khảo sát khả năng đối kháng với một số vi khuẩn sinh carbapenemase từ bộ sưu tập vi sinh vật nội sinh cây dược liệu

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.62 MB, 147 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: Th.S Dương Nhật Linh SVTH: Nguyễn Thị Thanh Tú MSSV: 1253012455

Khóa: 2012 - 2016

Tp. Hồ Chí Minh, tháng ….. năm ….

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: Th.S Dương Nhật Linh SVTH: Nguyễn Thị Thanh Tú MSSV: 1253012455

Khóa: 2012 – 2016 GVHD ký xác nhận:

Tp. Hồ Chí Minh, tháng ….. năm ….

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CẢM ƠN

Khoảng thời gian tại phòng thí nghiệm vi sinh, là khoảng thời gian tơi sẽ không bao giờ quên. Nơi đã cho tôi thật nhiều kiến thức và những kỷ niệm đẹp. Đề tài được thực hiện với sự giúp đỡ của rất nhiều người dù trực tiếp hay gián tiếp. Tôi xin được gởi lời cảm ơn chân thành thành đến tất cả những người đã giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này.

Đầu tiên cho phép em được gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc tới cô Dương Nhật Linh và thầy Nguyễn Văn Minh. Thầy, cô không chỉ truyền đạt những kiến thức quý báu mà còn dạy em những bài học trong cuộc sống, giúp em hoàn thiện nhân cách cũng như tri thức.

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý thầy cô ở Khoa Công nghệ sinh học nói chung và các thầy cơ trong tổ chun ngành Vi sinh – Sinh học phân tử nói riêng đã truyền đạt cho em vốn kiến thức quý báu.

Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, chị Trần Thị Á Ni đã luôn bên cạnh, chia sẻ vui buồn, giúp em tìm ra cách giải quyết những vấn đề, những khó khăn gặp phải trong quá trình làm đề tài.

Bên cạnh đó, xin gởi lời cảm ơn đến các anh/ chị, các bạn và các em ở phịng thí nghiệm đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Cuối cùng, con xin gởi lời cảm đến ba mẹ, anh, chị đã dạy dỗ, yêu thương, nuôi nấng con khôn lớn như ngày hơm nay. Gia đình là chỗ dựa tinh thần giúp con vượt qua những khó khăn trong cuộc sống.

Em xin chúc quý thầy cô dồi dào sức khỏe, gặt hái nhiều thành cơng.

Bình Dương, tháng 5 năm 2016

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ... IDANH MỤC HÌNH ẢNH ... VDANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ ... VIIDANH MỤC BẢNG ... VIIIDANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ... IXDANH MỤC PHỤ LỤC ... XIĐẶT VẤN ĐỀ ... XII

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 1

1.1.CÂYDƯỢCLIỆU ... 2

1.1.1. Cây trầu không ... 2

1.1.2. Cây sâm đại hành ... 4

1.1.3. Cây khổ qua ... 5

1.1.4. Cây neem ... 6

1.1.5. Cây rau diếp cá ... 8

1.1.6. Cây vối ... 10

1.1.7. Cây đinh lăng ... 12

1.2.VISINHVẬTNỘISINHCÂYDƯỢCLIỆU ... 14

1.2.1. Vi sinh vật nội sinh ... 14

1.2.2. Phân loại vi sinh vật nội sinh ... 16

1.2.3. Tình hình nghiên cứu ... 16

1.3.VIKHUẨNKHÁ NGTHUỐCSINHENZYMCARBAPENEMASE ... 18

1.3.1. Enzym carbapenemase ... 18

1.3.2. Đối tượng nghiên cứu ... 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ... 27

2.1.VẬTLIỆU ... 28

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ... 28

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ... 28

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, môi trường ... 28

2.2.PHƯƠNGPHÁ PNGHIÊNCỨU ... 29

2.2.1. Bố trí thí nghiệm ... 29

2.2.2. Quy trình phân lập vi sinh vật nội sinh ... 29

2.2.3. Quy trình tái kiểm tra vi khuẩn sinh carbapenemase ... 33

2.2.4. Thử nghiệm khả năng đối kháng của các chủng vi sinh nội sinh từ cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase ... 34

2.2.5. Định danh các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp truyền thống ... 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 46

3.1.KẾTQUẢPHÂNLẬPVISINHVẬTNỘISINH ... 47

3.1.1. Kết quả giám định tên khoa học cây dược liệu ... 47

3.1.2. Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh ... 47

3.1.3. Kết quả phân lập vi nấm nội sinh ... 49

3.2.TÁ IKIỂMTRAVIKHUẨNSINHCARBAPENEMASE ... 51

3.2.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁ T KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁ NG CỦA CHỦNG VI SINH VẬT NỘI SINH CÂY DƯỢC LIỆU VỚI VI KHUẨN SINH CARBAPENEMASE ... 52

3.2.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase ... 52

3.2.3. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase ... 58

3.3.KẾTQUẢKHẢOSÁ TKHẢNĂNGĐỐIKHÁ NGCỦACHỦNGVINẤMNỘISINHCÂYDƯỢCLIỆUVỚIVIKHUẨNSINHCARBAPENEMASE... 60

3.4.KẾTQUẢĐỊNHDANHMỘTSỐCHỦNGVIKHUẨNNỘISINHCĨHOẠTTÍNHKHÁ NGVIKHUẨNSINHENZYMCARBAPENEMASE ... 61

3.5.THẢOLUẬN ... 64

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. 1: Cây trầu khơng ... 3

Hình 1. 2: Cây sâm đại hành ... 4

Hình 1. 3: Cây khổ qua ... 5

Hình 1. 4: Cây neem ... 7

Hình 1. 5: Đặc điểm hình thái cây rau diếp cá ... 9

Hình 1. 6: Cây vối ... 11

Hình 1. 7: Cây đinh lăng ... 13

Hình 1. 8: Hình thái khuẩn lạc Acinetobacter spp. ... 19

Hình 1. 9: Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn Escherichia coli ... 21

Hình 1. 10: Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn Klebsiella spp. ... 23

Hình 1. 11: Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn P.aeruginosa ... 25

Hình 1. 12: Hình thái khuẩn lạc P. aeruginosa trên mơi trường MacConkey ... 25

Hình 2. 1: Kết quả vòng kháng khuẩn gây bệnh ... 37

Hình 3. 1: Phân lập vi khuẩn nội sinh cây Đinh Lăng trên đĩa TSA ... 48

Hình 3. 2: Kết quả khảo sát đại thể và vi thể của vi khuẩn nội sinh ... 49

Hình 3. 3: Kết quả khảo sát đại thể và vi thể của vi khuẩn QL7 nội sinh ... 49

Hình 3. 4: Kết quả phân lập vi nấm nội sinh trên PDA ... 50

Hình 3. 5: Kết quả khảo sát đại thể chủng nấm SN7 nội sinh cây Sâm Đại Hành .. 50

Hình 3. 6: Kết quả khảo sát đại thể, vi thể chủng vi khuẩn kháng thuốc sinh enzym carbapenemase ... 51

Hình 3. 7: Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc sinh carbapenemase của chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu 41a, 115e ... 57

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Hình 3. 8: Kết quả đối kháng của dịch lọc vi khuẩn đối với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase ... 60Hình 3. 9: Kết quả đối kháng (âm tính) của vi nấm nội sinh với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase ... 61

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

Sơ đồ 2. 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ... 29Sơ đồ 2. 2: Quy trình khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn nội sinh cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase ... 34

Biểu đồ 3. 1: Số lượng các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn sinh enzym carbapenemae ... 52

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3. 1: Kết quả giám định tên khoa học cây dược liệu ... 47Bảng 3. 2: Kết quả số lượng chủng vi khuẩn nội sinh ... 48Bảng 3. 3: Kết quả định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn nội sinh ... 62

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ATCC Ngân hàng chủng vi sinh vật quốc gia Mĩ

CDC Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh Mĩ

CLSI Viện tiêu chuẩn lâm sàng và thí nghiệm

EIEC Nhóm E. coli xâm nhập ruột

EPEC Nhóm E. coli gây bệnh

ESBL β - lactamase phổ rộng

ETEC Nhóm E. coli gây độc

GARP Đối tác toàn cầu về vấn đề kháng kháng sinh IAA Acid indol acetic

KIA Môi trường Kligler Iron Agar

KPC Carbapenemase của Klebsiella pneumoniae

MC Môi trường MacConkey

MHA Môi trường Mueller Hinton Agar MHT Thử nghiệm Hodge test biến đổi

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

MRSA Chủng S. aureus kháng Methicilin

NA Môi trường thạch dinh dưỡng cơ bản Nutrient Agar NB Môi trường canh dinh dưỡng cơ bản Nutrient Broth NCBI Trung tâm tin-sinh học quốc gia Mĩ

TSI Môi trường Triple Sugar Iron

WHO Tổ chức y tế thế giới

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

DANH MỤC PHỤ LỤC

Hình P. 1: Các kết quả test sinh hố tiêu biểu ... 120Hình P. 2: Kết quả xử lý thống kê ANOVA 1 yếu tố về khả năng kháng vi khuẩn sinh enzym carbapenemase của vi khuẩn cây dược liệu bằng phần mềm Statgraphic 3.0 ... 124 Bảng P. 1: Kết quả quan sát đại thể và vi thể của các chủng vi khuẩn nội sinh cây dược liệu ... 78

Bảng P. 2: Kết quả quan sát đại thể của các chủng vi nấm nội sinh các cây dược liệu

... 97Bảng P. 3: Kết quả quan sát đại thể, vi thể chủng vi khuẩn sinh enzym carbapenemase ... 101

Bảng P. 4: Kết quả khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược

liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenema ... 102Bảng P. 5: Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi nấm nội sinh cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase ... 113Bảng P. 6: Kết quả đường kính vịng vơ khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase (mm) ... 115

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kể từ khi được tìm ra, kháng sinh đã như được xem là “thần dược” giúp con người chống lại các bệnh nhiễm trùng vốn đã cướp đi nhiều mạng sống và để lại những hậu quả nặng nề cho người bệnh. Tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh đã gây ra hiểm hoạ đề kháng kháng sinh thậm chí là đề kháng đa kháng sinh, làm các kháng sinh trở nên vô tác dụng. Hiện tượng kháng kháng sinh đang là mối quan ngại toàn cầu khi việc điều trị các chủng vi sinh vật này trở nên phức tạp hơn, gây nhiều nguy hiểm hơn tới người bệnh và cộng đồng khi các người bệnh không đáp ứng trước các phương pháp chữa trị thơng thường và có khả năng lây truyền các chủng vi khuẩn kháng thuốc trên cho cộng đồng (WHO, 2014).

Trong các loại kháng sinh, nhóm Carbapenem là nhóm kháng sinh mạnh nhất thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” được sử dụng để điều trị cho các trường hợp bị nhiễm khuẩn bệnh viện nặng (GARP-Vietnam, 2010). Chính vì vậy, sự xuất hiện của các chủng có khả năng kháng Carbapenem thực sự là một mối đe doạ nghiêm trọng, thách thức y học trong thời điểm này, và đang có chiều hướng trở nên tồi tệ hơn (WHO, 2014). Theo trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Mỹ (CDC) 2015, riêng Mỹ và châu Âu hằng năm có khoảng 50.000 người chết vì nhiễm trùng mà khơng có thuốc chữa. Năm 2050, con số sẽ tăng lên đến 10 triệu ca với tốc độ kháng kháng sinh phát triển như hiện nay. Trong cuộc chiến chống đề kháng kháng sinh, con người hiện giờ đã hết cách, bằng chứng là: khơng có một loại nhóm kháng sinh mới nào được phát hiện thành cơng kể từ năm 1987, trong khi đó sự lây lây lan của các chủng đa kháng thuốc như vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (CRE) ngày càng lan rộng và diễn biến khó lường (Patel và cs, 2013).

Bên cạnh các hoạt chất dược tính đã được nhiều nghiên cứu tìm ra, các vi sinh vật nội sinh trong cây dược liệu đã được chứng minh có tác dụng kháng khuẩn kháng nấm, có tiềm năng ứng dụng to lớn để tạo ra kháng sinh mới, hiệu quả để chữa trị các ca bệnh nhiễm trùng trong bối cảnh nguy cấp do sự lan tràn vi khuẩn kháng thuốc gây ra. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nhiều loại vi sinh vật nội

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

sinh từ các cây dược liệu trên có tiềm năng ứng dụng làm các sản phẩm kháng sinh mới trong bối cảnh sự xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc càng nhiều (Christina và cs, 2013). Bên cạnh đó, một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, vi khuẩn nội sinh cây dược liệu có khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn chất kháng khuẩn, kháng nấm có tiềm năng quan trọng dùng cho việc phịng trị các loại vi nấm và vi khuẩn gây bệnh (Ryan và cs, 2008). Do đó, việc sử dụng các bài thuốc từ thực vật để chữa bệnh, đặc biệt là bệnh nhiễm trùng đang phổ biến trở lại và được kỳ vọng sẽ giúp đương đầu hiệu quả hơn với hiểm hoạ đề kháng kháng sinh tràn lan hiện nay. Với những công dụng và tiềm năng đã được đề cập ở trên, các cây dược liệu và đặc biệt là hệ vi sinh vật nội sinh cây dược liệu nên được tập trung nghiên cứu nhằm đưa ra nhiều loại kháng sinh hơn, thân thiện hơn cho các vấn đề sức khoẻ của con người và động vật và tiềm năng kháng sinh để đối phó với các vi khuẩn sinh enzym carbapenemase là một trong các vấn đề rất cần được nghiên cứu. Chính vì sự cần

thiết và ý nghĩa thực tiễn đã nêu ở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng đối kháng với một số vi khuẩn sinh carbapenemase từ bộ sưu tập vi sinh vật nội sinh cây dược liệu”.

❖ Mục tiêu

Xác định khả năng đối kháng sinh học của một số vi sinh vật nội sinh cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase.

❖ Nội dung thực hiện bao gồm

- Phân lập vi sinh vật nội sinh cây dược liệu

- Tái kiểm tra các chủng vi khuẩn sinh enzym carbapenemase.

- Thử nghiệm đối kháng của các chủng vi sinh vật nội sinh với chủng vi khuẩn sinh enzym carbapenemase.

+ Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn nội sinh với chủng vi khuẩn sinh enzym carbapenemase.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

+ Khảo sát khả năng đối kháng của vi nấm nội sinh với chủng vi khuẩn sinh enzym carbapenemase.

- Định danh một chủng vi sinh vật có hoạt tính.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

1.1. CÂY DƯỢC LIỆU

Trên trái đất, số lượng loài thực vật bậc cao chiếm khoảng 250.000 lồi, trong đó cây dược liệu chiếm khoảng 35.000 – 70.000 loài và chúng được sử dụng với những mục đích khác nhau tuỳ thuộc vào từng vùng văn hoá khác nhau.

Cây dược liệu là một phần quan trọng trong nền y học truyền thống của nhiều nước. Cây dược liệu được sử dụng hỗ trợ chăm sóc sức khoẻ và y học cách đây vài nghìn năm (Schulz, 2006). Nhiều cây dược liệu được sử dụng trong đối kháng nấm, kháng khuẩn và điều trị một loạt các bệnh nhiễm trùng (Mongalo và cs, 2013).

Theo Tổ chức y tế thế giới, cây dược liệu sẽ là nguồn tốt nhất để thu nhận các hợp chất dược liệu đa dạng (WHO, 1999). Các nhà nghiên cứu đã chứng minh được một số hợp chất được sử dụng trong nền y học hiện đại có nguồn gốc từ thực vật (Fabricant và cs, 2001). Tổ chức Y tế thế giới ghi nhận rằng khoảng 75-80% dân số thế giới sử dụng thảo dược trong điều trị do cây dược liệu hấp thụ tốt trong cơ thể con người và ít gây ra tác dụng phụ (Jayaraj, 2010). Cây dược liệu hiện nay còn được sử dụng để điều trị một số bệnh như: chống nhiễm khuẩn, bệnh tiểu đường, cao cholesterol và viêm nhiễm (Fabricant và cs, 2001).

1.1.1. Cây trầu không

Phân loại thực vật học (Đỗ Tất Lợi, 2004) + Tên khoa học: Piper betle L.

+ Tên khác: Trầu, Thược Tương, Hruề Êhang (Buôn Mê Thuột) + Vị trí phân loại cây trầu khơng: Piper betle L.(Pradhan, 2013)

Giới: Plantae Bộ: Piperales Họ: Piperaceae Chi: Piper

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Lồi: P.betle

Hình 1. 1: Cây trầu không

(www.suckhoevadoisong.vn) Công dụng và dược tính

Trong nghiên cứu của Nalina và Rahim, dịch chiết thơ của lá trầu Malaysia có

tác động lên vi khuẩn gây sâu răng trong khoang miệng người là Streptococcus

mutans (Nalina và cs, 2006; Nalina và cs, 2007). Dịch chiết lá có tác dụng ức chế sự

phát triển của trực khuẩn lao in vitro trong thử nghiệm pha loãng với nồng độ ức chế

thấp nhất 1 : 5000 (Suppakul và cs, 2006).

Ở Việt Nam, trầu khơng cịn được dùng chữa hàn thấp nhức mỏi, đau bụng đầy hơi, vết thương nhiễm trùng có mủ sưng đau, hen suyễn khi thời tiết thay đổi, đờm nhiều khó thở, cảm mạo, bỏng, mụn nhọt, hắc lào, mề đay, ghẻ ngứa, sâu kiến đốt, viêm quanh răng, viêm tai, viêm họng. Một số bệnh viện nước ta dùng cao nước trầu không thí nghiệm điều trị bệnh viêm cận răng (Đỗ Tất Lợi, 2004).

Ngồi ra, trầu khơng có khả năng chống oxy hóa, chống ung thư (Singh và cs, 2009).

Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng

Năm 2014, Bintang và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn nội sinh BS1

từ lá trầu khơng có khả năng chống lại một số vi khuẩn gây bệnh như: E. coli, B.

cereus và S. aureus, trong đó chủng BS1 có tác động ức chế lớn nhất đối với S. aureus

và phân tích trình tự 16S rRNA cho thấy chủng vi khuẩn BS1 tương đồng 98 % với

Pseudomonas sp. (Bintang và cs, 2014).

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

1.1.2. Cây sâm đại hành

Phân loại thực vật (Đỗ Tất Lợi, 2004)

+ Tên khoa học: Eleutherine Subaphylla gagnep, họ Lay ơn (Iridaceae).

+ Tên khác: tỏi Lào, hành đỏ, tỏi mọi, kiệu đỏ, phong nhan, hom búa lượt (Thái). + Vị trí phân loại cây sâm đại hành (Eleutherine Subaphylla gagnep)

Giới: Plantae Phân lớp: Liliidae Bộ: Asparagales Họ: Iridaceae Chi: Eleutherin

Lồi: Eleutherine Subaphylla gagnep

Hình 1. 2: Cây sâm đại hành

(www.soha.vn) Công dụng và dược tính

Dịch chiết củ sâm đại hành có tác dụng kháng khuẩn, chống viêm cấp và mãn tính, khơng có độc tính, khơng ảnh hưởng đến thành phần máu và chức năng gan, thận, làm tăng hồng cầu và huyết sắc tố, an thần, chữa thiếu máu, vàng da, phụ nữ kinh nguyệt không đều, đầu váng, mắt hoa, nhức đầu, mệt mỏi và mất ngủ. Sâm đại

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

hành có các chất kháng sinh chính là Eleutherin, Isoeleutherin và Eleuthenol có tác dụng kháng khuẩn (Trương Minh Lương và cs, 2006).

Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng

Người ta đã tìm thấy các chất trong củ, thân sâm đại hành như Eleutherin, Isoeleuthrin, Eleutherola có tác dụng kháng khuẩn mạnh (Schmid, 1957). Dịch chiết

toàn phần củ sâm đại hành có tác dụng ức chế rõ rệt in vitro đối với phế cầu khuẩn, liên cầu tan máu, tụ cầu vàng, tác dụng yếu với Shigella flexneri, S. dysenteriae, B.

Lồi: M. charantia

Hình 1. 3: Cây khổ qua

(www.blogcaycanh.vn) Cơng dụng và dược tính

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

Quả khổ qua được dùng làm thuốc mát, chữa ho, sốt, đái rắt, đái buốt, bệnh phù thũng do gan nhiệt, chữa đái tháo đường, dùng tắm cho trẻ trừ rôm sảy, chữa nhọt độc sưng tấy, các vết thương nhiễm độc, chữa đau dạ dày.

Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng

Nghiên cứu in vitro cho thấy dịch chiết khổ qua gây ức chế sự xâm nhập tế bào

của virus HIV, giảm sự lây nhiễm của tế bào lympho T với virus này. Nghiên cứu dịch chiết khổ qua cũng gây ức chế sự phát triển của một số chủng loại virus khác, (Wang và cs, 1999).

1.1.4. Cây neem

Phân loại thực vật (Đỗ Tất Lợi, 2004)

+ Tên khoa học : Azadirachta Indica A. Juss, thuộc họ xoan (Meliaceae)

+ Tên khác: xoan Ấn Độ, xoan chịu hạn, sầu đâu, cây nim, xoan trắng.

+ Tên nước ngoài: neem tree, margosa, Indian lilac (Anh), nimb (Hindi), niembau (Đức), nimba (Singapore).

+ Vị trí phân loại cây neem Azadirachta Indica A. Juss (Biswas và cs, 2002)

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Loài: Azadirachta indica A. Juss

Hình 1. 4: Cây neem (www.neemando.com) Cơng dụng và dược tính

Neem được người Ấn Độ sử dụng đầu tiên để hỗ trợ sức khỏe, giúp tăng cường sức khỏe một cách tổng thể, sử dụng neem không có bất cứ tác dụng phụ nào (Conrick, 2001).

Cây neem có vị đắng, nồng, tính mát, chữa trị được giun, chống nơn ói, ung nhọt ở trẻ em, chữa trị sưng viêm, sốt, rụng tóc, dùng xoa chống đau khớp hay dùng để trị chàm, táo bón, ung nhọt,…đối với dịch trích từ lá cây này có tính xua đuổi hay ức chế sự tăng trưởng của cơn trùng. Nhánh non có tác dụng trị giun, hen xuyễn và đầy bụng. Hoa có tính kích thích, bổ và dễ tiêu hóa. Ngồi ra cịn có thể dùng để trị đờm ở cổ. Trái có thể làm lành vết thương, chữa lao phổi, bệnh vàng da, sốt rét. Vỏ thân cây còn trị được bệnh lậu và bệnh đái tháo, trị viêm họng, suy nhược, chứng vàng da, làm giảm sốt. Ngoài ra, vỏ có thể được dùng làm thuốc ngừa thai (Thanh Huế, 2000; Võ Quang Yến, 1996). Khảo sát dược lý học cịn cho thấy lá cây neem có tác dụng kháng virus, có tính lợi niệu nhẹ. Dịch trích của lá trong nước và lá non có khả năng làm giảm đường huyết ở thỏ (Luscombe và cs, 1974).

Hợp chất nimbidol được trích từ hạt neem có tính hạ sốt và trị sốt rét (Phan Đức Bình và Phạm Bách Cúc, 1996). Năm 2002, Biswas và cộng sự đã có nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây neem cho thấy dịch chiết bằng chloroform từ vỏ thân cây

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

có tác dụng chống phù nề chân và viêm tai ở chuột, chiết xuất bằng nước từ vỏ thân cây đã được chứng minh có khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch ở chuột. Ngoài ra, chiết xuất bằng nước từ lá neem có tác dụng chống loét hiệu quả ở chuột (Biswas và cs, 2002).

Hợp chất nimbidin được trích từ hạt neem có tác dụng chống viêm loét bao tử,

trị phong thấp, ức chế nấm da, nấm tóc Tinea rubrum, ức chế vi trùng lao (Phan Đức

Bình, 2001).

Hiện nay, các hoạt chất từ cây neem được cho là có khả năng kiểm sốt trên 400 lồi sinh vật như: cơn trùng, vi sinh vật (vi nấm, vi khuẩn, virus), gây bệnh thực vật, người và động vật. Các hoạt chất từ cây neem được xác định là không độc đối với động vật có xương sống và vơ hại đối với nhiều loài thiên địch và tác nhân thụ phấn trong tự nhiên. Đây là cơ sở cho việc ứng dụng các dịch chiết từ cây neem để sản xuất thuốc trừ sâu và dược phẩm (Biswas và cs, 2002).

Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng

Chandrashekhara và cộng sự đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn nội sinh từ cây neem tại Ấn Độ trong đó có 2 chủng Gram (+) và 5 chủng Gram (-) (Chandrashekhara và cs, 2007). Năm 2009, Verma và cộng sự đã phân lập được 55 chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây neem có khả năng ức chế được 54,4% hoạt động của vi khuẩn và nấm bệnh.

1.1.5. Cây rau diếp cá

Phân loại thực vật học (Đỗ Tất Lợi, 2004) Giới: Plantae

Bộ: Piperales Họ: Saururaceae Chi: Houttuynia

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Loài: H. cordata

Hình 1. 5: Đặc điểm hình thái cây rau diếp cá (www.phunutoday.vn)

Công dụng và dược tính

Cây rau diếp cá có khả năng kháng nhiều loại virus như virus gây bệnh herpes (mụn rộp) chủng 1 (HSV-1), virus gây bệnh cúm và HIV chủng 1 của người (HIV-1) nhờ vào hoạt chất quercetin và tinh dầu. Mức độ giảm virus liên quan đến thời gian xử lý bằng thuốc. Hoạt chất decanonyl acetaldehyde từ cây rau diếp cá cũng có tác dụng kháng khuẩn (Kyoko Hayashi và cs, 1995).

Cây rau diếp cá cịn có tác dụng kháng viêm, thông tiểu. Dược điển Trung Quốc chỉ định dùng lá diếp cá trong các trường hợp áp-xe phổi, ho khó thở, lỵ, nhiễm trùng đường tiểu tiện, mụn nhọt.

Nhân dân ta có kinh nghiệm dùng diếp cá tươi để chữa đau mắt đỏ có tụ máu (giã nhỏ lá, ép vào hai miếng giấy bản, đắp vào mắt), bệnh trĩ (hãm lấy nước uống và rửa). Diếp cá là thứ rau ăn thông thường ở miền Nam. Đây cũng là nguồn cung cấp vitamin P rất tốt cho cơ thể.

Các công trình nghiên cứu ứng dụng

Đến nay, nước ta đã có nhiều cơng trình nghiên cứu cây dược liệu nhưng phần lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của rau diếp cá

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

thông qua các nghiên cứu điều trị lâm sàng. Việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội sinh sống trong vùng rễ của rau diếp cá có khả năng kích thích cây trồng phát triển, giảm các loại bệnh và đặc biệt là khả năng tổng hợp các hoạt chất kháng khuẩn là rất quan trọng.

Gon và cộng sự (2012) khi nghiên cứu công dụng của rau cây diếp cá cho thấy

dịch trích từ cây này có khả năng diệt khuẩn Salmonella.

Jee và cộng sự (2010) cũng cho thấy rau diếp cá có khả năng kháng khuẩn cũng như kháng viêm.

Ngoài ra, các dịch chiết của rau diếp cá còn làm tăng số lượng tế bào lympho nhanh chóng giúp tăng tính miễn dịch của người (Busarawan và cs, 2007).

Theo Kim và cộng sự (2007), rau diếp cá có khả năng ức chế phát triển của vi

khuẩn E. coli O157 – H7 giống như kháng sinh β-lactam.

1.1.6. Cây vối

Phân loại thực vật (Đỗ Tất Lợi, 2004)

+ Tên khoa học là Cleistocalyx operculatus Roxb, thuộc họ Myrtaceae. + Tên khác là Eugenia operculatus.

+ Năm 1999, cây vối được Đỗ Tất Lợi mô tả và định danh là Cleistocalyx operqulatus, thuộc hệ thống phân loại như sau:

Giới: Plantae

Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida

Chi: Cleistocalyx

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Loài: Cleistocalyx operculatus

Hình 1. 6: Cây vối

(www.suckhoedoisong.vn) Cơng dụng và dược tính

Vối được trồng để lấy gỗ dùng trong xây dựng, làm cơng cụ, vỏ có chất dùng để nhuộm đen.

Lá vối tươi đem thái nhỏ, rửa sạch nhựa rồi cho vào thùng ủ cho đến khi đen đều thì lấy ra rửa sạch, phơi khơ dùng để nấu làm nước uống rất thông dụng. Nụ và hoa thu hái vào vào tháng tư hoặc tháng sáu dương lịch cũng được pha làm trà uống. Kinh nghiệm dân gian thường phối hợp lá vối với lá hoắc hương làm nước uống lợi tiêu hóa. Nước sắc đậm đặc của lá cây dùng như thuốc sát trùng, để rửa mụn nhọt, lở loét, ghẻ. Lá, vỏ thân, hoa còn dùng làm thuốc chữa bệnh đầy bụng, khó tiêu, mụn nhọt, viêm đại tràng mãn tính, lỵ trực trùng (Võ Văn Chi và cs, 1971).

Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng

Viện nghiên cứu đông y đã tiến hành nghiên cứu thăm dò khả năng kháng sinh của lá và nụ cây vối đã đi tới kết luận là ở tất cả giai đoạn phát triển, lá và nụ vối đều có tác dụng kháng sinh, vào mùa đông kháng sinh tập trung nhiều nhất ở lá (Nguyễn Đức Minh, 1972). Hoạt chất kháng sinh từ cây vối tan trong nước, các dung môi hữu cơ, vững bền với nhiệt độ và ở các mơi trường có pH từ 2 đến 9, có khả năng kháng

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

khuẩn mạnh nhất đối với Streptococcus, vi trùng bạch hầu, Staphylococcus và

Pneumcoccus (Đỗ Tất Lợi, 1999).

Ngồi ra, cây vối cịn có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến, lão hóa, thối hóa gan, tổn thương do bức xạ, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, giảm đường huyết, chống oxy hóa, chống Alzheimer (Min và cs, 2010; Nguyễn Thị Kim Tuyến và cs, 2010; Nguyễn Quốc Tuấn, 2012; Nguyễn Thị Dung và cs, 2008).

1.1.7. Cây đinh lăng

Phân loại thực vật học (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Cây đinh lăng có tên khoa học là Polyscas fruticosa, dân gian còn gọi là cây gỏi

cá, cây nam dương sâm. Là một loài cây nhỏ thuộc ngành Angiospermae, bộ Apiales,

họ Araliaceae, chi Polyscia, loài P. fruticosa. Cây được trồng làm cảnh hay làm thuốc

trong y học cổ truyền. Năm 1984, cây Đinh Lăng được phân loại và định danh như sau:

Giới: Plantae

Ngành: Angiospermae

Họ: Araliaceae Chi: Polyscia

Loài: P. fruticosa

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Hình 1. 7: Cây đinh lăng (

Công dụng và dược tính

Theo y học cổ truyền, rễ đinh lăng có vị ngọt, hơi đắng, tính mát có tác dụng thơng huyết mạch, bồi bổ khí huyết, lá có vị đắng, tính mát có tác dụng giải độc thức ăn, chống dị ứng, chữa ho ra máu, kiết lỵ.

Qua nghiên cứu và thử nghiệm, Viện Y học quân sự đã tìm được từ cây đinh lăng những tính chất tương tự nhân sâm. Rễ đinh lăng có tác dụng làm tăng cường sức dẻo dai và sức đề kháng của cơ thể, chống hiện tượng mệt mỏi, giúp ăn ngủ ngon, tăng khả năng lao động, lên cân và chống độc. Các hợp chất polyacetylen như (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol phân lập được từ cây

đinh lăng cho thấy có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn Gram (+), kháng nấm Candida

albican (Trần Cơng Luận, 2014).

Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng

Nghiên cứu của Võ Duy Huân và cộng sự góp phần tìm hiểu thành phần hóa

học của cây đinh lăng nghiên cứu tạo rễ bất định cây đinh lăng lá xẻ (Polyscias

fruticosa) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro các saponin khung olean phân lập từ

cây đinh lăng (Võ Duy Huân và cs, 1998) hay nghiên cứu thành phần hóa học, tác

dụng ức chế enzym α- amylase và α-glucosidase của phân đoạn dịch chiết lá cây đinh

lăng (Polyscias fruticosa) (Hồ Lương Nhật Vinh, 2014) và rất nhiều nghiên cứu khác

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

về cây đinh lăng. Tuy nhiên chưa có cơng trình nghiên cứu khoa học nào về hệ vi

sinh vật nội sinh được phân lập từ cây đinh lăng được công bố.

1.2. VI SINH VẬT NỘI SINH CÂY DƯỢC LIỆU

1.2.1. Vi sinh vật nội sinh

Vi sinh vật nội sinh (endophytic) bao gồm các vi sinh vật phát triển bên trong các mô của thực vật bậc cao, không gây ra tác hại trên cây kí chủ mà nó đang tồn tại và đã được chứng minh là nguồn sản phẩm tự nhiên phong phú có hoạt tính sinh học (Li và cs., 2008; Tan và Zou, 2001). Tương tác hỗ sinh giữa vi sinh vật và cây chủ đem đến lợi ích cho cả hai bên (Kogel và cs., 2006).

Các vi sinh vật nội sinh thường gặp nhất là nấm và vi khuẩn (bao gồm cả xạ khuẩn). Cả vi khuẩn nội sinh và nấm nội sinh có thể cùng tồn tại trong một cây chủ duy nhất (Ting và cs, 2009). Vi sinh vật nội sinh được coi là một tập con của quần thể vi sinh vật (Germida và cs,1998).

Vi khuẩn nội sinh (endophytic bacteria) là vi khuẩn sống trong mơ thực vật được tìm thấy ở vùng rễ và rễ, thân, lá, quả của thực vật mà không gây dấu hiệu nhiễm trùng hoặc ảnh hưởng tiêu cực lên cây chủ (Schulz, 2006). Sau khi xâm nhập vào cây chủ chúng có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hoặc di chuyển đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân, lá, hoa. Có thể thu nhận được nhiều vi khuẩn nội sinh khác nhau từ một cây (Zinniel và cs, 2002).

Vi khuẩn nội sinh rất đa dạng gồm cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) như:

Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Brevibacterium, BurkhoLNeria, Chromobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Kocuria, Lysinibacillus, Methylobacterium, Microbacterium, Paneibacillus, Pantoea, Phyllobacterium, Pseudomonas, Rahnella, Rhodanobacter, Stenotrophomonas, Streptomyces, Xanthomonas…. (Khan, 2007; Sun, 2013), trong đó Streptomyces sp.

và Bacillus sp. là 2 loài chiếm ưu thế nhất (Cho, 2007).

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi sinh vật nội sinh có khả năng kiểm sốt mầm bệnh trên thực vật. Năm 2009, Gazis và cộng sự đã phân lập vi khuẩn nội sinh

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

mới kiểm soát sinh học chống lại các tác nhân gây bệnh rụng lá trên cây cao su (Hevea brasiliensis) tại Peru. Trong một số trường hợp chúng đẩy mạnh tốc độ nảy mầm của hạt, thúc đẩy sự hình thành cây con trong điều kiện bất lợi và nâng cao khả năng tăng trưởng của thực vật (Chanway, 1997). Bên cạnh đó, vi sinh vật nội sinh cịn có khả năng ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó để tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa và các hợp chất hữu cơ mới. Nghiên cứu chế phẩm sản sinh chất chuyển hóa mới trong sự đa dạng sinh học của vi sinh vật nội sinh có thể phát hiện các loại thuốc mới để điều trị có hiệu quả cả bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel và cs., 2003).

Sau khi đã cư trú trong các mô thực vật, vi sinh vật nội sinh sẽ sản xuất các sản phẩm tự nhiên đa dạng mà có thể là một nguồn tiềm năng của thuốc kháng sinh mới. Các sản phẩm tự nhiên thu được từ vi khuẩn nội sinh là các chất kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, chống oxy hóa, tiểu đường và ức chế miễn dịch. (Christina và cs., 2013).

Vi sinh vật nội sinh hiện đang được nghiên cứu rộng rãi như là nguồn sản phẩm hoạt tính sinh học mới, mở ra một cơ hội để khám phá các hợp chất mới và các nguồn lực cơng nghệ sinh học có tiềm năng có thể khai thác (Sivaramakrishnan và cs, 2006) và có tiềm năng sử dụng của chúng trong nhiều lĩnh vực (Strobel, 2003). Các sản phẩm tự nhiên thu được từ vi khuẩn nội sinh là các chất kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, chống oxy hóa, đái tháo đường và ức chế miễn dịch, và các hợp chất điều hoà sinh trưởng cây thực vật (Christina và cs, 2013; Kumala và cs, 2007). Vi khuẩn nội sinh có khả năng kiểm soát sinh học trong việc làm giảm các hợp chất độc hại trong tự nhiên, ngăn chặn mầm bệnh phát triển (Guo và cs, 2008; Berg và cs, 2005). Để ngăn chặn mầm bệnh, các vi khuẩn nội sinh tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó tổng hợp các chất chuyển hóa và các hợp chất hữu cơ mới. Việc nghiên cứu các cơ chế này có thể giúp phát triển các loại thuốc mới để điều trị hiệu quả các bệnh trên người, ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay công nghiệp (Strobel và cs, 2004; Menpara và cs, 2013; Ryan và cs, 2008).

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

1.2.2. Phân loại vi sinh vật nội sinh

Vi sinh vật nội sinh được chia thành hai loại chính: vi sinh vật nội sinh bắt buộc và vi sinh vật nội sinh tuỳ ý. Vi sinh vật nội sinh tuỳ ý có khả năng tồn tại trong đất, trên bề mặt cây trồng, bên trong thực vật cũng như trên các chất dinh dưỡng nhân tạo (Baldani và cs., 1997) và vi sinh vật sống bên trong mơ thực vật trong suốt vịng đời của chúng được gọi là vi sinh vật nội sinh bắt buộc (Stoltzfus và cs., 2000). Vi sinh vật nội sinh tuỳ ý được phân bố rộng rãi trên toàn giới thực vật và có thể được phân lập từ các loài thực vật khác nhau. Endophytes cũng được báo cáo là có ở cả một số lồi thực vật và cây con nuôi cấy in vitro.

Trên thế giới có vơ số lồi thực vật với số lượng khổng lồ, có khoảng 300.000 lồi thực vật tồn tại trên Trái Đất, mỗi loài là một ký chủ cho một đến nhiều các dạng nội sinh cư trú, do đó khơng thể đưa vào thí nghiệm một cách chủ quan hay ngẫu nhiên. Vì vậy, cần có nguyên tắc lựa chọn nhất định, phù hợp với mục đích để có được nguồn vi sinh vật nội sinh hữu ích, có tính ứng dụng cao (Strobel và cs., 2003).

1.2.3. Tình hình nghiên cứu

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới có nhiều cơng trình nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây dược liệu đã được công bố.

Năm 2002, phân lập được vi khuẩn nội sinh Gram (-) Pseudomonas sp. như một

yếu tố kiểm soát sinh học thông qua việc tạo ra các chất chuyển hóa có khả năng kháng khuẩn (Nielsen và cs, 2002). Kumala và cộng sự đã thu nhận được 5 chủng vi

khuẩn nội sinh từ cây nhàu (Morinda citrifolia) sản sinh ra hợp chất kháng khuẩn và

Staphylococcus aureus nhạy cảm nhất với hoạt chất kháng khuẩn của 5 chủng vi

khuẩn nội sinh này sản xuất ra (Kumala và cs, 2007).

Dịch lọc của vi khuẩn nội sinh Bacillus subtilis EDR4 thu nhận từ rễ lúa mì có protein kháng nấm E2, có hoạt tính kháng nấm mạnh với các chủng nấm Fusarium

Graminearum, Macrophoma kuwatsukai, Rhizoctonia cerealis, Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum, Botrytis cinerea and G. graminis var. tritici (Liu và cs, 2010).

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Bacillus licheniformisand và Bacillus pumilusfrom là 2 chủng vi khuẩn nội sinh phân

lập từ rễ cây hoa cát cánh (Platycodon grandiflorum) ở Hàn Quốc có hoạt tính kháng nấm Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, và Pythium

flourescens, trong khi đó ở cây AzR027, 032 và 051 có hoạt tính kháng E. coli (Verma

và cs, 2009). Năm 2013, El-Deeb và cộng sự đã thu nhận được 28 chủng vi khuẩn

nội sinh phân lập từ các bộ phận khác nhau của cây P. tenuiflorus, trong đó 28,5% có

hoạt tính kháng khuẩn ức chế ít nhất 1 tác nhân gây bệnh, 14,2% chủng có khả năng

đối kháng với cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+). Chủng Bacillus sp. và Pseudomonas

sp. phân lập được có hoạt tính kháng khuẩn nổi trội, đối kháng với toàn bộ chủng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm (El-Deeb và cs, 2013).

Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh trong các loài cây nhưng chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh cây dược liệu cũng như khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn cây dược liệu với vi khuẩn kháng thuốc sinh enzym carbapenemase. Nhưng bên cạnh đó đã có cơng trình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh trên cây khác:

Năm 2009, đã phân lập được 8 chủng vi khuẩn và 13 chủng vi nấm từ 35 dòng keo tai tượng, trong đó có 2 chủng vi khuẩn và 13 chủng nấm có hoạt tính ức chế nấm

Ceratocystis sp. (Phạm Quang Thu và cs, 2009).

Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh trong cây khóm trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An, Việt Nam (Cao Ngọc Diệp và cs, 2009).

Năm 2014, phân lập được 21 chủng vi khuẩn nội sinh và 14 chủng vi nấm nội sinh từ cây cao su. Qua thử nghiệm đối kháng bằng phương pháp thử nghiệm kép

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

giữa vi sinh vật nội sinh và Corynespora casiicola, đã xác định chủng T9 và T16 có kết quả đối kháng với nấm C. cassiicola (Nguyễn Văn Minh và cs, 2014).

CARBAPENEMASE

1.3.1. Enzym carbapenemase

Carbapenemase là enzym thuộc họ β – lactamase bất hoạt được tất cả các loại β

– lactam như Pencillin, Cephalosporin phổ rộng và kể cả kháng sinh mạnh nhất hiện nay là Carbapenem, vũ khí kháng sinh duy nhất giúp các bác sĩ điều trị nhiễm khuẩn do vi khuẩn tiết ESBL gây ra (Queenan và cs, 2007; Phạm Hùng Vân, 2013). Các gen mã hoá cho các loại Carbapenemase nằm trên plasmid hay integron của nhiễm sắc thể nên có khả năng lây lan cao. Các loại carbapenemase hiện nay đã xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới và đang được xem là “ác mộng” đề kháng kháng sinh đối với con người (Phạm Hùng Vân, 2013). Có hai loại carbapenemase được cảnh báo gần

đây, đó là blaKPC và NDM - 1. KPC là một loại β – lactamase lớp A nguồn gốc plasmid phát hiện trên K. pneumoniae, lưu hành ở Hoa Kỳ, Nam Mỹ và Châu Âu và

hiện cũng lây lan ra một số loài khác (Yigit và cs, 2001). NDM - 1 được cảnh báo là nguy hiểm nhất vì lan truyền cao, thuộc lớp B, metallo - β - lactamase, có nguồn gốc

plasmid và intergon được phát hiện trên K. pneumoniae và E. coli, được lưu hành cao

ở Ấn Độ, Pakistan (Yong và cs, 2009). Chính vì vậy, việc phát hiện vi khuẩn tiết ra enzym này rất quan trọng để cảnh báo nguy cơ lây lan tính đề kháng kháng sinh này

trong cộng đồng (Phạm Hùng Vân, 2013).

1.3.2. Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Acinetobacter spp.

Acinetobacter spp. là những vi khuẩn khơng lên men thường gặp trong phịng

xét nghiệm vi sinh lâm sàng.

• Phân loại theo khóa phân loại quốc tế

Acinetobacter spp. được phân loại như sau (Dworkin, 2006):

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Moraxellaceae Chi: Acinetobacter

Hình 1. 8: Hình thái khuẩn lạc Acinetobacter spp.

(www.CHROMagar.com) • Khả năng gây bệnh

Trước đây Acinetobacter spp. được coi là những vi khuẩn cơ hội, vai trò gây

bệnh của chúng mới được chú trọng trong những năm gần đây. Vi khuẩn

Acinetobacter spp. có thể là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện ở những bệnh nặng

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

như viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm phổi và nhiễm khuẩn huyết và khuynh hướng này ngày càng gia tăng (Nguyễn Thanh Bảo, 2011).

• Tình hình đề kháng kháng sinh

Tỉ lệ Acinetobacter spp. gây nhiễm khuẩn bệnh viện đã tăng lên đều đặn trong

những năm gần đây trên thế giới. Cùng với tỉ lệ nhiễm khuẩn tăng, tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn cũng đang tăng một cách đáng lo ngại. Ở Anh, các ca nhiễm khuẩn

bệnh viện do Acinetobacter kháng các loại Carbapenem đã xảy ra từ năm 2000. Cụ

thể hơn, khoảng thời gian năm 2004-2008, tỉ lệ kháng Meropenem đã tăng từ 13 đến

29%. Riêng tại Mĩ, các ca nhiễm khuẩn bệnh viện bởi Acinetobacter đa kháng thuốc

là 65-75% và không nhạy với Carbapenem tăng từ 9% trong năm 1995 lên 57% trong năm 2008 (WHO, 2011).

Ở Việt Nam, trong những nghiên cứu gần đây tại một số bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh, các vi khuẩn Gram (-) là căn nguyên thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện cũng đã kháng lại Cephalosporin thế hệ 3 và gia tăng từ 25% (2000-2001)

lên đến 42% (2009). Hai căn nguyên gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp là P.

aeruginosa và A. baumannii ở 6 bệnh viện năm 2008 có tỉ lệ 20% các chủng P. aeruginosa và 50% các chủng A. baumannii kháng kháng sinh nhóm Carbapenem

Lớp Gamma proteobacteria Bộ Enterobacteriales Họ Enterobacteriaceae

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

Chi Escherichia

Lồi Escherichia coli

• Hình thái

Escherichia coli là trực khuẩn Gram (-), dài hay ngắn tùy thuộc mơi trường

ni cấy, có kích thước trung bình 2 – 3 µm x 0,5 µm. Một số chủng di động hay bất động, và có thể có nang, khơng sinh bào tử (Nguyễn Thanh Bảo, 2011).

Hình 1. 9: Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn Escherichia coli

() • Khả năng gây bệnh

Nhiễm khuẩn đường tiểu: 90% trường hợp nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu tiên

ở phụ nữ là do E. coli với các triệu chứng tiểu lắc nhắc, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra

mủ. Có thể đưa tới nhiễm khuẩn bọng đái, thận, cơ quan sinh dục và nhiễm khuẩn huyết (Nguyễn Thanh Bảo, 2011).

Nhiễm khuẩn huyết: khi sức đề kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn máu (Nguyễn Thanh Bảo, 2011).

Viêm màng não: E. coli gây ra 40% trường hợp gây viêm màng não ở trẻ sơ

sinh, 75 % trong số đó có kháng nguyên K1 (Nguyễn Thanh Bảo, 2011).

Tiêu chảy: những chủng E. coli liên quan đến tiêu chảy thuộc các nhóm EPEC,

ETEC, EIEC, VTEC (Nguyễn Thanh Bảo, 2011). • Tình hình đề kháng kháng sinh

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Trong những năm gần đây, sự gia tăng khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn

E. coli đã được báo cáo nhiều ở các nước phát triển và cả những nước đang phát triển

(Thi Thu Thao Van và cs, 2007). Các kháng sinh nhóm Cephalosporin thế hệ 3 cũng bị kháng đến gần một nửa và nhóm Fluoro-quinolon cũng bị kháng khoảng 45% (Trần Thị Thùy Giang và cs, 2014).

Theo báo cáo tổng kết về tình hình đề kháng kháng sinh ghi nhận từ 15 bệnh

viện của GARP-Vietnam cho thấy tỷ lệ E. coli kháng với Cephalosporin thế hệ 3 khá

cao và có tỷ lệ kháng với Cotrimoxazole dao động từ 60%– 80% tại hầu hết các bệnh

viện ở nước ta. Tuy nhiên, tỷ lệ E. coli kháng với các Carbapenem thấp hơn 2%

(GARP-Vietnam, 2010).

Vi khuẩn Klebsiella spp.

Klebsiella spp. là vi khuẩn thường trú ở đường ruột, chúng có mặt khắp nơi

trong tự nhiên như ở đất, nước, những thức ăn có hàm lượng đường và acid cao, các

sản phẩm thực vật. Một số loài trong chi Klebsiella còn được phân lập từ bề mặt rễ

của một số loại thực vật với vai trò cố định nitơ. Ở người, có thể tìm thấy chúng ở da, cổ họng, đường ruột, dạ dày, nước tiểu hay vết thương (Podschun và cs, 1998; Dworkin, 2006).

• Phân loại theo khóa phân loại quốc tế

Klebsiella được phân loại như sau (Buchanan và Gibbons, 1994; Dworkin, 2006):

Giới Bacteria Ngành Proteobacteria

Lớp Gamma proteobacteria Bộ Enterobacteriales Họ Enterobacteriaceae Chi Klebsiella

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

Chi Klebsiella gồm các loài: K. pneumoniae, K. oytoca, K. oaenae, K. panticola,

K. onithicrocytica, K. rhinosclersmatis, K. terrigena (Dworkin, 2006). Trong chi Klebsiella, K. pneumoniae là thành viên quan trọng nhất về bệnh học và là một trong

những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng trong những năm gần đây (Podschun và cs, 1998).

• Hình thái

Klebsiella spp. là trực khuẩn Gram (-), không di động, có vỏ polysacharide đặc

trưng giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phòng vệ của tế bào chủ (Podschun và cs,

1998).

Klebsiella spp. có kích thước 0,3-1,5 àm ì 0,6-6,0 àm, hỡnh que, thng ng

thnh từng đôi, không sinh bào tử (Buchanan và Gibbons, 1994).

Hình 1. 10: Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn Klebsiella spp.

(

• Khả năng gây bệnh

Klebsiella là tác nhân đứng thứ 2 sau E.coli gây nhiễm khuẩn bệnh viện và cộng

đồng. Klebsiella spp. có thể gây tổn thương ở hầu hết các cơ quan của cơ thể như:

viêm xoang, viêm họng, viêm màng não, viêm phúc mạc, đáng chú ý là trẻ con có thể bị viêm ruột do lồi vi khuẩn này. Nó là căn nguyên quan trọng gây nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn mô mềm ở nhiễm

khuẩn bệnh viện. Klebsiella spp. lan rộng và nhanh trong môi trường bệnh viện qua

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

tay nhân viên y tế và đường tiêu hóa. Nhiễm khuẩn bệnh viện do Klebsiella kháng

thuốc tăng cao chủ yếu do việc sử dụng kháng sinh không hợp lý (Podschun và cs, 1998; Dworkin, 2006).

“siêu vi khuẩn” K. pneumoniae có khả năng kháng Carbapenem nhờ một số cơ chế

khác nhau đang bùng phát và trở thành mối nguy cho sức khỏe cộng đồng (Podschun và cs, 1998).

Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

Có thể phân lập được chi Pseudomonas ở trong mẫu đất, nước, thực vật và cả động vật. P. aeruginosa thường hiện diện trong đường tiêu hóa với số lượng ít và một

số nơi ẩm ướt trên cơ thể của người như da, niêm mạc, vùng dưới cánh tay. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, thường xuất hiện trong môi trường ẩm thấp ở bệnh viện và là một tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện và nhiễm trùng cơ hội (Dworkin và cs, 2006; Jawetz và cs, 1989).

• Phân loại theo khóa phân loại quốc tế

P. aeruginosa được phân loại như sau (Buchanan và Gibbons, 1994):

Giới Bacteria Ngành Proteobacteria

Lớp Gamma proteobacteria

Chi Pseudomonas

</div>