nghiên cứu quy trình chiết tách và cô lập palmatine chloride từ thân rễ cây hoàng đằng fibraurea tinctoria l

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.36 MB, 73 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH VÀ CƠ LẬP PALMATINE CHLORIDE TỪ THÂN RỄ CÂY

HỒNG ĐẰNG (FIBRAUREA TINCTORIA L.)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CNSH Y DƯỢC

CBHD: ThS. Nguyễn Minh Hoàng

SVTH: Đặng Hồi Thương MSSV: 1553010202

Tp. Hồ Chí Minh , tháng 05 năm 2019

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH VÀ CƠ LẬP PALMATINE CHLORIDE TỪ THÂN RỄ CÂY

HOÀNG ĐẰNG (FIBRAUREA TINCTORIA L.)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CNSH Y DƯỢC

SVTH: Đặng Hoài Thương MSSV: 1553010202

ThS. Nguyễn Minh Hồng Khóa: 2015 - 2019

Tp. Hồ Chí Minh , tháng 05 năm 2019

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG i

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã hết lịng truyền đạt cho em những kiến thức quý giá trong những năm tháng trên giảng đường đại học. Chính những kiến thức mà Thầy Cơ giảng dạy là nền tảng cho em trong quá trình thực hiện đề tài thực tập tốt nghiệp.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Thầy Nguyễn Minh Hoàng, người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, dạy bảo và truyền đạt những kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu đồng thời tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hồn thiện đề tài thực tập này.

Ngồi ra khơng thể thiếu sự giúp đỡ của những người bạn thực tập và các em học việc trong phịng Hóa – Môi trường. Mọi người đã luôn động viên, chia sẻ những khó khăn vui buồn trong suốt q trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện thực tập.

Quan trọng nhất trong cuộc đời con, con kính gửi đến Cha Mẹ tình cảm sâu sắc tận đáy lịng con. Nhờ sự dạy dỗ, động viên, dìu dắt và tạo mọi điều kiện cho con có thể phát huy hết được những khả năng tiếp tục thực hiện niềm u thích của mình. Con sẽ cố gắng và nỗ lực bước đi hết con đường tốt đẹp mà Cha Mẹ đã dành cho con.

Xin cảm ơn tất cả mọi người!

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019 Sinh viên

Đặng Hoài Thương

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

2.2.Phương pháp nghiên cứu ... 14

2.2.1. Quy trình chiết xuất chung palmatine trong rễ cây hồng đằng ... 14

2.2.2. Quy trình chiết xuất palmatine trong rễ cây hoàng đằng bằng phương pháp ngâm ... 15

2.2.2.1.Khảo sát thời gian chiết ... 16

2.2.2.2.Khảo sát tỉ lệ ngâm chiết ... 17

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG iii2.2.3. Quy trình chiết xuất palmatine trong rễ cây hồng đằng bằng phương

pháp đun khuấy từ hồi lưu ... 18

2.2.3.1.Khảo sát thời gian chiết bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu ... 19

2.2.3.2.Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ethanol bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu ... 20

2.2.4. Khảo sát than hoạt tính dùng để tinh chế ... 21

2.2.5. Cơ lập và xác định các thành phần có trong hỗn hợp palmatine ... 21

3.1.1. Kết quả khảo sát thời gian chiết tối ưu ... 26

3.1.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ ngâm chiết tối ưu ... 28

3.1.3. Kết quả khảo sát tỉ lệ than hoạt tính của phương pháp ngâm ... 29

3.2.Kết quả khảo sát quy trình chiết xuất bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu ... 32

3.2.1. Kết quả khảo sát thời gian chiết ... 32

3.2.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ethanol tối ưu ... 34

3.2.3. Kết quả khảo sát tỉ lệ than hoạt tính của phương pháp đun khuấy từ hồi lưu ... 36

3.3.Kết quả cô lập và nhận danh hợp chất thu được ... 38

3.3.1. Kết quả sắc kí bản mỏng ... 38

3.3.2. Kết quả chạy HPLC ... 40

3.3.3. Kết quả cô lập palmatine ... 42

3.3.4. Kết quả đo điểm nóng chảy ... 43

3.3.5. Kết quả chạy phổ cộng từ hạt nhân NMR ... 44

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

NMR: Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 13C-NMR: Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy cv: Coefficient of variability

TLTK: Tài liệu tham khảo

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Hình 2. 2: Máy đo điểm nóng chảy Stuart SMP11 ... 13

Hình 2. 3: Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III 500 MHz... 13

Hình 2. 4: Quy trình chiết palmatine bằng phương pháp ngâm ... 14

Hình 2. 5: Ngâm nguyên liệu trong bình thủy tinh ... 15

Hình 2. 6: Chưng cất thu hồi dung mơi ... 15

Hình 2. 7: Sơ đồ khảo sát thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp ngâm ... 16

Hình 2. 8: Sơ đồ khảo sát lượng ethanol tối ưu bằng phương pháp ngâm ... 17

Hình 2. 9: Hệ thống đun khuấy từ hồi lưu ... 18

Hình 2. 10: Sơ đồ khảo thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu ... 19

Hình 2. 11: Sơ đồ khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ethanol tối ưu bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu ... 20

Hình 2. 12: Bản nhơm sắc kí ... 22

Hình 2. 13: Các bước thực hiện sắc ký cột. ... 24

Hình 2. 14: Đo điểm nóng chảy của palmatine ... 25

Hình 3. 1: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất chiết hợp chất từ rễ cây hoàng đằng theo thời gian bằng phương pháp ngâm ... 27

Hình 3. 2: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất chiết hợp chất từ rễ cây hoàng đằng theo lượng ethanol bằng phương pháp ngâm ... 29

Hình 3. 3: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất tinh chế cao thô theo tỉ lệ than hoạt tính ... 31

Hình 3. 4: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất chiết hợp chất từ rễ cây hoàng đằng theo thời gian bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu ... 33

Hình 3. 5: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất chiết hợp chất từ rễ cây hoàng đằng theo lượng ethanol bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu ... 35

Hình 3. 6: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất tinh chế cao thơ theo tỉ lệ than hoạt tính ... 37

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

SVTH: ĐẶNG HỒI THƯƠNG viiHình 3. 7: Kết quả sắc kí bản mỏng theo từng hệ dung mơi ở bước sóng UV-Vis 254

nm ... 39

Hình 3. 8: Kết quả sắc kí bản mỏng theo từng hệ dung mơi ở bước sóng UV-Vis 365 nm ... 39

Hình 3. 9: Kết quả chạy HPLC của mẫu chiết ở bước sóng UV 280 nm ... 41

Hình 3. 10: Kết quả chạy HPLC của mẫu chiết ở bước sóng UV 320 nm ... 41

Hình 3. 11: Bảng mỏng các giai đoạn sắc kí cột ... 43

Hình 3. 12: Cấu trúc palmatine ... 44

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3. 1: Kết quả số liệu thực tế thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp ngâm .. 26Bảng 3. 2: Kết quả xử lý thống kê thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp ngâm . 26Bảng 3. 3: Kết quả số liệu thực tế của tỉ lệ ngâm chiết tối ưu ... 28Bảng 3. 4: Kết quả xử lý thống kê của tỉ lệ ngâm chiết tối ưu ... 28Bảng 3. 5: Kết quả số liệu thực tế của tỉ lệ than hoạt tính bằng phương pháp ngâm 30Bảng 3. 6: Kết quả xử lý thống kê của tỉ lệ than hoạt tính tối ưu bằng phương pháp

đun khuấy từ hồi lưu ... 30Bảng 3. 7: Kết quả số liệu thực tế của thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp đun

khuấy từ hồi lưu ... 32Bảng 3. 8: Kết quả xử lý thống kê của thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp đun

khuấy từ hồi lưu ... 33Bảng 3. 9: Kết quả số liệu thực tế của tỉ lệ nguyên liệu/ethanol bằng phương pháp

đun khuấy từ hồi lưu ... 34Bảng 3. 10: Kết quả xử lý thống kê của tỉ lệ nguyên liệu/ethanol bằng phương pháp

đun khuấy từ hồi lưu ... 35Bảng 3. 11: Kết quả số liệu thực tế của tỉ lệ than hoạt tính bằng phương pháp đun

khuấy từ hồi lưu ... 36Bảng 3. 12: Kết quả xử lý thống kê của tỉ lệ than hoạt tính bằng phương pháp đun

khuấy từ hồi lưu ... 37Bảng 3. 13: Kết quả giá trị Rf sắc kí bản mỏng ... 40Bảng 3. 14: Các phân đoạn sắc ký cột ... 42Bảng 3. 15: Dữ liệu phổ 1H và 13C của hợp chất palmatine cô lập được với tài liệu

tham khảo của tác giả Marek ... 44

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nơng nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc các chất phụ gia thực phẩm có giá trị (Rao và cs., 2002). Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây (thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với mơi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật (Wink, 1999).

Theo tổ chức Y Tế Thế Giới, 80% dân số ở các nước đang phát triển sử dụng y học cổ truyền hoặc thuốc từ thảo dược để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Nhu cầu về dược liệu, các sản phẩm từ dược liệu có xu hướng ngày càng gia tăng. Theo báo cáo của Bộ Y Tế tính đến năm 2016, nước ta đã ghi nhận có hơn 5.000 lồi thực vật được sử dụng làm thuốc.

Cây hồng đằng cịn có tên gọi khác là nam hồng liên, dây vàng giang, có tác dụng thanh nhiệt tiêu viêm, lợi thấp, giải độc (Dược điển Việt Nam IV, 2009). Hoàng đằng có vị đắng, tính hàn, được dùng làm thuốc bổ chữa các chứng viêm tấy, kiết lỵ, tiêu chảy, sốt rét, bệnh về gan, nóng trong người, lở ngứa ngồi da, mắt đỏ có màng, viêm tai chảy mủ (Đỗ Huy Bích và cs., 2004). Ngồi ra, trong nhiều năm trở lại đây, rất nhiều nghiên cứu đã được công bố về hoạt tính và dược học của hồng đằng cũng như các thành phần chiết xuất từ rễ cây hồng đằng, trong đó palmatine chloride được chứng minh là một trong những thành phần chính tạo nên dược tính cao của rễ cây hoàng đằng. Palmatine chloride chiết từ hồng đằng có thể dùng chữa đau mắt, tiêu chảy, lỵ như hoàng đằng (Đỗ Tất Lợi, 2004).

Trong xu hướng của nền sản xuất dược phẩm ngày nay, các thuốc có nguồn gốc thiên nhiên ngày càng được ưu tiên sử dụng hơn. Mặt khác, palmatine chloride có ưu

điểm là ít độc, ít tác dụng phụ. Vì vậy, chúng tơi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy

trình chiết tách và cơ lập palmatine chloride từ thân rễ cây hoàng đằng (Fibraurea

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 2

tinctoria L.)” nhằm chủ động hơn về nguồn nguyên liệu dược phẩm cho đất nước và

ứng dụng trong lĩnh vực y dược, thực phẩm,… Mục tiêu đề tài:

- Khảo sát lượng dung mơi, thời gian ly trích, tỉ lệ than hoạt và phương pháp tối ưu trong quy trình chiết tách palmatine chloride có trong thân rễ cây hồng đằng

(Fibraurea tinctoria L.).

- Cơ lập và tinh sạch palmatine thu được bằng sắc kí cột.

- Định danh và xác định cấu trúc của palmatine thu được bằng một số phương pháp như: sắc kí bản mỏng, đo điểm nóng chảy, sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 3

1.1. Tổng quan về cây hoàng đằng

Hoàng đằng cịn có tên là nam hồng liên, thích hồng liên, dây vàng giang, khau khem (Tày), co lạc khem (Thái), tốt choọc, t’rơn (K’dong). Tên khoa học Fibraurea

tinctoria L. và Fibraurea recisa Pierre, thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) (Đỗ Huy

Bích và cs., 2004)

Phân loại thực vật: Bộ: Ranunculales

Họ: Menispermaceae

Chi: Fibraurea

Loài: Fibraurea tinctoria L.

Hình 1. 1: Cây hồng đằng Fibraurea tinctoria L.

Phân bố: chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, từ một số đảo lớn của Indonesia, Philippines, Malaysia đến Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam và một số tỉnh phía nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, cả hai loài đều thấy có ở hầu hết các tỉnh miền núi và

trung du. Tuy nhiên lồi Fibraurea tinctoria L. có vùng phân bố rải rác cả ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam. Cịn lồi Fibraurea recisa Pierre lại gặp nhiều hơn ở các tỉnh

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

SVTH: ĐẶNG HỒI THƯƠNG 4phía nam. Các tỉnh có nguồn hồng đằng phong phú là Yên Bái, Lào Cai (các huyện vùng núi thấp), Tuyên Quang, Lai Châu, Sơn La, Bắc Cạn, Thái Ngun, Hịa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình (các huyện phía tây), Quảng Nam, Lâm Đồng, Phú Yên và các tỉnh Tây Nguyên (Đỗ Huy Bích và cs.,2004).

1.1.1. Đặc điểm thực vật

Cây hoàng đằng là một cây dây leo to, rất dài có thể vươn tới ngọn cây lớn. Rễ và thân già có vỏ ngồi nứt nẻ và gỗ màu vàng. Thân non nhẵn, màu lục. Lá mọc so le, hình trái xoan hoặc thn mũi mác, dài 9-8 cm, rộng 3-7 cm, phiến dài và nhẵn, 3 gân chính rõ, mặt trên xanh sẫm bóng, mặt dưới nhạt; cuống lá dài 5-14 cm, phình ở hai đầu. Cụm hoa mọc ở kẽ những lá đã rụng thành chùm phân nhiều nhánh, thường ngắn hơn lá; hoa nhỏ, màu vàng lục; 3 lá đài ngồi nhỏ hình trái xoan, hơi nhọn, 3 lá đài trong khum, rộng và dài hơn; cánh hoa 3, hơi rộng hơn lá đài trong; nhị 3, đối diện với cánh hoa, cong vào trong, bao phấn nhẵn, chỉ nhị rộng dài bằng bao phấn. Quả hình trái xoan, khi chín màu vàng, chứa hạt dày, hơi dẹt. Mùa hoa quả tháng 3 -7 (Đỗ Huy Bích và cs., 2004). Những đoạn thân và rễ hình trụ thẳng hoặc hơi cong, dài tới 10 cm đến 30 cm, đường kính 1 cm đến 3 cm, có khi tới 10 cm. Mặt ngồi màu nâu có nhiều vân dọc và sẹo của cuống lá (đoạn thân) hay sẹo của rễ con (đoạn rễ). Mặt cắt ngang có màu vàng gồm 3 phần rõ rệt: phần vỏ hẹp, phần gỗ có những tia ruột xếp thành hình nan hoa bánh xe, phần ruột ở giữa trịn và hẹp; thể chất cứng, khó bẻ gãy, vị đắng (Dược điển Việt Nam IV, 2009).

Cây hoàng đằng Fibraurea tinctoria L. rất giống loài hoàng đằng Fibraurea

recisa Pierre, nhưng khác nhau ở chỗ lá có mũi nhọn rõ; cụm hoa ngắn hơn, ít phân

nhánh; lá đài ngồi hình tam giác, mép nham nhở; nhị 6, chỉ nhị dài hơn bao phấn. Mùa quả: tháng 5-7 (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 5Năm 1969, Ito K. và Furukawa H. đã tìm ra một furanoid diterpene mới trong hồng đằng là fibleucin (Ito K. và cs., 1969).

Năm 1986, Itokawa và cộng sự đã phát hiện ra ba diterpenglycoside mới là tinophylloloside , fibleucinoside và fibraurinoside (Itokawa và cs., 1986).

Năm 2007, Su C. R. và cộng sự tìm ra bốn loại furanoditerpenoid là fibrauretin

A, fibrauretinoside A, epi-fibrauretinoside A, epi-12-palmatoside G và một glucoside

ecdapseoid mới là fibraurecdyside A (Su C. R. và cs., 2007).

Năm 2008, Su C. R. và cộng sự đã tìm thấy sáu furanoditerpenoid mới là

epi-8-hydroxycolumbin, fibaruretin B, C, D, E, F được cơ lập từ thân của cây hồng đằng (Su C. R. và cs., 2008).

1.1.3. Tác dụng dược lý

1.1.3.1. Tác dụng kháng khuẩn:

Palmatine có tác dụng ức chế sự phát triển của Streptococcus hemolyticus và

Staphylococcus aureus ở nồng độ 0,05% và 0,1%; còn đối với các loại vi khuẩn khác,

thí nghiệm trên ống kính khơng thấy kết quả rõ rệt. Tác dụng kháng khuẩn của palmatine kém so với các loại kháng sinh thường dùng. Palmatine cịn có tác dụng chống nấm như nấm gây viêm âm đạo (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).

1.1.3.2. Tác dụng kháng Trypanosoma:

Palmatine với nồng độ 1:4000 và 1:2000 đối với Trypanosoma lewisi (Kent) ức

chế được 75-100%, còn với nồng độ thấp hơn (1:8000) thì ức chế được khoảng 50-70%. Đối với hệ thần kinh trung ương: palmatine thí nghiệm trên chuột nhắt trắng, tiêm xoang bụng với liều 25-50 mg/kg có tác dụng ức chế hoạt động tự nhiên và hoạt động phản xạ của chuột nhưng không làm giảm trương lực cơ nếu tăng liều (100 mg/kg) thì tác dụng giảm trương lực cơ xuất hiện (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).

1.1.3.3. Tác dụng đối với hệ tim mạch:

Palmatine và jatrorrhizin trên tĩnh mạch đều có tác dụng hạ huyết áp, tác dụng này của palmatine mạnh hơn jatrorrhizin. Trên thỏ thí nghiệm, palmatine tiêm tĩnh mạch với liều 10 mg/kg làm huyết áp hạ tới 70% và kéo dài trong 5 giờ; khơng có hiện tượng quen thuốc. Trên mèo gây mê, palmatine tiêm tĩnh mạch với liều 2 mg/kg có tác dụng đối kháng với hiện tượng tăng áp do adrenalin và noradrenalin gây nên. Trên tiêu bản

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

SVTH: ĐẶNG HỒI THƯƠNG 6tuần hồn chi sau của ếch, palmatine hồn toàn đối kháng được tác dụng co mạch do adrenalin gây nên. Trên chuột cống trắng gây thiếu máu cơ tim thực nghiệm bằng cách thắt động mạch vành tim, palmatine tiêm tĩnh mạch với liều 10 mg/kg có tác dụng giảm tần suất xuất hiện rối loạn nhịp tim và giảm tỷ lệ tử vong của động vật thí nghiệm.

Palmatine có tác dụng đối kháng với loạn nhịp tim trên các mơ hình do chloroform gây nên trên chuột nhắt trắng, do ouabain gây nên trên chuột lang và do aconitin gây nên trên chuột cống trắng (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).

Ngồi ra, hồng đằng còn chủ trị viêm họng, mụn nhọt mẩn ngứa, viêm bàng quan (Dược điển Việt Nam IV, 2009).

1.2. Sơ lược về palmatine chloride

1.2.1. Phân loại

Palmatine (IUPAC: 2, 3, 9, 10-tetramethoxy-5, 6-dihydroisoquinolino [2, 1 - b] isoquinolin-7-ium; chloride), có cơng thức hóa học là C21H22ClNO4, là một alkaloid có cấu trúc protoberberin, nhân isoquinolin.

Hình 1. 2: Palmatine chloride.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

SVTH: ĐẶNG HỒI THƯƠNG 7

1.2.2. Tính chất hóa lý 1.2.2.1. Tính chất vật lý

- Palmatine là alkaloid ở thể rắn, màu vàng, không mùi, vị đắng, ít tan trong nước lạnh, tan nhiều trong nước nóng, tan trong ethanol, methanol, ít tan trong chloroform, khơng tan trong ether. Palmatine khơng có C bất đối, khơng có đồng phân quang học (Từ Minh Kóong, 2007).

- Nhiệt độ nóng chảy: 203 - 2040C (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).

1.2.2.2. Tính chất hóa học

Hóa tính của Nitơ : Nguyên tố N của palmatine là hydroxyd amoni bậc 4 đem tính kiềm cho phân tử, có thể cho muối cloride với HCl.

Môi trường kiềm Mơi trường acid

Hóa tính của oxy: có hóa chức ete có thể thủy phân cho alcol, riêng OH trong hydroxyd amoni bậc 4: N không vững bền, trong mơi trường kiềm dễ hỗ biến mở vịng, cho chức aldehyd gọi là palmatinal tương ứng.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

SVTH: ĐẶNG HỒI THƯƠNG 8bột vơ định hình trắng có độ chảy là 2150C là dl – tetrahydropalmatine sulfat, cho tác dụng với amoniac thu được dl – tetrahydropalmatine base, kết tinh trắng, độ chảy 140 - 1470C. Trái lại l– tetrahydropalmatine trắng đem oxy hóa bằng iod sẽ chuyển thành palmatine màu vàng.

Hóa tính của nhóm methoxy (-OCH3): trong cơng thức của palmatine có bốn nhóm chức methoxy (-OCH3) nên có thể kết hợp với aceton hay cloroform tạo các phức chất (Từ Minh Kóong, 2007).

ciprofloxacin cũng như làm giảm sự xuất hiện của Pseudomonas aeruginosa tốt hơn

berberine (Aghayan và cs., 2017).

1.2.3.2. Tác dụng kháng nấm

Palmatine có tác dụng kháng nấm tốt và ức chế đáng kể sự phát triển của Candida

albicans, Candida glabrata, Candida krusei và Candida parapsilosis, thể hiện mạnh

nhất trên Candida parapsilosis (MIC 16 mg/L). Palmatine ức chế tổng hợp chitin từ cả nấm men và các giai đoạn tăng trưởng của nấm Candida albicans một cách không cạnh

tranh (Park và cs., 1999). Hỗn hợp của palmatine chloride và berberin chloride có thể

được sử dụng hiệu quả để điều trị bệnh thối da thỏ do Microsporum canis gây ra (Xiao

và cs., 2015).

1.2.3.3. Tác dụng kháng tế bào ung thư

Palmatine ức chế sự phát triển và xâm lấn của tế bào ung thư tuyến tiền liệt (Hambright và cs., 2014). Trong nghiên cứu tìm các nguồn tự nhiên cho các tác nhân trị liệu và phòng ngừa biến chứng tiểu đường, các tác giả đã chỉ ra palmatine là một trong

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 9các alkaloid có tác dụng ức chế aldose reductase ở nồng độ ≤ 50 μg / ml (Jung và cs., 2008).

1.2.3.4. Một số công dụng khác

Hoạt chất palmatine chữa đau mắt, tiêu chảy, kiết lỵ, viêm âm đạo do nấm. Tetrahydropalmatine clorua được chế từ palmatine là thuốc an thần giảm đau (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).

1.3. Lịch sử nghiên cứu

1.3.1. Trong nước

Năm 2002, Đào Thanh Tùng so sánh 3 phương pháp chiết xuất palmatine từ hoàng đằng thu được kết quả như sau: phương pháp ngâm nóng với dung mơi là nước cho hiệu suất tính theo dược liệu là 1,1%, chiết xuất ngược dịng gián đoạn với dung mơi là acid acetic cho hiệu suất 1,3%, trong khi đó sử dụng phương pháp ngâm lạnh với dung môi ethanol 96% , thời gian chiết là 16 giờ cho hiệu suất đạt 1,94 % (Đào Thanh Tùng, 2002).

Theo nghiên cứu của Lê Trường Minh và cộng sự vào năm 2016, chiết xuất, phân lập và tinh chế được palmatine từ hoàng đằng cho độ tinh khiết là 97,31% (Lê Trường Minh và cs., 2016).

Năm 2018, Nguyễn Thị Lan Hương đã tiến hành khảo sát ba loại hạt nhựa cationit: Tulsion CXO – 9, Dower HCR – S, Purolite C100 thu được kết quả hạt Tulsion CXO – 9 là loại cationit acid yếu có dung lượng hấp phụ đạt 122,89 mg/g sau 4 giờ và giải hấp phụ bằng dung dịch HCl 3%/ EtOH 96% đạt hiệu suất 68,49% sau 3 giờ. Hiệu suất của quá trình phân lập đạt 87,5% tính theo lượng palmatine có trong dịch chiết hồng đằng, sản phẩm palmatine thu được có độ tinh khiết 81% (Nguyễn Thị Lan Hương, 2018).

Từ Minh Kóong đã thực hiện chiết palmatine bằng phương pháp chiết ngược dịng gián đoạn với dung mơi là cồn 800, dịch chiết được rút ra thu hồi cồn. Cặn thêm nước nóng và HCl thu được tủa palmatine clorid, hòa tan tủa trong cồn 900, tẩy màu bằng than hoạt, thu dịch lọc để 24 giờ cho kết tinh, lọc và rửa tinh thể bằng cồn 900 (Từ Minh Kóong, 2007).

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

SVTH: ĐẶNG HỒI THƯƠNG 10

1.3.2. Ngồi nước

Một nghiên cứu của Li Jixian và cộng sự chiết xuất palmatine từ Hoàng đằng bằng phương pháp ngâm dưới áp suất giảm, với dung môi H2SO4 1% trong 12 giờ, áp suất duy trì 0,04MPa – 0,05MPa, nhiệt độ 50 – 600C, thời gian chiết là 2 giờ, chiết 2 lần. Điều chỉnh pH dịch chiết bằng dung dịch NaOH đến pH 9-10, để yên trong 12 giờ sau đó lọc để loại bỏ tạp chất, cho vào dịch lọc 7-8% NaCl, để lạnh trong 12 giờ, lọc thu được tinh thể palmatine (Li Jixian và cs., 2011).

Năm 2001, Liu Youping và cộng sự đã đưa ra phương pháp ngâm để chiết xuất palmatine từ hoàng đằng, dung môi chiết là H2SO4 0,2%, thời gian chiết lần 1 là 48 giờ, 3 lần còn lại mỗi lần là 24 giờ. Tạo tủa thô bằng dung dịch NaCl 7%, kết tinh lại trong ethanol tuyệt đối ở pH = 2 bằng dung dịch HCl 5%. Kết quả cho thấy lượng palmatine là 85%. Bên cạnh đó, Liu Youping và cộng sự cũng tiến hành chiết xuất palmatine từ hoàng đằng bằng phương pháp ngâm với dung môi H2SO4 0,2% sau đó dùng nhựa macropopous D101 để phân lập và tinh chế. Cho dịch chiết nồng độ 0,5 mg/mL chảy qua cột có chứa hạt macropopous D101 và rửa giải bằng ethanol 40%, cô dịch rửa giải đến cắn thu được palmatine thô (Liu Youping và cs., 2001).

Năm 2013, F. S. Hall và cộng sự đã tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất và phân

lập palmatine từ Tinospora cordifolia. Palmatine thu được có thể tăng cường đáng kể

nồng độ enzyme chống oxy hóa như glutathione (GSH), superoxide effutase (SOD), catalase và ức chế peroxid hóa lipid do đó cho thấy vai trị của nó trong q trình giải độc. Cả hoạt động của enzyme và phân tích mơ học đều cho thấy chất gây ung thư da bị ức chế bằng cách thêm palmatine vào chế độ ăn uống hằng ngày (Hall và cs., 2013).

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 11

2.1. Vật liệu

2.1.1. Đối tượng, phạm vi thí nghiệm

- Nguyên liệu: Thân rễ cây hồng đằng (Fibraurea tinctoria L.) từ cơng ty cổ phần

trà thảo dược Trường Xuân. Nguyên liệu được sấy khô, xay thành bột.

- Thời gian, địa điểm thực hiện: Đề tài được thực hiện tại PTN Hóa – Môi trường Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 02/2019 đến tháng 05/2019.

2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất

- Ethanol 96% (VN-Chemsol Co., Việt Nam). - Methanol (VN-Chemsol Co., Việt Nam).

- Acid acetic (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Trung Quốc). - Acid clohydric (Cơng ty CP bột giặt và hóa chất Đức Giang).

- n-Butanol (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Trung Quốc).

- NH3 (Xilong Scientific Co., Trung Quốc). - Chloroform (VN-Chemsol Co., Việt Nam). - NaCl (Xilong Scientific Co., Trung Quốc). - NH4OH (VN-Chemsol Co., Việt Nam). - Silica gel 60 F254 (Merck).

- Palmatine chuẩn (Phịng Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Cơng nghệ Hóa học – Số 01, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh).

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 12- Bể ổn nhiệt Memmert WB7.

- Cân kỹ thuật Ohaus PA1402, cân phân tích Shimadzu ATX224. - Máy khuấy từ gia nhiệt Velp ARE.

- Máy HPLC Ultimate 3000 – Dionex (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) và đầu dò khối phổ MSQ Plus (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) tại phịng Hóa học và Hợp chất thiên nhiên thuộc Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (số 1 Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, Q.1, Tp. Hồ Chí Minh).

- Phổ NMR: đo phổ bằng máy Bruker Avance III 500 MHz tại Phịng Cộng hưởng từ hạt nhân thuộc Viện Hóa học, 18 Hồng Quốc Việt, Q. Cầu Giấy, Hà Nội.

Hình 2. 1: Cân kỹ thuật OHAUS PA1402 (trái) và cân phân tích SHIMADZU ATX224 (phải).

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

SVTH: ĐẶNG HỒI THƯƠNG 13

Hình 2. 2: Máy đo điểm nóng chảy Stuart SMP11

Hình 2. 3: Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III 500 MHz

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 14

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Quy trình chiết xuất chung palmatine trong rễ cây hồng đằng

Hình 2. 4: Quy trình chiết palmatine bằng phương pháp ngâm

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 15

2.2.2. Quy trình chiết xuất palmatine trong rễ cây hồng đằng bằng phương pháp ngâm

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết thơ

Cân 30 gam bột hồng đằng bỏ vào bình thủy tinh ngâm với lượng ethanol 96% để khảo sát thời gian chiết tối ưu. Sau quá trình chiết thô, rút dịch chiết lần một. Gạn lấy phần trong, lọc, ép lấy dịch, phần bã đem chiết thêm hai lần.

Hình 2. 5: Ngâm nguyên liệu trong bình thủy tinh

Bước 2: Thu dịch chiết palmatine

Gộp dịch chiết đã lọc lại với nhau cho vào bình cầu 1000 ml, bỏ thêm 1 viên đá bọt vào rồi tiến hành thu hồi dung mơi ở nhiệt độ 780C.

Hình 2. 6: Chưng cất thu hồi dung môi

Bước 3: Thu tinh thể và loại bỏ tạp chất

Hòa tan cao thu được vào 100 ml nước sôi trong becher 250 ml. Khuấy kỹ và để lắng 6h. Lọc lấy dịch trong.

Bước 4: Kết tinh palmatine

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 16Thêm từ từ dung dịch HCl 10% vào, vừa thêm vừa khuấy cho đến khi dung dịch có pH 2 -3. Cân 5 gam muối NaCl và thêm vào, khuấy đều cho tan hoàn toàn, để yên trong tủ lạnh ở 40C trong 24 giờ. Lọc thu tủa.

Hòa tan tủa trong ethanol 96%, đun sơi cách thủy. Thêm than hoạt tính, đun sơi tiếp 10 phút, lấy ra lọc nóng, thu dịch lọc. Để nguội dịch lọc sau đó kết tinh trong tủ lạnh ở 40C trong 3 ngày. Lọc lấy kết tinh, rửa bằng ethanol 96% lạnh 2 lần (mỗi lần 5 ml). Đem sấy khô ở nhiệt độ 40 - 600C trong 4-5h. Cân và tính hiệu suất.

2.2.2.1. Khảo sát thời gian chiết

Cân chính xác 30 gam bột hồng đằng cho vào bình thủy tinh. Tiến hành ngâm với dung môi ethanol 96% trong các thời gian khảo sát là 8 giờ, 16 giờ và 24 giờ. Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung. Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thơ bằng sắc ký bản mỏng. Thời gian tối ưu nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo.

Hình 2. 7: Sơ đồ khảo sát thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp ngâm

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 17

2.2.2.2. Khảo sát tỉ lệ ngâm chiết

Cân chính xác 30 gam bột hồng đằng cho vào bình thủy tinh. Tiến hành ngâm với dung mơi ethanol 96% theo các thể tích khác nhau là 270 ml, 360 ml và 450 ml tương ứng với tỉ lệ nguyên liệu/ethanol là 1:9, 1:12, 1:15 trong khoảng thời gian tối ưu đã được khảo sát ở thí nghiệm trên. Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung. Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thơ bằng sắc ký bản mỏng.

Hình 2. 8: Sơ đồ khảo sát lượng ethanol tối ưu bằng phương pháp ngâm

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

SVTH: ĐẶNG HỒI THƯƠNG 18

2.2.3. Quy trình chiết xuất palmatine trong rễ cây hoàng đằng bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết thơ

Cân 30 gam bột hồng đằng bỏ vào bình cầu đáy bằng 1000 ml và được đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu với lượng ethanol 96% để khảo sát thời gian chiết tối ưu. Sau q trình chiết thơ, gạn lấy phần trong, lọc, ép lấy dịch.

Hình 2. 9: Hệ thống đun khuấy từ hồi lưu

Bước 2: Thu dịch chiết palmatine

Gộp dịch chiết đã lọc lại với nhau cho vào bình cầu 1000 ml, bỏ thêm 1 viên đá bọt vào rồi tiến hành thu hồi dung môi ở nhiệt độ 780C.

Bước 3: Thu tinh thể và loại bỏ tạp chất

Hòa tan cao thu được vào 100 ml nước sôi trong becher 250 ml. Khuấy kỹ và để lắng 6h. Lọc lấy dịch trong.

Bước 4: Kết tinh palmatine

Thêm từ từ dung dịch HCl 10% vào, vừa thêm vừa khuấy cho đến khi dung dịch có pH 2 -3. Cân 5 gam muối NaCl và thêm vào, khuấy đều cho tan hoàn toàn, để yên trong tủ lạnh ở 40C trong 24 giờ. Lọc thu tủa.

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

SVTH: ĐẶNG HỒI THƯƠNG 19Hịa tan tủa trong ethanol 96%, đun sơi cách thủy. Thêm than hoạt tính, đun sơi tiếp 10 phút, lấy ra lọc nóng, thu dịch lọc. Để nguội dịch lọc sau đó kết tinh trong tủ lạnh ở 40C trong 3 ngày. Lọc lấy kết tinh, rửa bằng ethanol 96% lạnh 2 lần (mỗi lần 5 ml). Đem sấy khô ở nhiệt độ 40 - 600C trong 4-5h. Cân và tính hiệu suất.

2.2.3.1. Khảo sát thời gian chiết bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

Cân chính xác 30 gam bột hồng đằng cho vào bình cầu 1000 ml và đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu. Tiến hành đun khuấy từ hồi lưu với dung môi ethanol 96% trong các thời gian khảo sát là 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 8 giờ. Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung. Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký bản mỏng. Thời gian tối ưu nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo.

Hình 2. 10: Sơ đồ khảo thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 20

2.2.3.2. Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ethanol bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

Cân chính xác 30 gam bột hồng đằng cho vào bình cầu 1000 ml. Tiến hành đun khuấy từ hồi lưu với dung mơi ethanol 96% theo các thể tích khác nhau là 240 ml, 360 ml và 480 ml tương ứng với tỉ lệ nguyên liệu/ethanol là 1:8, 1:12, 1:16 trong khoảng thời gian tối ưu đã được khảo sát ở thí nghiệm trên. Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung. Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thơ bằng sắc ký bản mỏng.

Hình 2. 11: Sơ đồ khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ethanol tối ưu bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 21

2.2.4. Khảo sát than hoạt tính dùng để tinh chế

Kết tủa sau khi được hòa tan bằng ethanol 96% tiếp tục đem đi tinh chế với than hoạt tính. Tiến hành làm 4 nghiệm thức tinh chế khác nhau ở tỉ lệ than hoạt dùng so với lượng palmatine thô. Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần.

- Nghiệm thức 1: dùng 1% than hoạt tính. - Nghiệm thức 2: dùng 2% than hoạt tính. - Nghiệm thức 3: dùng 3% than hoạt tính.

Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký bản mỏng.

2.2.5. Cô lập và xác định các thành phần có trong hỗn hợp palmatine 2.2.5.1. Sắc kí bản mỏng

Loại bản mỏng: Bản nhơm đã tráng sẵn silica gel 60 F254. Độ dài 10 cm. Hoạt hóa bản mỏng ở 1050C trong 30 phút.

Chuẩn bị ly sắc kí: Ly thủy tinh có đường kính lớn hơn bề ngang bản mỏng. Cắt giấy lọc hình thang vừa vào ly sắc kí và để giấy lọc ở mặt trong của ly sắc kí (để bão hịa dung mơi trong bình) sao cho có khoảng trống để quan sát đường chạy của hệ dung môi. Cho lượng dung môi (khoảng 10 ml) vào ly sắc kí sao cho lớp dung mơi cao khoảng 0,5-0,7 cm (mực dung mơi phải thấp hơn vị trí vết chấm). Để n cho dung mơi trong ly được bão hịa.

Dung mơi chạy sắc kí: Sử dụng các hệ dung mơi kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh.

- Hệ 1: n-Butanol : acid acetic : nước tỉ lệ 7 : 1: 2 (Dược điển Việt Nam IV, 2009).

- Hệ 2: Methanol : NH4OH 25% : nước tỉ lệ 8 : 1 : 1 (Siwon và cs., 1980). - Hệ 3: Chloroform : methanol : NH3 tỉ lệ 14 : 7 : 1

- Hệ 4: n-Butanol : acid acetic : nước tỉ lệ 14 : 3 : 4 (Shariatgorji và cs., 2009).

Sản phẩm thu được hòa tan trong methanol. Chấm mẫu sản phẩm bằng ống vi quản lên trên bản nhôm đã tráng sẵn silica gel 60 F254. Chiều dài chạy mẫu là 8 cm. Bình khai triển được bão hịa bằng hệ dung mơi khảo sát. Hiện hình bằng đèn UV tại bước sóng 254 nm, 365 nm và ghi nhận Rf hiện trên bản.

Giá trị Rf

=

ả ể ủ ấ ( )

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

SVTH: ĐẶNG HỒI THƯƠNG 22

2.2.5.2. Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

Kết quả phân tích mẫu cao thơ ly trích từ rễ hồng đằng được thực hiện tại Phịng Hóa học và các Hợp chất thiên nhiên thuộc Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (số 1 Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, quận 1, TP. HCM).

Chất chuẩn

Hình 2. 12: Bản nhơm sắc kí

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 23- Sấy silica gel ở 1100C trong bốn giờ, cân bằng ẩm trong bình hút ẩm 30 phút.

Cột thủy tinh có đường kính ϕ = 20 mm, chiều dài d = 400 mm rửa sạch, sấy khô, dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá.

Bước 3: Nạp mẫu lên cột sắc kí

Nghiền mịn mẫu rồi trộn đều với silica gel theo tỷ lệ 1 : 1 về khối lượng. Nạp hỗn hợp mẫu và silica gel vào cột. Dùng pipet Pasteur cho một lượng nhỏ dung môi giải ly lên đầu cột, tranh thủ dùng dung môi này để rửa sạch thành cột do dung dịch mẫu bị dính lên thành cột. Cho một lớp bơng gịn dày khoảng 5 mm đặt nhẹ lên mặt thoáng đầu trên của cột để bảo vệ mặt cột không bị xáo trộn. Bước 4: Triển khai cột

Hệ dung môi để giải ly là chloroform : methanol : NH3 tỉ lệ 14 : 7 : 1. Bước 5: Hứng và kiểm tra các phân đoạn

Hứng dung dịch giải ly trong chai bi có đánh số thứ tự. Mỗi chai bi có lượng thể tích được đánh dấu ở mức 10 ml.

Bước 6: Thu hồi và kiểm tra, định lượng các phân đoạn.

Thu các phân đoạn giải ly cột. Sau đó, các phân đoạn được sắc ký bản mỏng để gom lại thành những phân đoạn có thành phần giống nhau.

Từng phân đoạn được tiến hành thu hồi dung môi để thu palmatine.

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 24Nhồi và ổn định cột Nạp mẫu vào cột Triển khai cột

Hình 2. 13: Các bước thực hiện sắc ký cột.

2.2.5.4. Phương pháp đo điểm nóng chảy

Dùng ống vi quản lấy vừa đủ lượng mẫu thử. Đặt ống này vào đúng vị trí, sao cho ống vi quản vào đúng khe soi mẫu, đầu ống có thể quan sát được và nằm chính giữa thị kính. Điều chỉnh nhiệt độ ở mức tối đa. Khi nhiệt độ đạt 60% điểm nóng chảy dự kiến thì giảm về mức 10 0C/ phút. Khi nhiệt độ cách điểm nóng chảy dự kiến 15 0C thì hạ xuống mức 1 0C/ phút.

Quan sát chất nóng chảy qua thị kính, ghi nhận nhiệt độ trên nhiệt kế từ khoảng thời điểm lúc chất bắt đầu nóng chảy cho đến khi chảy hồn tồn.

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

SVTH: ĐẶNG HỒI THƯƠNG 25

Hình 2. 14: Đo điểm nóng chảy của palmatine

(Mẫu đo tại thời điểm ban đầu (trái) và sau khi nóng chảy hồn tồn (phải)). 2.2.5.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Kết quả phân tích được thực hiện tại phịng cộng hưởng từ, viện hóa học (nhà A18, số 18, Hồng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Thành phố Hà Nội).

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 26