khảo sát tính chất methyl hóa bất thường trên gen apc và dapk trên bộ mẫu ung thư vú ở việt nam phân tích tổng hợp khảo sát thực nghiệm

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.13 MB, 69 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT METHYL HĨA BẤT THƯỜNG TRÊN

GEN APC VÀ DAPK TRÊN BỘ MẪU UNG THƯ VÚ Ở VIỆT

NAM: PHÂN TÍCH TỔNG HỢP & KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

CBHD: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG SVTH: NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DIỆU MSSV: 1553010257

KHÓA: 2015

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2019

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT METHYL HĨA BẤT THƯỜNG TRÊN

NAM: PHÂN TÍCH TỔNG HỢP & KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

CBHD: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG SVTH: NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DIỆU MSSV: 1553010257

KHÓA: 2015

GVHD ký xác nhận

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2019

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh và Quý Thầy Cô chuyên ngành Công nghệ Sinh Học - Y Dược đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian qua.

Em xin chân thành cám ơn PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức cần thiết trong suốt quá trình làm thực tập tốt nghiệp. Em xin cảm ơn ThS. Lao Đức Thuận, các anh chị, các bạn đã giúp đỡ và tạo điều kiện để em có thể hồn thành thực tập tốt nghiệp một cách thuận lợi nhất.

Đặc biệt, em xin cảm ơn ThS. Trương Kim Phượng đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo em không chỉ những kiến thức chun mơn mà cịn tinh thần nghiên cứu nghiêm túc và làm việc hiệu quả trong suốt quá trình thực hiện thực tập tốt nghiệp.Do trình độ chun mơn cũng như kinh nghiệm thực tiễn của em còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp từ Thầy Cơ để em có cơ hội nâng cao kiến thức chun mơn và hồn thiện bản thân.

Xin gửi lời cảm ơn đến các anh (chị), bạn bè đã luôn theo sát, giúp đỡ, chia sẻ nhiều kinh nghiệm cho em.

Sau cùng, con xin gửi lời tri ân sâu sắc đến Cha Mẹ dành trọn tháng năm cuộc đời để yêu thương, chăm sóc và dạy bảo chúng con.

Em xin kính chúc Thầy Cơ, gia đình và bạn bè thật nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành công trong cuộc sống.

Xin Chân Thành Cảm Ơn!

Sinh viên

Nguyễn Thị Phương Diệu

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

APC Polyposis Coli Adenomatous

DAPK Death-Associated Protein Kinase

CpG Cytosine phosphate Guanine DNMTs DNA methyltransferases

NCBI National Center for Biotechnology Information NCI National Cancer Institute

MS-HRM Methylation-sensitive high-resolution melting MSP Methylation specific Polymerase Chain Reaction

HER2 Human epidermal growth factor receptor 2

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

ii

DANH MỤC HÌNH

Hình I. 1 Vị trí gen APC trên nhiễm sắc thể số 5 ... 1

Hình I. 2 Vị trí gen DAPK trên nhiễm sắc thể số 9 ... 1

Hình II. 1 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Nested-MSP ... 12

Hình III.1 Quy trình chọn lọc bài báo trong phân tích tổng hợp trên gen APC và DAPK ... 14

Hình III.2 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số tỷ suất chênh (OR) của tính chất methyl hóa trên gen APC trong bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành dựa vào 13 công bố khoa học ca chứng. ... 17

Hình III.3 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số tỷ suất chênh (OR) của bộ dữ liệu 13 công bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen APC. ... 18

Hình III. 4 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số nguy cơ (RR) của tính chất methyl hóa trên gen APC trong bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành dựa vào 13 công bố khoa học ca chứng. ... 18

Hình III.5 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số nguy cơ (RR) của bộ dữ liệu 13 cơng bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen APC ... 19

Hình III.6 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số tỷ suất chênh (OR) của tính chất methyl hóa trên gen DAPK trong bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành trong 10 cơng bố khoa học ca chứng. ... 26

Hình III.7 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số tỷ suất chênh (OR) của bộ dữ liệu 10 cơng bố khoa học ca chứng về tính chấy methyl hóa trên gen DAPK... 27

Hình III.8 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số nguy cơ (RR) của tính chất methyl hóa trên gen DAPK trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành trong 10 công bố khoa học ca chứng. ... 27

Hình III.9 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số nguy cơ (RR) của bộ dữ liệu 10 công bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen DAPK ... 28

Hình IV.1 Vùng promoter trên gen APC ... 33

Hình IV.2 Vị trí hoạt động của cặp mồi Nested-MSP trên gen APC ... 34

Hình IV.3 Vùng promoter trên gen DAPK ... 35

Hình IV.4 Vị trí hoạt động của cặp mồi Nested-MSP trên gen DAPK ... 35

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

iii

Hình IV.5 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng Nested-MSP của gen APC trên mẫu bệnh

phẩm ung thư vú. ... 42

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng II. 1 Thành phần phản ứng PCR trong quy trình Nested MSP ... 12

Bảng III.1 Đặc điểm của bộ dữ liệu ca chứng về sự methyl hóa trên gen APC đối với

bệnh ung thư vú ... 16

Bảng III.2 Chỉ số tỷ suất chênh (OR) về tính chất methyl hóa gen APC trên bệnh ung

thư vú ... 23

Bảng III.3 Đặc điểm bộ dữ liệu ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen DAPK đối

với bệnh ung thư vú ... 25

Bảng III.4 Chỉ số tỷ suất chênh (OR) về tính chất methyl hóa gen DAPK trên bệnh ung

thư vú ... 32 Bảng IV.1 Thông tin bộ mồi khảo sát tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu ... 37

Bảng IV.2 Thông số vật lý của bộ mồi đặc hiệu trên vùng promoter gen mục tiêu APC và DAPK... 38

Bảng IV.3 Vị trí hoạt động của bộ mồi MSP xác định tính chất methyl hóa trên trình tự

promoter gen APC và DAPK... 39 Bảng IV. 4Tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen APC trên bộ mẫu ung thư vú

... 43

Bảng IV. 5 Tính chất methyl hóa và unmethyl hóa trên vùng promoter gen DAPK trên

bộ mẫu ung thư vú ... 43

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ... 1

I.1. Gen Polyposis Coli Adenomatous (APC) ... 1

I.2. Gen Death-Associated Protein Kinase (DAPK) ... 1

I.3. Epigenetics và sự methyl hóa vượt mức trên DNA ... 2

I.3.1. Epigenetics ... 2

I.3.2. Methyl hóa DNA và đảo CpG ... 2

I.4. Dấu chứng sinh học ... 3

I.5. Ung thư vú ... 3

I.6. Tình hình nghiên cứu tính chất methyl hóa trên gen APC và DAPK đối với bệnh ung thư vú ... 4

I.7. Phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA ... 4

I.8. Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta-analysis) ... 5

II. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP ... 7

II.1. Vật liệu ... 7

II.2. Phương pháp nghiên cứu ... 7

II.2.1. Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp ... 7

II.2.2. Khảo sát trên máy tính ... 8

II.2.3. Khảo sát thực nghiệm ... 8

III. KẾT QỦA-THẢO LUẬN ... 14

III.1. Khai thác dữ liệu ... 14

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

trong bộ dữ liệu ca chứng về ung thư vú ... 17

III.2.2 Chỉ số OR phản ánh tính chất methyl hóa gen APC trên một số phân hạng ... 19

III.3. Kết quả phân tích tổng hợp gen DAPK ... 24

III.3.1 Chỉ số OR và RR phản ánh tính chất methyl hóa gen DAPK trên bộ dữliệu ca chứng về ung thư vú ... 26

III.3.2 Chỉ số OR phản ánh tính chất methyl hóa gen DAPK trên một số phânhạng ... 28

IV. KHÀO SÁT TRÊN MÁY TÍNH ... 33

IV.1. Dữ liệu vùng gen APC và DAPK ... 33

IV.2. Kết quả khảo sát bộ mồi trong quy trình MSP ... 36

IV.3. Kết quả khảo sát tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen APC và DAPK bằng phương pháp Nested-MSP ... 40

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Về tình hình mắc bệnh ung thư vú trên thế giới, ung thư vú đứng vị trí thứ hai trong nhóm bệnh lý ung thư gây tử vong cao ở phụ nữ (World Health Organization – WHO, 2018. Trên thế giới, hàng năm có khoảng 2,1 triệu trường hợp ung thư vú mới được chẩn đoán và trong năm 2018 có 670.000 trường hợp tử vong do mắc ung thư vú (Ghoncheh

et al., 2016; WHO, 2018). Ở Việt Nam vào năm 2018, có khoảng 15.229 trường hợp

ung thư vú mới được phát hiện (WHO, 2018).

Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu về dấu chứng sinh tiềm năng để ứng dụng trong chẩn đoán và tiên lượng sớm đối với các bệnh lý ung thư, cụ thể là là hướng nghiên cứu tính chất methyl hóa bất thường trên vùng promoter các gen kiểm soát cơ chế sinh ung đối với bệnh lý ung thư vú.

Gen Polyposis coli adenomatous (APC) là gen ức chế khối u (Polakis et al, 1997; NCBI, Genomic context). Gen APC mã hóa protein APC, đây là protein tham gia con đường

điều hòa kinh điển, tương tác với β-catenin trong tế bào chất và thúc đẩy sự phosphoryl

hóa β-catenin ức chế khối u (William et al, 2018), đóng vai trị trong q trình thối hóa

protein cat-catenin, kích hoạt Tcf/Lef và gây ra sự sao chép bất thường của các chất gây

ung thư (Fearnhead et al, 2001). Cơng trình nghiên cứu của Begam và cộng sự (2018),

dựa vào phương pháp QMSP (Quantiative Methylation specific Polymerase chain reation) và phương pháp MSP (Methylation-specific PCR), xác định tần số methyl hóa

gen APC là 38% trên tổng số 50 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 0% trên tổng số 45 mẫu

lành ở Ấn Độ.

Gen Death-Associated Protein Kinase (DAPK) thuộc nhóm gen điều hịa chu trình tế bào định vị trên nhiễm sắc thể 9q21.33 (Truong et al., 2014), gồm 30 exon (NCBI).

DAPK là một protein kinase đa chức năng liên quan đến q trình điều hịa apoptosis,

autophagy, membrane blebbing và phản ứng viêm (Huang et al., 2018), đóng vai trò trong việc điều khiển tế bào chất theo chương trình (Truong et al., 2014). Cơng trình nghiên cứu của Yadav và cộng sự (2018), nghiên cứu về sự methyl hóa trên gen DAPK

trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú dựa vào MSP (Methylation-specific PCR) và phương pháp QMSP (Quantiative Methylation specific Polymerase chain reation), xác định tần

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

số methyl hóa bất thường trên gen DAPK là 55% trên 60 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và

0% trên 60 mẫu lành ở Ấn Độ.

Tiếp nối hướng nghiên cứu về dấu chứng sinh học tiềm năng trong tiên lượng, chẩn đốn

sớm một số bệnh ung thư vú chúng tơi tiến hành đề tài khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát

tính chất methyl hóa bất thường trên gen APC và DAPK trên bộ mẫu ung thư vú ở

Việt Nam: phân tích tổng hợp & khảo sát thực nghiệm”. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường (vượt mức) trên vùng

promoter gen APC, DAPK trong bệnh ung thư vú trên thế giới và ở Việt Nam, tập trung

vào nội dung phân tích tổng hợp và khảo sát thực nghiệm bằng phương pháp MSP trên một số mẫu bệnh phẩm (mẫu mô vú) ở người Việt Nam.

Nested-Nội dung nghiên cứu

Phân tích tổng hợp (Meta – analysis): thu thập dữ liệu khoa học trên thế giới và dựa vào công cụ phần mềm phù hợp để xác định chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio: OR) phản ánh

độ chênh của sự xuất hiện tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen APC và DAPK ở bộ mẫu ung thư vú so với ở bộ mẫu lành.

Khảo sát trên máy tính: thu thập và khảo sát bộ mồi phù hợp với phương pháp

Nested-MSP nhằm xác định tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen APC và DAPK trên

bộ mẫu ung thư vú trên bộ mẫu lành.

Khảo sát thực nghiệm: thiết lập quy trình Nested-MSP khảo sát tính chất methyl hóa

trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen APC và DAPK đối với một số mẫu bệnh phẩm

ung thư vú trên người Việt Nam.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

1

I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

I.1. Gen Polyposis Coli Adenomatous (APC)

Hình I.1 Vị trí gen APC trên nhiễm sắc thể số 5

(

Gen Polyposis coli adenomatous (APC) là gen ức chế khối u, định vị trên nhiễm sắc thể số 5 (5q21 – q22) (Polakis et al., 1997), gồm 15 exon (GeneCards, NCBI). Gen

APC mã hóa protein APC (2853 amino acid) tham gia vào con đường truyền tín hiệu

Wnt (con đường kinh điển), giúp duy trì ổn định các vi ống trong kì trung gian và quá trình nguyên phân, kiểm soát sự tăng sinh, biệt hóa, di cư và chu trình chết theo

chương trình (Apoptosis) của tế bào (McCartney et al., 2008). Protein APC trực tiếp

tham gia vào cơ chế điều hòa âm hoạt động của b-catein, liên quan giải phóng q

trình phiên mã Tcf/Lef (McCartney et al., 2008).

I.2. Gen Death-Associated Protein Kinase (DAPK)

Hình I.2 Vị trí gen DAPK trên nhiễm sắc thể số 9

(

Gen Death-Associated Protein Kinase (DAPK) thuộc nhóm gen điều hịa chu trình tế bào, định vị trên nhiễm sắc thể 9q21.33 (Truong et al., 2014), gồm 30 exon (GeneCards, NCBI). DAPK là một protein kinase đa chức năng liên quan đến quá

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

2

trình điều hòa apoptosis, autophagy, membrane blebbing và phản ứng viêm (Huang

et al., 2018), đóng vai trị trong việc điều khiển tế bào chất theo chương trình (Truong et al., 2014).

I.3. Epigenetics và sự methyl hóa vượt mức trên DNA Epigenetics

Epigenetics là những thay đổi ở mức độ biểu hiện kiểu gen mà không làm thay đổi

trình tự DNA (Chen et al., 2014). Epigenetics bao gồm sự methyl hóa DNA, biến đổi histone (H3, H4, H2A và H2B) và microRNAs (miRNAs) (Chen et al., 2014). Trong

tế bào thường, các cơ chế epigenetics đóng vai trò ổn định cấu trúc nhiễm sắc thể và điều hịa q trình sao chép DNA, sửa chữa sai hỏng cấp độ DNA, phiên mã và biểu

hiện gen (Crider et al., 2012).

Một số tác nhân dẫn đến biến đổi bất thường trong cơ chế Epigenetics: yếu tố môi trường: kim loại nặng, thuốc trừ sâu, khí thải động cơ điezen, khói thuốc lá, hydrocarbon dạng vòng thơm; yếu tố nội sinh: nội tiết tố, chất phóng xạ, vi rút và vi

khuẩn … (Weinhold et al., 2006).

Methyl hóa DNA và đảo CpG

Sự methyl hóa DNA là phản ứng hóa học xúc tác bởi enzyme DNA methyltransferases DNMTs tạo thành 5-methlcytosine, gắn nhóm methyl (CH3) vào phân tử cacbon số 5 của cytosine thuộc các cặp dinucleotide CpG (Moore, 2013). Sự

methyl hóa là biến đổi Epigenetics, xảy ra ở động vật có vú (Kulis et al., 2010).

Sự methyl hóa DNA đóng vai trị bất hoạt nhiễm sắc thể X, in dấu gen và hình thành khối u (AKM, Maruf Raza, 2016). Sự methyl hóa DNA bất thường dẫn đến sự hình

thành và diễn tiến của cơ chế sinh ung thư (Crider et al., 2012; MKA et al., 2016).

Sự methyl hóa DNA vượt mức tại vùng khởi đầu của gen ức chế khối u, làm ức chế

quá trình phiên mã và giảm tăng sinh tế bào (Wajed et al., 2001). Sự methyl hóa DNA

dưới mức làm ức chế im lặng trong phiên mã, kiểm soát hoạt động của

protooncogenes và tăng khả năng tăng sinh tế bào (Wajed et al., 2001). Do đó, sự

methy hóa DNA ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển và hoạt động của tế bào (Kulis

et al., 2010).

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

3

Đảo CpG hiện diện trên vùng trình tự promoter thuộc các gen chức năng (gen giữ nhà: “housekeeping gene”), có kích thước khoảng 100-1000bp với tỷ lệ GC lớn hơn

50% (Goldman et al., 2001; Virani et al., 2012). Cơ chế methyl hóa DNA diễn ra trên

các đảo CpG liên quan đến sự điều hòa biểu hiện gen, im lặng gen, in dấu gen, bất

hoạt nhiễm sắc thể X và sự hình thành khối u (Takai et al, 2002). Tính chất methyl

hóa vượt mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen kiểm soát cơ chế sinh ung (tumour suppresor gen) là dấu chứng sinh học đối với các bệnh lý ung thư.

I.4. Dấu chứng sinh học

Dấu chứng sinh học là các phân tử sinh học: protein, acid nucleic (DNA hoặc RNA), polysaccharide hiện diện trong máu, các chất dịch, hoặc các mô, biểu thị đặc trưng tình trạng bình thường hay bất bình thường của cơ thể con người (National Cencar Institute, 2016). Một số dấu chứng sinh học tiềm năng được ứng dụng trong tiên lượng, chẩn đoán và khảo sát đáp ứng điều trị đối với một số bệnh lý ở người: CA-125 (Cancer Antigen-125) đối với ung thư buồng trứng; CEA (Carcinoembryonic antigen) trong ung thư đại trực tràng và CA 15-3 (Cancer Antigen 15-3) trong ung

thư vú (Paczesny et al, 2015; MJ et al., 2017).

I.5. Ung thư vú

Theo Tổ chức y tế thế giới, ung thư vú là loại bệnh lý đứng hàng thứ hai trong những

dạng ung thư gây tử vong cao nhất ở phụ nữ (WHO, 2018; Nguyen et al, 2018). Trên

thế giới, hàng năm có khoảng 2.1 triệu trường hợp ung thư vú mới được chẩn đoán và

trong năm 2018 có 670.000 trường hợp tử vong do mắc ung thư vú (Ghoncheh et al.,

2016; WHO, 2018). WHO ghi nhận ở Việt Nam vào năm 2018, có khoảng 15.229 trường hợp ung thư vú mới được phát hiện (WHO, 2018).

Ung thư vú là dạng ung thư biểu mô, chủ yếu liên quan đến vùng nội mô của tuyến

sữa hoặc tiểu thùy và ống dẫn sữa (Ataollahi et al., 2015). Ung thư vú là một bệnh đa giai đoạn: I, IIA, IIB, III, và IV (Ataollahi et al., 2015), xảy ra ở phần lớn phụ nữ mãn

kinh biểu hiện cao trên thụ thể estrogen (ER). Thụ thể estrogen âm tính với ung thư biểu mơ tuyến vú, đóng vai chính trong phát triển ung thư vú theo hướng (1) các chất chuyển hóa ER có thể làm biến đổi hoặc tạo ra các gốc tự do gây đột biến DNA, (2)

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

4

và ER có thể tăng sinh trong tế bào tiền ung thư và ung thư (Ataollahi et al., 2015).

Các yếu tố dẫn đến ung thư vú: mức độ hormone cao, chế độ ăn uống mất cân bằng

dinh dưỡng,… (Ataollahi et al., 2015).

I.6. Tình hình nghiên cứu tính chất methyl hóa trên gen APC và DAPK đối với

bệnh ung thư vú

Hiện nay, trên thế giới có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp MSP

(Methylation-specific PCR) phân tích tính chất methyl hóa trên gen APC hoặc DAPK

trên bộ mẫu ung thư vú. Các kết quả nghiên cứu này bộc lộ tần số methyl hóa trên

gen APC hoặc DAPK dao động, biến thiên đối với bộ mẫu ung thư vú thuộc quần thể

người bệnh khác nhau.

Tiêu biểu là cơng trình nghiên cứu của Swellam và cộng sự (2015) dựa vào phương

pháp MSP, xác định tần số methyl hóa gen APC là 93,38% trên tổng số 121 mẫu bệnh

phẩm ung thư vú và 0% trên tổng số 66 mẫu lành ở Ai Cập. Theo cơng trình nghiên cứu của Begam và cộng sự (2018) sử dụng phương pháp MSP (Methylation-specific

PCR) xác định tần số methyl hóa gen APC là 38% trên tổng số 50 mẫu bệnh phẩm

ung thư vú và 0% trên tổng số 45 mẫu lành ở Ấn Độ.

Bên cạnh đó, cơng bố khoa học của Xhu và cộng sự (2017) xác định tần số methyl

hóa gen DAPK là 53,33% trên 15 mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở Trung Quốc. Cơng

trình nghiên cứu của Yadav và cộng sự (2018) xác định tần số methyl hóa gen DAPK

là 55% trên 60 mẫu bệnh phẫm ung thư ở Ấn Độ.

I.7. Phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA

− Phương pháp Methylation-specific PCR (MSP) và Nested MSP

Methylation-specific PCR (MSP) là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho

việc methly hóa tại các vị trí bất kỳ trên đảo CpG (Herman et al., 1996). Phương pháp

MSP được thực hiện dựa trên sự biến đổi bisulfite và phản ứng PCR sử dụng 2 cặp mồi: một cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele bị methyl hóa và cặp mồi cịn lại đặc

hiệu với trạng thái allele khơng methyl hóa (Herman et al., 1996).

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

5

Nested - MSP là phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA trên vùng gen mục tiêu, được mô tả bởi Plamisamo và cộng sự vào năm 2000. Nested - MSP được thực hiện dựa trên sự cải tiến của phương pháp MSP, gồm có:

- Phản ứng PCR thứ nhất: sử dụng một cặp mồi khuếch đại phổ quát trình tự DNA mục tiêu ở trạng thái allele bị methyl hóa và trạng thái allele khơng bị methyl hóa. Sản phẩm PCR này là DNA bản mẫu cho hai phản ứng PCR riêng biệt tiếp theo.

- Phản ứng PCR thứ hai và thứ ba lần lượt sử dụng một cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele bị methyl hóa và cặp mồi cịn lại đặc hiệu với trạng thái allele khơng methyl hóa, theo đúng nguyên tắc của phản ứng MSP.

− Phương pháp Bisulfite sequencing PCR

Bisulfite sequencing-PCR (BSP) là phương pháp do Frommer và cộng sự mô tả vào năm 1992. BSP được thực hiện dựa vào phản ứng PCR kết hợp giải trình tự, phản ứng PCR khuếch đại trình tự DNA mục tiêu đã được biến đổi bisulfite bằng một cặp mồi có tính phổ qt cho trạng thái allele bị methyl hóa và trạng thái allele khơng bị

methyl hóa (Frommer et al., 1992).

I.8. Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta-analysis)

Meta-analysis là phương pháp thống kê, cho phép đánh giá ước số chính xác dựa vào

bộ dữ liệu gồm kết quả nghiên cứu độc lập, khác nhau (Crombie et al., 2009; Lee et

al., 2018). Phân tích tổng hợp thường được sử dụng trong những cơng trình nghiên

cứu thực chứng, nhằm tìm hiểu/khảo sát/đánh giá các cơng cụ chẩn đốn hoặc pháp

đồ điều trị lâm sàng hoặc các yếu tố tác động đến tình trạng bệnh lý,.. (Crombie et

al., 2009). Phân tích tổng hợp bao gồm giai đoạn thu thập tài liệu có hệ thống (NCBI,

cơ sở dữ liệu Google scholar); trích suất dữ liệu và phân tích (Rodseth et al., 2016).

❖ Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) gồm các bước tiến hành cơ bản:

- Đặt ra câu hỏi và từ khóa giúp giải quyết các vấn đề phân tích tổng hợp (dựa theo PICO_Participant-Intervention-Comparator-Outcomes).

- Tìm kiếm cơng trình nghiên cứu dựa trên các cơ sở dữ liệu: PubMed/Medline, Google Scholar,…

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

6

- Đọc tóm tắt và tiêu đề của các cơng trình nghiên cứu .

- Chọn lọc cơng trình nghiên cứu và trích dẫn dữ liệu dựa trên phần nội dung cơng trình nghiên cứu .

- Xác định tính chất bất đồng (I2-Index of heterogeneity) trong bộ dữ liệu.

- Đánh giá biến số thông qua phương pháp thống kê với chỉ số tỷ suất chênh Odds ratio (OR), sử dụng mơ hình ảnh hưởng ngẫu nhiên “Ramdom effects model” hay mơ hình ảnh hưởng bất biến “Fixed effects model” và xây dựng đồ thị “forest plot”.

- Xác định tính thiên vị trong đồ thị “Funnel plot”

- Tiến hành phân chia nhóm phân tích và kiểm tra kết quả phân tích tổng hợp.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

7

II. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP II.1. Vật liệu

Chúng tôi sử sụng một số phầm mềm và các công cụ trực tuyến: - Phần mềm Excell

- Phần mềm MedCalc v18

- NCBI ( - Genecard ( - Google (

- BLAST ( - MethPrimer (http://www. urogene.org/methprimer/)

II.2. Phương pháp nghiên cứu

II.2.1. Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp

Chúng tôi tập trung thực hiện các nội dung nghiên cứu như sau:

− Tìm kiếm, thu thập dữ liệu khoa học (Bài báo khoa học) trên nguồn cơ sở dữ liệu của PubMed hoặc PubMed Central (National Center for Biotechnology

Information–NCBI), Google,…với một số từ khóa: APC, DAPK, DNA

methylation, breast cancer,…

− Thực hiện các bước cơ bản trong quy trình phân tích tổng hợp đã đề cập ở nội dung 1.7. Trong bước trích xuất dữ liệu, chúng tơi tập trung các tiêu chí nhằm

khai thác thơng tin về tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen mục tiêu APC,

DAPK đối với bộ mẫu ung thư vú / bộ mẫu lành trên thế giới; phương pháp sinh

học phân tử (MSP, MS-HRM,…) phù hợp để xác định tính chất methyl hóa của

gen DAPK, APC trên quần thể người bệnh ung thư vú cụ thể như sau: - Gen mục tiêu: APC, DAPK

- Số lượng mẫu bệnh phẩm; Số lượng mẫu đối chứng

- Số mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu đối chứng xuất hiện tính chất methyl hóa trên

gen APC, DAPK

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

8

- Tần số xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu APC, DAPK trên bộ

mẫu bệnh phẩm hoặc bộ mẫu đối chứng

- Chỉ số: chỉ số độc hại (Hazard ratio – HR), tỷ suất chênh (Odds ratio – OR),… với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals – Cis).

- Phương pháp nghiên cứu: MSP, MS-HRM,…

- Thông tin mẫu bệnh phẩm: loại mẫu (blood, tissue,…) - Thông tin bệnh nhân: độ tuổi, quốc tịch – chủng tộc.

- Đặc điểm bệnh học ung thư vú: giai đoạn bệnh (stage), phân độ mơ học (grade), kích thước khối u (tumor size),…

- Chỉ số hóa mô miễn dịch: ER, PR, HER/NEU2,…

II.2.2. Khảo sát trên máy tính

Chúng tơi tập trung thu thập trình tự mục tiêu thuộc gen APC (Adenomatous Polyposis Coli) và DAPK (Death-Associated Protein Kinase) gồm có: vùng promoter, vị trí các

đảo CpG,...dựa trên nguồn dữ liệu Genbank (NCBI) và GeneCards. Đồng thời, chúng tôi dựa vào một số công cụ tin sinh học (nội dung II.1) để kiểm tra độ đặc hiệu, vị trí hoạt động, thơng số vật lý của các cặp mồi phù hợp với phương pháp MSP hoặc Nested

MSP trong quy trình phân tích tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen APC, DAPK

đối với bệnh ung thư vú.

II.2.3. Khảo sát thực nghiệm

− Tách chiết DNA bộ gen người

Để thu nhận DNA bộ gen người từ các mẫu bệnh phẩm ung thư vú hoặc mẫu lành, đều ở dạng mẫu mơ đúc paraffin, nội dung chun đề khóa luận áp dụng phương pháp sử dụng xylen để loại bỏ paraffin và phương pháp phenol/chloroform (pH = 8) kết hợp việc sử dụng dung dịch ly giải tế bào (chất tẩy mạnh: SDS kết hợp với proteinase K) để tách chiết DNA bộ gen người từ các mẫu mô.

Thiết bị:

- Máy ly tâm lạnh; Máy vortex. Hóa chất:

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

9

- Xylene; Dung dịch ly giải: SDS 10%, NaCl 5M, Tris HCl 10mM (pH=8,0), EDTA 1M (pH=8), Proteinase K; Phenol bão hòa, Chloroform; Dung dịch Amonium acetate 5M; Ethanol tuyệt đối (99%), Ethanol 70%, Ethanol 50%.

Các bước tiến hành:

- Cắt nhỏ mẫu bệnh phẩm cho vào eppendof loại 1,5 ml.

- Bổ sung 1 ml dung dịch xylen, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vịng/phút trong 2 phút. Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi.

- Bổ sung 1 ml dung dịch ethanol tuyệt đối, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vịng/phút trong 2 phút. Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi.

- Bổ sung 1 ml dung dịch ethanol 70%, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vịng/phút trong 2 phút. Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi.

- Bổ sung 1 ml dung dịch ethanol 50%, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vịng/phút trong 2 phút. Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi. Để khô trong 30 phút.

- Bổ sung một thể tích phù hợp hỗn hợp dung dịch ly giải tế bào (NaCl 5M, Tris-HCl 1M, pH=8; dung dịch đệm EDTA 0,5M, pH=8; SDS 10%, và nước cất hai lần). Bổ sung 10 µl proteinase K (nồng độ 20 ng/ml). Trộn đều hỗn hợp ủ 56℃ trong 24-48 giờ.

- Bổ sung một thể tích (l) phù hợp của dung dịch phenol:chloroform (tỷ lệ 1:1), trộn đều. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút. Chuyển phần dịch nổi phíatrên sang ống eppendorf sạch.

- Bổ sung một luợng dung dịch chloroform với thể tích tương đương với thể tích dịch nổi thu đuợc, trộn nhẹ. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút. Chuyển phần dịch nổi phía trên sangống eppendorf sạch.

- Bổ sung một luợng ammonium acetate (NH4OAc) 5M và một luợng ethanol tuyệt đối theo tỷ lệ 0,2: 2,5 thể tích so với thể tích dịch nổi.

- Trộn đều. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4℃. Loại bỏ phần dịch nổi, thu tủa.

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

10

- Bổ sung một thể tích ethanol 70% trữ lạnh để rửa sạch kết tủa. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4℃. Thu tủa, loại bỏ dịch nổi (dung dịch ethanol). Để khô trong 30 phút.

- Hịa tan kết tủa DNA trong 30-50 µl nuớc cất hai lần vô trùng. Bảo quản DNA ở 4℃ đến -20℃.

❖ Kiểm tra chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ

Nhằm xác định nồng độ, hàm lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA bộ gen sau tách chiết, chuyên đề khóa luận áp dụng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Bởi vì DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm và protein hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 280 nm, do đó:

- Nồng độ DNA được xác định dựa vào độ hấp thụ A260 (Absorbance (OD260)) A260 = OD = 50 µg/ml DNA sợi đôi (Gallagher., 2011).

Công thức xác định nồng độ DNA: C (µg/ml) = 50 x A260 x d

Chú thích: A260: độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm; A280: độ hấp thụ cực đại của protein ở bước sóng 280 nm; d: độ pha loãng.

- Độ tinh sạch của DNA được đánh giá thông qua tỷ lệ A260/A280, dung dịch DNA sạch, khơng nhiễm protein thường có tỷ lệ A260/A280 = 1,8-2.

Thiết bị:

- Máy đo quang phổ và cuvette;

❖ Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite (Bộ kit EZ DNA Methylation-Gold)

- Chuẩn bị dung dịch biến đổi EZ1: Thêm 900 µl dung dịch nước cất 2 lần, 300 µl dung dịch EZ2 và 50 µl dung dịch EZ3 vào ống CT Conversion Reagent, trộn đều trong 10 phút.

- Bổ sung 130 µl dung dịch CT Conversion Reagent (EZ1) vào 20 µl dung dịch DNA đãhút vào eppendorf 250 µl, trộn đều. Sau đó đua vào chu trình ln nhiệt nhu sau: 98℃: 10phút, 64℃: 150 phút, 4℃: ∞.

- Bổ sung 600 µl EZ4 vào cột Zymo-spinTMIC (C1), sau đó thêm dung dịch DNA (đã chạy chu trình nhiệt) vào cột C1, đảo trộn thật đều. Sau đó, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng. Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm.

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

❖ Phản ứng MSP và Nested-MSP

Phương pháp Nested-MSP, gồm ba phản ứng PCR riêng biệt:

- Phản ứng pcr thứ nhất khuếch đại phổ quát vùng trình tự mục tiêu: vùng trình tự

promoter gen APC hoặc DAPK, bao quanh các vị trí “hot spot”. Sản phẩm PCR này

là DNA bản mẫu cho hai phản ứng PCR riêng biệt tiếp theo:

• Phản ứng PCR thứ hai sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho trạng thái DNA bị methyl hóa (Methylation: M);

• Phản ứng PCR thứ ba sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho trạng thái DNA khơng bị methyl hóa (Unmethylation: U);

Thiết bị: - Máy PCR Hóa chất:

- Thành phần phản ứng PCR: Master mix 2X (Bioline); Các cặp mồi; Nước cất hai lần, mẫu DNA.

Tất cả phản ứng PCR trong quy trình Nested MSP được thực hiện với tổng thể tích 50 μl. Thành phần phản ứng PCR và chương trình luân nhiệt được thể hiện trong Bảng II.1 và hình II.2.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Hình II.1 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Nested-MSP

Chú thích: Ta (Temperature annealing): nhiệt độ lai tối ưu với từng cặp mồi trong quy trình Nested-

MSP; x: số chu trình luân nhiệt; NC (Number of cycle): số chu kì.

❖ Phương pháp điện di

Nhằm xác định sản phẩm phản ứng MSP/Nested-MSP, chúng tôi thực hiện phương pháp điện di DNA trong bản gel agarose. Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào tính chất nucleic acid (DNA) tích điện âm, vì vậy DNA có khả năng di chuyển về phía cực dương trong điện trường. Tốc độ di chuyển của DNA phụ thuộc vào khối lượng và cấu trúc, sự tích điện của phân tử DNA. Sự hiện diện của các phân tử nucleic acid (DNA) trong gel agarose được phát hiện dưới tác động của tia tử ngoại (UV) và chất nhuộm GelRed. Kích thước của các phân tử DNA nucleic acid được xác định dựa vào kích thước đã biết trước của thang chuẩn 50 bp.

Thiết bị:

- Buồng điện di, khn gel, hệ thống đọc gel (Gel Doc, Biorad). Hố chất:

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

13 - Chất nhuộm GelRedTM, dung dịch nạp mẫu (6X GelRedTM loading buffer with

- Bên cạnh đó, dự kiến chọn lọc sản phẩm Nested-MSP dương với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele methyl hóa hoặc allele khơng bị methyl hóa để gửi giải trình tự nhằm kiểm tra, khẳng định hiệu quả của quy trình Nested-MSP trong việc phân tích tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu liên quan đến bệnh ung thư vú, đối với một số mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở người Việt Nam.

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Bộ dữ liệu gen APC 43 11 32 9 23 4 19 3 16

Bộ dữ liệu gen DAPK 35 7 28 8 20 5 15 1 14

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

15

Dựa vào các cơ sở dữ liệu của National Center for Biotechnology Information – NCBI (PubMed, PubMed Central,…), Google scholar, Google,…và sử dụng các từ khóa:

DAPK, APC, DNA methylation, breast cancer,…được cập nhật đến tháng 3 năm 2019,

chúng tơi chọn lọc được bộ dữ liệu cơng trình nghiên cứu liên quan đến tính chất methyl

hóa vùng promoter gen APC, DAPK (tính chất methyl hóa gen APC, DAPK):

− Bộ dữ liệu gồm 16 công bố khoa học ca chứng (Case control) về tính chất methyl

hóa gen APC trên bệnh ung thư vú (bảng III.1);

− Bộ dữ liệu 14 công bố khoa học ca chứng (Case control) về tính chất methyl hóa

gen DAPK trên bệnh ung thư vú (bảng III.3);

Trên hình III.1 mơ tả quy trình chọn lọc các cơng bố khoa học để đưa vào phân tích tổng hợp, dựa theo các tiêu chí trích xuất dữ liệu. Các phương pháp phân tích tổng hợp được thực hiện theo mơ hình phân tích ảnh hưởng cố định hay bất biến (Fixed, F) hoặc mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random, R) với khoảng tin cậy 95%CI (CI: > = 1: và/hoặc xấp xỉ 1), dựa vào tính chất đồng nhất hoặc bất đồng nhất của bộ dữ liệu.

III.2. Kết quả phân tích tổng hợp gen APC

Trong bộ dữ liệu gồm 16 nghiên cứu khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên

gen APC, tổng số mẫu ung thư vú là 998 mẫu (616 mẫu mô, 382 mẫu máu) và tổng số

mẫu lành 642 mẫu (159 mẫu máu, 483 mẫu mô), thông tin chi tiết thể hiện ở bảng III.1. Từ đó, chúng tơi chọn lọc bộ dữ liệu (13 công bố khoa học) đưa vào phân tích chỉ số

OR, để phản ánh độ chênh của tính chất methyl hóa trên gen APC xuất hiện ở bộ mẫu

bệnh phẩm ung thư vú và bộ mẫu lành và chỉ số RR phản ánh nguy cơ mắc ung thư vú

đối với các trường hợp có sự xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen APC.

Bộ dữ liệu đưa vào phân tích chỉ số OR tổng số và RR tổng số thể hiện tính bất đồng

nhất về tần số tính chất methyl hóa trên gen APC lần lượt với giá trị I2 = 80,99% và I2 = 84,66%. Từ đó, việc phân tích chỉ số OR và RR theo mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model, R) với khoảng tin cậy 95% CI, kết quả được trình bày trong hình III.2 và III.3.

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

16

Công bố khoa học

Phương pháp

Loại mẫu bệnh

Mẫu bệnh ung thư

Mẫu methyl hóa

Tổng

mẫu methyl hóa Mẫu

Tổng mẫu

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

17

III.2.1 Chỉ số OR và RR tổng số phản ánh tính chất methyl hóa trên gen APC

trong bộ dữ liệu ca chứng về ung thư vú

Trên bộ dữ liệu gồm 13 nghiên cứu khoa học ca chứng, chỉ số OR tổng số phản ánh độ

chênh của tính chất methyl hóa trên gen APC xuất hiện ở bộ mẫu bệnh phẩm ung thư vú

và bộ mẫu lành với giá trị OR = 21,357 (95%CI = 5,641 – 80,806; P <0,001; mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên-R). Kết quả nghiên cứu này phản ánh sự tương quan

chặt giữa tính chất methyl hóa gen APC và bệnh ung thư vú là 21,351 lần so với trạng

thái khơng mắc bệnh. Kết quả được trình bày trong hình III.2 và hình III.3.

Hình III.2 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số tỷ suất chênh (OR) của tính chất methyl hóa trên gen APC trong bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành dựa vào 13 công

bố khoa học ca chứng

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

18

Hình III.3 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số tỷ suất chênh (OR) của bộ dữ liệu 13 cơng bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen APC

Đồng thời, chỉ số RR phản ánh nguy cơ mắc ung thư vú đối với các trường hợp có sự

xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen APC với giá trị RR = 10,731 (95%CI = 3,083 –

37,348; P<0,001; mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên-R). Dữ liệu này phản ánh nguy cơ mắc bệnh ung thư vú cao gấp 10,731 lần khi có tính chất methyl hóa xuất hiện

bất thường trên vùng gen APC. Kết quả được trình bày trong hình III.4 và hình III.5.

Hình III. 4 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số nguy cơ (RR) của tính chất methyl hóa trên gen APC trong bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành dựa vào 13 công bố

khoa học ca chứng

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

19

Hình III.5 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số nguy cơ (RR) của bộ dữ liệu 13 công bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen APC III.2.2 Chỉ số OR phản ánh tính chất methyl hóa gen APC trên một số phân hạng

Đồ thị “Funnel plot” ở hình III.2 và III.3 thể hiện tính thiên vị (Publication bias) trong bộ dữ liệu 13 công bố khoa học trên bệnh phẩm ung thư vú. Do đó, chúng tơi tiến hành

khảo sát chỉ số tỷ suất chênh (OR) về sự xuất hiện tính chất methyl hóa gen APC giữa

bộ mẫu bệnh ung thư vú và bộ mẫu lành, xét trên các phân hạng: phương pháp phân tích tính chất methyl hóa; loại mẫu bệnh phẩm; chủng tộc/quần thể người bệnh và các đặc điểm bệnh học của từng loại bệnh ung thư :

- Độ tuổi: độ tuổi cao – độ tuổi sớm;

- Giai đoạn bệnh : giai đoạn muộn – giai đoạn sớm; - Phân độ mô học: phân độ cao – phân độ thấp; - Biểu hiện u lympho: có – khơng ,...

Kết quả phân tích chỉ số tỷ suất chênh (OR) xác định mối tương quan giữa tính chất

methyl hóa gen APC đối với bệnh ung thư vú trên các phân hạng: phương pháp phân

tích tính chất methyl hóa; loại mẫu bệnh phẩm; chủng tộc/quần thể người bệnh;...được trình bày ở Bảng III.2.

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

20

❖ Xét yếu tố loại mẫu

Chỉ số tỷ suất chênh (OR) phản ánh độ chênh của tính chất methyl hóa trên gen APC

xuất hiện ở bộ mẫu bệnh phẩm ung thư vú và bộ mẫu lành, xét ở nhóm mẫu mơ và mẫu máu lần lượt là OR = 4,590 (95%CI = 1,591 – 13,239; P = 0,005; theo mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên-R); OR = 50,953 (95%CI = 6,047 – 429,341; P <0,001; theo mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên-R).

Kết quả phân tích cho thấy ở các loại mẫu mô và loại mẫu máu, độ chênh về sự xuất

hiện tính chất methyl hóa trên gen APC giữa bộ mẫu mẫu bệnh và bộ mẫu lành là 4,590

lần và 50,953 lần. Kết quả nghiên cứu phản ánh tính phù hợp của hướng nghiên cứu phát triển cơng cụ tiên lượng, chần đốn sớm bệnh ung thư thơng qua tính chất methyl

hóa trên gen APC theo dạng xâm lấn: sử dụng mẫu mô hoặc dạng không xâm lấn: sử

dụng mẫu máu ngoại vi trong bệnh ung thư máu. Đây là cơ sở để chúng tơi có thể sử dụng các loại mẫu mơ vú của các bệnh nhân mắc bệnh ung thư vú hoặc người khỏe mạnh ở Việt Nam.

❖ Xét yếu tố phương pháp

Trong 16 công bố khoa học, có 9 cơng bố khoa học sử dụng phương pháp MSP, 5 công bố khoa học sử dụng phương pháp QMSP và 2 công bố sử dụng phương khác (MS-HRM và MS-MLPA). Chỉ số tỷ suất chênh (OR) phản ánh độ chênh về sự xuất hiện tính

chất methyl hóa trên gen APC giữa bộ mẫu mẫu bệnh và bộ mẫu lành khi được phân

tích bởi phương pháp MSP là OR = 22,538 (95%CI = 3,189 – 159,291; P = 0,002; theo mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên-R) và phương pháp QMSP là OR = 2,300 (95%CI = 1,376 – 3,842; P = 0,001; theo mô hình phân tích ảnh hưởng bất biến-F). Dựa vào các kết quả nêu trên cho thấy bên cạnh các phương pháp cải tiến (QMSP), phương

pháp MSP là phương pháp hữu hiệu, phổ biến để xác định tính chất methyl hóa gen APC

đối với bệnh phẩm ung thư vú.

❖ Xét yếu tố chủng tộc

Chỉ số tỷ suất chênh (OR) phản ánh độ chênh về sự xuất hiện tính chất methyl hóa trên

gen APC giữa bộ mẫu bệnh và bộ mẫu lành có chiều hướng giảm dần khi xét trên chủng

tộc (quần thể) người châu Á, châu Âu, châu Phi, châu Mỹ và châu lục khác lần lượt là

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

21

OR = 19,607 (95%CI = 2,478 – 155,114; P = 0,005; theo mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên-R); OR = 7,555 (95%CI = 2,057 – 27,747; P = 0,002; theo mơ hình phân tích ảnh hưởng bất biến-F); OR = 49,530 (95%CI = 0,369 – 6653,136; P = 0,119; theo mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên- R); OR = 1,766 (95%CI = 1,034 – 3,018; P = 0,037; theo mơ hình phân tích ảnh hưởng bất biến-F); OR = 295,06 (95%CI = 1,7072 – 509,9478; P = 0,0119).

Kết quả phân tích thể hiện rõ giá trị chỉ số OR phản ánh độ chênh có ý nghĩa thống kê

về tính chất methyl hóa gen APC xuất hiện ở bộ mẫu bệnh ung thư vú so với bộ mẫu

bệnh lành ở chủng tộc châu Á là 19,607 lần, châu Âu là 7,555 lần, châu Phi là 49,530 lần, châu Mỹ là 1,766 lần và châu lục khác là 295,06 lần. Các kết quả nêu trên biểu thị

tính tương quan chặt giữa tính chất methyl hóa gen APC và bệnh lý ung thư vú trên các

chủng tộc trên thế giới, nhất là ở khu vực châu Á và châu Phi. Nhận định này biểu thị ý nghĩa thực tiễn trong hướng nghiên cứu thiết lập dấu chứng sinh học tiềm năng trong tiên đoán và chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú – dựa vào sự xuất hiện tính chất methyl

hóa gen APC ở các quốc gia thuộc châu Á, châu Âu, châu Phi, châu Mỹ và các châu lục

khác, cụ thể là ở Việt Nam.

❖ Xét một số phân hạng về đặc điểm bệnh học ung thư vú

Chọn lọc các phân hạng so sánh về độ tuổi của bệnh nhân ung thư vú (độ tuổi muộn so với độ tuổi sớm), một số đặc điểm bệnh học ung thư vú: giai đoạn bệnh muộn (III và IV) so với giai đoạn bệnh sớm (I và II); phân độ mô học cao so với phân độ mô học thấp biểu hiện có u lympho so với biểu hiện khơng có u lympho, chỉ số tỷ suất chênh (OR) được xác định trên các phân hạng này. Kết quả phân tích thể hiện ở bảng III.2. Kết quả phân tích cho thấy chỉ số tỷ suất chênh (OR) phản ánh độ chênh về sự xuất hiện tính

chất methyl hóa trên gen APC giữa các nhóm phân hạng so sánh có giá trị dao động

trong khoảng OR = 1 - 2 và giá trị P >0,05. Đây là một sự hạn chế trong q trình phân tích tổng hợp – do bởi hồn tồn phụ thuộc vào dữ liệu về tính chất methyl hóa trên gen

APC có hoặc khơng được mơ tả cụ thể trong từng công bố khoa học ca chứng nêu trên.

Đây là thách thức để nhóm nghiên cứu cần cập nhật dữ liệu và tiến hành phân tích tổng hợp để làm rõ nét hơn về sự tương quan giữa sự xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen

APC và bệnh lý ung thư vú – xét ở các phân hạng bệnh học, từ đó có thể khẳng định

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

22

được vai trò của hiện tính chất methyl hóa bất thường trên gen APC là dấu chứng sinh

học tiềm năng trong tiên lượng và chẩn đoán bệnh ung thư vú.

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

23

Phân tích ảnh hưởng Tính bất đồng nhất Chỉ số N OR (95%CI) Z P Mơ hình PHI2(%) Tổng mẫu 16 21,351 [5,641 – 80,806] 4,508 <0,001 R <0,001 80,99

</div>