(Luận Văn Thạc Sĩ Vật Lí) Xây Dựng Quy Trình Phân Tích Độc Tố Tetrodotoxins Trong Ốc Biển Ở Việt Nam Bằng Lc- Ms Ms

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.38 MB, 73 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<i>trình nghiên cứu của tơi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tơi tự tìm hiểu và nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tơi hồn chịu trách nhiệm trước pháp luật. </i>

<b>Võ Thß Đoan Trang </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

đ°āc sā quan tâm và giúp đÿ quý báu cÿa các thầy cơ, b¿n bè và đßng nghiáp. Đầu tiên, tơi xin bày tá lịng biÁt ¢n chân thành và sâu sÁc đÁn PGS.TS. Đào Viát Hà đã t¿n tình h°ớng dÁn và t¿o mßi điÃu kián tãt nhất giúp tơi hồn thành lu¿n văn.

Tơi xin trân trßng cÁm ¢n Ban lãnh đ¿o Hßc vián Khoa hßc và Cơng nghá - Vián Hàn lâm Khoa hßc và Cơng nghá Viát Nam, Ban lãnh đ¿o Vián Nghiên cāu và Āng dụng công nghá Nha Trang, Ban lãnh đ¿o Viỏn Hi dÂng hòc Nha Trang ó to mòi điÃu kián thu¿n lāi giúp tơi hồn thành các hßc phần cÿa lu¿n văn và các thÿ tục cần thiÁt.

Tơi xin chân thành cÁm ¢n sā giúp đÿ và t¿o điÃu kián vÃ mßi mặt cÿa quý anh chá Phịng thí nghiám vÃ An tồn thāc ph¿m và mơi tròng (Khu vc min Trung)- Viỏn Hi dÂng hòc Nha Trang; cÿa q thầy cơ, anh chá hßc viên cao hßc các lớp CHE21A đang cơng tác và hßc t¿p t¿i Vián Nghiên cāu và Āng dụng công nghá Nha Trang.

Tơi cũng xin cÁm ¢n Sá Giáo dục và Đào t¿o Khánh Hịa, Ban lãnh đ¿o tr°ßng THPT Lý Tā Trßng, các anh chá em đßng nghiáp đã ln t¿o điÃu kián trong công viác, đáng viên và trā giúp tơi để tơi dành thßi gian chun tâm hßc t¿p và hồn thành lu¿n văn.

Ci cùng, tơi xin bày tá lịng biÁt ¢n sâu sÁc đÁn gia đình, ng°ßi thân và b¿n bè đã quan tâm, đáng viên và giúp đÿ tơi trong st q trình hßc t¿p và hoàn thành lu¿n văn.

<b> Võ Thß Đoan Trang </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

1.1.5.Tetrodotoxins trong ãc biển ... 15

1.2.MàT Sâ PH¯¡NG PHÁP PHÂN TÍCH TETRODOTOXINS. ... 16

1.2.1.Ph°¢ng pháp th nghiỏm sinh hòc ... 16

1.2.1.1.PhÂng phỏp sinh húa chuỏt ... 16

1.2.1.2.PhÂng phỏp th nghiỏm cm ng sinh hòc ... 18

1.2.1.3.Thā nghiám trên mơ tÁ bào ... 18

1.2.1.4.Ph°¢ng pháp thā nghiám hấp thụ mißn dách liên kÁt với enzyme ... 19

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

1.3.3.3.ChÁ đá khÁo sát ion cô l¿p và khÁo sát đa ion cơ l¿p ... 29

<b>Ch°¢ng 2. õI TỵNG V PHĂNG PHP NGHIấN CU ... 30</b>

2.1. ĐâI T¯ĀNG NGHIÊN CĀU ... 30

2.1.1. Đãi t°āng nghiên cāu... 30

2.1.2. Ngun liáu, thiÁt bá ... 30

2.1.2.1. Dung mơi, hóa chất ... 30

2.1.2.2. ThiÁt bá, dụng cụ phân tích ... 30

2.2. PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĀU ... 31

2.2.1. Thu mÁu và bÁo qn mÁu ... 31

2.2.2.Xây dāng quy trình phân tích... 31

2.2.2.1. KhÁo sát điÃu kián khãi phá xác đánh TTX ... 31

2.2.2.2. KhÁo sát điÃu kián sÁc ký láng hiáu năng cao ... 32

2.2.2.3. KhÁo sát quy trình xā lý mÁu ... 32

2.2.3. Đánh giá quy trình phân tích TTXs ... 33

2.2.3.1. KhÁo sát khoÁng tuyÁn tính và xây dāng đ°ßng chu¿n ... 33

2.2.3.2. Xác đánh giới h¿n phát hián và giới h¿n đánh l°āng ... 34

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

2.2.3.3. Đá chụm và đá đúng cÿa ph°¢ng pháp ... 34

<b>ChÂng 3. KắT QU V THO LUN ... 36</b>

3.1. KHÀO SÁT ĐIÂU KIàN PHÂN TÍCH TTXs TRÊN THIÀT Bà MS/MS ... 36

LC-3.1.1. KhÁo sát các điÃu kián cÿa detector khãi phá ... 36

3.1.2. KhÁo sát các điÃu kián cÿa há pha đáng ... 37

3.1.2.1. KhÁo sát ch°¢ng trình gradient pha đáng ... 38

3.1.2.2. KhÁo sát tãc đá dòng ... 40

3.2. KHÀO SÁT QUY TRÌNH XĀ LÝ MÀU ... 43

3.2.1. KhÁo sát nßng đá dung mơi tách chiÁt ... 45

3.2.2. KhÁo sát thể tích dung mơi rāa giÁi ... 47

3.3. ĐÁNH GIÁ PH¯¡NG PHÁP PHÂN TÍCH ... 53

3.3.1.KhÁo sát khng tun tính và l¿p đ°ßng chu¿n ... 53

3.3.2. Giới gi¿n phát hián và giới h¿n đánh l°āng ... 55

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

AOAC Association of official analytical chemists Hiáp hái các nhà hóa phân tích chính thāc. EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid <sup>Axit ethylene diamine </sup>

tetraacetic

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay Xét nghiám hấp thụ mißn dách liên kÁt với enzyme ESI Electro spray ionization Kỹ thu¿t ion hóa bằng

phun đián tā

GC-MS Gas chromatography-Mass spectrometry SÁc ký khí ghép khãi phá

HPLC High performance liquid chromatography SÁc ký láng hiáu năng cao LC-MS <sup>Liquid chromatography- Mass </sup>

spectrometry SÁc ký láng ghép khãi phá LC-

MS/MS

Liquid chromatography tandem mass

spectrometry SÁc ký láng khãi phá kép

chuát

MRM Multiple reaction monitoring Kỹ thu¿t khÁo sát đa ion cô l¿p

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

PSP Paralytic shellfish poisons Đác tã gây tê liát á đáng v¿t có vá

<b>SPR </b> Surface plasmon resonance <sup>C</sup>Ám biÁn cáng h°áng plasmon bÃ mặt

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

Hình 1. 1. Cấu trúc hóa hßc TTX ... 12Hình 1. 2. Mát sã dÁn xuất cÿa TTX ... 14Hình 1. 3. Tetrodotoxin ngăn kênh v¿n chuyển natri ... 15Hình 1. 4. <i>MÁu ãc Nassarius papillosus và Nassarius glans gây ngá đác t¿i </i>

V¿n Ninh, Khánh Hòa ngày 11/9/2020 ... 16Hình 1. 5. Phá hßng ngo¿i cÿa TTX ... 21Hình 1. 6. SÁc ký đß HPLC-FLD cÿa TTXs chu¿n và ... 23Hình 1. 7. Ph<i>á khãi phân giÁi LC-MS/MS cÿa 3 loài (A) Oliva annulata, (B) Oliva lignaria, (C) Oliva hirasei và (D) TTX ... 24</i>

Hình 1.8. SÁc ký đß LC-MS, mÁu chu¿n TTXs (A) và các mÁu thā

<i>F.niphobles (B), T.nigrovirids (C), T.biocellatus (D) ... 25</i>

Hình 2. 1. ThiÁt bá LC-MS/MS t¿i phịng thí nghiám vÃ An tồn thāc ph¿m và mơi tr°ßng (Khu vāc miÃn Trung) ... 30Hình 2. 2<i>. MÁu ãc (a) Nassarius glans, (b) Nassarius papillosus ... 31</i>

Hình 3. 1. SÁc ký đß LCMS/MS cÿa TTXs chu¿n với các thÁ phân mÁnh 25V, -27V, -29V... 36 Hình 3. 2. SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n với các thÁ phân mÁnh -38V, - 40V, -42V... 37Hình 3. 3. ò thỏ chÂng trỡnh gradient 1 ... 39Hỡnh 3. 4.Sc ký ò LC-MS/MS ca TTXs chun theo chÂng trỡnh gradient 1 ... 39Hỡnh 3. 5. ò thỏ chÂng trình gradient 2 ... 40Hình 3. 6. SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n theo ch°¢ng trình gradient 2 ... 40Hình 3. 7. SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n với tãc đá dòng 0,4 ml/phút ... 41

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

-Hình 3. 8. SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n với tãc đá dịng 0,6

Hình 3. 13. Đß thá sā phụ thc dián tích peak vào nßng đá TTX ... 54

Hình 3. 14. Đß thá sā phụ thc dián tích peak vào nßng đá 4-epiTTX ... 54

Hình 3. 15. Đß thá sā phụ thc dián tích peak vào nßng đá 4,9-anhydroTTX . ... 55

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

BÁng 2. 1. Sã l°āng và khãi l°āng trung bình cÿa 2 lồi ãc bùn thu á vùng

biển Khánh Hòa ... 31

BÁng 2. 2. Nßng đá dãy các dung dách chu¿n ... 34

BÁng 3. 1. Thơng sã điÃu kián tãi °u phân tích TTXs bằng LC-MS/MS ... 43

BÁng 3. 2. KÁt quÁ Ánh h°áng cÿa nßng đá acid acetic đÁn hiáu suất thu hßi TTX ... 45

BÁng 3. 3. KÁt quÁ Ánh h°áng cÿa nßng đá acid acetic đÁn hiáu suất thu hßi epiTTX ... 46

4-BÁng 3. 4. KÁt quÁ Ánh h°áng cÿa nßng đá acid acetic đÁn hiáu suất thu hßi 4,9-anhydroTTX ... 46

BÁng 3. 5. KÁt quÁ Ánh h°áng thể tích rāa giÁi đÁn hiáu suất thu hßi TTX ... 48

BÁng 3. 6. KÁt quÁ Ánh h°áng thể tích rāa giÁi đÁn hiáu suất thu hßi 4-epiTTX ... 49

BÁng 3. 7. KÁt quÁ Ánh h°áng thể tích rāa giÁi đÁn hiáu suất thu hßi anhydroTTX ... 49

4,9-BÁng 3. 8. Sā phụ thuác dián tích peak vào nßng đá TTXs ... 53

BÁng 3. 9. KÁt quÁ khÁo sát khng tun tính và đ°ßng chu¿n cÿa TTXs ... 55

BÁng 3. 10. Đá lặp l¿i cÿa ph°¢ng pháp ... 57

Bng 3. 11. Hiỏu sut thu hòi ca phÂng pháp ... 57

<i>BÁng 3. 12. KÁt quÁ phân tích 15 mÁu ãc loài N. glans ... 59</i>

<i>BÁng 3. 13. KÁt q phân tích 20 mÁu ãc lồi N. papillosus ... 60</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<i>Phụ lục 1. SÁc ký đß LC-MS/MS phân tích các mÁu ãc N. glans ... 69Phụ lục 2. SÁc ký đß LC-MS/MS phân tích các mÁu ãc N. papillosus 70</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

Đác tã sinh hßc biển ngày càng đ°āc quan tâm trên tồn thÁ giới, mát trong sã đó là Tetrodotoxins (TTXs). Tetrodotoxin là mát chất đác thần kinh m¿nh gây ra nhiÃu tr°ßng hāp ngá đác dÁn đÁn tā vong ỏ ngòi nhiu nÂi trờn th gii. Viỏc phát hián nhiÃu loài thÿy hÁi sÁn chāa đác tã TTXs chẳng h¿n nh° cá nóc, b¿ch tuác đãm xanh, so biển, mát sã loài cua biển, ãc biển...đã thu hút sā quan tâm cÿa giới khoa hßc và các nhà quÁn lý vÃ an tồn thāc ph¿m biển. Do đó, ngồi các nghiên cāu vÃ phân bã, thành phần, hàm l°āng, đác tính...cÿa đác tã này á sinh v¿t, các nhà nghiên cāu còn t¿p trung phát triển các ph°¢ng pháp phân tích xác đánh đác tã này, đặc biát l cỏc phÂng phỏp th nghiỏm sinh hòc v phân tích hóa hßc.

à Viát Nam, tÿ 2007 đÁn nay, mßi năm đÃu ghi nh¿n các vụ ngá đác TTXs trong ãc biển xÁy ra chÿ yÁu á các cùng ven biển Thanh Hóa, Ninh Thu¿n, Khánh Hịa...Mặc dù đ°āc rất nhiÃu sā quan tâm nghiên cāu vÃ đác tã TTXs với các ph°¢ng pháp, kỹ thu¿t phân tích khác nhau, nh°ng đÁn nay á Viát Nam ch°a có nhiÃu cơng bã vÃ vÃ phân tích đác tã này á ãc biển bằng kỹ thu¿t sÁc ký láng khãi phá kép LC-MS/MS. Đây là kỹ thu¿t hián đ¿i với đá nh¿y, đá đặc hiáu và đá chính xác rất cao giúp phát hián chính xác đác tã TTX và các đßng phân cÿa nó, đáp āng đ°āc tiêu chu¿n vÃ sã liáu đác tã TTXs trong sinh v¿t biển so với thÁ giới. Vì v¿y, viác thāc hián đÃ tài <Xây

<b>dăng quy trình phân tích đßc tã tetrodotoxins trong ãc biển ã Viát Nam bằng LC-MS/MS= là cần thiÁt, có ý nghĩa khoa hßc và thāc tißn. </b>

<b>Māc đích nghiên cāu </b>

Đ°a ra đ°āc quy trình xác đánh đác tã tetrodotoxins á ãc biển có đá tin c¿y và chính xác cao, phù hāp với điÃu kián trang thiÁt bá t¿i Viát Nam.

<b>Nßi dung nghiên cāu </b>

- KhÁo sát nßng đá acid acetic dùng tách chiÁt đác tã TTXs tÿ 1-2 loài ãc biển tā nhiên;

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

- KhÁo sát mát sã điÃu kián tách chiÁt và tinh s¿ch đác tã TTXs tÿ ãc biển;

- KhÁo sát mát sã điÃu kián phân tích đác tã TTXs tÿ mÁu chiÁt bằng ph°¢ng pháp sÁc ký láng khãi phá kép (LC-MS/MS).

- Xây dāng quy trình thāc nghiám phân tích đác tã trong ãc biển TTXs bằng ph°¢ng pháp LC-MS/MS.

- Đánh giá kÁt quÁ cÿa quy trình thāc nghiám trên c¢ sá so sánh, đãi chiu vi só liỏu kim chng.

Dāa trên nhÿng tiÁn bá khoa hßc- kỹ thu¿t và cơng nghá, trong lu¿n án này tôi đÃ xuất nghiên cāu xây dāng quy trình thāc nghiám phân tích TTXs bằng LC-MS/MS, phù hāp với điÃu kián trang thiÁt bá t¿i phịng thí nghiám An tồn thāc ph¿m và mơi tr°ßng (Khu vāc min Trung), Viỏn Hi dÂng hòc m bo đá chính xác và tin c¿y ph°¢ng pháp phân tích. Đãi t°āng nghiên cāu là mát sã loài ãc biển th°ßng gây ngá đác t¿i vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa. KÁt quÁ cÿa đÃ tài là dÁn liáu khoa hßc tin c¿y phục vụ cơng tác qn lý an tồn thāc ph¿m biển và là tiÃn đÃ cần thiÁt để có sã liáu phân tích chính xác phục vụ cho nhÿng cơng trình cơng bã qc tÁ vÃ đác tã TTXs trong sinh v¿t biển t¿i Viát Nam.

<b>Nhāng đóng góp cÿa luÃn văn </b>

- ĐÃ xuất đ°āc ph°¢ng pháp tách chiÁt, tinh s¿ch đác tã TTXs trong mÁu ãc để phân tích bằng LC-MS/MS.

- Xây dāng đ°āc quy trình phân tích đác tã TTXs trong mÁu ãc biển bằng (LC-MS/MS) có đá chính xác cao.

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<i><b>Ch°¢ng 1. TàNG QUAN NGHIÊN CĀU </b></i>

<b>1.1. ĐÞC Tâ TETRODOTOXIN 1.1.1. Đặc tính, c¿u trúc hóa hßc </b>

Tetrodotoxin là mát trong nhÿng chất đác phi protein m¿nh nhất cũng nh° chất đác tā nhiên biển đ°āc biÁt đÁn nhiÃu nhất. Năm 1909, TiÁn sĩ Yoshizumi Tahara đ°a ra xác nh¿n rằng cá nóc chāa mát lo¿i chất đác và đặt tên là Tetrodotoxin theo tên cÿa hß cá nóc mà nó đ°āc phân l¿p lần đầu tiên- Tetraodontidae [1]. Cấu trúc cÿa chất đác này đã đ°āc xác đánh bái Tsuda và cáng sā [2], Goto và cáng sā [3]. TTX là dÁn xuất aminoperhydroquinaoline, hāp chất dá vịng có cơng thāc phân tā C<small>11</small>H<small>17</small>O<small>8</small>N<small>3</small> và có cấu trúc hóa hßc đ°āc mơ tÁ nh° hình 1.1.

<b>Hình 1. 1. </b>Cấu trúc hóa hßc TTX[3]

TTX là tetrahydroxy-6-(hydroxymethyl)-2,3,4,41,5,6,7,8-octahydro-1H-8a,10-

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

VÃ đặc tính, TTX là mát lo¿i bát khơng màu. TTX trá nên sÁm màu á khoÁng 220<small>o</small>C nh°ng không nóng chÁy [4], có cấu trúc l°ÿng cāc [5] tan trong n°ớc, bÃn nhiát. Sā có mặt nhóm guanidine perhydroquinazoline (guanidin có tính baz¢ m¿nh) trong phân tā làm cho TTX dß tan trong dung dách axit. Ngồi ra do TTX cấu trúc ester nên dß bá thÿy phân trong dung dách có tính axit m¿nh hoặc kiÃm m¿nh. Mơi tr°ßng để đÁm bÁo cấu trúc TTX án đánh trong dung dách là trong axit hÿu c¢ yÁu [6].

Phân tā TTX có 6 nhóm OH á vá trí C<small>4</small>, C<small>6</small>, C<small>8</small>, C<small>9</small>, C<small>10</small>, C<small>11</small> á mßi vá trí gÁn thêm nhóm guaidin có tính kiÃm m¿nh Cấu trúc TTX thay đái liên quan đÁn mát hay nhiÃu nhóm OH, chúng có ái lāc với màng tÁ bào não, á đó có chāa nhiÃu kênh v¿n chuyển ion Na<small>+</small>. Nghiên cāu cho thấy kênh v¿n chuyển ion Na<small>+</small> bá đóng khi dùng TTX với nßng đá 1,8 nM [7].

<b>1.1.2. Mßt sã dÁn ch¿t cÿa Tetrodotoxin </b>

Trong tā nhiên, TTX cùng tßn t¿i với các dÁn xuất cÿa nó. Cho đÁn nay đã có 30 cấu trúc cÿa TTX đã đ°āc báo cáo và đác tính thay đái tùy theo cấu trúc [8]. Các dÁn xuất deoxy cÿa TTX thì ít đác h¢n TTX nh°ng các dÁn xuất hydroxyl đác h¢n TTX. NhiÃu nghiên cāu đã phát hián các dÁn chất cÿa TTX nh° 4-epiTTX; 4,9-anhydroTTX; 5,6,11-trideoxyTTX [8] trong trāng loài cá

<i>nócFugu poecilonotus và Fugu pardalis [9]; 6-epiTTX trong cá nóc Spheroids Spengler [10] và các loài khác nh° loài sa giông Cynops ensicauda </i>

[11], <i>ãc Nassarius glans, b¿ch tuác đãm xanh Hapalochlaena [12]…Mát sã </i>

cấu trúc cÿa các dÁn xuất TTXs đ°āc mơ tÁ trong hình 1.2.

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

<b>Hình 1. 2. Mát sã dÁn xuất cÿa TTX [8] 1.1.3. Đßc tính Tetrodotoxin </b>

Đác tính cÿa TTX th°ßng đ°āc biÁt đÁn đác h¢n mát nghìn lần so (1200 lần) với Cyanua và hián ch°a có thuãc giÁi đác đặc hiáu [9]. Trong các thā nghiám sinh hßc trên cht, liÃu gây chÁt trung bình LD<small>50</small>đ°āc phát hián là 10 µg/kg khi ăn phÁi chất đác và tÿ 1 đÁn 2 mg TTX là đÿ để gây chÁt cho mát ng°ßi tr°áng thành [13], [14].

Theo nghiên cāu cÿa Kao [15], liÃu gây chÁt tãi thiểu cÿa TTX trên mát sã loài đáng v¿t qua òng tiờm di da nh [10]: ch: 5 àg/kg; g mỏi: 6

<b>àg/kg; chuỏt nht: 8 àg/kg; bò cõu 2,7 µg/kg; thá: 8 µg/kg; mèo: 10 µg/kg. 1.1.4. C¢ ch¿ hot òng </b>

CÂ ch gõy ỏc ca TTX trong cÂ thể là āc chÁ kênh trao đái ion natri v¿n đáng qua màng tÁ bào thần kinh với LD<small>50</small> 9µg/kg (tiêm phúc m¿c). TTX ho¿t đáng bằng cách chặn các kênh natri, làm mất sā lan truyÃn tín hiáu thần kinh đÁn màng tÁ bào quan trßng cÿa tÁ bào c¢ tim, c¢ x°¢ng, há thần kinh trung °¢ng và ngo¿i biên [16]dÁn đÁn các triáu chāng điển hình và th¿m chí nặng nhất là tā vong [17], [13].

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

<b>Hình 1. 3. Tetrodotoxin ngăn kênh v¿n chuyển natri [13] </b>

Cấp đá cÿa triáu chāng ngá đác TTXs đ°āc Tani và cáng sā đ°a ra năm 2009 [18]. Cấp đá 1 bao gßm các dấu hiáu tê liát bao gßm tê mơi và đầu l°ÿi và các vấn đÃ tiêu hóa nh° nơn māa. Cấp đá 2 là tê liát lan đÁn tā chi, đau đầu. Cấp đá 3 làm tăng các triáu chāng thần kinh c¢ (nh° chāng khó nt, chāng mất ngơn ngÿ, hơn mê, mất phãi hāp, mất điÃu hịa, cÁm giỏc bòng bnh, liỏt dõy thn kinh sò, cÂ co gi¿t) và đi kèm các triáu chāng tim m¿ch (h¿ huyÁt áp hoặc tăng huyÁt áp, rãi lo¿n nháp tim, nháp tim nhanh và bất th°ßng, tím tái, xanh xao, khó thá). Trong nhÿng tr°ßng hāp nghiêm trßng dÁn đÁn cấp đá 4, n¿n nhân tê liát hoàn toàn, suy tim và dÁn đÁn tā vong.

<b>1.1.5. Tetrodotoxins trong ãc biển </b>

Các vùng biển trên thÁ giới có rất nhiÃu thÿy sÁn chāa đác tã TTXs sinh sãng, đặc biát á các vùng biển nhiát đới. Trong đó, đác tã TTXs trong mát sã loài ãc biển đã đ°āc ghi nh¿n bái nhiÃu nhóm nghiên cāu nh° Noguchi và cáng sā [19], Hwang và cáng sā [20], Taniyama và cáng sā [18], Đặng Quãc Minh và cáng sā [21]. Đác tã TTX đ°āc tìm thấy trong

<i>nhiÃu loài ãc nh° ãc mặt trăng (Turban), ãc đụn (The top of shells), ãc h°¢ng Nh¿t BÁn (Babylonia japonica), ãc bùn (Niotha, Zeuxis)...Tÿ năm 1985 đÁn </i>

2004, t¿i Trung Qc đã có ít nhất 28 vụ ngá đác. Ngồi ra, mát sã tr°ßng hāp đ°āc ghi nh¿n do ngá đác TTXs khi ăn ãc biển t¿i Đài Loan, Nh¿t BÁn, Brunei [22], [23], [19], [20]. Đác tính TTXs tính theo đ¢n vá chuát (MU)

<i>trong loài Nassarius glans </i>theo ghi nh¿n cÿa Tani tÿ 725 đÁn 9860 MU/cá thể [15]. T¿i Viát Nam, tÿ năm 2006 đÁn 2020, tình hình ngá đác ãc biển do TTXs xÁy ra rÁi rác á các đáa ph°¢ng ven biển nh° QuÁng Ngãi, Bình Thu¿n,

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

Khánh Hịa... gây ra mát sã tr°ßng hāp tā vong. Theo khÁo sát, đa sã các loài

<i>ãc này thuác hß Nasariidae cụ thể là ãc bùn răng c°a có tên khoa hßc Nassarius papillosus và ãc bùn bóng, có tên khoa hßc Nassarius glans [16], </i>

[21]. Theo ng<i>hiên cāu Đặng Quãc Minh và cáng sā, các loài N. Pullus, N. conoidalis conoidalis và N. glans </i>đ°āc xác đánh chāa hàm l°āng cao đác tã TTXs, trung bình tÿ 368-2625 MU/cá thể, đác tính v°āt ng°ÿng cho phép [16].

<b>Hình 1. 4. </b><i>MÁu ãc Nassarius papillosus và Nassarius glans </i>

gây ngá đác t¿i V¿n Ninh, Khánh Hịa ngày 11/9/2020

<b>1.2. MÞT Sâ PH¯¡NG PHÁP PHÂN TÍCH TETRODOTOXINS. </b>

Quy trình xác đánh đác tã TTXs trong sinh v¿t biển nói chung cũng nh° trong ãc biển nói riêng đã đ°āc nghiên cāu ráng rãi bái cỏc nh khoa hòc. Cú mỏt só phÂng pháp khác nhau đã đ°āc phát triển nh°ng nhìn chung t¿p trung vào 2 nhóm ph°¢ng pháp chính.

<b>1.2.1. PhÂng phỏp th nghiỏm sinh hòc </b>

Xột nghiỏm sinh hóa chuát MBA (Mouse bioassay) là ph°¢ng pháp chính để phát hián đác tã trong đáng v¿t có vá đ°āc áp dụng nhiÃu n°ớc trên thÁ giới. Trong các xét nghiám sinh hßc trên chuát, chất chiÁt tÿ mÁu đ°āc đ°a vào c¢ thể đáng v¿t thí nghiám và sau đó thßi gian chÁt đ°āc theo dõi.

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

Để biÁt nßng đá TTX trong mÁu nghiên cāu, thā nghiám sinh hßc trên chuát đ°āc thāc hián bằng cách tiêm phúc m¿c. Sau khi tiêm chất chiÁt TTX, chuát thā nghiám bÁt đầu xuất hián các dấu hiáu và triáu chāng đặc tr°ng nh° cào x°ớc vai, miáng bằng chân sau, yÁu dần đÁn liát á chân sau, cā đáng không phãi hāp, thá nông, co gi¿t, nhÁy, tiÁp theo là suy hơ hấp và ci cùng bi chÁt. Đác tính cÿa chất chiÁt chāa TTX đ°āc biểu thá bằng đ¢n vá chuát MU. Quy đánh đ¢n vá chuát (MU) là l°āng đác tã TTX tãi thiểu gây chÁt chuát có trßng l°āng 18 - 20 g trong vịng 30 phút.

Hashimoto và Noguchi [9] đã xác đánh chính xác hàm l°āng đác tã TTX á cÿa cá bãng t°āng sā dụng đ°ßng cong này quan há giÿa liÃu l°āng và thßi gian chÁt cÿa chuát. Mát lo¿t các dung dách thā nghiám đ°āc chu¿n bá bằng cách pha loãng dách chiÁt đác tã ch°a biÁt với acid acetic 0,1%. Mát l°āng nhá các dung dách này đ°āc tiêm vào màng bụng mát nhóm cht. Đ°ßng cong thßi gian chÁt đ°āc v¿ dāa vào giá trá trung bình cÿa thßi gian cht chÁt á mßi nßng đá pha loãng.

<i>Để xác đánh đác tã trong đáng v¿t chân bụng biển (Nassarius glans) </i>

trong vụ ngá đác ãc biển gây tā vong trên đÁo TungSa á Đài Loan vào tháng 4 năm 2004, Hwang và cáng sā [24] đã thu th¿p 20 mÁu ãc gây ngá đác để làm mÁu phân tích. Các mơ mÃm tách ra đ°āc làm nhuyßn với acid axetic 1% trong methanol trong vòng 5 phút và ly tâm. Dách chiÁt đ°āc làm khô á 45<small>o</small>C sā dụng há thãng cơ quay chân khơng và đ°āc kiểm tra đác tính TTX trên dòng chuát nhÁt trÁng ICR kháe m¿nh, khãi l°āng tÿ 18-20 gam. KÁt quÁ xác

<i>đánh đ°āc đác tính trung bình cÿa tÿng mÁu ãc N. glans khác nhau trong </i>

nghiên cāu này là 5.1886 ±1.959 MU.

MBA cho đÁn nay vÁn đ°āc sā dụng trong mát sã tr°ßng hāp. Tuy nhiên, do có mát sã h¿n chÁ nh° lý do đ¿o đāc, viác sā dụng MBA đãi với mát sã nhóm đác tã biển chò l phÂng phỏp tham khÁo. Ngồi ra, MBA khơng thể cung cấp thông tin vÃ thành phần đác tã cũng nh° phân biát đ°āc TTXs với các chất đác thần kinh khác nh° chất đác gây tê liát á đáng v¿t có vá (PSP) á mát sã lồi đáng v¿t biển chāa đßng thßi cÁ 2 lo¿i này. Thêm vào đó, các nh°āc điểm khác cÿa kỹ thu¿t này còn tßn t¿i, nh° thßi gian thā nghiám kéo dài, thiÁu tính đặc hiáu và dÁn đÁn các kÁt q d°¢ng tính giÁ

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

cao. Vì nhÿng lý do này, nhu cầu phát triển các ph°¢ng pháp thay thÁ MBA đã đ°āc nghiên cāu ráng rãi.

Mát trong nhÿng ph°¢ng pháp giúp phát hián đác tã nhanh chóng là cÁm biÁn cáng h°áng plasmon bÃ mặt SPR (Surface Plasmon Resonance). SPR cho phộp xỏc ỏnh cỏc thụng só ỏng hòc ca tÂng tác phân tā, nh°ng nó cũng đ°āc sā dụng để đánh l°āng chất phân tích trong các nÃn mÁu phāc t¿p.

Năm 2013, Campbell và cáng sā [27] đã phát triển ph°¢ng pháp xét nghiám SPR phát hián TTX đ¢n giÁn và nhanh chóng á đáng v¿t chân bụng á Châu Âu. Mô mÃm đáng v¿t chân bụng hoặc cá nóc đ°āc chiÁt bằng dung dách đám natri axetat, pH =5,0. Dách chiÁt đ°āc pha loãng 1:20 trong dung dách đám pH =7,4. Dung dách kháng thể đ°āc trán với l°āng bằng nhau cÿa dung dách hiáu chu¿n hoặc mÁu và đ°āc tiêm trên bÃ mặt chip với tãc đá dịng 12 µl/phút trong 2 phỳt. Viỏc òc cỏc Ân vỏ ỏp ng cÿa thiÁt bá đ°āc thāc hián 10 giây tr°ớc và 30 giõy sau mòi ln bÂm xỏc ỏnh s khác biát vÃ đ¢n vá cÿa đáp āng thiÁt bá t°¢ng đãi với tÿng chất hiáu chu¿n hoặc mÁu. BÃ mặt chip đ°āc tái sinh bằng hßn hāp với tß lá 1:1 acid clohydric (10 nM) và dung dách natri dodecyl sulfate 1% có pH 1,75. Mát chu kỳ phân tích điển hình đ°āc hồn thành trong khng 6 phút và mßi chất chu¿n đ°āc phân tích lặp l¿i [9]. Quy trình chiÁt xuất đ¢n đã đ°āc áp dụng để thúc đ¿y tính nhanh chóng cÿa thā nghiám. Viác chu¿n bá mÁu đ¢n giÁn này cho phép chiÁt xuất 40 mÁu mßi giß với tãc đá phát hián nhanh 6 phút mßi lần phân tích. Tuy nhiên SPR có đá nhy kộm hÂn th nghiỏm sinh hòc truyn thóng vỡ ph°¢ng pháp này cháu Ánh h°áng lớn bái các điÃu kián bên ngoài. Tất cÁ các yÁu tã làm thay đái chß sã khúc x¿ trên bÃ mặt cÁm biÁn làm cÁn trá q trình phân tích nh° nÃn mÁu khơng đßng nhất, phāc t¿p và các liên kÁt khơng đặc hiáu [28].

Ph°¢ng pháp thā nghiám trên mô tÁ bào TCBA (Tissue Culture Bioassay) này có thể thay thÁ cho MBA. TCBA phát hián cÁ TTX và STX do

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

các đác tã này có c¢ chÁ ho¿t đáng t°¢ng tā. Kogure và cáng sā [29] nh¿n thấy rằng tÁ bào u nguyên bào thần kinh cÿa chuát Neuro-2a có thể đ°āc āng dụng trong viác xác đánh TTX. Ouabain hoặc veratridine đ°āc thêm vào các tÁ bào ni cấy, làm giÁm khÁ năng tßn t¿i cÿa chúng bằng cách tăng dòng ion natri vào tÁ bào và TTX, ho¿t đáng nh° mát chất chặn kênh natri, s¿ vơ hiáu hóa phÁn āng giúp tÁ bào tiÁp tục phát triển. TÁ bào đ°āc nuôi bá sung 13,3 % hut thanh bị trong mơi tr°ßng ¿m có chāa 5% CO<small>2</small>- 95% khơng khí á 37<small>o</small>C. TÁ bào đ°āc nuôi cấy bằng dung dách 0,5% tryspin – 0,2% EDTA. Ít nhất 200 tÁ bào trong mßi giÁng đ°āc chßn ngÁu nhiên và theo dõi. Hàm l°āng TTX đ°āc °ớc tính tÿ mãi quan há giÿa nßng đá TTX và tỷ lá phần trăm tÁ bào sãng.

Trên c¢ sá cÿa ph°¢ng pháp, Hamasaki và cáng sā [30] đã cÁi tiÁn bằng cách sā dụng muãi tetrazolium, 3-(4,5-dimetyl-2-thiazolyl) -2,5 diphenyl-2H tetrazolium bromide và đo tā đáng đĩa microplate để giÁm thßi gian . Các muãi tetrazolium bá phân cÁt bái enzym dehydrogenase trong ti thể, t¿o ra tinh thể formazan màu xanh lam m. Do ú, xột nghiỏm dò thc hiỏn hÂn v kÁt q có thể lặp l¿i, đ¢n giÁn, rẻ tiÃn và có thể thay thÁ cho ph°¢ng pháp thā nghiám sinh hóa chuát. Tuy nhiên, ph°¢ng pháp này vÁn có khÁ năng bá Ánh h°áng bái tay nghÃ cÿa kỹ thu¿t viên vì cần phÁi có các b°ớc rāa để lo¿i bá thuãc nhuám hoặc tÁ bào chÁt tā do. Ngồi ra, nó cũng ch°a phân biát các chất đác và các hóa chất khác có khÁ năng āc chÁ dịng natri.

Ph°¢ng pháp xét nghiám hấp thụ mißn dách liên kÁt với enzyme (ELISA) sā dụng hiáu quÁ trong viác phát hián và đánh l°āng peptides, protein, antibodies, hormone,... trong các mÁu sinh hßc.

Trong nghiên cāu ngá đác TTX khi ăn cá nóc á Bangladesh, Islam và cáng sā [31] sā dụng mát kháng thể kháng nguyên l¿i TTX để xác đánh nßng đá TTX trong n°ớc tiểu và máu tÿ 38 bánh nhân [32]. KÁt quÁ TTX á d°ới māc phát hián (< 1,6 ng/ml) trong 11 mÁu máu nh°ng phát hián đác tã trong n°ớc tiểu. Ngy và cáng sā [33], Reverté và cáng sā [34] cũng đã phát triển ph°¢ng pháp này để phát hián đác tã tetrodotoxin trong hàu và trai. Ph°¢ng pháp này có lāi thÁ sàng lßc TTX trong các mÁu đáng v¿t hai mÁnh vá cú th

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

Ân gin húa, thòi gian phân tích nhanh nh°ng ELISA tãn nhiÃu cơng sāc và tãn kém để chu¿n bá kháng thể, ph°¢ng pháp thiÁu tính án đánh, sā āc chÁ khơng đÿ kháng ngun mißn dách có thể dÁn đÁn kÁt q sai, mỏt só tròng hp cho kt qu dÂng tớnh gi hoặc âm tính giÁ và đặc biát là chi phí phân tích rất cao nên āng dụng ch°a đ°āc phá bin.

<b>1.2.2. PhÂng phỏp húa hòc </b>

<b> Bờn cnh cỏc phÂng phỏp sinh hòc cựng vi s phỏt triển cÿa hóa </b>

phân tích hián đ¿i nhằm phát hián l°āng vÁt đác tã và các dÁn xuất cÿa nó chớnh xỏc hÂn, cỏc nh khoa hòc nghiờn cu phõn tớch ỏc tó TTXs bng cỏc phÂng phỏp húa hòc nh° sÁc ký bÁn máng, quang phá, sÁc ký khí kÁt hāp với khãi phá GC-MS, kỹ thu¿t sÁc ký láng hiáu năng cao HPLC, kỹ thu¿t sÁc ký láng khãi phá LC-MS hoặc LC-MS/MS đã đ°āc phát triển. Quy trỡnh ny thòng gòm cỏc bc cÂ bn nh chit tách, tinh s¿ch, phân tích và xā lý sã liáu.

Theo mát sã nhóm nghiên cāu [35] [36], ph°¢ng pháp sÁc ký lớp máng TLC (Thin layer chromatography) đ°āc sā dụng để xác đánh hāp chất TTX bằng cách sā dụng bÁn máng silica gel. Tấm này đ°āc theo dõi với 2 lo¿i dung môi: dung môi 1 (pyridin – ethyl acetat – acid acetic – n°ớc) với tỷ lá 15:5:3:4 và dung môi 2 (butanol – acid acetic – n°ớc) với tỷ lá 2:1:1. L°āng dung mơi tăng lên nhß tác đáng cÿa mao dÁn và thu đ°āc sā phân tách sÁc ký. Đác tã s¿ hiển thá huỳnh quang t¿i b°ớc sóng 365 nm. Thuãc thā màu đ°āc sā dụng là dung dách KOH 10% hoặc thuãc thā Weber.

Mát ph°¢ng pháp hiáu quÁ để xác đánh các nhóm chāc các chất là sā dụng quang phá hßng ngo¿i IR (Infrared Spectroscopy). Mặc dù phá IR đ°āc cho là phāc t¿p nh°ng nó vÁn góp phần đánh danh TTX. Năm 1984, Onoue đã sā dụng phá IR sā dụng để đánh tính đác tã TTX trong cá nóc [37]. Manabu Asakawa và cáng sā [37] cũng đã đ°a ra nghiên cāu phá muãi TTX-HCl

<i>đ°āc phân l¿p tÿ loài Caphalothrix sp. á vánh Hiroshima. Các dÁi hấp thụ á </i>

3353, 3235, 1666, 1612 và 1076 cm<small>-1</small> đ°āc quan sát thấy trong quang phá cÿa

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

tinh thể này cho thấy sā hấp thụ đặc tr°ng các nhóm chāc OH, guanidin và COO- cÿa TTX (Xem hình 1.6).

SÁc ký khí GC (Gas chromatography) và khãi phá MS (Mass spectrum) t¿o thành mát sā kÁt hāp hiáu q để phân tích hóa hòc. PhÂng phỏp GC-MS l phÂng phỏp giỏn tip phát hián TTX và các dÁn chất cÿa nó [38], [39].

Tÿ năm 1984, Noguchi và cáng sā [19] đã tách chiÁt đác tã TTX trong nhuyßn thể đáng v¿t chân bụng (Ách) á Nh¿t BÁn bằng các dung dách acid acetic và methanol, phân tích bằng ph°¢ng pháp GC-MS cho thấy rằng nó chāa khung quinazoline đặc tr°ng cho TTX. Viác sàng lßc đác tã tetrodotoxin á cá nóc, phân tích đá nh¿y cÿa TTX trong huyt tÂng ngòi s dng phÂng pháp GC-MS đã đ°āc báo cáo [40], [41]. Trong các báo cáo sā dụng mơ cá nóc nặng 0,5 g đ°āc xā lý bằng 5 ml acid acetic 0,1%, sau đó thÿy phân bằng kiÃm. KÁt hāp kỹ thu¿t chiÁt chất láng-láng và t¿o dÁn xuất N-methyl -N-TMS-trifluoroacetamide. PhÂng phỏp ó chò s dng mỏt lng mu nhỏ và dung mơi, quy trình chiÁt láng láng đ°āc đ¢n giÁn hóa cũng nh° phân tích sÁc ký ngÁn (8,2 phút).

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

<i><b>1.2.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao </b></i>

Ph°¢ng pháp sÁc ký láng hiáu năng cao HPLC (High performance liquid chromatography) dāa trên sā phân tách giÿa pha đáng và pha tĩnh nên có thể āng dụng để phân tích TTXs. NhiÃu nghiên cāu đã sā dụng ph°¢ng pháp thay đái các detector cho thấy kÁt quÁ đá nh¿y, giới h¿n phát hián và giới h¿n đánh l°āng khác nhau.

Năm 1998, Chen và cáng sā sā dụng HPLC với đầu dò huỳnh quang để

<i>đánh l°āng TTX trong cá nóc N. Lineatai cho kÁt q khng tun tính rất </i>

tãt tÿ 10-2000 ng và giới h¿n phát hián là 10 ng. Mát quy trình đ°āc Margaget và cáng sā [44] đ°a ra và phát triển bằng cách sā dụng ph°¢ng pháp chiÁt pha rÁn để làm s¿ch mÁu huyÁt thanh và n°ớc tiểu cÿa bánh nhân bá nhißm đác TTX sau đó phân tích các mÁu bằng sÁc ký láng hiáu năng cao với đầu dị huỳnh quang. Nßng đá TTX tãi thiểu có thể đánh l°āng đ°āc lần l°āt là 5 và 20 ng/ml đãi với huyÁt thanh và n°ớc tiểu. Đ°ßng chu¿n là tuyÁn tính trong khoÁng 20–300 ng/ml đãi với n°ớc tiểu và 5–20 ng/ml đãi với huyÁt thanh. Nhằm mục đích đánh l°āng TTX trong mÁu huyt tÂng v nc tiu ngòi, Yu v cỏng s [43] cũng thu đ°āc giới h¿n phát hián là 10 ng/ml khi sā dụng sÁc ký láng hiáu năng cao gép đầu dị diode.

à Viát Nam, ph°¢ng pháp sÁc kỷ láng hiáu năng cao đ°āc nhóm các nhà khoa hòc ng dng phÂng phỏp phõn tớch ỏc tó TTX trong ãc h°¢ng đ°āc ni bằng thāc ăn chÁ biÁn tÿ cá nóc trong sÁn ph¿m n°ớc mÁm chÁ biÁn tÿ các nóc đác chấm cam [47] hoặc trong mát sã loài ãc bùn tā nhiên gây ngá đác [21] ( Xem hình 1.7).

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

<b>Hình 1. 6. S</b>Ác ký đß HPLC-FLD cÿa TTXs chu¿n và m<b>át sã mÁu ãc thu á vùng biển Khánh Hòa, tháng 6/2015 [21] </b>

Khi nghiên cāu các ph°¢ng pháp phân tích hóa hßc hián đ¿i đãi với TTXs, các nhà nghiên cāu nh¿n thấy c°ßng đá huỳnh quang cÿa 6-epiTTX và 11-norTTX-6(R)-ol cao gấp 20 lần và 10 lần so với TTX, trong khi 5-deoxyTTX và 11-deoxyTTX có c°ßng đá huỳnh quang chß bằng 1/20 và 1/100 cÿa TTX [47]. Nh° v¿y, khi sā dụng há thãng thiÁt bá HLPC-FLD có thể làm Ánh h°áng đáng kể đÁn giới h¿n phát hián TTXs và đá nh¿y cÿa ph°¢ng pháp. Ph°¢ng pháp sÁc ký láng ghép đầu dị khãi phá có thể khÁc phục h¿n chÁ này bái nó làm tăng khÁ năng phát hián TTXs mát cách chính xác và hiáu quÁ h¢n. Ph°¢ng pháp sÁc ký láng khãi phá LC-MS (Liquid chromatography Mass spectrum) là ph°¢ng pháp có tính āng dụng cao và đang dần trá nên trong phân tích các đác tã trên nÃn mÁu sinh hßc.

Nhóm nghiên cāu Tsai và cáng sā [48] sā dụng ph°¢ng pháp LC-MS để đánh l°āng TTXs trong máu và n°ớc tiểu cÿa các n¿n nhân bá ngá đác khi sā dụng cá nóc. Thành phần pha đáng đ°āc sā dụng là hßn hāp 1% acetonitril, 10 mM trimethylamin, 10 mM amoniformat, tãc đá dòng tãi °u

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

đ°āc khÁo sát là 0,4 ml/phút và cát Zorax 300SB-C3. Ph°¢ng pháp LC-MS đ°āc xác nh¿n có hiáu q h¢n ph°¢ng pháp GC-MS hay HPLC. Đá phục hßi đác tã trong nÃn mÁu 88,6% và giới h¿n phát hián là 15,6 nM.

Năm 2007, nhóm nghiên cāu cÿa Jen cùng các cáng sā đã phân tích

<i>đác tã sinh v¿t biển tÿ năm loài đáng v¿t chân bụng Naitca vitellus, Natica tumidus, Oliva hirasei, Oliva lignaria và Oliva annulata </i>đ°āc thu th¿p tÿ vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa. KÁt quÁ đã đ°a ra quy trình phân tích đác tã STX và TTX bằng ph°¢ng pháp phân tích HPLC, kÁt hāp với ph°¢ng pháp LC-MS/MS [49]. KÁt q phân tích bằng LC-MS/MS các nhà nghiên cāu đã tìm thấy mÁnh phá m/z = 320 có thể gán cho [TTX + H

]

<small>+</small>và các mÁnh ion thā cấp t°¢ng āng m/z = 302 và 162 đặc tr°ng cho TTX.

<i><b>(A) Oliva annulata, (B) Oliva lignaria, (C) Oliva hirasei và (D) TTX [49] </b></i>

Năm 2008, Jen và cáng sā [50] sā dụng kÁt hāp hai ph°¢ng pháp phân tích HPLC và LC-MS/MS với cát Cosmosil HILIC 150 x 4,6 mm. Đác tã TTX hàm l°āng lớn đ°āc xác đánh bằng ph°¢ng pháp truyÃn thãng HPLC-

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

FLD. Tuy nhiên, chất đác trong mÁu máu chß á d¿ng vÁt và ph°¢ng pháp LC–MS/MS mới xác nh¿n sā hián dián cÿa TTX. Nghiên cāu này cho thấy rằng LC–MS/MS kÁt hāp với chiÁt pha rÁn có khÁ năng phát hián thấp h¢n và đáng tin c¿y h¢n khi xác đánh TTX trong các mÁu máu so với LC–MS đã báo cáo tr°ớc. KÁt quÁ cho thấy đá tuyÁn tính trong huyÁt thanh đ°āc quan sát thấy trong khoÁng nßng đá tÿ 1-100 ng/ml, đá phục hßi TTXs trong mÁu đÁn 90% và giới h¿n phát hián là 0,1 ng/ml. Khi so sánh với kÁt q phân tích bằng HPLC có òng chun tuyn tớnh 1-500 àg/ml v gii hn phỏt hiỏn 1 àg/ml khng ỏnh phÂng phỏp LC-MS/MS là ph°¢ng pháp đánh l°āng TTXs có giới h¿n phát hián thấp h¢n và đáng tin c¿y.

Jang và cáng sā [51] sā dụng há thãng LC-MS để phân tích đánh tính

<i>và đánh l°āng TTXs tÿ lồi cá nóc F. Niphobles, T. nigroviridis và T. Biocellatus (Xem hình1.9) . </i>

<i>F.niphobles (B), T.nigrovirids (C), T.biocellatus (D) [51] </i>

KÁt hāp với phân tích LC-MS/MS thu đ°āc các mÁnh ion m/z 320–162 āng với TTX và 4-epiTTX, m/z 302–162 āng với 4,9-anhydroTTX, m/z 304–162 āng với 5-deoxyTTX và 11-deoxyTTX, m/z 288–224 āng với 6,11-

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

dideoxyTTX, và m/z 272–162 āng với 5,6,11-trideoxyTTX. Ph°¢ng pháp đ¿t giới h¿n phát hián TTXs là 0,5 nmol/g.

Trong nghiên cāu cÿa Kudo và cáng sā [12] mát chất mới t°¢ng tā TTX là 6-deoxyTTX đ°āc phân l¿p tÿ bußng trāng cÿa cá nóc bằng há thãng LC-MS với với cát TSK gel Amide-80 (2,0 x 150 mm; 5 μm ). Thành phần pha đáng đ°āc tãi °u là acetonitrile - đám ammoni format 16mM (tỷ lá 7:3), tãc đá dòng 0,2 ml/phút. Nghiên cāu thāc hián khÁo sát l°āng TTXs trong cá

<i>nóc T. pardalis và ãc N. glans, b¿ch tuác đãm xanh Hapalochlaena sp. và b¿ch tuác H. maculosa. Hāp chất 6-deoxyTTX cũng đ°āc xác đánh á các đáng v¿t biển khác, ãc N. glans và b¿ch tuác đãm xanh bằng cách sā dụng </i>

LC-MS.

NhiÃu nghiên cāu đã chāng minh LC-MS và LC/MS-MS đã nâng cao đá chßn lßc và đá nh¿y khi phân tích đác tã TTXs trên tồn thÁ giới. Sā cÁi tiÁn thiÁt bá phân tích làm tăng hiáu quÁ trong đánh danh và xác đánh đặc tính các đßng phân đác tã TTXs. Tuy nhiên, sÁc ký láng ghép đầu dị khãi phá đ¢n vÁn bá h¿n chÁ khi cần kÁt quÁ đánh l°āng hàm l°āng vÁt mát sã dÁn xuất cÿa TTX. Các nghiên cāu trên cho thấy ph°¢ng pháp LC- MS/MS đáng tin c¿y, <small>LC-MS có thể áp dụng để phân tích hàm l°āng vÁt</small>, đá chßn lßc cao rất hÿu ích để xác đánh TTX và các dÁn chất cÿa TTX trong các chất nÃn phāc t¿p.

SÁc ký láng khãi phá (LC-MS) l phÂng phỏp phõn tớch húa hòc hiỏn i vi sā kÁt hāp giÿa thiÁt bá sÁc ký láng hiáu năng cao (HPLC) và detector khãi phá (MS). Hßn hāp các chất cần phân tích trong pha đáng sau khi đ°āc tách qua cát sÁc ký s¿ đ°āc phát hián và đánh l°āng bằng detector khãi phá.

Trong phõn tớch , ngòi ta thòng s dng phÂng phỏp LC-MS cho: - Các hāp chất có đá phân cāc trung bình và cao, khó bay h¢i

- Phân tích thc trong dách sinh hßc. - Phân tích các hāp chất tā nhiên.

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

-Tr°ßng hāp khơng sā dụng đ°āc các detector khác: Khơng phát hián đ°āc bằng detector khác hoặc trong phân tích khẳng đánh

- Nét nái b¿t cÿa phân tích khãi phá là tính chßn lßc và đá nh¿y, đá đặc hiáu cao. Giới h¿n phát hián có thể đÁn 10-14 gam. Do v¿y th°ßng dùng kỹ thu¿t này để phân tích hàm l°āng siêu vÁt trong mÁu thành phần phāc t¿p.

Mát trong các yÁu tã Ánh h°áng đáng kể đÁn sā phân tách cÿa quá trình sÁc ký là thành phần pha đáng. Thơng th°ßng, pha đáng là hai dung mơi (hÿu c¢ hoặc dung dách n°ớc) hồ tan vào nhau với tỷ lá thích hāp để có khÁ năng phân tách với đá phân giÁi cao.

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

MÁu láng hoặc dung dách đ°āc mát van tiêm tā đáng tiêm thẳng vào pha đáng cao áp ngay á đầu cát. ThiÁt bá chāa mÁu th°ßng có dung tích 0,50 - 20 àL

PhÂng phỏp phỏ khói lng l mát kỹ thu¿t đo trāc tiÁp tỷ sã khãi l°āng và đián tích cÿa ion (có đ¢n vá bằng Dalton) đ°āc t¿o thành khi ion hóa phân tā hoặc nguyên tā cÿa mÁu. Các ion đ°āc t¿o thành trong bng ion hóa, đ°āc gia tãc và tách riêng nhß bá ph¿n phân tích khãi tr°ớc khi đÁn bá ph¿n phát hián (detector). Khãi phá s¿ cho tín hiáu t°¢ng āng với các ion đ°āc biểu thá bằng c°ßng đá peak khác nhau. Khãi phá này cho thơng tin đánh tính góp phần nh¿n d¿ng và xác đánh hàm l°āng các chất.

<b>1.3.3. Mßt sã ch¿ đß trong sÅc ký láng khãi phá </b>

Với mát hßn hāp nhiÃu chất, sau khi đ°āc tách ra qua cát sÁc ký láng và đ°a vào detector khãi phá, khãi phá kÁ ghi nh¿n táng c°ßng đá các ion sinh ra tÿ mßi chất. Ta có mát sÁc đß toàn ion và phá khãi đ°āc lấy toàn bá các ion (Full scan). Full scan cho đầy đÿ thông tin vÃ chất phân tích h¢n, tuy nhiên ph°¢ng pháp này có đá nh¿y khơng cao, nhißu đ°ßng nÃn có thể lớn. Do đó chÁ đá quét này có hiáu quÁ đãi với các phân tích khi chất phân tích có nßng đá đÿ lớn và th°ßng đ°āc lāa chßn để khÁo sát ion mẹ.

Trong kỹ thu¿t phân tích chßn lßc ion (SIM), đầu dị MS chß ghi nh¿n tín hiáu mát sã mÁnh ion đặc tr°ng cho chất cần xác đánh. ChÁ đá SIM có thể đ°āc dùng để đánh l°āng chất phân tích. Để đ¿t đá nh¿y và đá chính xác cao có thể chßn đ°āc nhiÃu ion mát lần. Do đó, khi đã biÁt ion mẹ chÁ đá SIM th°ßng đ°āc sā dụng để khÁo sát năng l°āng phân mÁnh tãi °u cho quá trình phân tích.

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

Kỹ thu¿t ghi phá có đá nh¿y cao th°ßng đ°āc sā dụng là khÁo sát ion cơ l¿p (SRM) và khÁo sát đa ion cô l¿p (MRM). SRM là cơ l¿p ion cần chßn để phân mÁnh. Trong các mÁnh ion sinh ra cô l¿p 1 mÁnh ion con cần quan tâm và đ°a vào đầu dò để phát hián. Tuy nhiên trong thāc tÁ phân tích vi l°āng, các ion con cần khÁo sát th°ßng tÿ 2 trá lên, do v¿y kỹ thu¿t ghi phá MRM hiáu dụng h¢n SRM. Đầu tiên, cơ l¿p ion cần chßn (ion mẹ á tā cāc thā nhất, phân mÁnh ion cơ l¿p đó t¿i tā cāc thā 2 thu đ°āc các ion con, cô l¿p 2 hoặc nhiÃu ion con cần quan tâm á tā cāc thā 3 và đ°a vào đầu dò để phát hián.

Đãi với kỹ thu¿t MS/MS, mát ion chßn lßc á chÁ đá MS lần thā nhất và sau đó đ°āc khÁo sát tiÁp bằng cách sā dụng năng l°āng phân mÁnh t¿o ra mát hoặc vài ion con đặc tr°ng á chÁ đá MS lần thā hai. Kỹ thu¿t MS/MS đ°āc làm giÁm đáng kể nhißu cÿa đ°ßng nÃn góp phần để tng ỏ chòn lòc v tng ỏ nhy ca phÂng phỏp.

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

<b>ChÂng 2. õI TỵNG V PHĂNG PHP NGHIấN CU 2.1. õI TỵNG NGHIấN CU </b>

<b>2.1.1. Đãi t°ÿng nghiên cāu </b>

TTXs trong 2 loài ãc biển có tiÃn sā gây ngá đác thāc ph¿m t¿i Viát Nam đ°āc thu á vùng biển ven bß Khánh Hịa và lân c¿n, Viát Nam, đ°āc đánh danh làm tiêu bÁn và lấy phần mô mÃm làm mÁu nghiên cāu. MÁu đ°āc bÁo qn d°ới -10<small>o</small>C, t¿i phịng thí nghiám An tồn thāc ph¿m và mơi tr°ßng (Khu vāc miÃn Trung), Viỏn Hi dÂng hòc Nha Trang, Khỏnh Hũa.

- Chu¿n TTX (Wako, Nh¿t BÁn), chu¿n 4-epiTTX (Nh¿t BÁn), chu¿n 4,9-anhydroTTX (Nh¿t BÁn).

- Acetonitrile (Merck, Đāc), Methanol (Wako, Nh¿t BÁn), Acid formic (Wako, Nh¿t BÁn), Ammonium hydroxide (Wako, Nh¿t BÁn), n°ớc

<b>cất siêu s¿ch Mili-Q Water (Merck, Đāc) dùng cho LC-MS/MS. </b>

- Acid acetic (Wako, Nh¿t BÁn).

<b>Hình 2. 1. ThiÁt bá LC-MS/MS t¿i phịng thí nghiám vÃ </b>

An tồn thāc ph¿m và mơi tr°ßng (Khu vāc miÃn Trung).

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

<b>2.2. PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĀU 2.2.1. Thu mÁu và bÁo quÁn mÁu </b>

<i>2 loài ãc bùn, bao gßm: Nassarius glans (Hình 2.2a), Nassarius papillosus (Hình 2.2b) </i>đ°āc thu ngồi tā nhiên t¿i vùng biển Khánh Hịa vào tháng 6/2023 (BÁng 2.1). MÁu sau khi thu đ°āc rāa s¿ch và bÁo quÁn bằng đá

<b>l¿nh, sau đó v¿n chuyển ngay vÃ phịng thí nghiám vÃ An tồn thāc ph¿m và </b>

mơi tr°ßng (Khu vāc miÃn Trung). MÁu đ°āc bÁo quÁn d°ới -10<small>o</small>C đÁn khi thāc hián phân tích đác tã.

<b>Hình 2. 2. </b><i><b>MÁu ãc (a) Nassarius glans, (b) Nassarius papillosus </b></i>

<b>BÁng 2. 1. Sã l°āng và khãi l°āng trung bình cÿa </b>

2 lồi ãc bùn thu á vùng biển Khánh Hòa.

cá thể

Khãi l°āng cÁ vá (g)

Khãi l°āng thát ãc (g)

<i>Nassarius papillosus </i> 20 6,77±2,12 2,73±0,76

<b>2.2.2.Xây dăng quy trình phân tích </b>

Do TTXs có đá phân cāc và qua tham khÁo mát sã tài liáu [51], [53], [54] chúng tôi tiÁn hành xác đánh TTXs bằng kĩ thu¿t ion hóa phun đián tā

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

ESI với chÁ đá bÁn phá ion d°¢ng và chÁ đá ghi phá MRM. KhÁo sát thÁ phân mÁnh tãi °u để l°āng ion con t¿o thành nhiÃu, án đánh nhất trong điÃu kián hóa chất và trang thiÁt bá thāc tÁ t¿i phịng thí nghiám.

TiÁn hnh trờn mu chun TTXs (gòm TTX: 2,551 àg/ml; 4-epiTTX: 2,148 µg/ml; 4,9-anhydroTTX: 1,755 µg/ml)

Chúng tơi tiÁn hành khÁo sát điÃu kián sÁc ký láng hiáu năng cao với các nái dung:

- KhÁo sát ch°¢ng trình gradient há pha đáng: trong phân tích sÁc ký tỷ lá pha đáng Ánh h°áng rất nhiÃu đÁn khÁ năng phân tách cÿa TTXs ra khái hßn hāp và pha tnh. ChÂng trỡnh c chòn phi m bo peak cn phân tích trong sÁc ký đß phân tách rõ ràng, khơng bá ch¿p và thßi gian l°u hāp lý.

- KhÁo sát tãc đá dịng: điÃu chßnh tãc đá dịng để thßi gian l°u phù hāp, đÁm bÁo áp suất cát.

Tÿ kÁt quÁ khÁo sát lāa chßn điÃu kián sÁc ký thích hāp để có thể tiÁn hành đánh l°āng TTXs trong mÁu ãc trên há thãng LC-MS/MS.

<i><b>2.2.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu </b></i>

Viác xây dāng quy trình tách chiÁt đác tã TTXs tÿ mÁu ãc là cần thiÁt để đÁm bÁo đá chính xác cÿa kÁt quÁ phân tích LC/MS-MS.

KhÁo sát nßng đá dung mơi tách chiÁt: Do trong phân tā TTXs có nhóm guanindin perhydroquinaolin có tính kiÃm m¿nh nên TTXs tan trong dung dách axit. Tuy nhiên TTXs cũng có cấu trúc ester nái phân tā nên dß bá thÿy phân bái các axit m¿nh, do đó cách duy nhất để giÿ TTXs bÃn vÿng trong dung dách là hòa tan trong axit hÿu c¢ yÁu. Acid acetic đ°āc lāa chßn sā dụng trong nhiÃu nghiên cāu [6], [44], [53], [54] [53] để chiÁt đác tã TTXs tÿ sinh v¿t biển khi phân tích bằng kỹ thu¿t sÁc ký láng với đầu dị MS/MS. Trong nghiên cāu này, chúng tơi tiÁn hành khÁo sát nßng đá acid acetic phù hāp. Đánh giá qua hiáu suất thu hßi sau tách chiÁt bằng ph°¢ng pháp thêm chu¿n vào mÁu trÁng và tính hiáu suất thu hßi theo cơng thāc sau:

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

- KhÁo sát thể tích rāa giÁi: kỹ thu¿t phá biÁn nhất để làm s¿ch các mÁu chāa TTXs là chiÁt pha rÁn [54], [55]. Trong đó rāa giÁi là b°ớc cuãi cùng để thu hßi chất phân tích. TTXs tan trong n°ớc và đá phân cāc cao nên dung mơi rāa giÁi th°ßng đ°āc lāa chßn là methanol, acid acetic, acid formic, acetonitrile…Theo nhiÃu nghiên cāu, dung mơi rāa giÁi có đá hßi phục cao acetonitrile/n°ớc/acid acetic (20:80:1) [54]. Tuy nhiên, thể tích dung mơi rāa giÁi Ánh h°áng đÁn nßng đá d° TTXs đ°āc chiÁt tách tÿ mÁu thā. Vì v¿y, chúng tơi tiÁn hành khÁo sát thể tích rāa giÁi thích hāp. Đánh giá qua hiỏu sut thu hòi sau ra gii bng phÂng pháp thêm chu¿n vào mÁu trÁng và tính hiáu suất thu hßi theo cơng thāc (1).

Tÿ nhÿng kÁt quÁ khÁo sát điÃu kián sÁc ký, điÃu kián phân mÁnh khãi phá, quy trình xā lý mÁu mà cho hiáu suất cao nhất, táng hāp và xây dāng quy trình thāc nghiám đánh l°āng TTXs trong mÁu thā đ¿i dián.

<b>2.2.3. Đánh giá quy trình phân tích TTXs </b>

Theo h°ớng dÁn th¿m đánh ph°¢ng pháp phân tích AOAC, th¿m đánh l¿i quy trình phân tích đã xây dāng, đÁm bÁo ph°¢ng pháp nghiên cāu là phù hāp với các nái dung c¢ bÁn nh° sau:

TiÁn hành pha dãy các dung dách chu¿n TTXs với dung môi là acid acetic 0,03M. Các dung dách chu¿n đ°āc bÁo quÁn trong tÿ l¿nh nhiát đá f 4<small>o</small>C. Nßng đá dãy dung dách chu¿n đ°āc ghi trong bÁng 2.2.

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

Nòng ỏ TTX (àg/ml) 2,500 1,250 0,500 0,250 0,125 Nßng đá 4-epiTTX

<i><b>2.2.3.2. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng </b></i>

Giới h¿n phát hián LOD (Limit of detection) đ°āc đánh nghĩa là nßng đá nhá nhất cÿa chất phân tích mà có tín hiáu sÁc ký lớn gấp 3 lần tín hiáu đ°ßng nÃn (S/N=3). Đây là mát thông sã đặc tr°ng cho đá nh¿y cÿa ph°¢ng pháp. Chất nào nh¿y h¢n s¿ có giới h¿n phát hián nhá h¢n.

Giới h¿n đánh l°āng LOQ (Limit of quantification) là nßng đá nhá nhất đo đ°āc cÿa ph°¢ng pháp với đá đúng và đá chính xác thích hāp. Theo lý thuyÁt thãng kê trong hóa phân tích thì LOQ là nßng đá chất phân tích mà cho tín hiáu gấp 10 lần tín hiáu đ°ßng nÃ (S/N=10) tāc là:

- Đá lặp l¿i: là māc đá gần nhau cÿa các giá trá riêng lẻ cÿa các phép đo lặp l¿i và đ°āc biểu dißn bằng đá lách chu¿n (SD) hay đá lách chu¿n t°¢ng đãi RSD (%). Chúng tôi tiÁn hành khÁo sát trên nÃn mÁu thāc, phân tích lặp l¿i 6 lần. Tính giá trá trung bình, đá lách chu¿n, đá lách chu¿n t°¢ng đãi cÿa các lần thā nghiám.

Giá trá trung bình: <small>1</small>

<small></small>