khảo sát thành phần hóa học của phân đoạn cao ethyl acetate từ cành cây xà cừ khaya senegalensis desv a juss

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.64 MB, 82 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞---

NGUYỄN VIỆT NAM

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE

TỪ CÀNH CÂY XÀ CỪ

(KHAYA SENEGALENSIS (DESV.) A.JUSS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞---

NGUYỄN VIỆT NAM

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE

TỪ CÀNH CÂY XÀ CỪ

(KHAYA SENEGALENSIS (DESV.) A.JUSS)

Mã số sinh viên: 1853010101 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Nguyễn Việt Nam

Tơi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thơng tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

Nguyễn Việt Nam

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Lệ Thủy

xà cừ (Khaya senegalensis (Desv.) A.Juss)

Ý kiến của giảng viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên Nguyễn Việt Nam được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng.

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến giảng viên hướng dẫn là cô TS. Nguyễn Thị Lệ Thủy, người đã truyền cho em những kiến thức quý báu về hợp chất tự nhiên cũng như tạo điều kiện và hướng dẫn tận tình cho em trong suốt q trình em hồn thành bài khóa luận tốt nghiệp. Trong khoảng thời gian hồn thành bài khóa luận tốt nghiệp, dưới sự hướng dẫn và theo sát của cô, em đã có cho mình một lượng kiến thức đáng kể và từ thực nghiệm cũng đã giúp em rèn luyện, nâng cao kỹ năng thao tác của mình. Từ đó, em đã đúc kết được cho bản thân những kiến thức chuyên ngành bổ ích, cũng như đánh giá được những khiếm khuyết của mình. Ngồi những kiến thức và kinh nghiệm được cơ truyền đạt, thì những lời động viên cũng như góp ý từ cơ chính là nguồn động lực to lớn cho em ngày càng cố gắng trong khoảng thời gian hoàn thành bài luận này

Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn anh Bùi Thanh Tùng là cựu sinh viên khóa 2015 của khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh cũng là người đã giúp đỡ và hướng dẫn tận tình cho em về các kiến thức cơ bản cũng như các kinh nghiệm anh đã có qua tích lũy nhiều năm. Nhờ sự dẫn dắt, hướng dẫn và đưa ra lời khuyên giải quyết các vấn đề của anh đã giúp em tích lũy được một lượng kiến thức chuyên môn và kỹ năng thực nghiệm là vơ cùng q báu. Góp phần khơng nhỏ để giúp em hoàn thành bài luận này. Một lần nữa em gửi lời cảm ơn anh đã luôn dành thời gian giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.

Em cũng xin cảm ơn các anh chị khóa trước, các bạn cùng khóa và đàn em khóa sau đã và đang cùng làm việc tại phịng thí nghiệm Sinh Hóa đã dành chút thời gian quý báu của bản thân giúp đỡ em trong cơng việc để có được kết quả tốt nhất.

Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả những thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học của Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, những người đã đi cùng em từ lúc em còn non nớt bước vào trường cho đến bây giờ em đã hồn thành xong báo cáo khóa luận tốt nghiệp, đề tài có tên là: “Khảo sát thành phần hóa học của phân đoạn cao

Ethyl acetate từ cành cây xà cừ (Khaya senegalensis (Desv.) A.Juss).”

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

Em xin cám ơn sâu sắc đến trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, khoa Cơng Nghệ Sinh Học, nơi đã tạo điều kiện tốt nhất cho em có được khơng gian và đầy đủ cơ sở vật chất sử dụng trong thời gian làm việc tại đây.

Cuối cùng em xin gửi lời tri ân sâu sắc đến ba mẹ. Người đã sinh thành, nuôi nấng và luôn dạy dỗ em nên người, đã lo lắm cho em để em có cơ hội học hỏi và tiếp xúc với cuộc sống.

Bản thân em về kinh nghiệm vẫn đang cịn rất nhiều thiếu sót, em tin rằng những lời nhận xét từ Thầy Cô sẽ là những góp ý cần thiết để em có thể chỉnh sửa, bổ sung và hoàn thiện đề tài này một cách tốt hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2022

Sinh viên

Nguyễn Việt Nam

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

1.1. Tổng quan về cây xà cừ (Khaya senegalensis A.Juss) ... 4

1.1.1. Giới thiệu loài & nguồn gốc ... 4

1.1.2. Phân loại khoa học ... 4

1.1.3. Mô tả thực vật ... 4

1.1.4. Giá trị kinh tế ... 5

1.2.Các nghiên cứu về thành phần hóa học ... 6

1.2.1. Các nghiên cứu trong nước ... 6

1.2.2. Các nghiên cứu từ nước ngoài ... 6

1.2.2.1. Từ vỏ & thân cây: ... 6

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ... 16

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ... 16

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

2.1.3. Hóa chất thiết bị ... 16

2.1.3.1. Hóa chất: ... 16

2.1.3.2. Thiết bị: ... 17

2.2.Phương pháp nghiên cứu ... 17

2.2.1. Phương pháp thu thập & xử lý mẫu ... 17

2.2.2. Phương pháp ngâm ... 17

2.2.3. Phương pháp điều chiết cao phân đoạn ... 18

2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol ... 18

2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid ... 18

2.2.6. Phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH• ... 19

2.2.7. Phương pháp phân lập các hợp chất ... 20

2.2.7.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ... 20

2.2.7.2. Sắc ký cột (CC) ... 21

2.2.8. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất... 21

2.2.8.1. Phổ khối lượng (ESI-MS, HR-ESI-MS) ... 21

2.2.8.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ... 21

2.2.9. Phương pháp phân tích thống kê ... 21

2.3.Nội dung nghiên cứu ... 21

2.3.1. Quy trình điều chế cao chiết từ cành xà cừ ... 21

2.3.2. Xác định hàm lượng polyphenol & flavonoid ... 23

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

2.3.4. Quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn cao kháng oxy hóa tiềm năng

... 25

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 29

3.1.Kết quả quy trình điều chiết cao phân đoạn từ cành cây xà cừ ... 30

3.2.Kết quả xác định độ ẩm các phân đoạn cao chiết ... 30

3.3.Kết quả định lượng polyphenol & flavonoid ... 31

3.4.Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa các phân đoạn cao chiết từ cành xà cừ ... 32

3.5.Kết quả cô lập hợp chất tự nhiên từ phân đoạn cao chiết có khả năng kháng oxy hóa tiềm năng ... 33

3.5.1. Tinh sạch KS01 ... 33

3.5.2. Tinh sạch KS02 ... 35

3.5.3. Tinh sạch KS03 ... 39

3.6.Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cơ lập ... 42

3.6.1. Biện luận cấu trúc của hợp chất KS01 ... 42

3.6.2. Biện luận cấu trúc của hợp chất KS02 ... 45

3.6.3. Biện luận cấu trúc của hợp chất KS03 ... 46

3.7.Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa trên hợp chất được cơ lập . 48PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ... 50

4.1.Kết luận ... 51

4.2.Kiến nghị ... 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 52PHỤ LỤC 1 ... IPHỤ LỤC 2 ... VIII.Xác định độ ẩm và hàm lượng chất khô của nguyên liệu bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ... VII

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

II.Đồ thị đường chuẩn acid gallic ... VIIIIII.Đồ thị đường chuẩn quercetin ... IXPHỤ LỤC 3 ... XIKết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa ... XI

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. 1. Cây xà cừ (Khaya senegalensis A.Juss) ... 5

Hình 2. 1. Cành xà cừ ... 16

Hình 2. 2. Cơ chế kháng oxy hóa ... 20

Hình 3. 1. Sắc kỷ bản mỏng TLC khảo sát phân đoạn 5 đến phân đoạn 10 ... 33

Hình 3. 2. TLC của phân đoạn 7.1 - 7.4 và soi dưới đèn UV 254 nm ... 34

Hình 3. 3. TLC của PĐ7.3 và soi dưới đèn UV 254 nm ... 34

Hình 3. 4. TLC của PĐ5-6 và hiện hình dưới đèn UV 254 nm ... 35

Hình 3. 5. TLC của PĐ5 - PĐ11 và hiện hình dưới đèn UV 254 nm ... 35

Hình 3. 6. TLC của PĐ5-6: 1 và hiện hình dưới đèn UV 254 nm ... 36

Hình 3. 7. TLC của PĐ5-6: 1 và hiện hình dưới đèn UV 256 nm ... 37

Hình 3. 8. TLC của PĐ5-6: 1.6 và hiện hình dưới đèn UV 254 nm ... 38

Hình 3. 9. TLC của PĐ5-6: 1.6.4 và hiện hình dưới đèn UV 254 nm ... 39

Hình 3. 10. TLC của PĐ5-6: 4 và hiện hình dưới đèn UV 254 nm ... 39

Hình 3. 11. TLC của PĐ5-6: 4 và hiện hình dưới đèn UV 254 nm ... 40

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2. 1. Quy trình điều chế cao chiết từ cành xà cừ ... 22

Sơ đồ 2. 2. Quy trình cơ lập hợp chất KS01 có hoạt tính sinh học từ cành cây xà cừ ... 26

Sơ đồ 2. 3. Quy trình cơ lập hợp chất KS02 có hoạt tính sinh học từ cành cây xà cừ ... 27

Sơ đồ 2. 4. Quy trình cơ lập hợp chất KS03 có hoạt tính sinh học từ cành cây xà cừ ... 28

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Bảng 3. 2. Kết quả xác định độ ẩm của các phân đoạn cao chiết. ... 31

Bảng 3. 3. Kết quả định lượng polyphenol & flavonoid của hợp chất có hoạt tính sinh học ... 31

Bảng 3. 4. Kết quả khả năng kháng oxy hóa của cácphân đoạn cao chiết cành xà cừ ... 32

Bảng 3. 5. Ký hiệu phân đoạn và khối lượng cao thu được từ cao PĐ7 ... 34

Bảng 3. 6. Ký hiệu phân đoạn và khối lượng cao phân đoạn thu được từ PĐ5 - 6 .. 36

Bảng 3. 7. Ký hiệu phân đoạn và khối lượng cao phân đoạn thu được từ PĐ5-6:1 . 37Bảng 3. 8. Ký hiệu phân đoạn và khối lượng cao phân đoạn thu được từ PĐ5-6: 1.6 ... 38

Bảng 3. 9. Ký hiệu phân đoạn và khối lượng cao phân đoạn thu được từ PĐ5-6: 4 40Bảng 3. 10. Ký hiệu phân đoạn và khối lượng cao phân đoạn thu được từ PĐ5-6: 4.4 ... 41

Bảng 3. 11. Bảng dữ liệu phổ 1H-NMR & 13C-NMR của... 44

Bảng 3. 12. Bảng dữ liệu phổ 1H-NMR & 13C-NMR của... 46

Bảng 3. 13. Bảng dữ liệu phổ 1H-NMR & 13C-NMR của ... 48

Bảng 3. 14. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa trên hợp chất được cơ lập ... 49

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, vấn đề về sức khỏe của con người đã và đang được quan tâm rất nhiều, lĩnh vực y dược cũng như thực phẩm chức năng đã có nhưng bước phát triển vượt bật trong nhưng năm gần đây. Trên thế giới đã có nhiều nước theo xu hướng sử dụng các sản phẩm thảo dược từ thiên nhiên vì tác dụng mà thảo dược mang lại và vì phù hợp với sinh lý của cơ thể con người, có rất ít tác dụng phụ mà sản phẩm này mang lại. Chính vì lí do trên, việc nghiên cứu về thành phần hóa học mang những hoạt tính sinh học đã và đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm.

Tại Việt Nam, đất nước sở hữu một đường bờ biển dài kết hợp với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa quanh năm đã tạo nên những cánh rừng, một hệ thống sinh thái

phong phú và đa dạng. Cây xà cừ (Khaya senegalensis A.Juss) thuộc một trong những

loại cây thuốc dân gian ở Việt Nam, được trồng và mọc hoang dại ở nhiều nơi khắp đất nước và đặc biệt là trong các thành phố, tại các trạm y tế, ven đường và trong các nhà dân. Cho tới hiện nay, tại Việt Nam ít có những nghiên cứu về các thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của cây xà cừ (Khaya senegalensis A.Juss) được cơng

bố, cây có những hợp chất limonoid, flavonoid, nhóm các hợp chất phenolic mang nhiều hoạt tính sinh học có giá trị cao, cao chiết methanol với hợp chất 3,7-dideacetylkhivorin có hoạt động ức chế tăng trưởng chống lại các tế bào MCF-7,SiHa và Caco-2 với IC50 khoảng 0,07-0,14 µM (35-69 ppm)[15],... Đặc biệt, cây có hàm lượng flavonoid tương đối cao. Chúng có tác dụng bảo vệ cơ thể, chống oxy hóa, ngăn ngừa viêm, nhiễm trùng, dị ứng, ngăn ngừa xơ vữa động mạnh.

Từ cơ sở khoa học như trên, đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học của phân

đoạn cao ethyl acetate từ cành cây xà cừ (Khaya senegalensis (Desv.) A.Juss)”

được đề xuất nhằm tìm ra những hợp chất mới có hoạt tính sinh học trong cây. Tiêu chí đặt ra là cơng tác nghiên cứu không làm ảnh hưởng tới việc phát triển của cây mà vẫn bảo vệ hệ sinh thái cho nên nhóm nghiên cứu chỉ thu hái những cành cây được tỉa, những cành khô và nhặt những cành xung quanh cây xà cừ để làm đối tượng nghiên cứu.

Mục tiêu nghiên cứu:

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

2 - Khảo sát định lượng polyphenol và flavonoid từ cao chiết cành xà cừ (Khaya senegalensis A.Juss).

- Khảo sát khả năng kháng oxy hóa từ các phân đoạn cao chiết cành xà cừ

(Khaya senegalensis A.Juss).

- Cô lập và xác định cấu trúc của các hợp chất trong phân đoạn cao ethyl acetate

từ cành xà cừ (Khaya senegalensis A.Juss).

- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa trên các hợp chất được cô lập của phân đoạn

cao ethyl acetat từ cành xà cừ (Khaya senegalensis A.Juss).

Đề tài được thực hiện nhằm cô lập hợp chất tự nhiên theo định hướng hoạt tính kháng oxy hóa trên đối tượng cành xà cừ bằng các phương pháp như sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, phương pháp ELISA và phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phương pháp thống kê.

Cách tiếp cận:

Dựa trên một số bài thuốc dân gian về tác dụng dược lý từ cây xà cừ kết hợp với một số các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học mà các bài báo khác trên thế giới đã đề cập. Trên cơ sở đó chủ nhiệm đề tài đã đề xuất nghiên cứu cô lập hợp chất tự nhiên theo định hướng hoạt tính sinh học từ cành cây xà cừ.

Phạm vi không gian: đề tài chỉ tập trung về việc điều tra, đánh giá chất lượng của hợp chất cô lập được trên đối tường được thu nhận trong một khu vực nhất định và ở đây là khu vực Thành phố Thủ Dầu Một thuộc tỉnh Bình Dương. Nghiên cứu được thực hiện tại địa điểm phịng thí nghiệm Sinh hóa thuộc Khoa Cơng nghệ Sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

Phạm vi thời gian: đề tài được thực hiện theo kế hoạch của trường thời gian từ

tháng 5 đến tháng 9 năm 2022.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

PHẦN I: TỔNG QUAN

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

1.1. Tổng quan về cây xà cừ (Khaya senegalensis A.Juss)

1.1.1. Giới thiệu loài & nguồn gốc

Cây xà cừ hay cịn có tên gọi khác là cây sọ khỉ, tên khoa học là Khaya senegalensis

là loài cây thân gỗ thuộc họ Xoan (Meliaceae) có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Châu Phi và Madagascar. Cây xà cừ bắt nguồn từ Mauritania, rừng hoang mạc Sahara từ Senegal đến đông bắc Uganda, Châu phi như Cameroon, Cộng hịa Trung Phi, Chad, Bờ Biển Ngà, Guinea Xích Đạo, Gambia, Ghana, Guinea, Guinea-Bissau Mali, Niger, Nigeria, Senegal, Sierra Leone, Sudan, Togo, Uganda. Ngồi ra Khaya senegalensis cịn được tìm thấy ở nhiều nước khác như Úc, Cuba, Ấn độ, Indonesia, Puerto Rico, Singapore, Nam Phi và Việt Nam. Tại Việt Nam, cây xà cừ được trồng và mọc hoang dại tại nhiều nơi khắp đất nước, được tìm thấy nhiều nhất ở phía Nam và Tây Nguyên, đặc biệt là trong các thành phố, tại các trạm y tế, bệnh viện, trường học…, ven đường và trong các nhà dân [1].

1.1.2. Phân loại khoa học

Họ: Xoan (Meliaceae)

Chi: Xà cừ, Sọ khỉ (Khaya)

Loài: Gỗ gụ Senegal (Khaya senegalensis (Desv.) A.Juss) 1.1.3. Mô tả thực vật

Xà cừ (Khaya senegalensis): Đại mộc cao 15-30 m, đường kính khoảng 1,0-2,5 m.

Vỏ non có màu xám, nhẵn, bong vẩy trịn. Vỏ khi nứt có nhưng khoanh trịn như cái sọ nên cây cịn có tên gọi khác là sọ khỉ. Các lá mọc so le, lá non có màu tím nhạt, lá chét mọc đối hoặc gần giống, hình elip đến thn dài 5-12 cm x 2,5-5 cm, mép toàn bộ, mỏng như da, sáng bóng, gân lá nhọn với 8-10 cặp gân bên.

Hoa xếp thành chùm ở nách hoặc dường như ở cuối dài tới 20 cm, hoa nhỏ có màu trắng xếp thành cụm. Hoa đơn tính, hoa đực và hoa cái, hình dáng rất giống nhau, cuống dài 1-2 mm, đài hoa chia thùy gần như tận gốc, có thùy trịn dài 1,5 mm, nhị hoa hợp thành ống hình bầu dài 5 mm, thường có 8 bao phấn ở gần đỉnh, xen kẽ với

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

5 các thùy trịn, đầu nhụy hình đĩa. Hoa đực có bầu nỗn thơ, hoa cái có bao phấn nhỏ hơn, khơng phân nhánh.

Quả mọc thẳng, gần hình cầu, quả nang hóa gỗ, đường kính 4–6 cm, màu xám nhạt đến nâu xám, phân thành 4 van, nhiều hạt. Hạt hình đĩa hoặc hình tứ giác, dẹt mạnh, có cánh hẹp quanh mép, màu nâu. Cây con có khả năng nảy mầm dưới lá mầm, các lá mầm còn lại nằm trong vỏ hạt, trụ trên lá mầm dài 5-6 cm, hai lá đầu mọc đối, đơn giản [1].

Đối với cảnh quan mơi trường, rễ cây xà cừ có thể bám chặt trên đất, chống chịu mưa bão, xói mịn đất. Thân cây lớn, nhiều cành, tán lá nhiều, xum xuê nên thường được trồng nhiều ở các khu đô thị để tạo nên khơng gian xanh và làm bóng râm che mát.

Hình 1. 1. Cây xà cừ (Khaya senegalensis A.Juss)

Nguồn: Internet

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

6 Đối với y học, có tác dụng đáng ngạc nhiên trong chữa các bênh như bệnh ho, ghẻ, các triệu chứng đau nhức, sưng tấy, sốt rét, tiêu chảy và các bệnh về da liễu. Ngồi ra, cây xà cừ có thể phát triển ngay trên những vùng đất khô cằn, ít bị sâu bệnh gây hại nên rất dễ trồng và mang lại giá trị kinh tế rất cao.

1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Hiện nay, cây xà cừ đã được biết là có sự phong phú và đa dạng về cấu trúc của các limonoid, có một số cơng trình khoa học nghiên cứu về thành phần hóa học của cây.

1.2.1. Các nghiên cứu trong nước

Năm 2016, Vũ Thị Hiền và cộng sự, thành phần hóa học của quả Khaya

senegalensis có bốn limonoid, seneganolide A (1), khayanone (2), khayanolide B (3),

6-acetoxy-methyl angolensate (4), và hai flavonoid, (-)-epicatechin (5) và quercitrin

(6) được phân lập từ chiết xuất etyl acetat của quả Khaya senegalensis[1].

1.2.2. Các nghiên cứu từ nước ngoài 1.2.2.1. Từ vỏ & thân cây:

Năm 1982, Ulubelen và cộng sự đã phân lập được hợp chất aesculetin (85) từ cây

metyl-1α-acetoxy-2β,3α,6,8α,14β-pentahydroxy-senegalensis)[7].

Năm 1998, Khalid và cộng sự đã phân lập được một limonoid mới là 2,6-

dihydroxyfissinolide (40); từ vỏ cây Khaya senegalensis[8].

Năm 2000, Samir và cộng sự; đã phân lập được hợp chất khayalactol (15) từ vỏ

thân cây Khaya senegalensis[9].

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

7 Năm 2001, Abdelgaleil và cộng sự đã tách được ba limonoid, được đặt tên là khayanolide A, B và C, được phân lập làm chất chống cơn trùng cùng với bốn hợp

chất vịng B, D-seco, seneganolide (11), methyl angolensate (12) và các dẫn xuất hydroxy (10) và 6-acetoxy (4) của nó từ ether chiết xuất từ vỏ thân cây Khaya

6-senegalensis[10].

Năm 2001, Kayser và cộng sự đã phân lập được hai proanthocyanidin dimeric,

catechin-(4a,6)-catechin (83) và catechin-(4a,8)-catechin (84), từ vỏ cây Khaya

senegalensis[11].

Năm 2002, Nakatani và cộng sự đã phân lập được hai có tên khayanolide D (16) và E (17) và một limonoid glucoside có tên khayanoside (18) đã được phân lập làm

thuốc chống côn trùng từ vỏ thân cây Khaya senegalensis của Ai Cập[12].

Năm 2004, El-Aswad và cộng sự đã phân lập được ba limonoid loại phragmalin,

khayanolide A (13), khayanolide B (3) và 1‐O‐acetyl-khayanolide B (14) và một limonoid loại mexicanolide là khayalactol (15) từ vỏ thân cây Khaya senegalensis

(Desr) A.Juss[13].

Năm 2007, Zhang và cộng sự đã phân lập được D-seco limonoid, được đặt tên là

1,3,7- trideacetylkhivorin (65) từ vỏ thân của cây gỗ gụ Châu Phi Khaya senegalensis

(Meliaceae)[14].

Năm 2007, Zhang và cộng sự tách được các hợp chất deacetylkhayanolide E (88),

6 S-hydroxykhayalactone (89), grandifolide (90), 1-O-deacetylkhayanolide (91) từ

chiết xuất methanol của vỏ thân cây Khaya senegalensis[15].

Năm 2009, Zhang và cộng sự đã phân lập được năm loại khayanolide là

1-O-acetylkhayanolide B (14), khayanolide B (3), khayanolide E (17),

1-O-7-deacetylkhayanolide E (26), 6- dehydroxylkhayanolide E (27) từ vỏ thân cây gỗ gụ

Châu phi Khaya senegalensis[16].

Năm 2010, Yuan và cộng sự tách được bảy limonoid mới (1-7), được đặt tên là

khayalenoid C-I (41-47), ba triterpenoid mới (8-10), được đặt tên là senegalenes

A-C (48-50) từ thân cây Khaya senegalensis[17].

Năm 2014, Kankia và cộng sự đã phân lập được ba triterpenoid mới của loại

mexicanolide là 2- hydroxymexicanolide (38), 6-deoxydestigloylswietenine (39) và

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

2,6-dihydroxy-3-mexicanolide (76), từ chiết xuất ethanol của vỏ cây Khaya

senegalensis[18].

Năm 2015, Li và cộng sự đã tách được sáu limonoid mới có vịng furan đã được

sửa đổi, khaysenelide A–F (1-6) (59-64) từ vỏ thân của Khaya senegalensis[19]. Năm 2020, Bu và cộng sự đã phân lập được một limonoid loại andirobin mới với

vòng furan đã biến đổi, khaysenelide K (82) từ vỏ thân cây Khaya senegalensis[20].

1.2.2.2. Từ quả & hạt xà cừ:

Năm 1998, Govindachari và cộng sự tách được ba hợp chất mới là

2α-hydroxymexicanolide (23), 6-deoxydestigloylswietenine (24) và

2,3-dihydroxy-3-deoxymexicanolide (25) từ hạt của Khaya senegalensis bằng phương pháp HPLC[21].

Năm 1999, Govindachari và cộng sự đã phân lập được mexicanolide (66),

2α,3β-dihydroxymexicanolide (69) bốn limonoid từ hạt Khaya senegalensis[22].

Năm 2000, Bickii và cộng sự tách được bảy limonoid, methylangolensate (12), 6- methylhydroxyangolensate (10), gedunin (70), 7-deacetylkhivorine (71), 1- deacetylkhivorine (72), swietenolide (73), 6-acetylswietenolide (74) và một

flavonoid, catechin (75), từ vỏ và hạt của cây Khaya grandifoliola [23].

Năm 2004, Abdelgaleil và cộng sự đã phân lập được ba limonoid mexicanolide

mới có chứa hệ thống diene lactone liên hợp hiếm có tên là seneganolide A (1), hydroxyseneganolide A (7) và 2-acetoxyseneganolide A (8). Hai limonoid đã biết, 3-deacetyl-7-deacetoxy-7-oxokhivorin (9) và methyl 6- hydroxyangolensate (10) từ

2-quả cây Khaya senegalensis[24].

Năm 2006, Michel và cộng sự đã phân lập được hợp chất

3,7-dideacetyl-6α-hydroxykhivorin (86), 6S,8α-dihydroxy-14,15-dihydrocarapin (87) từ hạt của Khaya

senegalensis[25].

Năm 2016, Tian, X. và cộng sự, đã phân lập được mười hai limonoid mới

(khasenegasins O–Z) (28-39) với ba loại khung sườn khác nhau, bao gồm tám

mexicanolide, hai gedunin và hai andirobin từ hạt của Khaya senegalensis[26].

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

1.2.2.3. Từ lá & cành xà cừ:

Năm 1997, Olmo và cộng sự đã trích xuất được hai limonoid mới

methyl-1α-axetoxy-3β,6,8α-trihydroxy-2α-methoxy-2β,14β-epoxy-tricyclomeliac-7-oate (19) và metyl-1α-acetoxy-6,8α,14β,30β-tetrahydroxy-3-oxo-tricyclomeliac-7-oate (20). Scopoletin (21), quercitrin (6) và rutin (22) từ lá của cây Khaya senegalensis[27].

Năm 2012, Yuan và cộng sự đã phân lập được tám limonoid mới gọi tên

khayseneganin A–H (1-8) (51-58) từ lá và cành của cây Khaya senegalensis[28]. Năm 2012, Yuan và cộng sự đã phân lập được các hợp chất senegalension A-C

(92-94) từ lá và cành của cây Khaya senegalensis[29].

Năm 2013, Yuan và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất mới là khayseneganin

I (77) và 2α,3α,16β-trihydroxy-20-acetoxy20(R)-pregnane (78) từ lá và cành cây

Khaya senegalensis[30].

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

1.2.3. Các hợp chất được cô lập từ khaya senegalensis 1.2.3.1. Limonoid

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

1-0-Deacetylkhayanolide E(26)Metyl-1a-acetoxy-3 p,6,8a-trihydroxy-2a

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

SenegalensionA(92)Senegalension B (93) Senegalension c (94)

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

1.2.3.2. Phenolic

1.2.3.3. Flavonoid

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

PHẦN II: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

2.1. Vật liệu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Cành cây xà cừ (Khaya senegalensis) được thu hái tại khoa Công nghệ Sinh học thuộc Cơ sở 3 tỉnh Bình Dương. Mẫu được giám định tên khoa học là Khaya senegalensis (Desv.) A.Juss. bởi TS. Đặng Lệ Anh Tuấn (trường Đại học Khoa học

Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh).

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

Thực nghiệm được tiến hành tại phịng thí nghiệm Sinh Hóa, khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh trong từ gian từ tháng 04/2022 đến tháng 08/2022.

2.1.3. Hóa chất thiết bị 2.1.3.1. Hóa chất:

Các loại dung mơi ethanol (Việt Nam), n-hexane (Việt Nam), ethyl acetat (Việt

Nam), methanol (Việt Nam), chloroform: Chemsol (Việt Nam). Các hóa chất sử dụng trong chạy phổ DMSO, CDCl3 (Mesk).

Silicagel (Indian), silicagel 200-400 (Merck), bản mỏng silicagel 60 F254 (Merck).

Hình 2. 1. Cành xà cừ

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

17 Thuốc thử Folin-ciocalteu (Merck), acid gallic, Na2CO3, quercetin, AlCl3, NaOH, NaNO2, DPPH•.

Hóa chất sử dụng đạt độ tinh khiết phân tích.

2.1.3.2. Thiết bị:

Tủ sấy (Memmert ALM400)

Cân phân tích điện tử (AA – 200), cân kĩ thuật (Sartorius TE 412) Đèn UV hiện huỳnh quang Vilber Lourmat VL – 6.LC

Máy cô quay (Heidolph)

Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM

Máy đo quang phổ BioTeK

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp thu thập & xử lý mẫu

Cành xà cừ được thu thập tại khoa Cơng nghệ Sinh học thuộc Cơ sở 3 tỉnh Bình Dương. Thu hái những cành dài có đường kính từ 1.5-3cm, không lấy những cành đã bị hư hại hoặc mục nát. Mẫu được rửa sạch, phơi khô, xay mịn và ngâm với ethanol 96° ở nhiệt độ phòng.

2.2.2. Phương pháp ngâm

Kỹ thuật chiết ngâm (maceration) [4], ngâm bột cây trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép khơng rỉ, bình phải có nắp đậy (tránh sử dụng bằng bình nhựa). Rót dung mơi tinh khiết vào bình cho đến khi sấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên nhiệt độ phòng trong 1 đêm hoặc 1 ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc qua một tờ giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết. Tiếp theo, rót dung mơi mới vào bình chiết bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây.

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

2.2.3. Phương pháp điều chiết cao phân đoạn

Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng dung mơi có độ phân cực tăng dần để phân tách các hợp chất tự nhiên có độ phân cực khác nhau thành các phân đoạn cao chiết có độ phân cực tương ứng. Đây là phương pháp thường quy nhất được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực cô lập hợp chất tự nhiên.

2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol

Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương pháp sử dụng thuốc thử ciocalteu được mô tả bởi Aiyegoro và Okoh[33].

Folin-Nguyên tắc:

Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc các hợp chất polyphenol trong dung dịch phản ứng với thuốc thử folin-ciocalteu. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với hàm lượng polyphenol trong một phạm vi nhất định. Dựa vào cường độ màu đo ở bước sóng λ 760 nm và đồ thị đường chuẩn acid gallic có thể xác định được hàm lượng polyphenol.

Hàm lượng polyphenol được tính theo cơng thức sau: P = a × V

H: hiệu suất chiết cao (%)

2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid

Hàm lượng flavonoid được định lượng theo phương pháp Aluminium trichloride

được mô tả bởi Chang và cộng sự (2002)[32].

Nguyên tắc:

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

19 Phương pháp này được thực hiện dựa vào đặc tính tạo phức màu của các flavonoid với kim loại. Al3+ thường được sử dụng để khảo sát vì nó là kim loại tạo phức màu mạnh và không độc hại. Cường độ màu của hỗn hợp tỉ lệ thuận với hàm lượng flavonoid. Dựa vào cường độ màu đo ở bước sóng λ 425 nm và đồ thị đường chuẩn quercetin có thể xác định được hàm lượng flavonoid.

Hàm lượng flavonoid được tính theo cơng thức sau: F = b × V

Nguyên tắc:

Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hịa gốc DPPH• bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

20 sẽ nhạt dần, chuyển từ màu tím sang vàng nhạt. Phản ứng trung hịa gốc DPPH• của các chất kháng oxy hóa được minh họa bằng phản ứng được mô tả bên dưới:

2.2.7. Phương pháp phân lập các hợp chất 2.2.7.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254

(Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu [4].

Hình 2. 2. Cơ chế kháng oxy hóa

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

2.2.7.2. Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành trên cột thủy tinh, với chất nhồi cột là silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh), silica gel pha đảo, saphadex LH-20 để phân lập chất [4].

2.2.8. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 2.2.8.1. Phổ khối lượng (ESI-MS, HR-ESI-MS)

Phổ khối lượng phun mù điện tử được đo trên máy Agilent 1260 LC ghép đầu dò khối phổ 6120B single quadrupole MSD của trường Đại học Khoa học tự nhiên TPHCM. Phổ khối lượng phân giải cao ghi trên máy MicroOTOF-Q mass spectrometer, Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM.

2.2.8.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM.

2.2.9. Phương pháp phân tích thống kê

Các thí nghiệm được thử nghiệm định lượng hợp chất sinh học và kháng oxy hóa đều được thực hiện với ít nhất 3 lần lặp lại. Số liệu phân tích được trình bày dưới dạng giá trị trung bình và xử lý thống kê phương pháp phân tích phương sai

(ANOVA) và so sánh sự khác biệt bằng kiểm định Duncan (ở mức ý nghĩa α<0,05)

thông qua phần mềm Statgraphics Plus 3.0.

2.3. Nội dung nghiên cứu

2.3.1. Quy trình điều chế cao chiết từ cành xà cừ

Cành xà cừ phơi khô (22,4 kg) xay nhuyễn thành bột, sau đó bột này được ngâm trong 47 L dung mơi ethanol 96° ở nhiệt độ phịng, khuấy đảo hỗn hợp bột cây và dung môi đã ngâm sau mỗi 4 - 8 h và để yên. Sau 24 h, hỗn hợp này được lọc để thu nhận dịch lọc, phần bã được tiếp tục ngâm với 8 L dung mơi ethanol 96°. Q trình ngâm được lặp lại 7 lần. Dịch lọc thu được từ mỗi lần ngâm được gộp chung lại và

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

22 tiến hành cô đuổi dung môi ở áp suất cao thu được cao ethanol với khối lượng là 630g.

Cao ethanol (630 g) được sắc ký phân đoạn với chất hấp thụ là silica gel và cột thủy tinh được sử dụng ở kỹ thuật này có chiều dài 120 cm, đường kính cột là 6 cm.

Pha động sử dụng là hệ dung mơi có độ phân cực tăng dần từ n-hexan, ethyl acetate và methanol, thu được ba loại cao chiết tương ứng là cao n-hexan, ethyl acetate và

methanol.

Cao n-hexan (26,57 g) được tiếp tục sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan và ethylacetate theo tỉ lệ lần lượt là 9:1, 8:2, 1:1, 0:1 (v/v) và cuối cùng là methanol

thu được bốn phân đoạn cao được ký hiệu PĐ1 – PĐ4.

Cao ethyl acetate (59,67 g) thực hiện sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ethyl

acetate và methanol theo tỉ lệ lần lượt là 9:1, 8:2, 1:1, 0:1 (v/v) và cuối cùng là

Sơ đồ 2. 1. Quy trình điều chế cao chiết từ cành xà cừ

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

23 methanol (449,4 g) thu được năm phân đoạn cao được ký hiệu PĐ5 – PĐ10. Lặp lại quy trình này với cao methanol thu được bốn phân đoạn ký hiệu PĐ11 – PĐ14.

Quy trình chiết và phân đoạn cao được thể hiện theo sơ đồ 2.1. Các phân đoạn cao chiết này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.3.2. Xác định hàm lượng polyphenol & flavonoid 2.3.2.1. Xác định hàm lượng polyphenol

Mẫu được dùng để thử nghiệm là bốn loại cao chiết được điều chế theo sơ đồ 2.1

đó là cao ethanol, n-hexan, ethyl acetate và methanol.

Cân 1 mg mẫu thử nghiệm hòa tan trong 5 ml methanol. Lấy 1 ml dung dịch mẫu thử cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml thuốc thử Folin – Ciocalteu lắc đều trong 3 phút. Tiếp tục thêm 1 ml Na2CO3 20% và 7,5 ml nước cất để yên trong 2 giờ. Sau đó tiến hành đo OD ở bước sóng λ = 760 nm.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Xử lý kết quả dựa vào đường chuẩn acid gallic để xác định hàm lượng polyphenol có trong mẫu cao chiết. Hàm lượng polyphenol có trong mẫu được tính bằng trung bình 3 lần lặp lại được xử lý thống kê theo phần mềm Excel 2016 của đương lượng acid gallic (GAE) có trong mẫu cao thử nghiệm.

2.3.2.2. Xác định hàm lượng flavonoid

Mẫu được dùng để thử nghiệm là bốn loại cao chiết được điều chế theo sơ đồ 2.1

đó là cao ethanol, n-hexan, ethyl acetate và methanol. Hàm lượng flavonoid được xác

định dựa theo phương pháp tạo màu với Aluminium trichloride (AlCl3) của Chang và

cộng sự (2002)[32].

Cân 1 mg mẫu thử nghiệm hòa tan trong 5 ml methanol. Lấy 1 ml dung dịch mẫu thử cho vào ống nghiệm thêm 4 ml nước cất, thêm 0,3 ml NaNO2 5% để yên trong 5 phút, tiếp tực thêm 0,3 ml AlCl3 10% để yên trong 6 phút, bỏ thêm 2 ml NaOH 1M, cho 2,4 ml nước cất. Sau đó tiến hành đo OD ở bước sóng λ = 425 nm.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

24 Xử lý kết quả dựa vào đường chuẩn quercetin để xác định hàm lượng flavonoid có trong mẫu cao chiết. Hàm lượng flavonoid có trong mẫu cao được tính bằng trung bình 3 lần lặp lại được xử lý thống kê theo phần mềm Excel 2016 theo đương lượng quercetin có trong mẫu cao thử nghiệm.

2.3.3. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa các phân đoạn cao chiết từ cành xà cừ 2.3.3.1. Cách tiến hành:

Cân 1,576 mg DPPH• định mức bằng methanol thành 20 ml. Để ổn định trong tối 30 phút ở 4°C. Lúc này DPPH• có nồng độ là 0,2 mM.

- Mẫu thử: pha mẫu thí nghiệm bằng methanol, lắc cho mẫu tan hoàn toàn, pha thành 5 dãy nồng độ từ 25 – 200 µg/ml (Bảng 2.1). Tiến hành cho 100 µl mẫu thí nghiệm với 100 àl DPPHã (0,2 mM). Lc u, c dung dch mẫu. Để yên các mẫu trong tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm.

- Mẫu đối chứng: được tiến hành tương tự như mẫu thí nghiệm nhưng được thay bằng dung dịch Vitamin C.

- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, % ức chế là giá trị trung bình 3 lần lặp lại được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphicplus 3.0.

Sau khi chuẩn bị các mẫu, tiến hành khảo sát khả năng ức chế gốc tự do, các mẫu sẽ được bơm vào đĩa 96 giếng và đưa vào máy ELISA đọc kết quả ở giá trị mật độ quang 517 nm.

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

25 Khả năng kháng oxy hóa được đánh giá bằng giá trị IC50. Giá trị IC50 của mỗi mẫu được tính dựa trên phương pháp hồi quy từ độ thị giữa % ức chế gốc tự do với nồng độ chất ức chế.

Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa

Kết quả của thí nghiệm thử hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn cao chiết sẽ là cơ sở cho việc chọn lựa phân đoạn cho thí nghiệm phân lập hợp chất theo định hướng kháng oxy hóa.

Các hợp chất sau khi đã được cơ lập và tinh sạch sẽ được xác định cấu trúc hóa học bằng cách giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR.

2.3.4. Quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn cao kháng oxy hóa tiềm năng

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

Sơ đồ 2. 2. Quy trình cơ lập hợp chất KS01 có hoạt tính sinh học từ cành cây xà cừ

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

Sơ đồ 2. 3. Quy trình cơ lập hợp chất KS02 có hoạt tính sinh học từ cành cây xà cừ

</div>