÿa hàm l°ợng IB ến kh¿ năng ra rễ cÿa một số giống ậu
t° ng sau 30 ngày nuôi cÁy ... 78
3.6<i>. Biểu hiện nhuộm GUS cÿa m u lây nhiễm Agrobacterium ... 82 </i>
3.7. <i>Kết qu¿ chuyển gen Atore1 vào cây Arabidopsis thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 93 </i> 3.8<i>. Kết qu¿ chọn lọc cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 ... 93 </i>
3.9<i>. ặc iểm hình thái và sinh tr°áng á cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T</i><small>1</small> ... 95
3.10<i>. Hình thái lá cÿa cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T</i><small>2</small> ... 97
3.11. Kết qu¿ nuôi cÁy t o vật liệu biến n p gen ... 100
3.12. ¾nh h°áng cÿa mật ộ vi khuẩn ến kh¿ năng biến n p gen ... 105
3.13. ắnh hỏng ca thòi gian ng nuôi cÁy ến kh¿ năng biến n p gen ... 106
3.14. ¾nh h°áng cÿa n ng ộ S ến kh¿ năng biến n p gen ... 107
3.15. ¾nh h°áng cÿa PPT ến kh¿ năng chọn lọc ch i chuyển gen á cây ậu t° ng . 108 3.16<i>. Kết qu¿ chuyển gen tore1 á cây ậu t° ng thông qua vi khuẩn A.tumefaciens . 109 </i> 3.17<i>. Kết qu¿ chọn lọc và tái sinh cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 ... 110 </i>
3.18. Kết qu¿ tái sinh cây ậu t° ng chuyển gen hoàn ch nh ... 111
3.19. Kết qu¿ °a cây ậu t° ng chuyển gen T<small>0</small>ra tr ng ... 112
3.20. Kết qu¿ sàng lọc cây ậu t° ng chuyển gen T<small>0</small>ngoài ng ruộng ... 114
3.21. Kết qu¿ ánh giá s bộ cây ậu t° ng chuyển gen thế hệ T<small>0</small> ... 115
3.22. ánh giá biểu hiện gen á cây ậu t° ng chuyển gen T<small>0</small>b ng P R ... 115
3.23. Kết qu¿ chọn lọc các cây ậu t° ng chuyển gen tore1 thế hệ T<small>1</small>b ng thuốc diệt cỏ Basta ... 116
3.24. Kết qu¿ phân t ch biểu hiện gen b ng P R á T<small>1</small> ... 118
3.25<i>. ặc iểm sinh tr°áng bộ lá cÿa các dòng cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 </i> thế hệ T<small>1</small> ... 119
3.26. Hàm l°ợng diệp lục cÿa các cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T<small>1</small> .... 120
3.27<i>. Kết qu¿ chọn lọc các cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T</i><small>2</small>b ng thuốc diệt cỏ Basta ... 122
3.28<i>. ặc iểm sinh tr°áng bộ lá cÿa các dòng cây chuyển gen Atore1 thế hệ T</i><small>2</small> . 123 3.29<i>. Hàm l°ợng diệp lục cÿa các cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T2 .... 124 </i>
</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">3.30<i>. Kết qu¿ sàng lọc dòng ậu t° ng chuyển gen Atore1 ng hợp tử á thế hệ T</i><small>2</small> .. 127 3.31<i>. Kết qu¿ sàng lọc dòng ậu t° ng chuyển gen Atore1 ng hợp tử á thế hệ T</i><small>3</small> .. 128 3.32<i>. ặc iểm sinh tr°áng bộ lá cÿa các dòng cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 </i>
ng hợp tử T<small>3</small> ... 130 3.33<i>. Hàm l°ợng diệp lục cÿa các cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 ng hợp tử T</i><small>3</small> 130 3.34. Kết qu¿ tách chiết DN tổng số ... 131 3.35<i>. ặc iểm sinh tr°áng cÿa dòng ậu t° ng chuyển gen Atore1 ng hợp tử 133 </i>
3.36. Một số yếu tố cÁu thành năng suÁt cÿa dòng ậu t° ng chuyển gen Atore1 ng hợp tử ... 134 3.37<i>. Hiện tr ng hc-mơn á các dịng ậu t° ng chuyển gen ột biến Atore1 .... 136 </i>
</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17"><i><b>DANH MĀC HÌNH </b></i>
1.1. Một số vật liệu ni cÁy trong ni cÁy mô ậu t° ng ... 10
1.2. Diện t ch cây tr ng NSH toàn c u năm 2019 [10] ... 29
1.3<i>. Kiểu hình cÿa cây chuyển gen kìm h m già hóa lá ore1 và cây ối chāng wild </i> type sau 50 ngày n¿y m m ... 37
1.4. Dòng ậu t° ng chuyển gen GmBS1 tăng k ch th°ớc h t ... 39
2.1. S quy trình tái sinh cây ậu t° ng từ nốt lá m m ... 48
2.2. Vùng T-<i>DN cÿa vector p MBI 3301 mang gen Bar và GUS, i u khiển </i> bái promoter 35S ... 49
2.3<i>. S tổng quát mô t¿ quá trình chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana ... 54 </i>
3.1. Một số hình ¿nh thực hiện các b°ớc tiến hành th nghiệm ... 75
3.2. Nuôi cÁy t o a ch i á một số giống ậu t° ng nghiên cāu ... 75
3.3. ¾nh h°áng cÿa IB 1,0mg/l ến kh¿ năng ra rễ á giống T26 sau 3 tu n nuôi cÁy ... 79
3.4<i>. Biểu hiện gen GUS và tái sinh cây chuyển gen ... 80 </i>
3.5<i>. Hình vẽ mơ phỏng cÁu tr c vector pBS nhân dòng gen Atore1 ... 88 </i>
3.6<i>. Kết qu¿ kiểm tra khuẩn l c mang gen Atore1 b ng P R và enzyme cắt giới h n . 88 </i> 3.7<i>. Kết qu¿ gi¿i trình tự gen tách dịng Atore1 và so sánh với trình từ gen At5g39610 </i> b ng ph n m m BioEdit. Vị tr mũi tên trên hình ch o n ch n thêm cÿa gen <i>Atore1</i> trên v ng m hóa cÿa gen At5g39610 ... 89
3.8<i>. Hình vẽ cÁu tr c vector chuyển gen Atore1 ... 91 </i>
3.9<i>. Kết qu¿ kiểm tra khuẩn l c mang gen Atore1 b ng P R và enzyme cắt giới h n . 91 </i> 3.10. Kết qu¿ iện di s¿n phẩm P R kiểm tra sự có mặt cÿa gen Atore1 á cây Arabidopsis chuyển gen thế hệ T<small>1</small> ... 94
3.11<i>. Hình thái lá cÿa cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T</i><small>1</small> ... 96
3.12<i>. Kết qu¿ iện di s¿n phẩm P R kiểm tra sự có mặt cÿa gen Atore1 á cây Arabidopsis </i> chuyển gen thế hệ T<small>2</small> ... 96
</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">3.13<i>. Biểu so sánh hàm l°ợng diệp lục chlorophyll giữa cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 và cây Arabidopsis </i>ối chāng ol-wt á giai o n thu ho ch ... 98 3.14. H t ậu t° ng n¿y m m và m u biến n p ... 101 3.15. Vi khuẩn mang gen °ợc nuôi tr¿i trên mơi tr°ßng LB sau ó °ợc chuyển sang mơi tr°ßng LB lỏng ể thu tế bào. Tế bào vi khuẩn °ợc hòa tan b ng mơi tr°ßng M lỏng B ể sử dụng cho biến n p gen ... 102 3.16. họn lọc ch i chuyển gen sau 14 ngày trên mơi tr°ßng SIM PPT 10mg/l ... 109 3.17. Một số hình ¿nh m u biến n p gen sau 5 ngày trên mơi tr°ßng ng ni cÁy
CCM ... 110 3.18. Một số hình ¿nh cây ậu t° ng chuyển gen tái sinh trên mơi tr°ßng SEM chāa
kháng sinh 10mg/l PPT ... 111 3.19. Hình ¿nh cây ậu t° ng chuyển gen trên mơi tr°ßng ra rễ RM ... 112 3.20<i>. ây ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T</i><small>0 </small>giai o n c¿m āng trong phòng
ni ... 113 3.21. Hình ¿nh sàng lọc cây ậu t° ng chuyển gen sau 3 ngày b ng thuốc diệt cỏ
Basta ... 114 3.22. Kết qu¿ phân t ch P R cây ậu t° ng chuyển gen tore1 thế hệ T<small>0</small> ... 116 3.23. Kết qu¿ chọn lọc ậu t° ng chuyển gen T<small>1</small> b ng thuốc diệt cỏ Basta ... 117 3.24. Kết qu¿ phân t ch biểu hiện cÿa gen chọn lọc Bar b ng P R cÿa các cây ậu
t° ng chuyển gen T<small>1</small> ... 117 3.25<i>. Kết qu¿ phân t ch biểu hiện gen Atore1 cÿa các cây ậu t° ng chuyển gen T</i><small>1</small> . 118 3.26. Kết qu¿ lai Southern cÿa các dòng ậu t° ng mang gen Atore1 thế hệ T<small>1</small> ... 121 3.27. Biểu hiện kết qu¿ chọn lọc cây ậu t° ng chuyển gen T<small>2 </small>b ng thuốc diệt cỏ
Basta ... 122 3.28. Kết qu¿ phân t ch P R các cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T<small>2</small> ... 125 3.29<i>. Kết qu¿ lai Southern cÿa các dòng ậu t° ng mang gen Atore1 và thế hệ T</i><small>2</small> .... 126 3.30<i>. Hình ¿nh sàng lọc các dòng ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T</i><small>2</small>b ng thuốc
diệt cỏ Basta ... 127 3.31<i>. Kết qu¿ sàng lọc dòng ậu t° ng chuyển gen Atore1 ng hợp tử á thế hệ T</i><small>3</small>
</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">b ng thuốc diệt cỏ Basta ... 129 3.32<i>. Hình thái cây ậu t° ng mang gen Atore1 ng hợp tử giai o n thu ho ch so </i>
với cây ậu t° ng không chuyển gen /c ... 130 3.33. Kết qu¿ phân t ch biểu hiện cÿa gen chọn lọc Bar b ng P R cÿa các cây ậu
t° ng chuyển gen T<small>3</small> ... 131 3.34<i>. Hình thái cây ậu t° ng mang gen Atore1 ng hợp tử giai o n thu ho ch so </i>
với cây ậu t° ng không chuyển gen /c ... 132 3.35. Kết qu¿ lai Southern cÿa các dòng ậu t° ng mang gen Atore1 ng hợp tử .... 132 3.36<i>. Kiểu hình tuổi thọ cÿa lá á các dòng ậu t° ng Atore1 á giai o n thu ho ch R8 141 </i>
3.37<i>. Năng suÁt h t cÿa dòng ậu t° ng biểu hiện Atore1 ột biến ... 142 </i>
</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20"><i><b>Mä ĐÄU </b></i>
<b>1. Tính cÃp thiÁt căa đà tài </b>
<i> ậu t° ng [Glycine max (L.) Merrill] °ợc xếp vào cây tr ng nông nghiệp </i>
quan trọng nhÁt. H t ậu t° ng °ợc xếp trong 8 lo i h t có d u có giá trị kinh tế và nhu c u sử dụng cao, °ợc s¿n xuÁt và giao dịch phổ biến trên thj tr°ßng quốc tế [10], [46]. à Việt Nam, ậu t° ng °ợc xếp vào nhóm cây tr ng quan trọng thā ba sau l a và ngơ. ng thßi Việt Nam có ngu n gen ậu t° ng rÁt phong ph , riêng t i v ng mi n n i ph a Bắc, n i s¿n xuÁt ậu t° ng lớn cÿa c¿ n°ớc chiếm kho¿ng h n 65% diện t ch , hiện có nhi u ngu n gen b¿n ịa quý nh° giống ậu t° ng Sông M , c Hà Bắc, ọc h m ao B ng, Vàng M°ßng Kh° ng, ậu t° ng Hữu Lũng, ậu t° ng h t vàng L ng S n… ác giống này có kh¿ năng chống chịu tốt với i u kiện ngo i c¿nh, nh°ng năng suÁt thÁp [2], [3].
Một thực tế á Việt Nam hiện nay là: trong khi nhu c u sử dụng h t ậu t° ng ngày càng cao thì diện t ch tr ng ậu t° ng cÿa Việt Nam ngày cang gi¿m. Theo báo cÿa Bộ NN&PTNT diện t ch và s¿n l°ợng ậu t° ng cÿa Việt Nam liên tục gi¿m d n qua các năm: năm 2010, diện t ch tr ng ậu t° ng là 197.800 ha, ến năm 2021 ch còn kho¿ng 37.000 ha, diện t ch gi¿m h n 75% và s¿n l°ợng gi¿m trên 70% so với năm 2010. Nguyên nhân cÿa việc gi¿m nhanh v diện tich s¿n xuÁt là do cây ậu t° ng bị sâu bệnh phá ho i nặng, việc áp dụng tiến bộ kỹ thuật chậm h n so v i các cây tr ng khác, vì vậy năng suÁt ậu t° ng rÁt thÁp ch t kho¿ng 1,5 tÁn/ha b ng 50% năng suÁt cÿa thế giới . Thực tr ng ó d n ến việc Việt Nam thiếu hụt 3,5 - 5,0 triệu tÁn ậu t° ng/năm, trá thành n°ớc nhập khẩu ậu t° ng rÁtlớn với kim ng ch 2 - 3 t USD/năm, g n t° ng v i giá trị xuÁt khẩu l a g o cÿa Việt Nam hiện nay. Thực tế trên cho thÁy, ể phát triển s¿n xuÁt ậu t° ng, Việt Nam c n u t° ẩy m nh nghiên cāu t o các giống ậu t° ng có năng suÁt và chÁt l°ợng cao phổ biến cho s¿n xuÁt [2], [3], [46].
Āng dụng công nghệ sinh học trong công tác chọn t o giống cây tr ng nói chung và cây ậu t° ng nói riêng là h°ớng mới và hiệu qu¿ á các quốc gia nơng nghiệp trên thế giới. Trong ó, chọn t o giống b ng công nghệ chuyển gen ể t o
</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">ra s¿n phẩm cây tr ng chuyển gen °ợc āng dụng phổ biến và rộng r i, t o ra các giống cây tr ng có năng suÁt cao, chống chịu tốt với i u kiện biến ổi kh hậu gi p mang l i lợi ch nhi u mặt v kinh tế, mơi tr°ßng, x hội và xóa ói gi¿m ngh o. T nh ến năm 2019, diện t ch cây tr ng chuyển gen lên ến 190,4 triệu ha á 29 quốc gia, s¿n l°ợng tăng 94 l n so với năm 1996 là năm u tiên cây tr ng chuyển gen °ợc th° ng m i hóa trá thành ngành cơng nghệ phát triển nhanh nhÁt trong lịch sử thế giới hiện i. ây ậu t° ng là cây tr ng chuyển gen °ợc tr ng á nhi u quốc gia, ến năm 2021 diện t ch ậu t° ng chuyển gen lên ến g n 100 triệu ha, chiếm 50% tổng diện t ch cây tr ng chuyển gen trên thế giới, chiếm 78% diện t ch canh tác ậu t° ng toàn c u. ác t nh tr ng phổ biến á cây ậu t° ng chuyển gen là: kháng sâu, kháng, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, nâng cao hàm l°ợng d u [10].
Xu h°ớng hiện nay chuyển gen á cây ậu t° ng nói riêng và cây tr ng nói chung ó là tiếp tục c¿i biến di truy n với các t nh tr ng chống chịu và nhÁt là các t nh tr ng nâng cao năng suÁt, chÁt l°ợng cây tr ng. Một trong những h°ớng chọn t o giống cho năng suÁt cao những năm g n ây °ợc nhi u nhà chọn giống quan tâm ó là kéo dài thßi gian sinh tr°áng cÿa bộ lá b ng cách °a gen xác ịnh t nh tr ng <trẻ lâu= juvenile trait vào các giống ch n sớm thông qua lai t o hoặc c¿i biến di truy n b ng chuyển gen/ch nh sửa gen [48], [51].
Năm 1996, tác gi¿ Oh và cs sàng lọc h n 25.000 dòng ột biến cây
<i>Arabidopsis</i>và phát hiện 5 dòng gen ột biến cÿa gen ORE1 l n l°ợt °ợc ặt tên là:
<i>ore </i>1, 2, 3, 9 và 11 có biểu hiện kéo dài tuổi thọ cÿa bộ lá [105]. ác nghiên cāu tiếp
<i>theo cho thÁy: dòng Arabidopsis ột biến ore1 có hàm l°ợng diệp lục cao h n 30% so với ối chāng, kết qu¿ là bộ lá dịng ore1 có tuổi thọ dài h n so với, các cây ối </i>
chāng là 15 - 30 ngày [71], [123]. Năm 2015, tr°ßng i học Dong Hàn Quốc
<i> thành công trong việc chuyển gen Ore1 vào cây l a, kết qu¿ là làm tăng tuổi thọ </i>
cÿa bộ lá nhÁt là bộ lá òng, lá giữ °ợc màu xanh ngay c¿ khi h t ch n, vì thế làm tăng năng suÁt l a 15 - 25%.
</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">Trên c sá những kiến thāc hiểu biết tr°ớc ó, ch ng tôi xác ịnh h°ớng
<i>nghiên cāu chuyển gen ore1 vào cây ậu t° ng và tiến hành thực hiện luận án </i>
<i><b><Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương </b></i>
<i><b>(Glycine max (L.) Merr.)”. Kết qu¿ cÿa tài có ý nghĩa quan trọng, góp ph n </b></i>
phát triển kỹ thuật c¿i biến di truyển t o ra các giống ậu t° ng có năng suÁt cao
<i><b>phục vụ s¿n xuÁt. </b></i>
<i><b>2. Māc tiêu nghiên cąu </b></i>
<i><b>2.1. Mục tiêu tổng quát </b></i>
Nghiên cāu chuyển gen t o các dòng ậu t° ng mang gen kìm hãm già hố
<i>cÿa bộ lá (gen Atore1) theo h°ớng nâng cao năng suÁt h t trên giống ậu t° ng cÿa </i>
Việt Nam.
<i><b>2.2. Mục tiêu cụ thể </b></i>
- ánh giá °ợc kh¿ năng tái sinh và kh¿ năng tiếp nhận gen cÿa các giống ậu t° ng Việt Nam phục công tác chuyển gen.
- <i>Thiết kế thành công vector chuyển gen mang gen ch gen Atore1 có kh¿ </i>
năng nâng cao năng st h t thơng qua việc kéo dài tuổi thọ cÿa bộ lá á cây ậu t° ng.
<i>-</i> T<i> o °ợc các dòng ậu t° ng chuyển gen mang gen ch Atore1 và b°ớc </i>
u ánh giá °ợc biểu hiện cÿa gen á các dòng ậu t° ng chuyển gen.
<b>3. Ý ngh*a khoa hãc và thăc tiÇn căa luÁn án </b>
<i><b>3.1. Ý nghĩa khoa học </b></i>
- Kết qu¿ cÿa luận án là ti n cho việc āng dụng kỹ thuật di truy n hiện i chuyển gen, ch nh sửa gen nh m t o ra các giống ậu t° ng có năng suÁt cao h n, có kh¿ năng chống chịu tốt h n.
- Kết qu¿ nghiên cāu cÿa luận án là c sá khoa học và thực tiễn cho việc hoàn thiện kỹ thuật tái sinh các giống ậu t° ng cho chuyển gen, thiết kế vector chuyển gen, chuyển gen, sàng lọc ánh giá cây chuyển gen; xây dựng c sá ph° ng pháp luận ánh giá chọn lọc dòng chuyển gen ng hợp tử có kiểu gen ổn ịnh ể chọn lọc giống ậu t° ng chuyển gen á Việt Nam.
</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">- Kết qu¿ nghiên cāu cÿa luận án có giá trị làm t° liệu, tài liệu cho gi¿ng d y, nghiên cāu sâu h n v chuyển gen á cây ậu t° ng nói riêng và á cây tr ng nói chung.
<i><b>3.2. Ý nghĩa thực tiễn </b></i>
T o °ợc các dòng ậu t° ng chuyển gen thế hệ T<small>0</small>, T<small>1</small>, T<small>2</small>, t o °ợc một số
<i>dòng chuyển gen Atore1 ng hợp tử thế hệ T</i><small>3</small> có tuổi thọ cÿa bộ lá kéo dài h n và cho năng suÁt cao h n giống ối chāng không chuyển gen.
<b>4. ỏi tÔng v phm vi nghiờn cu </b>
<i><b>4.1. Đối tượng nghiên cứu </b></i>
<i>Cây mơ hình Arabidopsis thaliana. </i>
30 giống ậu t° ng cÿa Việt Nam (bao g m các giống tr ng canh tác và các giống ịa ph° ng), 02 giống ậu t° ng mơ hình là Kwangan KW và William82.
<i><b>4.2. Phạm vi, thời gian nghiên cứu </b></i>
ác th nghiệm °ợc tiến hành trong i u kiện phòng th nghiệm, nhà k nh nhà l°ới t i Khoa ông nghệ sinh học và ông nghệ thực phẩm, tr°ßng i học Nơng lâm, i học Thái Nguyên trong thßi gian từ năm 2019 - 2022.
<b>5. Nhāng đóng góp mái căa ln án </b>
- Luận án là cơng trình u tiên nghiên cāu v chuyển gen nâng cao năng suÁt á cây ậu t° ng thông qua việc kéo dài tuổi thọ cÿa bộ lá á Việt Nam. Luận án nghiên cāu có t nh hệ thống v ặc iểm tái sinh phục vụ chuyển gen, thiết kế vector, t o các dòng ậu t° ng chuyển gen và ánh giá biểu hiện cÿa gen.
- Kết qu¿ nghiên cāu cÿa luận án là c sá khoa học ể xây dựng c sá dữ liệu và ph° ng pháp luận v ngu n vật liệu phục vụ cho chuyển gen á cây ậu
<i>t° ng. Trong ó, tối °u hóa °ợc các iểu kiện tái sinh in vitro và lựa chọn °ợc </i>
các giống ậu t° ng th ch hợp cho tái sinh là: T22, VX93, VN11, VN9, VN6, VN5, VN10, T26.
<i>- Nhân dịng thành cơng gen Atore1</i>, thiết kế thành công cÁu tr c vector
<i>chuyển gen pER8-Atore1 mang gen kìm h m già hóa bộ lá Atore1, thử nghiệm trên cây mơ hình Arabidosis </i>co thế vector và gen ho t ộng tốt, sẵn sàng cho việc
</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">chuyển gen vào cây ậu t° ng. Kết qu¿ thiết kế vector là c sá lý luận ể thiết kế hệ thống vector chuyển gen cho ối t°ợng thực vật nh m nâng cao việc āng dụng kỹ thuật di truy n hiện t i và t° ng l i.
- Thành công trong việc t o °ợc cây ậu t° ng chuyển gen thế hệ T<small>0</small>, T<sub>1</sub>, T<sub>2</sub> và T<small>3</small>, sử dụng chÁt ch thị, phân t ch P R, phân t ch biểu hiện hình thái, phân t ch Southern ể sàng lọc cây chuyển gen qua các thế hệ. NhÁt là thành công trong việc chọn lọc °ợc 02 dòng chuyển gen ng hợp tử thế hệ T<small>3</small>, ổn ịnh v kiểu gen, có tuổi thọ cÿa bộ lá dài h n từ 17 - 22 ngày so với ối chāng, và có năng suÁt cao h n ối chāng không chuyển trên trên 18%. Việc thành công trong chọn lọc °ợc dòng ng hợp tử á thế hệ thā 3 T<small>3</small> là c sá khoa học có t nh thuyết phục cao trong việc h° ng ến chọn thành giống ậu t° ng chuyển gen.
</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25"><i><b>CH£¡NG I </b></i>
<i><b>TàNG QUAN TÀI LIÈU VÀ C¡ Sä KHOA HâC CĂA ĐÂ TÀI </b></i>
<b>1.1. Tỡnh hỡnh sn xut u tÔÂng trờn th giỏi và ViÉt Nam </b>
<i><b>1.1.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới </b></i>
Do có kh¿ năng th ch āng rộng nên cây ậu t° ng °ợc tr ng khắp các châu lục, nh°ng tập trung nhi u nhÁt á hâu Mỹ và chiếm tỷ lệ tới 87,4 %, tiếp ến là hâu Á với 8,5 % tổng diện t ch ậu t° ng trên thế giới từ năm 2012 - 2021 [46]. Trong những năm g n ây, diện t ch tr ng, s¿n l°ợng và năng suÁt ậu t° ng u có những biến ộng nhÁt ịnh. ụ thể, giai o n 2012 - 2021 diện t ch ậu t° ng tăng u từ 105,35 triệu ha ến 129,06 triệu ha. S¿n l°ợng cũng tăng u từ 241,18 triệu tÁn ến 364,06 triệu tÁn kéo theo sự tăng năng suÁt từ 22,89 t /ha ến 28,21 t /ha. Năm 2020 và 2021, năng suÁt và diện t ch ậu t° ng tiếp tục tăng nhẹ, t s¿n l° ng cao nhÁt năm 2021 là 364,06 triệu tÁn [46]. Số liệu °ợc thu thập và trình bày
</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">S¿n xuÁt ậu t° ng tập trung á các quốc gia có °u thế v s¿n xuÁt nông nghiệp, 12 quốc gia āng u trên thế giới có s¿n l°ợng hàng năm trên 1 triệu tÁn. āng u là Brazil trên 121 triệu tÁn năm 2021 , tiếp ó là Mỹ và rgentina và Trung Quốc. Trong số 12 quốc gia āng u thế thế giới v s¿n xuÁt ậu t° ng có 4 quốc gia là Brazil, Mỹ, Trung Quốc, Paraguay và Nga có s¿n l°ợng ổn ịnh và liên tục tăng trong 5 năm trá l i ây B¿ng 1.2 [46].
<b>BÁng 1.2. Tình hình sÁn xuÃt u tÔÂng ca mòt sỏ nÔỏc ng u trờn th giỏi trong nhng nm gn õy (sn lÔng trờn 1 triÉu tÃn) </b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27"><b>1.1.2. Tình hình sÁn xut u tÔÂng ồ Viẫt Nam </b>
T i Vit Nam, ậu t° ng là cây tr ng quan trọng thā ba sau cây l a và ngô. Vậy nh°ng diện t ch gieo tr ng ngày càng gi¿m, không áp āng °ợc nhu c u cÿa ngành công nghiệp thực phẩm, thāc ăn chăn nuôi, thāc ăn thÿy s¿n và công nghệ ép d u do giống b¿n ịa năng suÁt thÁp, giống nhập ngo i năng suÁt cao nh°ng l i khơng có những ặc t nh nổi trội cÿa giống b¿n ịa, giá bán l i không cao so với các cây cơng nghiệp khác. Nhìn chung, diện t ch ậu t° ng Việt Nam không ổn ịnh, s¿n xuÁt nội ịa mới ch ÿ cung cÁp cho kho¿ng 8 - 10% nhu c u. T nh ến năm 2021, diện t ch tr ng trên c¿ n°ớc gi¿m m nh ch còn 37,3 nghìn ha, gi¿m h n 3 l n
Qua B¿ng 1.3 cho thÁy, diện t ch và s¿n l°ợng ậu t° ng cÿa n°ớc ta có chi u h°ớng gi¿m d n, ặc biệt trong 05 năm g n ây. Năm 2012, diện t ch t 119,6 nghìn ha, s¿n l°ợng t 173,5 nghìn tÁn, ến năm 2021 diện t ch ch t 37,3 nghìn ha và s¿n l°ợng gi¿m cịn 60,2 nghìn tÁn. Tuy nhiên, từ b¿ng số liệu thống kê cũng cho thÁy năng suÁt hàng năm cÿa cây ậu t° ng t° ng ối ổn ịnh và có chi u
</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">h°ớng tăng nhẹ từ 14,5 t /ha năm 2012 lên 15,7 t /ha năm 2020) và 16,1 t /ha năm 2021 song so với thế giới Việt Nam v n là n°ớc có năng suÁt thÁp ch b ng 65% năng suÁt trung bình cÿa thế giới [2].
<i><b>Bng 1.4. Tỡnh hỡnh nhp khu u tÔÂng ca Viẫt (2020 - 2022) </b></i>
<b>Sn lÔng nghỡn tn </b> 3.545,2 4.988.6 4.751,1
<i>Nguồn: B Công thương </i>
Dựa trên số liệu B¿ng 1.4 cho thÁy, nhu c u tiêu thụ ậu t° ng t i Việt Nam t° ng ối cao, trong khi ó s¿n xuÁt trong n°ớc mới áp āng °ợc một ph n nhỏ nhu c u nội ịa chÿ yếu ể chế biến sữa ậu nành và một số lo i thực phẩm khác, có ến 90% là nhập khẩu ể phục vụ s¿n xuÁt d u ăn và chế biến thāc ăn chăn nuôi. Năm 2014, c¿ n°ớc nhập h n 1,5 triệu tÁn ậu t° ng, ến năm 2022 n°ớc ta v n ph¿i nhập h n 4,9 triệu tÁn với chi ph h n 2,7 tỷ USD ể phục vụ cho công nghiệp chế biến, s¿n xuÁt d u ăn và thāc ăn chăn ni. h nh vì vậy việc tăng năng suÁt và s¿n l°ợng ậu t° ng là rÁt c n thiết. Tuy nhiên, thực tế s¿n xuÁt ậu t° ng á n°ớc ta còn gặp nhi u khó khăn, bên c nh tình hình giá phân bón, thuốc trừ sâu tăng cao và sâu bệnh di<i>ễn biến phāc t p còn thiếu ngu n giống tốt cho s¿n xuÁt [3]. </i>
<b>1.2. Táng quan và nghiên cąu chuyn gen ồ cõy u tÔÂng trờn th giỏi </b>
<i><b>1.2.1. Nghiên cứu về tái sinh in vitro ở cây đậu tương </b></i>
<i>1.2.1.1. Vật liệu sử dụng trong t i sinh in vitro á cây đậu tương </i>
<i> ác kết qu¿ nghiên cāu tái sinh cây ậu t° ng in vitro cho thÁy, vật liệu </i>
°ợc sử dụng khá a d ng và phong ph bao g m trụ d°ới lá m m - hypocotyl [80], lá m m - cotyledon, nốt lá m m cotyledon node [80]
<i>có thể sử dụng các m u nuôi cÁy khác nhau cho tái sinh in vitro cây ậu t° ng. Hiện </i>
</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">nay, tái sinh ậu t° ng cho chuyển gen, các nhà nghiên cāu chÿ yếu sử dụng m u nửa lá m m, trụ d°ới hoặc trụ tên cÿa lá m m.
<b>Hình 1.1. Mßt sá vÁt liẫu nuụi cy trong nuụi cy mụ u tÔÂng </b>
<i><b>A Trụ trên lá m m á m m Trụ dưới lá m m hồi ngọn Nốt lá m m [56] </b></i>
<i>1.2.1.2. Phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây đậu tương </i>
Phát sinh phôi soma là một kỹ thuật quan trọng trong nuôi cÁy mô thực vật. ¯u iểm ch nh cÿa ph° ng pháp này là sự phát triển cÿa phôi soma bắt ch°ớc phôi hợp tử và nếu °ợc bao bọc, sẽ giống nh° h t giống h t nhân t o . Tuy nhiên, một
<i>số lồi có các tế bào ti n phôi °ợc xác ịnh, nên dễ phát triển phôi in vitro, một số lồi v n ch°a có ph° ng pháp hình thành phơi soma in vitro. Các nghiên cāu cho </i>
thÁy ậu t° ng ph¿n āng thuận lợi ối với việc t o phôi soma thông qua m u cÁy lá m m và có thể °ợc khai thác một cách th ch hợp cho q trình t o phơi. à các giống ậu t° ng khác nhau, sự hình thành phơi soma có khác nhau v u c u mơi tr°ßng với từng kiểu gen. Chao Yang và cs cho r ng các kiểu gen ậu t° ng khác nhau yêu c u n ng ộ °ßng sucrose khác nhau mơi tr°ßng MS biến ổi với vitamin B5 ể phát triển phôi soma hiệu qu¿ [31]. T° ng tự, các giống ậu t° ng
<i>tr ng á các ịa iểm khác nhau ph¿n āng khác nhau ối với in vitro ể phát triển </i>
</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">phôi soma thông qua nuôi cÁy m m h t. Do ó, sự phát triển cÿa phôi soma thay ổi theo các kiểu gen khác nhau và các dòng khác nhau ph¿i °ợc sàng lọc ể phát triển phôi soma hiệu qu¿. Mặc d q trình t o phơi soma cung cÁp một số āng dụng, nh°ng khó khăn trong việc sử dụng phôi soma là tỷ lệ thành công không cao. Thơng th°ßng, ch có một số phơi soma phát triển thành cây con hoàn ch nh. Nguyên nhân là do t° ng tác giữa kiểu gen và mơi tr°ßng ni cÁy trong q trình phát triển phơi. Tác gi¿ Birch
Phơi soma có kh¿ năng phát sinh c¿ ch i, rễ và hình thành cây hồn ch nh khi tái sinh. Mặc d quá trình phát sinh phôi vô t nh °ợc báo cáo á một số phòng th nghiệm nh°ng h u hết các quy trình này khi tiến hành các thử nghiệm chuyển gen ban u không thành công [31, [34]
<i>cho chuyển gen [48]. Việc phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây ậu t° ng </i>
cũng °ợc āng dụng trong b¿o t n, lữu giữ và āng dụng các kỹ thuật di truy n á cây ậu t° ng.
</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31"><i>1.2.1.3. Ph t sinh cơ quan thông qua mô sẹo trong t i sinh in vitro cây đậu tương </i>
Phát sinh c quan ch i/rễ... từ m u cÁy thông qua giai o n mô sẹo callus Trong ph° ng pháp này, m u cÁy u tiên °ợc k ch th ch ể t o ra callus, sau ó °ợc ịnh h°ớng ể t o thành c quan biệt hóa ch i, rễ... và °ợc phát triển thành cây con hoàn ch nh.
Lợi ch cÿa ph° ng pháp này bao g m việc nhân nhanh giống cây tr ng và phát triển các giống mới b ng các biến dị dòng soma. ác biến dị này là do i u
<i>kiện nuôi cÁy in vitro cung cÁp cho các tế bào ch°a biệt hóa, t o ra các biến dị di </i>
truy n trong các mô tái sinh. Giống °ợc phát triển nh° vậy cũng dễ dàng °ợc chÁp nhận vì nó khơng liên quan ến thao tác gen ngo i lai. ối với cây ậu t° ng, một số nghiên cāu °ợc thực hiện ể s¿n xuÁt cây con qua trung gian mơ sẹo. Nhóm tác gi¿ Liu và cs nghiên cāu hiệu qu¿ cÿa h t từ phôi trên cây tái sinh từ mô sẹo và t o phơi trên mơi tr°ßng MS có chāa B P, N và cho r ng bên c nh việc āng dụng chÁt i u tiết sinh tr°áng ngo i sinh, hàm l°ợng I và polyamine nội sinh trong m u ậu t° ng rÁt quan trọng trong việc xác ịnh hiệu qu¿ cÿa c¿m
<i>āng mô sẹo và sự phát triển trong in vitro [82]. Bên c nh m u cÁy non, lá m m và </i>
phôi tr°áng thành cũng °ợc sử dụng ể tái sinh mô sẹo á ậu t° ng [81]. Nuôi cÁy lá ậu t° ng cũng °ợc d ng ể phát triển các giống ậu t° ng chịu mặn thông qua nuôi cÁy mô sẹo trung gian. Wada và cs t o ra các giống ậu t° ng chịu mặn trên mơi tr°ßng °ợc bổ sung tới 0,1% Na l, họ cũng ch ra r ng stress do muối có thể °ợc gi¿m bớt b ng cách bổ sung a l<small>2</small> trong mơi tr°ßng ni cÁy [79]. Nghiên cāu thử nghiệm này có thể hữu ch trong việc t o ra các giống ậu t° ng chịu mặn và có thể °ợc thử nghiệm thêm trên ng ruộng v năng suÁt trong i u kiện tự nhiên. Lá °ợc coi là m u cÁy th ch hợp vì có thể cung cÁp các tế bào ng nhÁt ể phân hóa và nhân giống. Wright và cs thiết lập quy trình t o cây ậu t° ng hồn ch nh có thể °ợc phát triển từ các o n lá nhỏ cÿa cây mẹ, trong ó sử dụng tu n tự mơi tr°ßng MS và mơi tr°ßng B5 có bổ sung các chÁt i u hòa sinh tr°áng thực vật khác nhau [130].
</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32"><i>1.2.1.4. Ph t sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu ni cây (khơng qua việc hình th nh mô sẹo) </i>
Phát sinh c quan trực tiếp là sự phát sinh c quan ch i/rễ từ m u cÁy không qua mô sẹo. ác ốt thân °ợc sử dụng phổ biến nhÁt ể t o m u cÁy ch i khơng có mô sẹo và phát triển thành các cây con là dịng vơ t nh cÿa cây mẹ [81]. Trong ph° ng pháp này, các ch i nách °ợc k ch th ch hình thành từ các o n có ốt thân và °ợc nhân lên thành các b¿n sao giống hệt nhau v mặt di truy n cÿa cây mẹ. Tác gi¿ Hitoshi và cs nhân giống hàng lo t cây ậu t° ng b ng cách sử dụng các o n ốt thân. Họ sử dụng dung dịch natri hypochlorite ể khử tr ng b mặt m u và mơi tr°ßng MS, B P và IB ể k ch th ch sự hình thành nhi u ch i. Tuy nhiên, các m u cÁy c n °ợc thu thập từ các cây mẹ khỏe m nh và cÁy m u ngay sau khi xử lý vào mơi tr°ßng nuôi cÁy, việc phát sinh c quan trực tiếp không qua mô sẹo phụ thuộc rÁt nhi u vào kiểu gen t y từng giống mà mơi tr°ßng ni cÁy [126].
Việc hình thành các bộ phận c quan trực tiếp không qua mô sẹo, quan trọng nhÁt là quá trình phát hình thành và phát triển ch i. h i hình thành từ một khối mô khác nhau °ợc tách ra ể t o rễ và hình thành cây mới. ể biến n p, gen ngo i lai c n °ợc chuyển vào mơ phân sinh ch i hoặc các khối mơ có kh¿ năng tái sinh ch i. Phát sinh hình thái ch i á ậu t° ng, l n u tiên °ợc Wright và cs báo cáo năm 1986, sử dụng nốt lá m m cÿa cây m m làm m u cÁy; Barwale và cs 1986 sử dụng nốt lá m m cÿa h t non. Khi nuôi cÁy trên mơi tr°ßng có chāa B P ch i °ợc hình thành từ lớp mơ biểu bì d°ới subepidermal tissue . ¯u iểm ch nh cÿa ph° ng pháp này là ch i °ợc nhân lên và có thể hình thành rễ d°ới 3 tháng. Trong khi ó, ph° ng pháp phơi vơ t nh ph¿i mÁt 4 tháng hoặc h n nữa. Trụ d°ới hypocotyl và trụ trên epicotyl lá m m cÿa cây ậu t° ng cũng °ợc sử dụng ể tái sinh trực tiếp thành cây hồn ch nh [47], [125], t o phơi vơ t nh [81] và t o cây chuyển gen [61], [100].
</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33"><i>1.2.1.5. Ành hưáng của mơi trưßng ni cấy v điều kiện ni cấy đến khÁ năng t i sinh đậu tương </i>
Môi tr°ßng ni cÁy có ¿nh h°áng quan trọng ến kh¿ năng tái sinh ậu t° ng, tuy nhiên, māc ph¿n āng với i u kiện mơi tr°ßng cịn t y thuộc kiểu gen và ngu n vật liệu. Do ó, c n nghiên cāu i u kiện mơi tr°ßng ni cÁy cho ậu t° ng ph hợp với từng giống và từng giai o n.
<i><b>Bng 1.5. Mòt sỏ mụi trÔóng tỏi sinh cõy u tÔÂng in vitro </b></i>
<b>1. Nuụi cy h¿t/phơi </b>
Mơi tr°ßng MS <sup>Shan và cs (2005); Vural (2010); Phat và cs </sup>
Trong nuôi cÁy mô ậu t° ng, pH mơi tr°ßng th°ßng sử dụng là 5,8, mơi tr°ßng th ch hợp cho giai o n gieo h t là mơi tr°ßng MS bổ sung B . ác tác gi¿ nghiên cāu ¿nh h°áng cÿa n ng ộ B khác nhau ến kh¿ năng n¿y m m và
</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">kết luận n ng ộ B = 1mg/l cho kết qu¿ tốt nhÁt. H t °ợc gieo trong i u kiện 16h sáng 8h tối d°ới ánh sáng huỳnh quang, nhiệt ộ 24<small>0</small> trong 7 ngày. Islam và cs nghiên cāu ¿nh h°áng cÿa B và 2,4D ến kh¿ năng t o mô sẹo á ch i ngọn và nốt lá m m ậu t° ng. Th nghiệm cho thÁy mơi tr°ßng MS bổ sung 2,5mg/l BAP + 0,5mg/l 2,4D cho tỷ lệ phát sinh callus cao nhÁt 76,60% . Kết qu¿ cũng cho thÁy tỷ lệ phát sinh callus cÿa ch i ngọn cao h n có y nghĩa so với nốt lá m m [56], [61]. Begum và cs nghiên cāu ¿nh h°áng cÿa 2,4D, N , B ến kh¿ năng t o mơ sẹo. Mơi tr°ßng th ch hợp nhÁt là MS 3,32mg/L 2,4D và MS + 1,5mg/L B P Tỷ lệ 100% . Mơi tr°ßng phát sinh ch i sử dụng B và N cho kết qu¿ tốt nhÁt MS + 2,5mg/l BAP + 1,0mg/l NAA (tỷ lệ 79,4%, ch i cao 5,32cm [29]. Theo Hu CY và cs mơi tr°ßng MS 1mg/l B th ch hợp nhÁt cho tái sinh ch i. Hu CYvà cs cũng ch ra r ng ch i ch phát sinh trong mơi tr°ßng có n ng ộ B từ 5 - 10µM/l Kho¿ng 1 - 2mg/l , á n ng ộ cao h n 10µM/l 35 ch i khơng hình thành [59]. i u này ph hợp với những nghiên cāu cÿa Sairam và cs [127]. Sau khi callus phát sinh ch i, ch i °ợc chuyển sang mơi tr°ßng kéo dài ch i SEM), mơi tr°ßng ph hợp là mơi tr°ßng MS bổ sung 0,1mg/l IAA, 0,5 mg/l GA<small>3</small>, 1mg/l ZR trong 14 ngày [85].
<i><b>1.2.2. Kết quả nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương trên thế giới </b></i>
<i>1.2.2.1. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium </i>
<i> ây là ph° ng pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium nh° một vector sinh học </i>
ể biến n p một ph n DN cÿa ch ng vào hệ gen thực vật, kết qu¿ là t o °ợc cây
<i>biến ổi gen. Agrobacterium xâm nhiễm vào cây tr ng thông qua vết th° ng. Khi bị </i>
tổn th° ng, mô thực vật sẽ tiết ra hợp chÁt phenol, hợp chÁt này sẽ d n dụ vi khuẩn
<i>Agrobecteriumbiểu hiện gen v ng vir. Kết qu¿ biểu hiện cÿa gen Vir, sợi n </i>
DN sẽ °ợc chuyển và tổng hợp trong hệ gen thực vật. VÁn ch nh cÿa ph° ng pháp chuyển gen này là sự kết hợp giữ tế bào chÿ với vector t° ng āng [57], [139].
Mặc d ban u ậu t° ng không ph¿i là ối t°ợng °ợc xem xét ể lây nhiễm với vi khuẩn cho tới khi Pederson và cs chāng minh ậu t° ng là vật chÿ th ch hợp với lo i vi khuẩn này [38], [115]. Tuy nhiên, hiệu qu¿ chuyển gen v n bị kiểm soát bái yếu tố v giống [41], [96], [110], [113]. Mặt khác, kh¿ năng thu °ợc
</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">các ch i chuyển gen từ những khối mơ có kh¿ năng tái sinh nh° phơi vô t nh và nốt lá m m ban u rÁt thÁp. ể nâng cao hiệu qu¿ chuyển gen ngày càng có nhi u nghiên cāu nh m tối °u quy trình nh°: bổ sung hợp chÁt có vai trò x c tác nh°
<i>acetosyringone ể k ch th ch sự biểu hiện cÿa gen Vir, L-cystein, hoặc sử dụng các </i>
chÿng vi khuẩn có kh¿ năng gây ộc tính cao [109], xác ịnh các yếu tố ¿nh h°áng ến hiệu qu¿ chuyển gen thông qua nốt lá m m, nghiên cāu c¿i tiến nốt lá m m làm vật liệu biến n p, kết hợp lây nhiễm với tái sinh [110]. VÁn khác khi sử dụng vi
<i>khuẩn Agrobacterium còn phụ thuộc vào chÿng khuẩn, số l°ợng b¿n DN copy </i>
°ợc tổng hợp trong hệ gen thực vật, pH mơi tr°ßng, māc ộ gây tổn th° ng cÿa m u. Trái ng°ợc với các ph° ng pháp chuyển DN tr°ợc tiếp có thể cho kết qu¿ với số b¿n copy nhi u h n, có thể là các m¿nh hoặc các o n °ợc kết hợp trong một khuân m u khơng °ợc kiểm sốt [110], [114].
Những cây ậu t° ng chuyển gen u tiên °ợc t o ra b ng ph° ng pháp nốt
<i>lá m m sử dụng vi khuẩn Agrobacterium làm trung gian °ợc báo cáo vào năm </i>
1988 [55]. Nốt lá m m cÿa giống Peking °ợc lây nhiễm với chÿng vi khuẩn
<i>Agrobacteriummang gen ch thị gus, gen kháng kanamycin và glyphosate. M u </i>
°ợc nuôi cÁy trên mơi tr°ßng có chāa B P ể c¿m āng t o ch i, kanamycin cùng với các kháng sinh khác có tác dụng lo i bỏ l°ợng vi khuẩn còn l i sau khi ng nuôi cÁy. Sau một vài tháng, cây con °ợc tái sinh và °ợc kiểm tra thông qua sự
<i>biểu hiện cÿa gen gus hoặc kh¿ năng kháng glyphosate. h 6% tổng số ch i lựa </i>
chọn °ợc chuyển gen. Tám cây °ợc tái sinh và phân t ch, kết qu¿ cho thÁy ch ng có một sợi DN ch n vào. Mặc d sự biến n p cho hiệu qu¿ không cao nh°ng báo cáo ch ra r ng có thể tái sinh các tế bào chuyển gen cÿa một giống ậu t° ng khi
<i>°ợc lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium th ch hợp. </i>
Nhóm tác gi¿ Townsend và Thomas sử dụng quy trình t° ng tự thu °ợc cây chuyển gen từ giống Pioneer 9341. ác yếu tố quan trọng gi p họ thành cơng ó là 1 sử dụng chÁt acetosyringone; 2 giới h n nhiệt ộ giai o n ng ni cÁy °ợc kiểm sốt trong kho¿ng 18 - 28<small>0</small>
C; 3 mật ộ tế bào vi khuẩn lây
</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">nhiễm từ 10<small>8</small> ến 3x10<small>9</small>
/ml; 4 sử dụng axit pyroglutamic ể bổ sung vào trong mơi tr°ßng tái sinh [130].
V<i>i khuẩn Agrobacterium và nốt lá m m cũng °ợc sử dụng ể chuyển gen </i>
tổng hợp protein vỏ cÿa virus Bean Pod Mottle một lo i vius rây bệnh ốm vỏ trên h t ậu vào ậu t° ng. Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển n p gen thÁp, ch có 5 cây chuyển gen s khái cÿa 5 lá m m khác nhau °ợc t o ra từ 400 lá m m ban u. Phân t ch Southern cho thÁy sự t ch hợp gen BPMV P-P vào bộ gen và thể hiện qua các cây R1. Kho¿ng 30% cây R2 có ngu n gốc từ 1 dòng chuyển gen ban u °ợc xét nghiệm ELIS Enzym-linked Immuno Sorbent ssay cho thÁy kh¿ năng kháng hồn tồn với virus này. T nh tr ng hình thái không bị biến ổi so với thế hệ R1. [91], [130].
Parrott và cs °a ra ph° ng pháp chuyển gen khác ó là sử dụng vi khuẩn
<i>Agrobacterium</i>lây nhiễm với m u mô lá m m h t non ể t o phôi vô t nh sau ó tái
<i>sinh thành cây hồn ch nh. Ba cây chuyển gen có chāa gen zein k ch th°ớc 15kD </i>
°ợc hình thành. Tuy nhiên, những cây chuyển gen này u bị kh¿m và khi phân
<i>t ch các cây á thế hệ sau khơng thÁy có một cây nào có chāa gen zein 15kD [113]. </i>
G n ây, một ph° ng pháp mới và có kh¿ năng cho hiệu qu¿ h n °ợc
<i>phát triển ể biến n p vi khuẩn Agrobacterium mang gen vào thẳng tế bào mô ch. Kỹ thuật mới này gọi là S T Sonicate Assisted Agrobacterium - media </i>
transformation) [131]. Sử dụng S T với nuôi cÁy huy n ph phát sinh phôi vô t nh cho hiệu qu¿ chuyển gen ổn ịnh và khơng có hiện t° ng thể kh¿m. Ph° ng pháp này có °u iểm là thßi gian nuôi cÁy cộng sinh mô thực vật với
<i>Agrobacterium</i>°ợc r t ngắn. Với kỹ thuật hiển vi iện tử quét, nhóm tác gi¿ khám phá ra S T, t o ra những r nh và khe nhỏ giống nhau, xuyên qua mô, cho phép
<i>Agrobacterium</i> dễ dàng i vào mô ch mong muốn không giống nh° ph° ng pháp chuyển n p gen khác. Sử dụng kỹ thuật S T ể chuyển gen vào nh sinh tr°áng làm gia tăng hiệu qu¿ chuyển n p gen t m thßi trong nhi u c quan nh°: lá, nốt
<i>lá m m, phôi hữu t nh, phôi vô t nh, rễ, thân, ch i, h t qua sự thể hiện GUS tăng </i>
gÁp 100 - 400 l n trên cây Ohio buckeye, ậu ũa cowpea , cây vân sam trắng
</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">white spruce , l a mì, ngơ và ậu t° ng, ng thßi gen chuyển n p t° ng ối ổn ịnh qua các thế hệ. Meurer và cs áp dụng ph° ng pháp nêu trên á 28 giống ậu t° ng, nhóm tác gi¿ cho r ng, ể thực hiện thành cơng ph° ng pháp S T thì c n kh¿o sát các yếu tố nh°: chÿng vi khuẩn, xác ịnh tế bào chÿ và kh¿ năng tiếp nhận gen cÿa mô mong muốn. Với ph° ng ph° ng pháp S T, chọn những cụm phơi có 10 - <i>20 phơi °ßng k nh 2 - 4 mm °ợc lây nhiễm với 1 ml dịch khuẩn A. tumefaciens</i> có n ng ộ OD<small>600 </small>= 0,1 - 0,5 trong thßi gian 0 - 300 giây. Sau 2 ngày trên mơi tr°ßng lây nhiễm có 0,1mM cetosyringone m u °ợc chuyển lên môi tr°ßng chāa 400 mg timentin/l. Hai tu n sau khi S T, chuyển mô sang mơi tr°ßng có 20 mg hygromycin/l và 400 mg timentin/l. Những dòng chuyển gen °ợc quan sát và phân lập kho¿ng 6 - 8 tu n sau khi S T. Kỹ thuật này cho hiệu qu¿ chuyển gen cao h n so với các ph° ng pháp chuyển gen khác. Má ra một h°ớng
<i>mới sử dụng vi khuẩn Agrobacterium ể biến n p gen cho các mô ch khác nhau </i>
[97], [131].
<i>1.2.2.2. Nghiên cứu chuyển gen bằng súng bắn gen </i>
Kỹ thuật bắn gen dựa trên gia tốc cÿa các h t bọc DN v ph a tế bào thực vật. Nhß có gia tốc lớn mà các h t DN có thể âm xuyên qua thành tế bào và màng tế bào. Bên trong tế bào, DN °ợc phân tách từ các h t nhỏ và tổng hợp á trong hệ gen thực vật. ¯u iểm cÿa s ng bắn gen là có thể lo i bỏ các tác nhân sinh học không th ch hợp, ặc biệt là với những lo i m u không th ch hợp với chuyển
<i>gen b ng vi khuẩn Agrobacterium. Ph° ng pháp này cho phép chuyển trực tiếp gen </i>
quan tâm vào mô phân sinh nh cÿa thực vật. Tuy nhiên, ph° ng pháp này yêu c u ph¿i có dụng cụ, máy móc chuyên dụng có thể phân chia ch nh xác các h t DN sâu trong mô phân sinh ch [97]. Báo cáo u tiên v chuyển gen b ng s ng bắn gen vào ậu t° ng sử dụng ch i phân sinh nh làm mô ch °ợc McCabe và cs tiến hành năm 1988. h i nh sau khi biến n p °ợc c¿m āng t o a ch i tr°ớc khi tái sinh thành cây hồn ch nh. Phân t ch khối mơ chuyển gen nhận thÁy có các h t nhỏ mang DN và có sự tái tổ hợp DN trong tế bào chÿ [87], [97]. Kh¿ năng tổng
</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">hợp DN trong tế bào °ợc xem nh° biểu hiện cÿa quá trình chuyển gen có hiệu qu¿ [62].
<i>1.2.2.3. Nghiên cứu chuyển gen bằng xung điện </i>
Sử dụng xung iện cho hiệu qu¿ biến n p khá cao ối với tế bào ộng vật. Fromm M. và cs l n u tiên cho r ng có thể c¿i tiến ph° ng pháp này ể biến n p gen vào thực vật, nhóm tác gi¿ sử dụng kỹ thuật xung iện ể chuyển gen vào tế bào tr n cÿa cây ngô và họ thu °ợc cây ngô chuyển gen b n vững b ng ph° ng pháp này. ng với các th nghiệm thu °ợc trên cây thuốc lá cÿa nhi u tác gi¿ khác, ph° ng pháp này °ợc sử dụng ể chuyển gen cho cây ậu t° ng [118], [52].
Tế bào tr n ậu t° ng °ợc xung iện ¿m b¿o mật ộ 2 - 4 x 10<small>6</small> tế bào trên/ml mơi tr°ßng Kao bổ sung 40mM Na l. Một ml dung dịch huy n ph tế bào tr n °ợc h t cho vào cuvet 1,5ml và làm l nh trong thßi gian ngắn trên á. Dịng iện xung phát ra từ các sợi b ch kim có kho¿ng cách 1cm. Dòng iện này °ợc cung cÁp bái một tụ iện 490µF Sprague Power-lytic 36D, Marsh Electronics, Milwaukee, WI và là ngu n cung cÁp iện áp ổn ịnh. iện thế °ợc i u ch nh b ng một vôn kế [54].
Chowrira và cs sử dụng ph° ng pháp xung iện ể biến n p gen vào iểm sinh tr°áng cÿa cây m m ậu t° ng. ây m m 7 - 10 ngày °ợc lo i bỏ lá m m, ADN °ợc tiêm vào nh ch i b ng hệ thống ống tiêm có chāa dung dịch lipofectin. DN °ợc chuyển vào b ng một dịng iện xung, cây sinh tr°áng mà khơng c n tác nhân chọn lọc. Quá trình này °ợc thực hiện trên nhi u mô phân sinh và thu °ợc một vài thể kh¿m. ây là ph° ng pháp tốt nh°ng việc āng dụng còn nhi u h n chế [35].
<i>1.2.2.4. Nghiên cứu chuyển gen qua ống phấn </i>
H u hết các ph° ng pháp chuyển gen hiện t i u dựa trên c sá nuôi cÁy mơ tế bào, nó ịi hỏi các tế bào chuyển gen ph¿i °ợc tái sinh thành cây [26]. Phát triển một hệ thống chuyển gen ộc lập với nuôi cÁy mô tế bào giành °ợc nhi u sự quan tâm cÿa các nhà khoa học. ách tiếp cận này cho phép v°ợt qua rào c¿n v kiểu gen cÿa cây biến n p vốn ¿nh h°áng rÁt nhi u ến hiệu qu¿ chuyển gen. Mặt
</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">khác chi ph tài ch nh và thßi gian chọn t o sẽ °ợc r t ngắn. Ph° ng pháp chuyển gen qua ống phÁn l n u tiên °ợc báo cáo thành công trên cÁy bơng [35]. Kỹ thuật này sau ó °ợc sử dụng ể chuyển gen á một số cây tr ng nh°: ngô [33], bông [102], lúa [39], [87], ậu t° ng [138], [140], [141], d°a hÁu [32]. Một số báo cáo ch ra r ng có thể chuyển gen vào ậu t° ng thông qua ống phÁn, Meurer và cs sử dụng ph° ng pháp này ể t o ra cây ậu t° ng và cây bông chuyển gen, nhóm tác gi¿ thu °ợc 50 h t ậu t° ng, 226 h t bông. Nh°ng tÁt c¿ u cho kết qu¿ âm t nh khi sử lý thuốc diệt cỏ [99].
Zenglu Li và cs thu °ợc xÁp x 5.000 h t ậu t° ng sau khi xử lý hoa
<i>với DN mang gen bar. Khi kiểm tra tÁt c¿ các h t thu °ợc từ cây xử lý với DN có chāa gen bar u khơng cho kết qu¿ d° ng t nh với gen này. Quan sát hình thái </i>
cÿa một vài cây thÁy có sự khác nhau, nh°ng h t cÿa ch ng không có kh¿ năng n¿y
<i>m m. Th nghiệm khác với gen gus, nhóm tác gi¿ thu °ợc g n 2% số h t cÿa các cây °ợc xử lý với DN có chāa gen gus ph¿n āng d° ng t nh với gen này khi </i>
kiểm tra. Tuy nhiên, khi cho h t n¿y m m và tiến hành lÁy lá phân t ch thì khơng
<i>thÁy có sự ho t ộng cÿa gen gus. 3% h t thu từ các cây thế hệ sau °ợc kiểm tra u khơng thÁy có biểu hiện cÿa gus [140]. Huixia Shou và cs tiến hành chuyển gen </i>
vào 8 giống ậu t° ng, trong ó có giống mơ hình Williams 82 b ng kỹ thuật chuyển gen qua ống phÁn, tuy nhiên kết qu¿ không thành công nh° mong muốn[59].. Nhi u báo cáo tr°ớc ây khi sử dụng ph° ng pháp chuyển gen này cũng u ch ra một số h n chế cÿa ph° ng pháp này [142], [79], [102].
<i><b>1.2.3. ác tính trạng được cải thiện thơng qua chuyển gen ở cây đậu tương </b></i>
Hiện nay, ể áp āng n n nơng nghiệp hiện i thì kỹ thuật di truy n là h°ớng nghiên cāu ch nh °ợc áp dụng trên nhi u cây tr ng quan trọng nh° ngô, l a, bông, ậu t° ng và thu °ợc những kết qu¿ rÁt kh¿ quan. ác gen quy ịnh các ặc t nh quan trọng °ợc °a vào cây tr ng và h u hết các dòng chuyển gen này °ợc tr ng kh¿o nghiệm ngoài ng ruộng, nhi u giống °ợc th° ng m i hóa. ối với cây ậu t° ng, một số ặc t nh sau °ợc c¿i thiện nh° kháng thuốc diệt cỏ, kháng côn tr ng, chịu h n, ch n sớm, c¿i thiện chÁt l°ợng h t hay giun tròn h i rễ.
</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40"><i>1.2.3.1. Đặc tính kh ng thuốc diệt cỏ </i>
B ng cơng nghệ sinh học ng°ßi ta có thể t o ra những giống cây tr ng kháng thuốc diệt cỏ, cho phép lo i trừ °ợc cỏ d i một cách chọn lọc. Nhìn chung, s¿n xuÁt cây tr ng kháng thuốc diệt cỏ °ợc tiến hành b ng việc chuyển gen m hóa enzyme gây bÁt ho t thuốc diệt cỏ vào cây tr ng.
Theo tác gi¿ Lawton có kho¿ng 1.000 giống ậu t° ng kháng thuốc diệt cỏ glyphosate ang °ợc bán bái h n 200 công ty trên thế giới. Monsanto, công ty giữ b¿n quy n v giống ậu t° ng chuyển gen kháng cỏ <Round up= thống kê cho thÁy năm 1996 có kho¿ng 0,4 triệu hecta tr ng ậu t° ng kháng thuốc diệt cỏ, năm 1997 tăng lên 3,6 triệu hecta và năm 1998 t 11,3 triệu hecta [75].
Gen m hóa enzyme tổng hợp 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic (EPSPS), gen m hóa enzyme phosphinothricin acetyl transerase P T °ợc chuyển vào cây ậu t° ng và t o ra các dòng ậu t° ng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glyphosate/glufosinate.
ác giống ậu t° ng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glufosinate, Roundup và imidazoline °ợc th° ng m i hóa. Năm 2004, hàng lo t các giống ậu t° ng chuyển gen kháng các lo i thuốc diệt cỏ khác nhau °ợc tr ng chÿ yếu á Mỹ và ch ng °ợc nhập khẩu vào cộng ng chung Châu Âu, mặc d v n t n t i khá nhi u tranh c i. Trong thập kỷ qua 1995-2006 , ối với cây chuyển gen, ặc t nh kháng thuốc diệt cỏ liên tục là t nh tr ng nổi bật chiếm 71% , tiếp sau là ặc t nh kháng sâu bệnh chiếm 18% và các cây mang c¿ hai ặc t nh này chiếm 11% [10].
<i>1.2.3.2. Đặc tính kh ng cơn trùng </i>
Việc sử dụng giống kháng bị h n chế vì khơng có giống kháng cao ể hồn tồn phịng trừ sâu h i ậu t° ng, á Mỹ một vài kỹ thuật canh tác °ợc áp dụng nh° là gieo tr ng sớm hay tr ng các giống ngắn ngày ể né tránh các nh bộc phát cÿa sâu Velvetbean; tr ng g n bên các ruộng cây tr ng khác °ợc sâu o °a th ch h n ậu t° ng cũng h n chế māc gây h i cÿa sâu o ến ruộng ậu t° ng á một số v ng tr ng ậu t° ng cÿa n°ớc Mỹ [10], [45]. Thuốc trừ sâu th°ßng °ợc d ng khi mật ộ sâu lên ến māc ng° ng gây h i. Tổng chi ph °ớc t nh cho thuốc trừ sâu sử
</div>