bước đầu khảo sát tính chất đột biến điểm trên gen brca1 palb2 trên bệnh nhân ung thư vú

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM </b>

<b> </b>

<b>BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP </b>

<i><b>Tên đề tài: </b></i>

<b>BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN </b>

<i><b>ĐIỂM TRÊN GEN BRCA1, PALB2 TRÊN BỆNH </b></i>

<b>NHÂN UNG THƯ VÚ. </b>

<b>KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC </b>

<b>CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ </b>

<b>GVHD: PGS.TS. Lê Huyền Ái Thúy Ths. Trương Kim Phượng SVTH: Trịnh Ngọc Châu </b>

<b>MSSV: 1253010037 Khóa: 2012-2016 </b>

<i><b>Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016. </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

Trang i Trịnh Ngọc Châu

<b>LỜI CẢM ƠN </b>

Lời đầu tiên, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến quý Thầy Cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong những năm học qua.

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Cô Lê Huyền Ái Thúy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm bổ ích.

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn Cô Trương Kim Phượng đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt và chia sẻ cho em những kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành tốt bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp.

Bên cạnh đó, con trân trọng biết ơn Ông Bà, Cha Mẹ đã nuôi dưỡng, dạy dỗ và tạo điều kiện tốt nhất để con được học tập.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn anh chị em trong gia đình đã ln động viên quan tâm tơi. Cảm ơn bạn bè, các em cùng trường đã chia sẻ, quan tâm, giúp đỡ tơi trong q trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Sinh viên Trịnh Ngọc Châu.

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

Trang ii Trịnh Ngọc Châu

<b>DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT </b>

<i>BRCA1</i> Breast cancer 1, early onset

<i> </i>

CpG Cytosine-phosphodiester-Guanine DCIS Ductal Carcinoma <i>In Situ </i>

NCBI National Center for Biotechnology Information p53 Tumor suppressor protein

<i><b>PALB2 </b></i> Partner And Localizer of BRCA2 PCR Polymerase Chain Reaction PR Thụ thể Progesterone SAM S-denosylmethionine

SNP Single-nucleotide polymorphism Tm Temperature melt

WHO

<b> </b>

World Health Organization

<b> </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

Trang iii Trịnh Ngọc Châu

<b>DANH MỤC HÌNH</b>

Hình 1. 1. Diễn tiến của quá trình sinh ung [141] ... 3

Hình 1. 2. Tỉ lệ mắc ung thư ở phụ nữ trên thế giới [125] ... 6

Hình 1. 3. Tỉ lệ mắc ung thư ở phụ nữ tại Việt Nam [125] ... 7

Hình 1. 4. Cơ chế epigenetics [51] ... 9

Hình 1. 5. Sự methyl hóa [52] ... 9

<i>Hình 1. 6. Đột biến trên gene BRCA1 [140] ... 11</i>

<i>Hình 1. 7. Định vị gen BRCA1 trên nhiễm sắc thể 17 [132] ... 12</i>

Hình 1. 8. Con đường truyền tín hiệu ATM [110] ... 13

<i>Hình 1. 9. Vị trí của gen PALB2 trên nhiễm sắc thể 16 [133] ... 14</i>

Hình 1. 10. Cơ chế sửa chữa DNA sai hỏng qua tái tổ hợp tương đồng [78] ... 15

Hình 1. 11. Nguyên tắc của phản ứng PCR [1] ... 17

Hình 1. 12. Phương pháp Sanger sequencing [87] ... 18

Hình 3. 1. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các exon ... 26

Hình 3. 2. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên từng châu lục ... 26

Hình 3. 3. Tổng số phương pháp trên các exon ... 27

Hình 3. 4. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các exon ở Châu Âu ... 27

Hình 3. 5. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các exon ở Châu Mỹ ... 28

Hình 3. 6. Kết quả phân tích vị trí bắt cặp của cặp mồi BRCA1_11F7 và BRCA1_11R7 với trình tự gen BRCA1 (NC_000017.11) ... 31

Hình 3. 7. Kết quả BLAST sản phẩm của cặp mồi BRCA1_11F7 và BRCA1_11R7 ... 32

Hình 3. 8. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các exon ... 33

Hình 3. 9. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên từng châu lục ... 34

Hình 3. 10. Tổng số phương pháp trên các exon ... 34

Hình 3. 11. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các exon ở Châu Á ... 35

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

Trang iv Trịnh Ngọc Châu

Hình 3. 12. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các exon ở Châu Âu ... 35

Hình 3. 13. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các exon ở Châu Mỹ ... 36

Hình 3. 14. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các exon ở Châu Úc ... 37

Hình 3. 15. Kết quả phân tích vị trí bắt cặp của cặp mồi PALB2_4AIF và PALB2_4AIR với trình tự gen PALB2 (NC_000016.10) ... 39

Hình 3. 16. Kết quả BLAST sản phẩm của cặp mồi PALB2_4AIF và PALB2_4AIR ... 40

<i>Hình 3. 17. Kết quả điện di khuếch đại gen BRCA1 với bộ mồi BRCA1_11F7 và </i>BRCA1_11R7 ... 41

Hình 3. 18. Mơ tả kết quả phân tích sản phẩm giải trình tự R1 bằng cơng cụ CLC . 43Hình 3. 19. Giao diện tập tin dữ liệu của kết quả phân tích mẫu R1 bằng CLC. ... 44

<i>Hình 3. 20. Dạng đột biến c.2082C>T[S694S] (Risch et al. 2001) xuất hiện trên </i>mẫu R1 ... 44

Hình 3. 21. Dạng đột biến c.2123C>T[S708F] và c.2129C>T[T710Ter*] xuất hiện trên mẫu R1 ... 45

Hình 3. 22. Dạng đột biến c.2148delT và c.2152C>T[L718F] xuất hiện trên mẫu R1 ... 45

Hình 3. 23. Dạng đột biến c.2161T>A[F721Ter*] và c.2171C>G[P724A] xuất hiện trên mẫu R1 ... 46

Hình 3. 24. Dạng đột biến c.2220G>T[V740Q], c.2222C>T[S741F] và c.2226delT xuất hiện trên mẫu R1 ... 46

Hình 3. 25. Dạng đột biến c.2231C>T[A744Q], c.2237A>G[D746P] và c.2248C>A[L750Ter*] xuất hiện trên mẫu R1 ... 47

Hình 3. 26. Mơ tả kết quả phân tích sản phẩm giải trình tự R2 bằng cơng cụ CLC . 48Hình 3. 27. Giao diện tập tin dữ liệu của kết quả phân tích mẫu R2 bằng CLC ... 48

Hình 3. 28. Dạng đột biến c.1844C>T[S615F] xuất hiện trên mẫu R2 ... 49

Hình 3. 29. Dạng đột biến c.1891C>T[L631L] xuất hiện trên mẫu R2 ... 49

Hình 3. 30. Dạng đột biến c.1971A>C[Q657H] xuất hiện trên mẫu R2 ... 50

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

Trang v Trịnh Ngọc Châu

<i>Hình 3. 31. Dạng đột biến c.2082C>T[S694S] (Risch et al. 2001) xuất hiện trên </i>

mẫu R2 ... 50Hình 3. 32. Mơ tả kết quả phân tích sản phẩm giải trình tự R4 bằng cơng cụ CLC . 52Hình 3. 33. Giao diện tập tin dữ liệu của kết quả phân tích mẫu R4 bằng CLC ... 52Hình 3. 34. Dạng đột biến c.1847C>T[S616F] xuất hiện trên mẫu R4 ... 52Hình 3. 35. Dạng đột biến c.1891C>T[L631L] xuất hiện trên mẫu R4 ... 53

<i>Hình 3. 36. Kết quả điện di khuếch đại gen PALB2 với bộ mồi PALB2_4AIF và </i>

PALB2_4AIR ... 55Hình 3. 37. Mơ tả kết quả phân tích sản phẩm giải trình tự K3 bằng cơng cụ CLC . 57Hình 3. 38. Giao diện tập tin dữ liệu của kết quả phân tích mẫu K3 bằng CLC ... 58Hình 3. 39. Mơ tả kết quả phân tích sản phẩm giải trình tự K1 bằng cơng cụ CLC . 58Hình 3. 40. Giao diện tập tin dữ liệu của kết quả phân tích mẫu K1 bằng CLC ... 59Hình 3. 41. Dạng đột biến c.512insT [L172F] xuất hiện trên mẫu K1 ... 59Hình 3. 42. Mơ tả kết quả phân tích sản phẩm giải trình tự K2 bằng cơng cụ CLC . 60Hình 3. 43. Giao diện tập tin dữ liệu của kết quả phân tích mẫu K2 bằng CLC ... 60Hình 3. 44. Dạng đột biến c.427delC xuất hiện trên mẫu K2 ... 60Hình 3. 45. Dạng đột biến c.489delCT xuất hiện trên mẫu K2 ... 61Hình 3. 46. Dạng đột biến c.526C>T, c.534delA, c.549delT xuất hiện trên mẫu K2 ... 61

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

Trang vi Trịnh Ngọc Châu

<b>DANH MỤC BẢNG </b>

Bảng 2. 1. Thành phần phản ứng PCR ... 23

Bảng 2. 2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ... 23

<i>Bảng 3. 1. Các cơng trình nghiên cứu về tính chất đột biên trên gen BRCA1 ... 25</i>

<i>Bảng 3. 2. Một số trình tự mồi khuếch đại exon 11 gen BRCA1 ... 29</i>

Bảng 3. 3. Thông số vật lý của cặp mồi BRCA1_11F7 và BRCA1_11R7 ... 30

Bảng 3. 4. Các cơng trình nghiên cứu về tính chất đột biến trên gen PALB2 ... 33

<i>Bảng 3. 5. Một số trình tự mồi khuếch đại exon 4 gen PALB2 ... 37</i>

Bảng 3. 6. Thông số vật lý của cặp mồi PALB2_4AIF và PALB2_4AIR ... 38

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

Trang vii Trịnh Ngọc Châu

<b>MỤC LỤC </b>

PHẦN I. TỔNG QUAN ... 3

I.1. Đại cương về ung thư... 3

I.1.1. Khái niệm về ung thư ... 3

I.1.2. Các yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư ... 3

I.1.3. Phân loại ung thư ... 4

I.1.4. Ung thư vú ... 4

I.1.5. Phân loại ung thư vú ... 4

I.1.6. Các giai đoạn phát triển của ung thư vú ... 5

I.1.7. Tình hình ung thư vú ở phụ nữ trên thế giới ... 6

I.1.8. Tình hình ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam ... 7

I.1.9. Các yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư vú ... 7

I.2. Epigenetics ... 8

I.2.1. Sự methyl hóa DNA ... 9

I.3. Đột biến điểm ... 10

I.3.1. Khái niệm về đột biến điểm ... 10

I.3.2. Phân loại các đột biến điểm [139] ... 10

I.3.3. Sự thay đổi nucleotide trong đột biến điểm ... 11

I.3.4. Đột biến trên gene BRCA1 ... 11

I.4. Single-nucleotide polymorphism ... 11

I.5. Tổng quan về gen ... 11

I.5.1. Gen <i>BRCA1 (Breast cancer 1, early onset) ... 12</i>

I.5.2. Gene <i>PALB2 (Partner And Localizer of BRCA2) ... 14</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

Trang viii Trịnh Ngọc Châu

I.6. Phương pháp xác định tính chất đột điểm và tính chất methyl hóa. ... 16

I.6.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 16

I.6.2. Phương pháp PCR giải trình tự ... 17

PHẦN II. VẬ T LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ... 19

II.1. Vật liệu ... 19

II.1.1. Các công cụ tin sinh học: ... 19

II.1.2. Các trang web: ... 19

II.1.3. Xử lý thống kê ... 19

II.2. Phương pháp ... 19

II.2.1. Khai thác dữ liệu ... 19

II.2.2. Khảo sát in silico ... 20

II.2.3. Khảo sát thực nghiệm về tính chất đột biến ... 20

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N ... 25

III.1. Kết quả khai thác dữ liệu và khảo sát in silico về tính chất đột biến trên gen <i>BRCA1 ... 25</i>

III.1.1. Khai thác dữ liệu ... 25

III.1.2. Khảo sát in silico ... 28

III.2. Kết quả khai thác dữ liệu và khảo sát in silico về tính chất đột biến trên gen <i>PALB2 ... 32</i>

III.2.1. Khai thác dữ liệu ... 32

III.2.2. Khảo sát in silico ... 37

<i>III.3. Kết quả khảo sát thực nghiệm về tính chất đột biến trên gen BRCA1 ... 40</i>

III.3.1. Tách chiết DNA ... 40

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

Trang ix Trịnh Ngọc Châu

III.3.2. Kết quả phản ứng PCR và điện di ... 41

III.3.3. Phân tích kết quả giải trình tự gen BRCA1 với cặp mồi BRCA1_11F7 và BRCA1_11R7 ... 42

<i>III.4. Kết quả khảo sát thực nghiệm về tính chất đột biến trên gen PALB2 ... 54</i>

III.4.1. Tách chiết DNA ... 54

III.4.2. Kết quả phản ứng PCR và điện di ... 54

III.4.3. Phân tích kết quả giải trình tự ... 55

PHẦN IV. KẾT LUẬ N VÀ ĐỀ NGHỊ ... 63

IV.1. Kết luận ... 63

IV.2. Đề nghị ... 64

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

Trịnh Ngọc Châu Trang 1

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ </b>

Theo tổ chức Y Tế Thế Giới (World Health Organization), ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên thế giới. Theo báo cáo Globocan (2008), có khoảng 50% các trường hợp mắc ung thư vú và 58% các ca tử vong xảy ra ở các nước đang phát triển. Theo báo cáo Globocan (WHO, 2012), trên toàn thế giới có hơn 508.000 phụ nữ tử vong do mắc ung thư vú trong năm 2011. Theo báo cáo sơ bộ của dự án ung thư quốc gia giai đoạn 2008-2010 của Duc và các cộng sự (2010) tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú ở Việt Nam đã tăng lên từ tỷ lệ 13,8/100.000 phụ nữ trong năm 2000 lên 28,1/100.000 phụ nữ trong năm 2010, ước tính 12.533 trường hợp mắc ung thư vú ở Việt Nam tính đến năm 2010 [28].

<b>Gen </b><i><b>BRCA1 (Breast cancer 1, early onset) n</b></i>ằm trên nhiễm sắc thể 17 (17q21), có chiều dài 81.189 bp [142]. Gen BRCA1 mã hóa protein có chức năng đè nén ung, tham gia quá trình sửa chữa DNA và điều hịa q trình phân bào [137].

Cơng trình nghiên cứu của King và các cộng sự (2003) xác định một số đột biến

<i>điểm trên gen BRCA1 và BRCA2 liên quan đến cơ chế hình thành và diễn tiến ung </i>

thư vú và ung thư buồng trứng. Cơng trình nghiên cứu của Anjum và các cộng sự (2014) ghi nhận tính chất đột biến trên gen BRCA1 là yếu tố nguy cơ (85%) dẫn đến bệnh ung thư vú, tuy nhiên yếu tố nguy cơ thuộc cơ chế epigenetics, sự methyl hóa DNA vượt mức là dấu chứng đặc trưng sớm trong cơ chế sinh ung thư vú [142].

<b>Gen </b><i><b>PALB2 (Partner And Localizer of BRCA2) </b></i>định vị trên cánh ngắn (p) của nhiễm sắc thể 16 ở vị trí 12.2, có chiều dài 38.196 bp [143]. Gen PALB2 mã hóa protein đè nén ung có chức năng liên kết và đồng định vị (colocalization) với protein BRCA2 trong nhân [138].

Cơng trình nghiên cứu của Casadei và các cộng sự (2013) xác định tính chất đột biến trên gen PALB2 làm tăng nguy cơ hình thành và diễn tiến ung thư vú.

Ở Việt Nam, có ít cơng bố khoa học về tính chất đột biến trên một số gen đè nén ung (tumor suppressor gene) đối với bệnh ung thư vú. Do vậy, chúng tôi thực hiện

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

Trịnh Ngọc Châu Trang 2

<b>chuyên đề khóa luận tốt nghiệp “Bước đầu khảo sát tính chất đột biến điểm trên gen </b><i><b>BRCA1, PALB2 trên b</b></i><b>ệnh nhân ung thư vú”. </b>

<b>Mục tiêu: Bước đầu xác định tính chất đột biến điểm trên gen BRCA1, PALB2 trên </b>

bệnh nhân ung thư vú ở Việt Nam. Từ đó, hướng đến sự xác định tính tương quan giữa tính chất đột biến và tính chất methyl hóa ở bệnh ung thư vú trên người bệnh Việt Nam.

<b>Nội dung nghiên cứu </b>

− <i>Khai thác dữ liệu về tính chất đột biến trên gen BRCA1, PALB2 trên bệnh </i>

nhân ung thư vú trên thế giới (có/không có tính chất methyl hóa bất thường) trên gen <i>BRCA1. </i>

− <i>Khảo sát in silico, tập trung khảo sát bộ mồi phù hợp với phương pháp PCR- </i>

giải trình tự trên vùng trình tự bao quanh các đột biến nổi trội thuộc gen

<i>BRCA1, PALB2. </i>

− Bước đầu thiết lập quy trình PCR – giải trình tự phân tích tính chất đột biến trên gen <i>BRCA1, PALB2</i> trên bệnh nhân ung thư vú, người Việt Nam.

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

Trịnh Ngọc Châu Trang 3

<b>PHẦN I. TỔNG QUAN I.1. Đại cương về ung thư </b>

<b>I.1.1. Khái niệm về ung thư </b>

Ung thư là thuật ngữ dùng để mô tả cho những dạng bệnh lý có thể ảnh hưởng đến bất kỳ cơ quan nào của cơ thể. Quá trình hình thành và diễn tiến ung thư là sự tăng sinh bất thường của các tế bào sinh ung phát triển mất kiểm sốt. Một nhóm các tế bào ung thư khởi phát có thể xâm lấn các tế bào xung quanh hoặc di căn tới các vùng khác của cơ thể qua hệ bạch huyết và hệ máu [133].

<b>Hình 1. 1. Diễn tiến của quá trình sinh ung [141]</b>

<b>I.1.2. Các yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư </b>

Sự khởi phát và diễn tiến quá trình sinh ung là hệ quả của sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của con người và một số tác nhân như sau:

− Tác nhân vật lý: tia cực tím, bức xạ ion hóa [125].

− Tác nhân hóa học: amiang, các thành phần trong khói thuốc lá, aflatoxin (chất gây nhiễm bẩn thực phẩm) và thạch tín (chất gây nhiễm bẩn nước uống) [125].

− Tác nhân sinh học: virus, ký sinh trùng [125].

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

Trịnh Ngọc Châu Trang 4 Bên cạnh đó, hút thuốc lá, uống rượu, chế độ ăn uống không hợp lý cũng là nguy cơ dẫn đến bệnh ung thư [69].

<b>I.1.3. Phân loại ung thư </b>

− Ung thư biểu mô (carcinoma): khởi phát từ các tầng biểu mô hoặc niêm mạc da và các cơ quan trong cơ thể (cổ tử cung, thanh quản, thực quản, dạ dày, gan,...) [126].

− Ung thư mô liên kết (sarcoma): khởi phát trong các mô vùng đệm, mô liên kết: xương, dây chằng, sụn [126].

− Ung thư tủy (myeloma): khởi phát từ tương bào (tế bào plasma) ở tủy xương [126].

− Ung thư bạch cầu (leukemia): ung thư tủy xương [126].

− Ung thư lympho bào (lymphoma): khởi phát từ dòng tế bào lympho [126].

<b>I.1.4. Ung thư vú </b>

Ung thư vú khởi phát từ các tế bào biểu mô ống dẫn sữa hoặc tế bào tiểu thùy. Ung thư vú xâm lấn là ung thư đã di căn từ nơi nó bắt đầu trong các ống dẫn sữa hoặc tiểu thùy đến các hạch lympho và các nơi khác trong cơ thể. Nó có thể xảy ra ở cả nam giới và nữ giới, nhưng rất hiếm gặp ở nam giới [127].

<b>I.1.5. Phân loại ung thư vú </b>

Theo tiêu chuẩn phân loại bệnh quốc tế (The International Classification of Diseases-IDC) của WHO [131] về đặc điểm mô học, ung thư vú được phân loại thành [134]:

<i>− Ung thư biểu mô ống dẫn sữa tại chỗ (Ductal Carcinoma In Situ- DCIS) là loại </i>

ung thư vú khởi phát bên trong hệ thống ống dẫn sữa nhưng không xâm lấn vùng mô lân cận.

− Ung thư biểu mô ống dẫn sữa xâm lấn (Invasive Ductal Carcinoma - IDC) là loại ung thư thường gặp nhất, khởi phát từ trong ống dẫn sữa và lan đến các mô

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

Trịnh Ngọc Châu Trang 5 xung quanh, có thể di căn đến các bộ phận khác của cơ thể qua hệ bạch huyết và mạch máu.

<i>− Ung thư biểu mô tiểu thuỳ tại chỗ (Lobular Carcinoma In Situ -LCIS) là dạng </i>

hiếm của ung thư vú, có tính chất khơng xâm lấn

− Ung thư biểu mơ tiểu thùy xâm lấn (Invasive Lobular Carcinoma - ILC) là loại ung thư vú thường gặp thứ hai, khởi phát trong tiểu thùy hoặc thùy và di căn đến các bộ phận khác của cơ thể. ILC có biểu hiện ER dương (+) và PR dương (+). Đây là dạng bệnh ung thư vú có thể điều trị thành cơng bằng liệu pháp hormone.

<b>I.1.6. Các giai đoạn phát triển của ung thư vú </b>

Biểu hiện của bệnh được mô tả ở từng giai đoạn khác nhau [128] Giai đoạn 0

Đây là giai đoạn sớm, không xuất hiện tế bào bất thường hoặc tế bào ung thư và khơng có tính chất xâm lấn. Ở giai đoạn này, loại ung thư vú thường gặp là DCIS.

Giai đoạn I

Đây là giai đoạn ung thư vú xâm lấn, bao gồm giai đoạn IA và IB.

<i>− Giai đoạn IA: Kích thước khối u </i>≤ 2 cm, khơng di căn, không có hạch bạch huyết.

<i>− Giai đoạn IB: Xuất hiện các tế bào bất thường từ 0,2 mm -2 mm trong hạch </i>

bạch huyết, có thể có khối u ≤<i> 2 cm. </i>

Giai đoạn II

<i>− Giai đoạn IIA: Kích thước khối u từ 2 cm – 5 cm nhưng không di căn hoặc </i>

khối u ≤ 2 cm nhưng đã di căn đến các hạch bạch huyết ở nách hoặc xuất

<i>hiện khối u ≥ 2 mm trong các hạch bạch huyết. </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

Trịnh Ngọc Châu Trang 6

<b>Hình 1. 2. Tỉ lệ mắc ung thư ở phụ nữ trên thế giới [125]</b>

<i>− Giai đoạn IIB: Kích thước khối u ≥ 5 cm khơng di căn hoặc kích thước khối </i>

u từ 2 cm – 5 cm nhưng di căn đến các hạch bạch huyết ở nách và xuất hiện

<i>các tế bào bất thường từ 0,2 mm -2 mm trong hạch bạch huyết. </i>

Giai đoạn III

<i>− Giai đoạn IIIA: Kích thước khối u ≥ 5 cm đã di căn đến các hạch bạch huyết </i>

ở nách hoặc xuất hiện thêm các tế bào bất thường từ 0,2 mm -2 mm trong hạch bạch huyết.

<i>− Giai đoạn IIIB: Xuất hiện các khối u có kích thước bất kỳ đã di căn đến thành ngực, có thể lan ra đến 9 hạch bạch huyết ở nách. </i>

<i>− Giai đoạn IIIC: Xuất hiện các khối u có kích thước bất kỳ có thể lan ra </i>

thành ngực hoặc da vú, có thể lan ra ≥ 10 hạch bạch huyết ở nách hoặc đã

<i>lan đến các hạch bạch huyết gần xương đòn, xương ức. </i>

Giai đoạn IV

Giai đoạn này, ung thư vú xâm lấn mà đã lan rộng ra khỏi vú và các hạch bạch huyết lân cận đến các cơ quan khác của cơ thể như phổi, da, xương, gan hoặc não.

<b>I.1.7. Tình hình ung thư vú ở phụ nữ trên thế giới </b>

Theo báo cáo Globocan 2012 [129], ung thư vú là loại ung thư thường gặp nhất ở phụ nữ trên thế giới với ước tính trên 1,67 triệu trường hợp mới được chẩn đoán vào năm 2012 , chiếm 25,1 % trong tổng tất cả các ung thư.

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

Trịnh Ngọc Châu Trang 7

<b>I.1.8. Tình hình ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam </b>

Theo báo cáo Globocan 2012 [129], ung thư vú chiếm tỉ lệ cao nhất trong các loại ung thư ở phụ nữ Việt Nam với ước tính 11.067 trường hợp mắc bệnh tương đương với 20,3 % số trường hợp bị ung thư.

<b>I.1.9. Các yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư vú </b>

Các yếu tố thường dẫn đến ung thư vú ở phụ nữ:

− Lịch sử gia đình: 5- 10% do sự di truyền tính chất bất thường trên gen

<i>BRCA1 và BRCA2 [130]. </i>

− Tác nhân vật lý: sự tiếp xúc với tia bức xạ vào vùng ngực [69].

− Liệu pháp thay thế hormone (HRT- hormone replacement therapy)/ hormone therapy) [69].

(HT-− Tuổi tác: phụ nữ hơn 30 tuổi mang thai con đầu tiên, phụ nữ có kinh nguyệt trước 11 tuổi, những người có thời kỳ mãn kinh sau tuổi 54 do ảnh hưởng hormone estrogen và progesterone [69].

− Sử dụng thuốc ngừa thai [69].

− Chế độ dinh dưỡng: thừa cân, uống rượu, ít vận động [131].

Ngồi ra, yếu tố sinh học phân tử bị biến đổi bất thường cũng góp phần trong sự hình thành và diễn tiến ung thư như: protein p53, protein HER2/neu, ER, PR. Cơng trình khoa học của Lee và các cộng sự (2012) đã ghi nhận ung thư vú được phát hiện khi “Triple negative” qua chỉ số lâm sàng ER (-), PR (-), HER2/neu (-).

<b>Hình 1. 3. Tỉ lệ mắc ung thư ở phụ nữ tại Việt Nam [125] </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

Những biến đổi di truyền trong gen p53 làm tăng đáng kể nguy cơ phát triển ung thư vú, đây là một phần của một hội chứng ung thư hiếm gặp được gọi là hội chứng Li-Fraumeni. Đột biến gen p53 xảy ra ở 20 -40% bệnh nhân mắc ung thư vú [135].

<i> Gen HER2/neu (Human Epidermal growth factor Receptor) </i>

Gen <i>HER2/neu là m</i>ột thành viên trong yếu tố phát triển biểu bì (Epidermal Growth Factor - EGF) thuộc họ các thụ thể tyrosine kinases [136]. Biểu hiện vượt mức của oncogene này đã được tìm thấy 20 - 30 % trong các khối u ung thư vú (Schnitt <i>et al. 2010; Mitri et al. 2012). Trong nh</i>ững năm gần đây, protein này đã trở thành dấu chứng sinh học và mục tiêu điều trị cho khoảng 30 % các bệnh nhân ung

<i>thư vú (Mitri et al. 2012). </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

Trịnh Ngọc Châu Trang 9

<b>I.2.1. Sự methyl hóa DNA </b>

Là q trình chuyển nhóm methyl từ S-adenosylmethionine (SAM) đến vị trí C5 của cytosine. Trong tế bào động vật, cytosine thường đứng trước guanine (CpG) tạo thành 5-methylcytosine (5mC) (Egger et al. 2004; Jones et al. 2002; Robertson

<i>et al. 2002). S</i>ự methyl hóa các đảo CpG thường gặp ở vùng promoter hoặc vùng exon 1.

Sự methyl hóa các vị trí đảo CpG trong bộ gen người được thực hiện bởi họ enzyme DNA methyltransferases (DNMTs) (Egger <i>et al. 2004; Robertson et al. </i>

2002), gồm DNMT 1, DNMT 3a, DNMT 3b (Bestor et al. 2000).

<b>Hình 1. 5. Sự methyl hóa [52] Hình 1. 4. Cơ chế epigenetics [51] </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

Trịnh Ngọc Châu Trang 10 Sự biến đổi chức năng của các enzym DNMTs dẫn đến sự methyl hóa DNA bất

<i>thường: sự methyl hóa vượt mức (hypermethylation) DNA (Laird et al. 1999) hoặc giải methyl hóa (hypomethylation) DNA (Ehrlich et al. 2002). </i>

Cytosine-phosphodiester-Guanine (CpG) là cặp dinucleotide được hình thành bởi cytosine tạo liên kết phosphodiester với guanine (Robertson et al. 2002). Đảo CpG là các đoạn DNA giàu CpG, có kích thước khoảng 200 - 1000 nucleotide, GC

<i>≥ 50 % (Bird et al. 1985). Trong bộ gen người, các đảo CpG chiếm khoảng 70 %, đặc biệt tập trung 50 – 60 % ở vùng promoter (Larsen et al. 1992; Wang et al. </i>

2004).

<b>I.3. Đột biến điểm </b>

<b>I.3.1. Khái niệm về đột biến điểm </b>

Đột biến điểm là sự thay đổi một hay một vài nucleotide trong trình tự nucleotide của gen loài sinh vật. Đột biến điểm xảy ra do DNA sai hỏng trong quá trình sao chép không được sửa chữa hoặc do bị chèn hay xóa các đoạn DNA di truyền [9]. Đột biến có tần suất xuất hiện < 1% trong quần thể. Đột biến có thể được di truyền từ cha mẹ (đột biến mầm) hoặc tích lũy trong quá trình sống của cá nhân

<b>(đột biến soma), chủ yếu gây bệnh cho người [59]. </b>

<b>I.3.2. Phân loại các đột biến điểm [139] </b>

− Đột biến sai nghĩa (Missensen): thay đổi một nucleotide dẫn đến thay đổi một axit amin trong chuỗi protein.

− Đột biến đồng nghĩa (silent substitution): thay đổi một nucleotide nhưng

<b>không làm thay đổi chuỗi protein. </b>

− Đột biến vô nghĩa (Nonsense): thay đổi một nucleotide dẫn đến thay đổi một axit amin kết thúc làm dừng lại qua trình dịch mã protein.

− Đột biến chèn (Insertion): thêm một hoặc một vài nucleotide làm lệch khung dịch mã các protein sau có thể không hoạt động đúng.

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

Trịnh Ngọc Châu Trang 11 − Đột biến xóa (Deletion): mất một hoặc một vài nucleotide làm lệch khung dịch

mã các protein sau có thể không hoạt động đúng.

<b>I.3.3. Sự thay đổi nucleotide trong đột biến điểm </b>

− Transitions (đột biến đồng hoán): là sự thay đổi nucleotide purine thành nucleotide purine hoặc nucleotide pyrimidine thành nucleotide pyrimidine. − Transversions (đột biến dị hoán): là sự thay đổi nucleotide purine thành

nucleotide pyrimidine hoặc ngược lại [35].

<b>I.3.4. Đột biến trên gene BRCA1 </b>

<i>Khảo sát in silico trên gen BRCA1 ước lượng có khoảng 1863 amino acid [140]. </i>

Theo nguồn dữ liệu của nhóm ARUP Laboratories thuộc trường đại học UTAH

<i>(Mỹ) đã công bố các loại đột biến trên gen BRCA1. </i>

<b>I.4. Single-nucleotide polymorphism </b>

Tính đa hình đơn nucleotide (Single-nucleotide polymorphism – SNP) là tính chất biến thể xảy ra ở bất kỳ vị trí nucleotide trong bộ gen (vùng mã hóa, vùng intron và vùng không rõ chức năng). Tần số xuất hiện của biến thể >1% quần thể

<b>[59]. </b>

<b>I.5. Tổng quan về gene </b>

<i><b>Hình 1. 6. Đột biến trên gene BRCA1 [140] </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

Trịnh Ngọc Châu Trang 12

<b>I.5.1. Gen BRCA1 (Breast cancer 1, early onset) </b>

Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen BRCA1

Gen <i>BRCA1 được nhóm nghiên cứu của Hall et al. công bố lần đầu tiên vào </i>

năm 1990. Gen nằm trên nhiễm sắc thể 17 (17q21), có chiều dài 81.189 bp [142], mã hóa protein có chức năng đè nén ung, tham gia quá trình sửa chữa DNA và điều hịa q trình phân bào [137].

ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated Protein) là một thành viên thuộc họ kinase có trình tự tương đồng với PI3K (Phosphoinositide 3-kinase). Con đường truyền tín hiệu ATM đáp ứng khi DNA bị sai hỏng, duy trì tính ổn định của bộ gen thông qua sự phối hợp của các trạm kiểm soát chu kỳ tế bào (checkpoint), sửa chữa DNA và chu trình chết tế bào (Apoptosis) (Shiloh et al. 2003; Bartek et al. 2004; Bartek <i>et al. 2007). </i>

Trong tế bào bình thường, protein CtIP gắn ở đầu C của protein BRCA1 (Li et

<i>al. 1999; Wong et al. 1998; Yu et al. 2000; Yu et al. 1998) có nhi</i>ệm vụ điều hịa âm gen <i>BRCA1 trong quá trình phiên mã (Wang et al. 2000). Khi DNA b</i>ị sai hỏng, enzyme ATM phosphoryl hóa protein BRCA1. Sau khi đáp ứng ATM, protein CtIP bị phosphoryl hóa tách khỏi protein BRCA1 (Yu et al. 2000). Phức hợp các protein BRCA1, BRCA2, BARD, RAD51<i> ho</i>ạt động sửa chữa DNA sai hỏng. Khi gen

<i>BRCA1 b</i>ị biến đổi bất thường (đột biến, epigenetics) dẫn đến khơng thể sửa chữa DNA và điều hịa q trình phân bào.

<i><b>Hình 1. 7. Định vị gen BRCA1 trên nhiễm sắc thể 17 [132] </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

Trịnh Ngọc Châu Trang 13

<b>Hình 1. 8. Con đường truyền tín hiệu ATM [110]</b>

Các cơng trình nghiên cứu về gen BRCA1.

Cơng trình nghiên cứu của King và các cộng sự (2003) xác định một số đột biến điểm trên gen BRCA1 và BRCA2 liên quan đến cơ chế hình thành và diễn tiến ung thư vú và ung thư buồng trứng. Cơng trình nghiên cứu của Anjum và các cộng

<i>sự (2014) ghi nhận tính chất đột biến trên gen BRCA1 là yếu tố nguy cơ (85%) dẫn </i>

đến bệnh ung thư vú, tuy nhiên yếu tố nguy cơ thuộc cơ chế epigenetics, sự methyl hóa DNA vượt mức là dấu chứng đặc trưng sớm trong cơ chế sinh ung thư vú.

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

Trịnh Ngọc Châu Trang 14 Công trình nghiên cứu của Wong và các cộng sự (2011) khảo sát tính chất

<i>methyl hóa vượt mức trên gen BRCA1 bằng việc nghiên cứu trên 255 phụ nữ được </i>

chẩn đoán mắc bệnh ung thư vú trước tuổi 40 mang tính chất đột biến trên gen

<i>BRCA1. Trong s</i>ố đó, nhóm 1 có 52/255 bệnh nhân mang nhiều hơn 5 vị trí đột biến, nhóm 2 có 39/255 bệnh nhân mang 4 vị trí đột biến và nhóm 3 có 164/255

<i>bệnh nhân đã có ít hơn 4 vị trí đột biến trên gen BRCA1. Kết quả nghiên cứu của </i>

nhóm tác giả đã xác định tần số methyl hóa nhóm 1, nhóm 2, nhóm 3 tương ứng (16/52) 31 %, (4/39) 10 %, (8/164) 5 %. Điều đó cho thấy mối tương quan giữa tính

<i>chất đột biến và tính chất methyl hóa vượt mức trên gen BRCA1. </i>

Cơng trình nghiên cứu của nhóm tác giả Phuong và các cộng sự (2014) xác

<i>định tần số methyl hóa vượt mức trên gen BRCA1 là (78/95) 82,1 %, có thể được sử </i>

dụng như các dấu chứng sinh học tiềm năng với bệnh nhân ung thư vú Việt Nam.

<b>I.5.2. Gene PALB2 (Partner And Localizer of BRCA2) </b>

Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen PALB2

Định vị trên cánh ngắn (p) của nhiễm sắc thể 16 ở vị trí 12.2, có chiều dài 38.196 bp [143]. Gen <i>PALB2 mã hóa p</i>rotein đè nén ung có chức năng liên kết và đồng định vị (colocalization) với protein BRCA2 trong nhân [138].

Các protein BRCA1, PALB2 và BRCA2 đều tham gia vào con đường tổng hợp các sản phẩm của các gen có tính nhạy với ung thư vú. Đây là con đường trung gian HR (homologous recombination) duy trì tính ổn định gen (Park et al. 2014). Trong phức hợp các protein sửa chữa DNA, BRCA1 liên kết với BRCA2 qua PALB2 (Xia

<b>Hình 1. 9. Vị trí của gen PALB2 trên nhiễm sắc thể 16 [133]</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

Trịnh Ngọc Châu Trang 15

<i>et al. 2006)</i>. Hơn nữa, protein BRCA1 thúc đẩy sự tích lũy PALB2 và BRCA2 tại các vị trí DNA sai hỏng và sự tương tác này quan trọng cho việc sửa chữa tái tổ hợp

<i>tương đồng (homologous recombination repair) (Zhang et al. 2009). Protein </i>

BRCA1 liên kết với protein PALB2 qua cuộn motif “Coiled-coil” có ở cả hai protein, PALB2 sau đó trực tiếp liên kết với đầu N của BRCA2 qua vùng WD40, BRCA2 trực tiếp liên kết với RAD51 qua vùng lặp lại BRC. Tuy nhiên protein PALB2 có thể tự tích lũy RAD51 mà khơng cần phụ thuộc vào BRCA2 (Park et al. 2014).

<b>Hình 1. 10. Cơ chế sửa chữa DNA sai hỏng qua tái tổ hợp tương đồng [78] </b>

Các cơng trình nghiên cứu về gen PALB2

Nhóm nghiên cứu Rahman và các cộng sự (2007) tại Anh xác định tính chất đột biến điểm trên gen PALB2 trong 10/923 bệnh nhân ung thư vú có tính chất gia đình so với 0/1084 người khơng mắc bệnh ung thư (đối chứng). Kết quả nghiên cứu đã

<i>xác định đột biến gen PALB2 đã làm tăng 2- 3 lần nguy cơ bị ung thư vú. </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

Trịnh Ngọc Châu Trang 16 Công trình nghiên cứu Cao và các cộng sự (2008) ghi nhận đột biến lệch khung (c.1050-1051 del AA ins TCT) tại exon 4 của gen PALB2 chiếm 44,1% (15/34), kết quả này xác định đột biến tại exon 4 của gen PALB2 là một dấu chứng sinh học liên quan đến sàng lọc ung thư vú trong cộng đồng người Trung Quốc.

Cơng trình nghiên cứu của Casadei và các công sự (2011) sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự trên mẫu của bệnh nhân ung thư vú tại Mỹ. Kết quả nghiên cứu đã ghi nhận tỉ lệ bệnh nhân mang đột biến là 3,4% (33/972) và không

<i>mang đột biến trên gen BRCA1 và BRCA2. </i>

Cơng trình nghiên cứu của Janatova và các cộng sự (2013) xác định được 13 thể đột biến điểm trên gen PALB2 trong 16/409 bệnh nhân (3,9%) thuộc cộng đồng người Cộng hòa Czech.

<b>I.6. Phương pháp xác định tính chất đột điểm và tính chất methyl hóa. I.6.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) </b>

Phương pháp PCR do Karl Mullis và các cộng sự phát minh năm 1985. Đây là

<i>phương pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của tế bào [1]. </i>

Nguyên tắc: PCR là phương pháp tổng hợp đoạn DNA dựa trên mạch khuôn ban đầu nhờ hoạt động của DNA polymerase và cặp mồi chuyên biệt, khuếch đại, nhân bản số lượng lớn bản sao của một trình tự xác định [1].

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước [1].

– Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturation), DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94<small>0</small>C – 95<small>0</small>C trong khoảng 30 giây đến 1 phút. – Bước 2: Giai đoạn lai (hybridization), nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Nhiệt độ này giao động trong khoảng 40<small>0</small>C đến 70<small>0</small>C, tùy thuộc vào Tm của mồi sử dụng và kéo dài khoảng 30 giây đến 1 phút.

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

Trịnh Ngọc Châu Trang 17 – Bước 3: Giai đoạn kéo dài (elongation), nhiệt độ được tăng đến 72<small>0</small>C giúp cho

DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.

<b>Hình 1. 11. Nguyên tắc của phản ứng PCR [ 1] </b>

<b>I.6.2. Phương pháp PCR giải trình tự </b>

Giải trình tự DNA là quá trình xác định các nucleotide trên chuỗi DNA. Hiện nay, phương pháp “Sanger sequencing” được thiết lập bởi Frederick Sanger vào năm 1977 [87] được sử dụng phổ biến giải trình tự DNA. Kỹ thuật này dựa vào nguyên tắc “dideoxy” nhóm 3’OH thay bằng H trong các nucleotide, đầu 3’ tự do này sẽ làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA [87].

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

Trịnh Ngọc Châu Trang 18

<i>Chú thích: </i>

− <i>(A): Trình tự mồi gắn đặc hiệu bắt cặp tại vị trí đầu trình tự DNA mục tiêu </i>

− <i>(B): Môi trường được bổ sung 4 loại deoxynucleotide dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) cùng với 4 loại di-deoxynucleotide ddNTP (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP). </i>

−<i> (C): Các đoạn DNA ngừng tổng hợp tại các vị trí di-deoxynucleotide (ddNTP). </i>

− <i>(D): Mỗi ddNTP được đánh dầu bằng một fluochrome khác nhau. Sau đó kết quả huỳnh quang sẽ được đọc bằng máy ghi tự động. </i>

<b>Hình 1. 12. Phương pháp “Sanger sequencing” [87] </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

− IDT Analyzer 3.1 ( − Chương trình BLAST (NCBI)

<b>II.1.2. Các trang web</b>

<b>: </b>

− NCBI ( − Genecard ( − WHO (

<b>II.1.3. </b>

<b>Xử lý thống kê </b>

Phần mềm Excel và MedCalc (phiên bản 12.7).

<b>II.1.4. Vật liệu thực nghiệm </b>

Mẫu mô đúc paraffin được cung cấp từ bệnh viện Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh từ năm 2010 đến năm 2011 (có chỉ số hóa mô miễn dịch: p53 và HER2/neu).

<b>II.2. Phương pháp </b>

<b>II.2.1. Khai thác dữ liệu </b>

Chúng tôi thu thập các bài báo khoa học trên NCBI về gen BRCA1, PALB2 và các cơng trình khoa học xác định tính chất đột biến của gen BRCA1, PALB2 đối với ung thư vú bằng một số từ khóa như: “BRCA1 gene”, “PALB2 gene”, “breast cancer”, “mutations”,…

Chúng tôi sử dụng phần mềm Excel và MedCalc (phiên bản 12.7) nhằm phân tích tần số đột biến điểm trên gen BRCA1, PALB2 trong các loại mẫu bệnh phẩm ung thư vú.

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

Thiết kế và đánh giá mồi

− IDT analyzer ( xác định các thông số của mồi như: chiều dài, %GC, nhiệt độ nóng chảy, cấu trúc thứ cấp self dimer, hetero dimer, hairpin-loop.

− Annhyb (4.964): kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi và kích thước sản phẩm.

<b>II.2.3. Khảo sát thực nghiệm về tính chất đột biến </b>

Tách chiết DNA

<i><b>❖ Nguyên tắc </b></i>

Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA bộ gen người từ các mô đúc paraffin. Màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh (SDS) kết hợp sử dụng enzym proteinase K. Sau đó, protein sẽ được biến tính và bị loại bỏ bằng phenol/chloroform. DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol tuyệt đối trữ lạnh.

<i><b>❖ Hóa chất </b></i>

− Phenol (pH=8) − Chloroform − SDS 10% − NaCl 5M − Proteinase K

− EDTA 0,5M (pH=8) − Tris HCl 1M (pH=8) − C<small>2</small>H<small>3</small>O<small>2</small>NH<small>4</small> 5M − Ethanol tuyệt đối

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

Trịnh Ngọc Châu Trang 21 ❖ <i><b>Thiết bị</b></i>

− Máy ly tâm lạnh (Hettich) − Bể ổn nhiệt (Thermo Final Test)

<i><b>❖ Các bước tiến hành tách chiết DNA từ các mô đúc paraffin [82] </b></i>

− Cắt nhỏ mẫu bệnh phẩm cho vào ống eppendorf loại 1,5 ml.

− Bổ sung 1 ml dung dịch Xylene, lắc đều. Sau đó, ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 3 phút ở 4<small>0</small>C. Sau đó thu cắn, loại bỏ dịch nổi.

− Bổ sung 1 ml dung dịch Ethanol tuyệt đối, lắc đều. Sau đó, ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 3 phút ở 4<small>0</small>C. Sau đó thu cắn, loại bỏ dịch nổi. Lặp lại bước trên 2-3 lần.

− Bổ sung 1 ml dung dịch Ethanol 70 %, lắc đều. Sau đó, ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 3 phút ở 4<small>0</small><b>C. Sau đó thu cắn, loại bỏ dịch nổi. Lặp lại bước trên </b>

2-3 lần.

− Bổ sung 1 ml dung dịch Ethanol 50 %, lắc đều. Sau đó, ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 3 phút ở 4<small>0</small>C. Sau đó thu cắn, loại bỏ dịch nổi. Để khô trong 30 phút. Lặp lại bước trên 2-3 lần.

− Bổ sung một thể tích phù hợp hỗn hợp dung dịch ly giải (NaCl 5M, Tris-HCl 1M (pH=8), dung dịch đệm EDTA 0,5M (pH=8), SDS 10%, và H<small>2</small>O cất hai lần). Bổ sung 10µl proteinase K (nồng độ 20 ng/ml). Sau đó tiến hành ủ trong bể ổn nhiệt ở 56<small>0</small>C trong 3 ngày, thỉnh thoảng lắc nhẹ.

− Bổ sung một thể tích l phù hợp của dung dịch phenol: chloroform (tỷ lệ 1:1), trộn đều. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút ở 4<small>0</small>C. Chuyển phần dịch nổi

<b>phía trên sang ống eppendorf sạch. Lặp lại bước này thêm một lần. </b>

− Thêm một lượng dung dịch chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được, trộn nhẹ. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút ở 4<small>0</small>C. Chuyển phần dịch nổi

<b>phía trên sang ống eppendorf sạch. </b>

− Bổ sung một lượng Ammonium acetate (NH<small>4</small>OAc) 5M và một lượng Ethanol

<b>tuyệt đối theo tỷ lệ 0,2: 2,5 thể tích so với thể tích dịch nổi. </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

Trịnh Ngọc Châu Trang 22 − Trộn đều. Để kết tủa DNA ở -20<small>0</small>C trong 30 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút

trong 20 phút ở 4<small>0</small><b>C. Loại bỏ phần dịch nổi, thu tủa. </b>

− Bổ sung một thể tích Ethanol 70% trữ lạnh để rửa sạch kết tủa. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4<small>0</small><b>C. </b>

− <b>Thu tủa, loại bỏ dịch nổi (dung dịch ethanol). Để khô trong 30 phút. </b>

− Hòa tan kết tủa DNA trong 30-50 µl nước cất hai lần vô trùng. Bảo quản DNA ở 4<small>0</small>C đến -20<small>0</small><b>C. </b>

Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận bằng phương pháp đo mật độ quang

❖ <i><b>Nguyên tắc</b></i>

Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm. Giá trị mật độ quang OD<small>260 </small>nm (Optical Density 260 nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch (với A<small>260 </small>nm= 1OD = 50 µg/ml DNA sợi đơi). Độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A<small>260</small>/A<small>280</small><i><b>. </b></i>

<i><b>❖ Hóa chất và thiết bị </b></i>

− Nước cất hai lần

− Máy đo quang phổ (Bio Rad)

<i><b>❖ Các bước tiến hành </b></i>

DNA sau khi tách chiết được pha loãng bằng nước cất vô trùng. Sau đó chuyển tất cả dung dịch DNA pha loãng vào cuvette. Sau đó, tiến hành đo nồng độ DNA ở bước sóng 260 nm và xác định độ tinh sạch của dung dịch được xác định bằng OD<small>260</small>/OD<small>280</small>.

Phản ứng PCR

Sau khi thực hiện tách chiết các mẫu DNA bộ gen người từ mẫu đúc paraffin, chúng

<i>tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự exon 11 trên gene BRCA1 và trình tự exon 4 trên gene PALB2. </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

Trịnh Ngọc Châu Trang 23

<i><b>❖ Hóa chất: </b></i>

− Dung dịch Master mix 2X (Hãng My tab pol) − Bộ mồi BRCA1_11F7 và BRCA1_11R7 (hãng IDT) − Bộ mồi PALB2_4F1 và PALB2_4R1 (hãng IDT) − Nước cất hai lần.

<i><b>❖ Thiết bị: </b></i>

− Máy luân nhiệt (Thermo cycler, hãng BioRad)

<b>Bảng 2. 1. Thành phần phản ứng PCR </b>

<b>Thành phần Thể tích (</b>µl)

<b>Bảng 2. 2 Chu kỳ nhiệt phản ứ ng PCR </b>

Nhiệt độ (<small>0</small>C) Thời gian

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

<i><b>kích thước đã biết trước của thang chuẩn. ❖ Thiết bị, hóa chất </b></i>

- Buồng điện di

- Máy đọc gel ... Bio Rad - Gel agarose ... Bio Rad - 25X TAE Buffer ... Bio Rad - Ethidium bromide ... Bio Rad - Thang chuẩn 50bp……….Bioline

<i><b>❖ Các bước tiến hành: </b></i>

Chúng tơi hòa trộn 6 µl sản phẩm DNA và 1 µl dung dịch nạp mẫu (7X). Sau đó, chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose 1,5 % ở hiệu điện thế 75V trong 30 phút.

<b>II.2.4. Phân tích kết quả thực nghiệm </b>

Chúng tơi gửi giải trình tự hai chiều sản phẩm PCR tại Công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa. Sau đó, chúng tôi sử dụng phần mềm Chromas Lite để hiện thị kết quả giải trình tự sản phẩm PCR và công cụ CLC (CLC Main Workbench 7) để phân tích kết quả giải trình tự.

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

Trịnh Ngọc Châu Trang 25

<b>PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN </b>

<b>III.1. Kết quả khai thác dữ liệu và khảo sát in silico về tính chất đột biến trên gen BRCA1 </b>

<b>III.1.1. Khai thác dữ liệu </b>

Nhằm mục đích tìm hiểu tính chất đột biến điểm trên gen BRCA1 liên quan đến các bệnh ung thư, chúng tôi khai thác dữ liệu trên NCBI bằng các từ khóa: “BRCA1 gene”, “mutations”, “breast cancer”… Chúng tôi thu thập được tổng số 21 bài báo khoa học bằng tiếng Anh có liên quan đến tính chất đột biến trên gen BRCA1.

<i><b>Bảng 3. 1. Các cơng trình nghiên cứu về tính chất đột biên trên gen BRCA1 </b></i>

báo

Tài liệu tham khảo

1 Tổng quan gen BRCA1 10 [90], [7], [8], [105], [66], [111], [119], [120], [137], [110]

2 Nghiên cứu thực nghiệm về tính chất đột biến trên gen <i>BRCA1 </i>

21 [61], [33], [98], [96], [85], [73], [107], [97], [5], [30], [80], [94], [43], [29], [20], [38], [67], [60], [79], [56], [42]

Bộ dữ liệu về tính chất đột biến trên gen BRCA1 trên thế giới

Chúng tôi tiến hành thu thập các cơng trình nghiên cứu trên thế giới về các

<i>đột biến trên gen BRCA1 lên quan đến bệnh ung thư và thống kê thông tin đột biến </i>

(Bảng PL.3.1). Với bảng dữ liệu, chúng tôi tiến hành khảo sát tỉ lệ đột biến theo exon (Hình 3.1).

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

Trịnh Ngọc Châu Trang 26

<b>Hình 3. 1. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các exon </b>

Kết quả hiển thị ở Hình 3.1 cho thấy tỉ lệ đột biến gen BRCA1 xuất hiện trên các exon trong khoảng 0,2 - 26,8%, điển hình đối với exon 11 chứa nhiều đột biến với tỉ lệ trung bình có trọng số xấp xỉ 0,7% và chứa nhiều “marker” có tỉ lệ cao (Bảng PL.3.2). Chúng tôi tiếp tục khảo sát tỉ lệ đột biến theo từng châu lục

<b>Hình 3. 2. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên từng châu lục </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

Trịnh Ngọc Châu Trang 27 Kết quả Hình 3.2 cho thấy tỉ lệ đột biến tại Châu Á cao nhất với 6,2 %. Chúng tôi cũng đặc biệt quan tâm đến tỉ lệ đột biến tại Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Úc với các tỉ lệ từ 1,8 - 5% (Bảng PL.3.3).

<b>Hình 3. 3. Tổng số phương pháp trên các exon </b>

Chúng tôi thu thập một số phương pháp được sử dụng khảo sát tính chất đột biến trên gen BRCA1. Kết quả thể hiện ở Hình 3.3 cho thấy phương pháp PCR kết hợp giải trình tự là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất chiếm tới 51,5% (Bảng PL.3.4) để phân tích tính chất đột biến.

Bộ dữ liệu về tính chất đột biến trên gen BRCA1 ở Châu Âu

<b>Hình 3. 4. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các exon ở Châu Âu </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

Trịnh Ngọc Châu Trang 28 Xét về tỷ lệ đột biến trên exon ở các quốc gia thuộc châu Âu, chúng tôi ghi nhận tỉ lệ đột biến gen BRCA1 xuất hiện trong các exon trong khoảng 0,5 - 14,4% (Bảng PL.3.5). Đáng chú ý, tỉ lệ đột biến gen BRCA1 tại Nga là cao nhất (Bảng PL.3.6). Qua kết quả thống kê, chúng tôi cũng nhận thấy rằng các đột biến thường tập trung tại exon 11 và xuất hiện ở nhiều quốc gia như: Anh, Nga.. (Bảng PL.3.7). Phương pháp thường được sử dụng ở Châu Âu để xác định tính chất đột biến là SSCP và PCR kết hợp giải trình tự (Bảng PL.3.8).

Bộ dữ liệu về tính chất đột biến trên gen BRCA1 ở Châu Mỹ

<b>Hình 3. 5. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các exon ở Châu Mỹ </b>

Chúng tôi ghi nhận tỉ lệ đột biến gen BRCA1 xuất hiện trong các exon trong khoảng 0,2-26,8% (Bảng PL.3.9). Các cơng trình nghiên cứu được công bố tập trung nhiều nhất tại Mỹ, với tỉ lệ đột biến trung bình có trọng số là 2,2%. Qua kết quả thống kê, chúng tôi cũng nhận thấy rằng, các đột biến thường tập trung tại exon 11 và xuất hiện ở cả Mỹ và Canada (Bảng PL.3.10). Phương pháp thường được sử dụng ở Châu Mỹ để xác định tính chất đột biến là PCR kết hợp giải trình tự (Bảng PL.3.11).

<b>III.1.2. Khảo sát in silico </b>

Một số trình tự mồi thu thập trong các cơng trình khoa học

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

Trịnh Ngọc Châu Trang 29

<i>Dựa vào cơng trình nghiên cứu của Southey et al. (1999), chúng tôi thu thập </i>

và ghi nhận được 12 cặp mồi cho phương pháp PCR kết hợp giải trình tự trên exon 11 gen <i>BRCA1 (B</i>ảng 3.2).

<i><b>Bảng 3. 2. Một số trình tự mồi khuếch đại exon 11 gen BRCA1 </b></i>

<b><small>Chiều dài (bp) </small></b>

<b><small>Vị trí sản phẩm </small></b>

<b><small>TLTK </small></b>

<small>1129–1411 [40] </small>

<small>1363–1590 [40] </small>

<small>1561–1796 [96] </small>

<small>1790–2059 [40] </small>

<small>2768-3234 [40] </small>

<small>2964-3420 [96] </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

Trịnh Ngọc Châu Trang 30

<small>3417-3761 [40] </small>

<small>3744-4215 [40] </small>

Chúng tôi nhận thấy rằng cặp mồi BRCA1_11F7 và BRCA1_11R7 khuếch đại được đoạn sản phầm 514 bp. Sau đó, chúng tôi đánh giá thông số vật lý của mồi bằng trang wed trực tuyến IDT. Kết quả ghi nhận trong Bảng 3.3.

<b>Bảng 3. 3. Thông số vật lý của cặp mồi BRCA1_11F7 và BRCA1_11R7 </b>

Tên mồi Kích thước (bp) %GC Tm (⁰C) (1) (2) (3)

<i><b>Chú thích: (1): ∆G của cấu trúc kẹp tóc (kcal/mole); (2): ∆G của cấu trúc self </b></i>

<i>dimer ∆G (kcal/mole); (3): ∆G của cấu trúc hetero dimer ∆G (kcal/mole) </i>

Sau khi ghi nhận những thông số vật lý của cặp mồi BRCA1_11F7 và BRCA1_11R7 (Hình PL.3.1-Hình PL.3.7), chúng tơi tiến hành đánh giá theo những tiêu chí sau:

- Chiều dài mồi hồn toàn phù hợp, dao động trong khoảng từ 18-25 bp.

- %GC của cặp mồi nằm trong từ 50-60%. Nếu %GC quá cao sẽ làm nhiệt độ bắt cặp của bộ mồi tăng cao, dễ làm biến tính khơng tốt trong quá trình thực hiện phản ứng PCR.

- Nhiệt độ nóng chảy của hai mồi khác biệt khơng q 5<small>0</small>C.

- Các cấu trúc thứ cấp (kẹp tóc, tự bắt cặp, dị bắt cặp): các cấu trúc thứ cấp càng bền vững thì hiệu quả của phản ứng PCR càng thấp do chúng ta nên chọn những cặp mồi có ∆G nhỏ hơn 9 kcal/mole thì liên kết yếu sẽ không ảnh hưởng đến phản ứng PCR.

</div>