hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.03 MB, 95 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

TRẦN CAO MINH

<b>HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH THUỶ PHÂN PROTEIN </b>

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 8540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS. TS. Hoàng Kim Anh Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Nguyễn Hoài Hương

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày 02 tháng 01 năm 2024.

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1. Chủ tịch hội đồng: GS. TS. Lê Văn Việt Mẫn 2. Phản biện 1: PGS. TS. Hoàng Kim Anh 3. Phản biện 2: TS. Nguyễn Hồi Hương 4. Uỷ viên: PGS. TS. Võ Đình Lệ Tâm 5. Thư ký: PGS. TS. Tôn Nữ Minh Nguyệt

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).

GS. TS. Lê Văn Việt Mẫn

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc </b>

<b>NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ </b>

Họ tên học viên: Trần Cao Minh ... MSHV: 2170496 ... Ngày, tháng, năm sinh: 07/08/1999 ... Nơi sinh: Tp. Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm ... Mã số: 8540101 ...

<b>I. TÊN ĐỀ TÀI: Hoạt tính sinh học của dịch thuỷ phân protein (Bioactivity of protein </b>

hydrolysate)

<b>II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: </b>

- Xác định hàm lượng kim loại nặng của thịt hến.

- Thu dịch thuỷ phân protein thịt hến có hoạt tính ức chế lipase cao nhất theo điều kiện thuỷ phân được chọn.

- Xác định mức độ thủy phân, thành phần acid amin của dịch thuỷ phân thu được. - Đánh giá độ bền hoạt tính ức chế lipase của bột dịch thủy phân theo pH và nhiệt độ. - Đánh giá một số tính chất chức năng của dịch thuỷ phân thu được.

- Tách phân đoạn peptide từ dịch thuỷ phân.

- Xác định hoạt tính ức chế lipase của các phân đoạn peptide thu được.

<b>III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/09/2023 </b>

<b>IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/12/2023 V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS. TS. Võ Đình Lệ Tâm </b>

GS. TS. Lê Văn Việt Mẫn

<b>TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC </b>

(Họ tên và chữ ký)

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>LỜI CẢM ƠN </b>

Để hoàn thành luận văn này, trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Bộ mơn Cơng nghệ Thực phẩm, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt cơng trình nghiên cứu khoa học này. Tôi xin chân thành cảm ơn các Quý Thầy, Cô của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt những kiến thức bổ ích, kinh nghiệm quý báu và giải đáp những thắc mắc trong suốt thời gian học. Tôi xin chân thành cảm ơn Q Thầy Cơ phịng thí nghiệm đã giúp đỡ và tạo điều kiện về trang thiết bị, dụng cụ,… trong suốt thời gian thực hiện luận văn.

Đặc biệt tôi xin được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Võ Đình Lệ Tâm đã tận tình hướng dẫn, chia sẻ và hỗ trợ tơi hoàn thành luận văn một cách tốt nhất. Cám ơn Cô đã luôn dành thời gian, lo lắng và cho tôi những lời khuyên quý báu mỗi khi tôi gặp khó khăn cả trong việc học tập và cuộc sống.

Bên cạnh đó, tơi cũng xin gửi lời cảm ơn các em sinh viên đã gắn bó và giúp đỡ tơi rất nhiều trong q trình thực hiện luận văn này.

Lời cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, cùng bạn bè đã hỗ trợ, động viên tinh thần và bên cạnh tơi những lúc khó khăn nhất.

“Chúng tơi xin cảm ơn Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM đã hỗ trợ cho nghiên cứu này.”

TP. Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 12 năm 2023 Học viên thực hiện

Trần Cao Minh

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>TÓM TẮT LUẬN VĂN </b>

Nghiên cứu này tận dụng con hến, là nguồn nguyên liệu có giá trị kinh tế thấp, để thu dịch thuỷ phân protein có hoạt tính ức chế lipase và các tính chất chức năng gồm độ tan, độ bền nhiệt, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, khả năng giữ nước, khả năng giữ dầu. Dịch thuỷ phân protein có hoạt tính ức chế lipase cao nhất theo điều kiện thuỷ phân được chọn được xác định thành phần acid amin, mức độ thuỷ phân. Sau đó, các tính chất chức năng bao gồm độ tan, khả năng tạo bọt, độ bền bọt, khả năng tạo nhũ, độ bền nhũ, khả năng giữ nước, khả năng giữ dầu và độ ổn định hoạt tính ức chế lipase dưới ảnh hưởng của pH và nhiệt độ của dịch thuỷ phân được khảo sát. Ngoài ra, năm phân đoạn peptide > 30 kDa, 10-30 kDa, 3-10 kDa, 1-3 kDa, < 1 kDa thu nhận từ dịch thuỷ phân được xác định hoạt tính ức chế lipase.

Dịch thuỷ phân protein từ thịt hến đạt hoạt tính ức chế lipase cao nhất là 36,83 ± 1,17% (cao hơn 1,16 lần so với Orlistat) với mức độ thuỷ phân là 12,66 ± 0,26%. Kết quả xác định thành phần acid amin cho thấy dịch thuỷ phân protein thịt hến chứa hàm lượng acid amin thiết yếu khoảng 44,86% tổng lượng acid amin. Độ tan của bột dịch thuỷ phân protein vẫn giữ được trên 75% khi khảo sát trong khoảng pH 3-8 và kể cả sau khi xử lý nhiệt ở 63℃ trong 30 phút và 93℃ trong 30 giây. Khả năng tạo bọt và độ bền bọt của dịch thuỷ phân giảm dần trong khoảng khảo sát khi tăng pH từ 3 đến 8. Khả năng tạo bọt của dịch thuỷ phân hến đạt giá trị cao nhất là 26,44 ± 1,29% (cao hơn albumin 3,50 lần) và độ bền bọt của dịch thuỷ phân hến đạt giá trị cao nhất ở pH 3 là 14,88 ± 0,21% (cao hơn albumin 2,95 lần). Khả năng tạo nhũ của dịch thuỷ phân giảm dần trong khoảng pH từ 3 đến 8, đạt giá trị cao nhất là 32,98 ± 0,88 m<small>2</small>/g tại pH 3 (cao hơn sodium caseinate 1,14 lần). Độ bền nhũ của dịch thuỷ phân đạt giá trị cao nhất là 51,77 ± 1,74 phút tại pH 5, cao hơn sodium caseinate 1,41 lần. Khả năng giữ nước và khả năng giữ dầu của bột dịch thuỷ phân protein lần lượt là 3,09 ± 0,03 mL nước/g bột dịch thuỷ phân (cao hơn casein 1,26 lần) và 6,79 ± 0,19 mL dầu/g bột dịch thuỷ phân (cao hơn casein 5,03 lần). Trong khoảng pH từ 2 đến 4, bột dịch thuỷ phân protein thịt hến có độ ổn định hoạt tính ức chế lipase trên 90% và độ ổn định hoạt tính ức chế lipase trên 20% tại các giá trị pH khác trong khoảng pH 1-11.

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

Độ bền hoạt tính ức chế lipase của bột dịch thuỷ phân protein thịt hến được xử lý ở 100℃ từ 0 đến 120 phút có độ ổn định trên 85%. Khi xử lý nhiệt từ 120 đến 180 phút, độ bền hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân giảm xuống và duy trì ổn định trong khoảng 29,38 ± 0,06% đến 39,21 ± 0,03%. Kết quả xác định hoạt tính ức chế lipase của các phân đoạn peptide cho thấy phân đoạn peptide < 1 kDa thể hiện hoạt tính ức chế lipase cao nhất đạt 37,28 ± 0,35% (cao hơn Orlistat 1,18 lần).

Kết quả nghiên cứu cho thấy thịt hến có thể được sử dụng để thu dịch thuỷ phân protein có hoạt tính ức chế lipase và các tính chất chức năng như độ tan, độ bền nhiệt, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, khả năng giữ nước, khả năng giữ dầu, định hướng sử dụng như chất bổ sung acid amin, chất phụ gia thực phẩm cải thiện hương vị và/hoặc kết cấu thực phẩm.

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>ABSTRACT </b>

This study takes advantage of baby clams, a raw material source with low economic value, to obtain protein hydrolysate with lipase inhibitory activity and functional properties including solubility, heat stability, foaming ability, emulsifying ability, water holding capacity, oil holding capacity. The protein hydrolysate with the highest lipase inhibitory activity was determined by its amino acid composition and degree of hydrolysis. Then, the functional properties include solubility, foaming capacity, foam stability, emulsifying capacity, emulsion stability, water holding capacity, oil holding capacity and lipase inhibitory activity stability under the influence of pH and temperature were investigated. In addition, five peptide fractions > 30 kDa, 10-30 kDa, 3-10 kDa, 1-3 kDa, < 1 kDa obtained from the hydrolysate were determined to have lipase inhibitory activity.

Protein hydrolysate from baby clams meat achieved the highest lipase inhibitory activity of 36.83 ± 1.17% (1.16 times higher than Orlistat) with a degree of hydrolysis of 12.66 ± 0.26%. The results of determining the amino acid composition show that baby clams meat protein hydrolysate contains essential amino acids about 44.86% of the total amino acids. The solubility of the protein hydrolysate powder remained above 75% when tested in the pH range 3-8 and even after heat treatment at 63℃ for 30 minutes and 93℃ for 30 seconds. The foaming capacity and foaming stability of the hydrolysate gradually decreased over the survey range when increasing pH from 3 to 8. The foaming capacity of the baby clams’s hydrolysate reached the highest value of 26.44 ± 1.29% (3.50 times higher than albumin) and the foaming stability of the baby clams’s hydrolysate reached the highest value at pH 3 of 14.88 ± 0.21% (2.95 times higher than albumin). The emulsifying capacity of the hydrolysate gradually decreased in the pH range from 3 to 8, reaching the highest value of 32.98 ± 0.88 m<small>2</small>/g at pH 3 (1.14 times higher than sodium caseinate). The emulsion stability of the hydrolysate reached the highest value of 51.77 ± 1.74 minutes at pH 5, 1.41 times higher than sodium caseinate. The water holding capacity and oil holding capacity of protein hydrolysate powder were 3.09 ± 0.03 mL water/g

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

hydrolysate powder (1.26 times higher than casein) and 6.79 ± 0.19 mL oil/g hydrolysate powder (5.03 times higher than casein), respectively. In the pH range from 2 to 4, protein hydrolysate powder from baby clams meat had lipase inhibitory activity stability of over 90% and lipase inhibitory activity stability of over 20% at other pH values in the pH range of 1-11. The stability of lipase inhibitory activity of protein hydrolysate powder from baby clams meat treated at 100℃ for 0 to 120 minutes was over 85%. When heat treated for 120 to 180 minutes, the lipase inhibitor activity stability of the hydrolysate decreased and remained stable in the range of 29.38 ± 0.06% to 39.21 ± 0.03%. The results of determining the lipase inhibitory activity of the peptide fractions showed that the peptide fraction < 1 kDa showed the highest lipase inhibitory activity at 37.28 ± 0.35% (1.18 times higher than Orlistat).

Study results showed that baby clams can be used to obtain protein hydrolysate with lipase inhibitory activity and functional properties such as solubility, thermal stability, foaming ability, emulsifying ability, water-holding capacity, oil-holding capacity. It is intended for use as an amino acid supplement, food additive to improve food flavor and/or texture.

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>LỜI CAM ĐOAN </b>

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn hoàn toàn trung thực và đều thuộc sở hữu nhóm nghiên cứu. Các số liệu tham khảo đã được trích dẫn và chỉ rõ nguồn gốc trong bài viết.

Học viên thực hiện Luận văn

Trần Cao Minh

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

1.2.2 Phương pháp thu nhận dịch thủy phân protein ... 5

<b>1.3Hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein ... 6</b>

1.3.1 Giới thiệu hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein ... 6

1.3.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein ... 7

1.3.2.1 Nghiên cứu trên thế giới ... 7

1.3.2.2 Nghiên cứu ở Việt Nam ... 10

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>1.4Tính chất chức năng của dịch thuỷ phân protein ... 10</b>

1.4.1 Độ tan ... 10

1.4.2 Độ bền nhiệt (Độ tan ở các pH sau khi xử lý nhiệt) ... 10

1.4.3 Khả năng tạo bọt và bền bọt ... 11

1.4.4 Khả năng tạo nhũ và bền nhũ ... 11

1.4.5 Khả năng giữ nước và giữ dầu ... 11

1.4.6 Tổng quan tình hình nghiên cứu dịch thủy phân protein có tính chất chức năng ... 12

1.4.6.1 Nghiên cứu trên thế giới ... 12

1.4.6.2 Nghiên cứu ở Việt Nam ... 12

<b>1.5Ứng dụng của dịch thủy phân protein ... 13</b>

<b>CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ... 14</b>

<b>2.1Nguyên liệu và hóa chất ... 14</b>

2.1.1 Hến ... 14

2.1.2 Chế phẩm enzyme ... 14

2.1.3 Hóa chất khác ... 15

<b>2.2Sơ đồ nghiên cứu ... 15</b>

<b>2.3Giải thích sơ đồ nghiên cứu ... 15</b>

<b>2.4Phương pháp nghiên cứu ... 16</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

2.4.6 Xác định thành phần acid amin (TCVN 8764:2012) ... 18

2.4.7 Đánh giá tính chất chức năng của dịch thủy phân ... 18

2.4.7.1 Đánh giá độ hoà tan của bột dịch thuỷ phân ... 18

2.4.7.2 Đánh giá độ bền nhiệt của bột dịch thuỷ phân ... 18

2.4.7.3 Đánh giá khả năng tạo bọt và độ bền bọt của dịch thuỷ phân .... 19

2.4.7.4 Đánh giá khả năng tạo nhũ và độ bền nhũ của dịch thuỷ phân ... 19

2.4.7.5 Đánh giá khả năng giữ nước của bột dịch thuỷ phân ... 19

2.4.7.6 Đánh giá khả năng giữ dầu của bột dịch thuỷ phân ... 19

2.4.8 Đánh giá độ ổn định hoạt tính ức chế lipase ... 19

2.4.8.1 Phương pháp đánh giá độ ổn định hoạt tính ức chế lipase theo pH ... 19

2.4.8.2 Phương pháp đánh giá độ ổn định hoạt tính ức chế lipase theo nhiệt độ ... 19

2.4.9 Xử lý thống kê ... 20

<b>CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ... 21</b>

<b>3.1Xác định hàm lượng kim loại nặng của thịt hến ... 21</b>

<b>3.2Đánh giá thành phần acid amin và tính chất chức năng của dịch thủy phân ... 21</b>

3.2.1 Thành phần acid amin của dịch thuỷ phân ... 21

3.2.2 Tính chất chức năng của dịch thuỷ phân ... 24

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<b>3.3Độ bền hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein hến ... 33</b>

3.3.1 Độ bền hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein hến theo pH ... 33

3.3.2 Độ bền hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein hến theo nhiệt độ ... 35

<b>3.4Xác định hoạt tính ức chế lipase của các phân đoạn peptide ... 36</b>

<b>CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN ... 38</b>

<b>DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ... 39</b>

<b>PHỤ LỤC A. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐƯỢC SỬ DỤNG ... 60</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>DANH MỤC VIẾT TẮT </b>

ACE Enzyme chuyển đổi Angiotensin Angiotensin-converting enzyme ANOVA Phân tích phương sai Analysis of variance

AOAC Association of Official

Analytical Chemists <sup> </sup>

DH Mức độ thủy phân Degree of hydrolysis DPP-IV Dipeptidyl peptidase-IV

DTP Dịch thủy phân protein

EAI Khả năng tạo nhũ Emulsifying activity index ESI Độ bền nhũ Emulsion stability index E:S Tỷ lệ enzyme : cơ chất Enzyme : substrate ratio FC Khả năng tạo bọt Foaming capacity FS Độ bền bọt Foaming stability

IC<small>50</small> Nồng độ ức chế 50% Inhibitory concentration OHC Khả năng giữ dầu Oil-holding capacity WHC Khả năng giữ nước Water-holding capacity v/v thể tích / thể tích volume / volume

w/v khối lượng / thể tích weight / volume

Asn Asparagine Asp Aspartic acid

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

Ile Isoleucine

Met Methionine Phe Phenylalanine

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

<b>DANH MỤC BẢNG </b>

Bảng 1.1. Phân loại khoa học của hến [10] ... 3Bảng 1.2. Thành phần hóa học của thịt hến tươi [12] ... 4Bảng 3.1. Hàm lượng kim loại nặng trong thịt hến ... 21Bảng 3.2. Đánh giá sơ bộ thành phần acid amin trong DTP hến có hoạt tính ức chế lipase cao nhất ... 22Bảng 3.3. Kết quả so sánh WHC và OHC của bột DTP hến có hoạt tính ức chế lipase cao nhất và Casein ... 32

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

<b>DANH MỤC HÌNH </b>

Hình 1.1. Hình thái của hến ... 4

Hình 2.1. Thịt hến tươi ... 14

Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu ... 15

Hình 3.1. Ảnh hưởng của pH đến độ tan và độ bền nhiệt của bột DTP hến có hoạt tính ức chế lipase cao nhất ... 24

Hình 3.2. Ảnh hưởng của pH đến FC của DTP hến ... 26

Hình 3.3. Ảnh hưởng của pH đến FS của DTP hến ... 27

Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH đến EAI của DTP hến ... 29

Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến ESI của DTP hến ... 30

Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH đến độ bền hoạt tính ức chế lipase của DTP hến ... 33

Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt ở 100℃ đến độ bền hoạt tính ức chế lipase của DTP hến ... 35Hình 3.8. Hoạt tính ức chế lipase của các phân đoạn peptide thu nhận từ DTP hến 36

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ </b>

<i>Hến thuộc họ gồm các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, thuộc bộ Veneroida, có </i>

vỏ cứng hình tròn, thường sống ở nhiều vùng nước khác nhau như các cửa sông nước lợ, nước ngọt, gần các vùng kênh, rạch và ven biển ở nước ta. Có 4 loài hến thường

<i>gặp, gồm Corbicula baudoni, C. moreletiana, C. bocurti và C. cyreniformis. Thống </i>

kê cho thấy, trong tháng 4 năm 2023, sản lượng thu hoạch hến ở hồ Ea Kao và sông Mã từ 50-100 kg/ngày/người với giá bán 10000-15000 đồng/kg [1]. Thịt hến chứa nhiều chất dinh dưỡng như protein, lipid, carbohydrate, vi khống [2]. Ngồi việc được dùng trong một số món ăn như hến xào, hến sấy và món cơm hến nổi tiếng ở Huế [3], hến cịn được xem là nguồn thức ăn chính trong chăn nuôi tôm hùm ở Nha Trang. Đây là nguồn nguyên liệu quý để sử dụng và chế biến tạo sản phẩm có giá trị gia tăng, mang lại hiệu quả kinh tế nhưng chưa được khai thác hiệu quả [4].

Gần đây, nghiên cứu về dịch thủy phân protein (DTP)/peptide có hoạt tính sinh học như hoạt tính liên kết khống, hoạt tính kháng oxy hố, hoạt tính ức chế enzyme chuyển đổi Angiotensin (Angiotensin-converting enzyme – ACE),… đã thu hút nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta. Nghiên cứu từ Chen và cộng sự [5] đã tinh sạch một peptide từ DTP cơ cá ngừ chù có hoạt tính liên kết calcium cao (76,8 ± 4,5 mg/g) và trình tự của peptide được xác định là Glu-Pro-Ala-His. Zhang và cộng sự [6] khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của DTP gelatin được trích ly từ da cá mè trắng Hoa Nam với ba loại chế phẩm enzyme khác nhau là Alcalase, Papain và Flavourzyme. Kết quả cho thấy DTP bằng chế phẩm enzyme Flavourzyme thể hiện khả năng trung hòa gốc tự do DPPH<small>● </small>cao nhất (gấp 1,2 lần DTP từ Alcalase; 1,6 lần DTP từ Papain) và khả năng khử cao nhất (gấp 1,2 lần DTP từ Alcalase; 2,3 lần DTP từ Papain), trong khi DTP bằng chế phẩm enzyme Alcalase thể hiện khả năng liên kết Fe<small>2+</small> cao nhất. Mongkonkamthorn và cộng sự [7] đã sử dụng máu cá ngừ, là một loại phụ phẩm của quy trình sản xuất cá ngừ đóng hộp, để thu nhận peptide có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế ACE bằng phương pháp thủy phân với các chế phẩm enzyme (Alcalase, Neutrase hoặc Flavourzyme). Kết quả cho thấy phân đoạn < 1 kDa

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

của DTP với enzyme Neutrase thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế ACE cao nhất.

Hoạt tính ức chế lipase của DTP thịt hến được khảo sát trong nghiên cứu này. Mục đích của nghiên cứu này là cung cấp dữ liệu sơ bộ về hoạt tính ức chế lipase của DTP từ hến và phân đoạn peptide. Nghiên cứu này có thể là nền tảng cho các nghiên

<i>cứu sâu hơn như thử nghiệm in vitro, in vivo, thử nghiệm an toàn, cơ chế hoạt động </i>

của các peptide trong cơ thể sống hoặc các thử nghiệm lâm sàng.

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

<b>1 CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU </b>

<b>1.1 Giới thiệu về hến </b>

Hến là loài động vật thân mềm hai mảnh, tương đối nhỏ sinh sống tại các vùng nước khác nhau, chủ yếu ở các vùng nước lợ (cửa sông) và nước ngọt (hồ, sông, suối), ngồi ra cịn có ở vùng nước mặn (ven biển). Hến phân bố ở Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương, tập trung nhiều ở Nam Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Philippine, Ấn Độ, Việt Nam… [8, 9].

Bảng 1.1. Phân loại khoa học của hến [10]

<i>Việt Nam có các lồi chủ yếu là: Corbicula baudoni, Corbicula moreletiana, </i>

<i>Corbicula bocuri, Corbicula cyreniformis, Corbicula fluminea… Chúng phân bố </i>

khắp cả nước, có nhiều ở miền Trung (Quảng Trị, Thừa Thiên Huế…) và Đông Nam Bộ (Đồng Nai, Bến Tre, Tiền Giang…).

Hến có hình bầu dục hay tam giác, có khi gần trịn, cân đối, phồng to và dày. Vỏ hình trứng và sâu nhất ở khớp nối hai mảnh vỏ, vùng đỉnh nhô cao, phần đầu và đuôi gần bằng nhau. Cạnh trước và sau đều trịn, cạch bụng cong nhiều hơn. Mặt ngồi của vỏ thường là màu xanh vàng tới nâu, trên vỏ có nhiều đường vân sinh trưởng thể hiện số tuổi của hến. Mặt trong của vỏ được bao phủ bởi lớp xà cừ nhẵn bóng, ánh tím. Kích thước hến trưởng thành thường gặp từ 20,5 đến 28,5 mm [11].

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

Hình 1.1. Hình thái của hến

Đây là lồi động vật ăn lọc, chúng sống chủ yếu ở các vùng nước chảy. Thức ăn của hến là các vật lơ lửng như mùn bã hữu cơ và sinh vật phù du, các lồi tảo có kích thước nhỏ. Sự tăng trưởng của hến phụ thuộc vào nhiệt độ, môi trường sống, nguồn thức ăn, nguồn nước. Sự tăng trưởng của hến thể hiện chủ yếu trên các đường vân vỏ.

<i>1.1.3 Thành phần hóa học </i>

Theo bảng thành phần dinh dưỡng Việt Nam, trong nguyên liệu hến tươi có một số thành phần như sau:

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của thịt hến tươi [12]

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

<b>1.2 Dịch thủy phân protein </b>

<i>1.2.1 Giới thiệu </i>

DTP được định nghĩa là hỗn hợp của oligopeptides, peptides và acid amins tự do bằng cách thủy phân một phần hay toàn bộ nguồn protein trong điều kiện được kiểm sốt, theo sau đó là q trình xử lý sau thủy phân để phân lập các peptide có hoạt tính sinh học [13]. DTP được sản xuất cho nhiều mục đích sử dụng trong ngành cơng nghiệp thực phẩm, bao gồm chất thay thế sữa, chất bổ sung protein, chất ổn định trong đồ uống và chất điều vị trong các sản phẩm bánh kẹo [14]. Gần đây, lợi ích của việc thủy phân protein thực phẩm để tạo thành các peptide có hoạt tính sinh học và thành phần bổ sung dinh dưỡng đang nhận được nhiều sự quan tâm.

<i>1.2.2 Phương pháp thu nhận dịch thủy phân protein </i>

Nhìn chung, DTP có thể được thu nhận bằng cách sử dụng phương pháp thủy phân trong môi trường acid/kiềm, thủy phân bằng chế phẩm enzyme protease hoặc lên men bằng vi sinh vật [15].

Thủy phân hóa học có thể được thực hiện bằng cách cắt đứt liên kết peptide trong môi trường acid hoặc kiềm [16]. Ưu điểm của phương pháp này là chi phí thấp, nhanh và cho hiệu suất thu hồi protein cao [17]. Tuy nhiên, các sản phẩm khơng mong muốn có thể được hình thành do q trình xử lý khơng đặc hiệu như chuyển hóa đồng phân L-acid amin thành D-acid amin và có thể hình thành chất độc như lysino-alanine [18]; một số acid amin có thể bị ảnh hưởng như Trp thường bị phá hủy hoàn toàn khi thủy phân bằng acid; Cys, Ser và Thr bị mất một phần và Asn và Gln được chuyển đổi thành dạng acid của chúng trong quá trình thủy phân bằng acid [19]. Từ đó làm giảm giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học của sản phẩm khi thủy phân bằng acid hoặc kiềm. Do sự thay đổi lớn trong quá trình thủy phân dẫn đến sự thay đổi cao về hoạt tính sinh học của các peptide thu được đã hạn chế đáng kể các ứng dụng có giá trị của các sản phẩm thủy phân protein theo phương pháp này [13].

Lên men bằng vi sinh vật cũng là một cách thu nhận các peptide có các hoạt tính sinh học nhất định [20]. Các vi khuẩn hoặc nấm men đang phát triển sẽ tiết ra

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

các enzyme phân giải protein vào nguyên liệu để giải phóng các peptide từ các protein mẹ [21]. Ưu điểm của quá trình lên men là quá trình thủy phân bằng enzyme được thực hiện bởi các protease của vi sinh vật, và do đó, các peptide có hoạt tính sinh học có thể được tinh chế mà không cần thủy phân thêm [22]. Tuy nhiên, nhược điểm của quá trình lên men là hiệu suất tạo thành peptide thấp [23]. Trên thực tế, trong quá trình lên men, một số peptide có hoạt tính sinh học và acid amin được giải phóng từ protein, thơng qua tác động của các enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật phân giải protein, sẽ được chủng vi khuẩn sử dụng làm nguồn carbon hoặc nitrogen cho sự phát triển của chúng [13].

Quá trình thủy phân bằng chế phẩm enzyme chuyển đổi protein thành các

<i>peptide có kích thước khác nhau và các acid amin tự do [24]. Thủy phân in vitro cơ </i>

chất protein bằng cách sử dụng các chế phẩm enzyme phân giải protein thích hợp là quá trình được sử dụng rộng rãi để sản xuất DTP và peptide với các hoạt tính sinh học mong muốn [25]. So với phương pháp thủy phân hóa học, phương pháp thủy phân protein bằng chế phẩm enzyme là một cách tiếp cận phù hợp để sản xuất peptide có hoạt tính sinh học, do quy trình yêu cầu điều kiện nhẹ nhàng hơn (pH 6,0-8,0; nhiệt độ 40-60℃) và q trình thủy phân được kiểm sốt tốt hơn [13]. Hơn nữa, trái ngược với thủy phân hóa học, thành phần acid amin của DTP bằng chế phẩm enzyme gần như tương tự với thành phần của protein ban đầu. Ngồi ra, q trình thủy phân bằng chế phẩm enzyme khơng có các dung mơi hữu cơ hoặc hóa chất độc hại, do đó nó phù hợp cho các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm [26].

<b>1.3 Hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein </b>

<i>1.3.1 Giới thiệu hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein </i>

Béo phì là một căn bệnh toàn cầu và là yếu tố nguy cơ chính gây ra các bệnh mạn tính và bệnh đi kèm [27]. Tổ chức Y tế Thế giới dự đoán rằng số người béo phì và thừa cân trên tồn cầu có thể lên tới khoảng 3,3 tỷ người vào năm 2030 [28]. Béo phì là kết quả của sự tích tụ quá nhiều chất béo trong cơ thể và chuyển hóa lipid bất thường. Các enzyme tham gia vào các q trình này có thể được sử dụng làm mục tiêu được lựa chọn để phát triển các chất chống béo phì. Một số phương pháp đã được

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

đề xuất để điều trị bệnh béo phì, bao gồm ức chế q trình đồng hóa chất béo trong chế độ ăn uống thông qua ức chế lipase đường tiêu hóa và tuyến tụy để giảm quá trình thủy phân chất béo trong chế độ ăn uống, giảm hấp thu monoglyceride và acid béo tự do. Orlistat đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê duyệt để điều trị béo phì, vì Orlistat có thể ức chế hoạt động của lipase tuyến tụy và ức chế hấp thu khoảng 30% chất béo trong chế độ ăn uống [29].

Pancreatic lipase (Lipase tuyến tụy) (EC 3.1.1.3) là một enzyme chủ yếu để chuyển hóa lipid, tiêu hóa triglyceride trong chế độ ăn uống, ở người. Tính đến thời điểm hiện tại đã có những loại dược phẩm thương mại ức chế lipase tuyến tụy, ngăn chặn hoạt động của enzyme này làm giảm hấp thu chất béo, thúc đẩy quá trình giảm cân [30]. Tuy nhiên, gần đây, các lựa chọn thay thế tự nhiên đã được đánh giá với khả năng có tác dụng tương tự như các loại thuốc thương mại ức chế lipase [31, 32]. Việc ức chế hoạt động của lipase tuyến tuỵ đã đạt được thông qua việc đưa vào các chất ức chế lipase tuyến tuỵ như polyphenols [33], polysaccharides [34], peptides [35].

<i>1.3.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein </i>

1.3.2.1 Nghiên cứu trên thế giới

Fan và cộng sự [31] đã phân lập và tinh sạch peptide chống béo phì từ protein

<i>tảo Spirulina. Dùng 5 loại chế phẩm enzyme khác nhau, bao gồm: Trypsin, Alcalase, </i>

Pepsin, Papain và Protamex để thủy phân protein đã trích ly. Kết quả cho thấy, phân đoạn 3-5 kDa của DTP thu được bằng chế phẩm Pepsin cho hoạt tính ức chế lipase tuyến tụy cao nhất với 72%.

Mudgil và cộng sự [32] đã nghiên cứu khả năng ức chế dipeptidyl IV (DPP-IV), α-amylase tuyến tụy lợn và lipase tuyến tụy của peptide thủy phân từ protein sữa lạc đà bằng các chế phẩm enzyme khác nhau. Kết quả cho thấy, protein sữa lạc đà có khả năng ức chế DPP-IV và lipase tuyến tụy tốt, trong khi đó, khả năng ức chế α-amylase tuyến tụy lợn được cải thiện không nhiều.

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

peptidase-Nghiên cứu của Gil-Rodríguez và Beresford [36] về khả năng ức chế lipase tuyến tụy của sữa tách béo lên men bằng vi khuẩn lactic acid. Kết quả cho thấy phân

năng ức chế lipase tuyến tụy cao nhất đạt 49%.

Abdelhedi và cộng sự [37] đã sử dụng chế phẩm enzyme Purafect® để thuỷ phân nội tạng cá mập Mustelus. Nghiên cứu phát hiện ở nồng độ 7,5 mg/mL, phân đoạn < 1 kDa của DTP từ nội tạng cá mập thể hiện hoạt tính ức chế lipase đạt 85%.

Garzón và cộng sự [38] đã nghiên cứu DTP từ bã bia lên hoạt tính ức chế cholesterol esterase và ức chế lipase tuyến tụy. Peptide Trp-Asn-Ile-His-Met-Glu-His-Gln-Asp-Leu-Thr-Thr-Met-Glu cho khả năng ức chế cholesterol esterase cao nhất. Ngoài ra, nghiên cứu cũng phát hiện 2 peptide Asp-Phe-Gly-Ile-Ala-Ser-Phe và Leu-Ala-Ala-Val-Glu-Ala-Leu-Ser-Thr-Asn-Gly ức chế lipase tuyến tụy mạnh nhất. Zielińska và cộng sự [39] đã nghiên cứu hoạt tính ức chế ACE, ức chế lipase tuyến tụy và ức chế α-glucosidase từ các phân đoạn peptide của các lồi cơn trùng ăn được. Trong đó, phân đoạn peptide < 700 Da từ châu chấu sa mạc cho khả năng ức chế ACE, ức chế lipase tuyến tụy và ức chế α-glucosidase cao nhất.

Złotek và cộng sự [40] đã nghiên cứu đặc tính gây độc tế bào, ảnh hưởng đến enzyme hoạt động liên quan đến hội chứng chuyển hóa và hoạt tính kháng khuẩn của peptide từ DTP hạt kê bao gồm Gly-Gln-Leu-Gly-Glu-His-Gly-Gly-Ala-Gly-Met-Gly, Gly-Glu-His-Gly-Gly-Ala-Gly-Met-Gly-Gly-Gly-Gln-Phe-Gln-Pro-Val, Glu-Gln-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-Pro-Glu-Glu-Ser-Gly-Arg, Arg-Leu-Ala-Arg-Ala-Gly-Leu-Ala-Gln, Tyr-Gly-Asn-Pro-Val-Gly-Gly-Val-Gly-His, và Gly-Asn-Pro-Val-Gly-Gly-Val-Gly-His-Gly-Thr-Thr-Gly-Thr. Kết quả cho thấy những peptide này khơng có độc tính lên tế bào. Bên cạnh đó, peptide Gly-Gln-Leu-Gly-Glu-His-Gly-Gly-Ala-Gly-Met-Gly cũng cho thấy hoạt tính ức chế lipase tuyến tụy và ức chế α-amylase cao nhất.

Baba và cộng sự [41] đã nghiên cứu hoạt tính ức chế cholesterol esterase và ức chế lipase tuyến tụy từ DTP whey protein lạc đà. Kết quả cho thấy, Phe-Cys-Cys-

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

Leu-Gly-Pro-Val-Pro-Pro là peptide có hoạt tính ức chế cholesterol esterase cao nhất, trong khi đó, các peptide Pro-Ala-Gly-Asn-Phe-Leu-Pro-Pro-Val-Ala-Ala-Ala-Pro-Val-Met, Met-Leu-Pro-Leu-Met-Leu-Pro-Phe-Thr-Met-Gly-Tyr, và Leu-Arg-Phe-Pro-Leu cho hoạt tính ức chế lipase tuyến tụy cao nhất.

Suwanangul và cộng sự [42] đã nghiên cứu DTP hạt Sacha Inchi bằng 3 loại chế phẩm khác nhau, bao gồm Pepsin, Papain và Flavourzyme lên hoạt tính ức chế α-amylase và α-glucosidase. Kết quả cho thấy các peptide được phân đoạn có khả năng ức chế lipase thấp hơn (nồng độ ức chế 50%, IC<small>50</small> > 3,0 mg/mL) so với DTP ban đầu (IC<small>50</small> < 3,0 mg/mL).

Ketprayoon và cộng sự [43] đã nghiên cứu hoạt tính ức chế lipase tuyến tụy từ cám gạo, chế phẩm Alcalase được dùng để thu nhận DTP. Phân đoạn peptide < 0,65k Da được kết luận là có hoạt tính ức chế lipase tuyến tụy cao nhất.

Esfandi và cộng sự [44] nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của peptide thủy phân từ cám yến mạch và khả năng ức chế lipase và ức chế α-amylase. Peptide Tyr-Phe-Asp-Glu-Gln-Asn-Glu-Gln-Phe-Arg được kết luận là có khả năng ức chế α-amylase cao nhất, trong khi đó, Ser-Pro-Phe-Trp-Asn-Ile-Asn-Ala-His có khả năng ức chế lipase cao nhất.

Zhang và cộng sự [45] đã nghiên cứu hoạt tính ức chế ACE và α-amylase từ peptide có nguồn gốc từ hải sâm. Kết quả cho thấy peptide Phe-Glu-Asn-Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys có khả năng ức chế ACE và α-amylase theo cơ chế khác nhau. Một peptide khác được tìm thấy là Ala-Pro-Phe-Pro-Leu-Arg cũng thể hiện hoạt tính ức chế ACE, α-amylase và lipase.

Mudgil và cộng sự [46] đã nghiên cứu hoạt tính ức chế cholesterol esterase và lipase tuyến tụy từ DTP casein bò và casein lạc đà. DTP được thu nhận bằng quá trình thủy phân với chế phẩm Alcalase và Pronase-E. Kết quả cho thấy, các peptide Met-Met-Met-Leu, Phe-Asp-Met-Leu, His-Leu-Pro-Gly-Arg-Gly từ casein bò và các peptide Ala-Ala-Gly-Phe, Met-Ser-Asn-Tyr-Phe, Phe-Leu-Trp-Pro-Glu-Tyr-Gly-Ala-Leu từ casein lạc đà cho hoạt tính ức chế lipase tuyến tụy cao nhất.

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

Ijarotimi và cộng sự [47] đã thu nhận DTP từ hạt đậu bắp có hoạt tính kháng oxy hố, ức chế α-amylase, ức chế α-glucosidase, ức chế lipase và ức chế ACE. DTP thu được có hoạt tính ức chế lipase đạt 52,9%.

Trong nghiên cứu của Oussaief và cộng sự [48], DTP lactoferrin lạc đà thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa, ức chế lipase và ức chế ACE cao hơn so với lactoferrin tự nhiên; trong đó, hoạt tính ức chế lipase cao nhất đạt 48,1%.

Hiện tại trên thế giới chưa có cơng bố nào về hoạt tính ức chế lipase của DTP từ thịt hến.

1.3.2.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nghiên cứu hiện có được thực hiện trên các dịch trích từ thực vật. Tong và cộng sự [49] sử dụng ethanol để điều chế cao ethanol của cây Giảo cổ lam và khảo sát các hoạt tính sinh học trong đó có hoạt tính ức chế lipase. Kết quả thu được cho thấy cao ethanol của cây Giảo cổ lam thể hiện hoạt tính ức chế lipase đạt 73,88%.

Hiện tại ở Việt Nam chưa có cơng bố nào về hoạt tính ức chế lipase của DTP từ thịt hến.

Ngoài ra, DTP cịn có các hoạt tính sinh học khác như kháng oxy hố, kháng khuẩn,…

<b>1.4 Tính chất chức năng của dịch thuỷ phân protein </b>

Độ hòa tan của protein là lượng protein được phân tán trong dung dịch đệm, nhạy cảm với sự kết tụ và biến tính của protein [50].

<i>1.4.2 Độ bền nhiệt (Độ tan ở các pH sau khi xử lý nhiệt) </i>

Bên cạnh độ hòa tan, độ bền nhiệt cũng là một tính chất quan trọng của DTP cần được quan tâm. Xử lý nhiệt là một quy trình quan trọng, thiết yếu trong công nghệ chế biến và sản xuất thực phẩm. Vì vậy, dựa vào độ bền nhiệt có thể xác định

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

được mức độ ứng dụng của DTP vào công nghệ chế biến thực phẩm. Độ bền nhiệt của DTP có thể xác định thông qua độ tan ở các pH sau khi xử lý nhiệt [51].

Bọt là sự phân tán của khí, thường là các tế bào khí, trong một pha liên tục, thường là chất lỏng. Bề mặt phân chia pha khí-nước khơng ổn định về mặt nhiệt động lực học vì tương tác giữa các phân tử nước thuận lợi hơn nhiều so với tương tác giữa các phân tử nước và khí [24, 52]. Bọt nhanh chóng bị tan ra chủ yếu do hai cơ chế gây mất ổn định: sự mất cân bằng do gradient áp suất gây ra sự khuếch tán khí từ các bọt khí nhỏ hơn đến các bọt khí lớn hơn [53], và sự thốt nước của lớp màng nước giữa các bọt khí [54]. Tiềm năng tạo bọt thường được đánh giá dựa trên khả năng tạo bọt (FC), cụ thể là lượng bọt ban đầu được tạo thành sau khi khuấy hoặc đánh bông, và độ bền bọt (FS), là lượng bọt còn lại sau một thời gian nhất định.

Nhũ tương bao gồm hai pha không tan vào nhau. Trong các sản phẩm thực phẩm, đây thường là 2 chất lỏng: dầu và nước, trong đó nhũ tương dầu trong nước là phổ biến nhất. Nhũ tương không ổn định về mặt nhiệt động lực học [55]. Sự kết dính và tạo kem, khuynh hướng dầu nổi lên trên bề mặt của hệ nhũ, là những yếu tố quan trọng gây mất ổn định hệ nhũ [56]. Thơng thường, đặc tính tạo nhũ được đánh giá thông qua khả năng tạo nhũ (EAI) và độ bền nhũ (ESI).

Khả năng giữ nước (WHC) là tổng lượng nước có thể được liên kết hoặc giữ lại bởi peptide, khả năng giữ dầu (OHC) được định nghĩa là lượng chất béo được peptide giữ lại [57, 58].

Ngoài ra, DTP cịn có các tính chất chức năng khác như khả năng tạo màng, khả năng tạo gel,…

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

<i>1.4.6 Tổng quan tình hình nghiên cứu dịch thủy phân protein có tính chất chức năng </i>

1.4.6.1 Nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu của Putra và cộng sự [59] về độ tan, EAI, FC, WHC của DTP ốc bươu vàng. Kết quả nghiên cứu cho thấy DTP ốc bươu vàng có độ tan cao nhất là 77,78%. EAI và FC cao nhất lần lượt là 19,90 m<small>2</small>/g và 34,67%. WHC của DTP ốc bươu vàng cũng đạt cao nhất với giá trị là 4,24 mL nước/g bột DTP.

Cá mè lúi là một loại cá có nguồn gốc từ Indonesia vốn có giá trị kinh tế thấp hơn khi so với cá tra và cá rô phi. Một trong số các hướng đi để tạo giá trị gia tăng cho cá mè lúi là tận dụng protein từ DTP của cá mè lúi. Theo Junianto và cộng sự [60], kết quả đánh giá các tính chất chức năng của DTP protein cá mè lúi bao gồm: WHC, OHC, EAI và khả năng tan trong nước lần lượt là 3,1 mL/g; 1,94 mL/g; 23,60% và 78,2%.

Nghiên cứu của Islam và cộng sự [61] đã thuỷ phân đậu xanh với 2 loại chế phẩm enzyme là Alcalase và Protamex. DTP từ chế phẩm enzyme Protamex tại pH 2 thể hiện tốt độ tan, EAI và FC lần lượt là 83,83%; 95,03 m<small>2</small>/g và 93,84%. WHC đạt 4,52 g/g đối với DTP từ chế phẩm enzyme Alcalase, và OHC đạt 4,91 g/g đối với DTP từ chế phẩm Protamex.

Hiện tại trên thế giới chưa có cơng bố nào về tính chất chức năng của DTP từ thịt hến có hoạt tính ức chế lipase.

1.4.6.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Nguyen và Nguyen [62] đã thu nhận DTP từ đầu cá hồng mím bằng chế phẩm enzyme Flavourzyme, kết quả thu được cho thấy DTP từ đầu cá hồng mím thể hiện các tính chất chức năng bao gồm độ tan, EAI, WHC và FC lần lượt là 93,6%; 32,0 mL/g; 1,9 mL/g và 43,5%.

Cao và Tran [63] đã khảo sát ảnh hưởng của mức độ thuỷ phân (DH), thời gian thuỷ phân lên tính chất chức năng và hoạt tính liên kết calcium của DTP từ phụ phẩm

<i>cá tra Pangasius hypophthalmus. Tại 75 phút thuỷ phân với DH là 18,38%; DTP thu </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

được thể hiện EAI cao nhất là 20,99 mL dầu/ g bột protein phân lập từ cá. Sau 90 phút thuỷ phân, FC cao nhất là 94,59% tại DH là 20,21%.

<i>DTP từ con ruốc Acetes japonicus thu được bằng phương pháp thuỷ phân với </i>

chế phẩm enzyme Flavourzyme thể hiện các tính chất chức năng như độ tan đạt 80% ở pH 5, độ bền nhiệt đạt 80% sau khi xử lý ở 63℃ trong 30 phút và độ bền nhiệt đạt 60% sau khi xử lý ở 93℃ trong 30 giây, EAI và ESI đạt giá trị cực đại tại pH 8 với giá trị lần lượt là 15,92 m<small>2</small>/g và 48,08 phút; FC của DTP là 31,84% và FS là 10,18% tại pH 5; OHC đạt 1,59 mL dầu/g bột DTP và WHC là 1,95 mL/g bột DTP [64].

Hiện tại ở Việt Nam chưa có cơng bố nào về tính chất chức năng của DTP từ thịt hến có hoạt tính ức chế lipase.

<b>1.5 Ứng dụng của dịch thủy phân protein </b>

DTP có hoạt tính sinh học và tính chất chức năng có thể được sử dụng làm chế phẩm bổ sung thực phẩm có hoạt tính sinh học như hoạt tính ức chế lipase, hoạt tính liên kết khống, hoạt tính ức chế tiểu đường,… và có các tính chất chức năng như khả năng tạo nhũ, tạo bọt, giữ nước, giữ dầu, tạo màng, tạo gel,…

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

<b>2 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP </b>

<b>2.1 Nguyên liệu và hóa chất </b>

Hến sau khi được thu mua, vận chuyển lạnh đến phịng thí nghiệm. Hến được rửa với nước sạch để loại bỏ bùn đất, tạp chất cịn dính lại trên vỏ trước khi chần qua nước nóng với tỷ lệ hến:nước 1:10 (w/w) (90-95℃) trong 5 phút. Trong quá trình chần, khuấy đảo mạnh để phần thịt có thể tách ra khỏi vỏ và nổi lên trên. Tiếp theo, phần thịt tươi được thu nhận và rửa với nước sạch để loại bỏ hoàn toàn phần cát, vỏ hến cịn dính vào ngun liệu. Thịt hến sau khi để ráo được xay nhuyễn 2 lần (để đảm bảo đồng nhất kích thước). Thịt hến xay nhuyễn được trữ trong túi polyamide và bảo quản ở -20℃ trong tủ đơng đến khi phân tích.

Hình 2.1. Thịt hến tươi

<i>2.1.2 Chế phẩm enzyme </i>

Nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme Alcalase® 2.5 L của hãng Novozyme (Đan Mạch). Chế phẩm enzyme có dạng lỏng, hoạt tính 2,5 AU-A/g, nhiệt độ tối ưu 30-65℃ và pH tối ưu 7-10.

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

p-nitrophenyl butyrate, pancreatic lipase enzyme và các hóa chất khác được mua từ cơng ty Sigma-Aldrich, Merck. Các hóa chất có mức độ tinh sạch ở mức độ

<b>phân tích. Nước cất một lần được sử dụng trong các thí nghiệm. </b>

<b>2.2 Sơ đồ nghiên cứu </b>

Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu

<b>2.3 Giải thích sơ đồ nghiên cứu </b>

Theo Hình 2.2, nghiên cứu được thực hiện như sau:

<i>Xử lý thịt hến: Hến sau khi được thu mua, vận chuyển lạnh đến phòng thí </i>

nghiệm. Hến được rửa với nước sạch để loại bỏ bùn đất, tạp chất và chần qua nước nóng. Phần thịt tươi được thu nhận, rửa với nước sạch và để ráo. Thịt hến sau khi để ráo được xay nhuyễn 2 lần. Thịt hến xay nhuyễn được trữ trong túi polyamide và bảo quản ở -20℃ trong tủ đơng đến khi phân tích.

<small>Phân tích thành phần acid amin của DTP </small>

<small>Xác định hoạt tính ức chế lipase của các phân đoạn peptide </small>

<small>Đánh giá độ tan, độ bền nhiệt, WHC, OHC của bột DTP </small>

<small>Xử lý thịt hến </small> <sub>hàm lượng kim loại nặng </sub><sup>Xác định </sup>

<small>DTP có hoạt tính ức chế lipase cao nhất </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

<i>Xác định hàm lượng kim loại nặng của thịt hến: Hàm lượng kim loại nặng của </i>

thịt hến được xác định gồm Cd, Pb, Hg.

<i>Thủy phân: Thịt hến được thủy phân bằng chế phẩm enzyme Alcalase với các </i>

điều kiện thủy phân về tỷ lệ thịt hến : nước (w/v), tỷ lệ enzyme : cơ chất (E:S, U/g protein) và thời gian thủy phân (h) để thu DTP có hoạt tính ức chế lipase cao nhất; điều kiện pH và nhiệt độ của quá trình thuỷ phân được lựa chọn nằm trong khoảng tối ưu của chế phẩm enzyme.

DTP có hoạt tính ức chế lipase cao nhất cao nhất được lọc phân đoạn và hoạt tính ức chế lipase của từng phân đoạn được xác định. Đồng thời, giá trị DH và thành phần acid amin của DTP cũng được xác định. DTP cũng được khảo sát các tính chất chức năng, độ bền hoạt tính ức chế lipase của dịch theo nhiệt độ và pH.

<b>2.4 Phương pháp nghiên cứu </b>

<i>2.4.1 Xử lý nguyên liệu </i>

Hến sau khi được thu mua, vận chuyển lạnh đến phòng thí nghiệm. Hến được rửa với nước sạch để loại bỏ bùn đất, tạp chất cịn dính lại trên vỏ trước khi chần qua nước nóng với tỷ lệ hến:nước 1:10 (w/w) (90-95℃) trong 5 phút. Trong quá trình chần, khuấy đảo mạnh để phần thịt có thể tách ra khỏi vỏ và nổi lên trên. Tiếp theo, phần thịt tươi được thu nhận và rửa với nước sạch để loại bỏ hồn tồn phần cát, vỏ hến cịn dính vào nguyên liệu. Thịt hến sau khi để ráo được xay nhuyễn 2 lần (để đảm bảo đồng nhất kích thước). Thịt hến xay nhuyễn được trữ trong túi polyamide và bảo quản ở -20℃ trong tủ đông đến khi phân tích.

Quy trình thủy phân được tiến hành theo phương pháp của Vo và cộng sự [64] với một vài điều chỉnh. Thịt hến sau khi rã đông được đem cân và phối trộn với nước theo tỷ lệ 1:4 (w/v), hỗn hợp sau đó được gia nhiệt lên 90℃ và giữ trong 10 phút để bất hoạt các enzyme nội tại có trong nguyên liệu. Enzyme Alcalase được bổ sung vào hỗn hợp với tỷ lệ E:S là 30 U/g protein sau khi đã hiệu chỉnh pH của dịch về pH 7,5 bằng HCl 1M hoặc NaOH 1M, giữ ở 55℃ để tiến hành thủy phân.

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

Sau 4 h thuỷ phân, kết thúc phản ứng bằng cách gia nhiệt hỗn hợp lên 90℃ trong 10 phút để bất hoạt chế phẩm enzyme. DTP được đem đi ly tâm để tách riêng phần rắn và dịch lỏng (supernatant). Phần DTP sau khi ly tâm được tiến hành lọc bằng giấy lọc Whatman no.3 và bảo quản ở -20℃ bằng tủ đông. DTP sau đó được sử dụng cho các thí nghiệm.

Mức độ thuỷ phân được xác định theo phương pháp của Yao và cộng sự [65]. Nguyên tắc: DH được định nghĩa là tỷ lệ % giữa số liên kết peptide bị cắt đứt và tổng số liên kết peptide. Trong nghiên cứu này, việc xác định DH được phân tích bằng phương pháp chuẩn độ formol. Trong quá trình thủy phân protein, cứ một liên kết peptide bị cắt đứt giải phóng một nhóm amino (-NH<small>2</small>) và một nhóm carboxyl (-COOH). Formol (HCHO) phản ứng với nhóm amino của acid amin sinh ra proton (H<small>+</small>). H<small>+</small> sinh ra được chuẩn độ với NaOH. Lượng nhóm amino được định lượng dựa vào lượng NaOH dùng để chuẩn độ H<small>+</small>, đại diện cho số liên kết peptide bị cắt đứt. Tổng số liên kết peptide được thể hiện thông qua lượng nitơ tổng. Quy trình thực hiện

<b>và tính tốn kết quả được trình bày trong phụ lục A. </b>

<i>2.4.4 Xác định hàm lượng protein hịa tan </i>

Hàm lượng protein hồ tan được xác định theo phương pháp của Lowry và cộng sự [66]. Nguyên tắc: Phương pháp này kết hợp phản ứng giữa ion đồng với liên kết peptide trong môi trường kiềm (phản ứng Biuret) và phản ứng oxy hóa vịng thơm trong protein (chủ yếu là mạch nhánh của Trp và Tyr). Phương pháp Lowry dựa trên phản ứng ion đồng (I), sinh ra bởi phản ứng oxy hóa của liên kết peptide, với thuốc thử Folin–Ciocalteu (hỗn hợp phosphotungstic acid và phosphomolybdic acid). Phản ứng sinh ra phân tử màu xanh là xanh heteropolymolybdenum có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 660 nm. Do đó, tổng nồng độ protein trong mẫu có thể được suy ra từ nồng độ của mạch nhánh Trp và Tyr thơng qua độ hấp thu ở bước sóng 660 nm. Quy

<b>trình thực hiện và tính tốn kết quả được trình bày trong phụ lục A. </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

<i>2.4.5 Xác định hoạt tính ức chế lipase </i>

Hoạt tính ức chế lipase được xác định theo phương pháp của Jafar và cộng sự [67]. Nguyên tắc: Enzyme lipase thủy phân p-nitrophenyl butyrate tạo thành p-nitrophenol. Do môi trường có đệm natri phosphate pH 7,3; p-nitrophenol tồn tại dạng p-nitrophenolate có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 405 nm. Khi có mặt chất ức chế, hoạt tính enzyme lipase giảm, giảm độ hấp thu của mẫu ở bước sóng 405 nm. Thơng qua đó, hoạt tính ức chế enzyme lipase của chất ức chế được xác định. Quy trình thực

<b>hiện và tính tốn kết quả được trình bày trong phụ lục A. </b>

<i>2.4.6 Xác định thành phần acid amin (TCVN 8764:2012) </i>

Nguyên tắc: DTP được thủy phân hoàn toàn thành các acid amin tự do, sau đó được phân tách bằng sắc ký trao đổi ion. Khi các acid amin có nhóm alpha amino tự do được xử lý với lượng dư ninhydrin, chúng tạo ra sản phẩm có màu tím cho độ hấp thụ cực đại ở 440 nm (đối với sản phẩm có nguồn gốc từ Pro) và 570 nm (đối với sản phẩm có nguồn gốc từ acid amin khác).

2.4.7.1 Đánh giá độ hoà tan của bột dịch thuỷ phân

Độ hoà tan của bột DTP được thực hiện theo phương pháp của Li và cộng sự [68]. Bột DTP được pha loãng với nước cất và được điều chỉnh pH trong khoảng 3, 4, 5, 6, 7, 8. Sau đó khảo sát độ hồ tan các mẫu đã xử lý pH. Quy trình thực hiện và

<b>tính tốn kết quả được trình bày trong phụ lục A. </b>

2.4.7.2 Đánh giá độ bền nhiệt của bột dịch thuỷ phân

Độ bền nhiệt (độ tan ở các pH sau khi xử lý nhiệt) của bột DTP được thực hiện theo phương pháp của Li và cộng sự [68]. Bột DTP được pha loãng với nước cất và được điều chỉnh pH trong khoảng 3, 4, 5, 6, 7, 8. Sau đó khảo sát độ bền nhiệt các mẫu đã xử lý pH này ở 2 mức nhiệt độ là 63℃ trong 3 phút và 93℃ trong 30 giây.

<b>Quy trình thực hiện và tính tốn kết quả được trình bày trong phụ lục A. </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

2.4.7.3 Đánh giá khả năng tạo bọt và độ bền bọt của dịch thuỷ phân

Khả năng tạo bọt và độ bền bọt của DTP được thực hiện theo phương pháp của Li và cộng sự [68]. Mẫu DTP được điều chỉnh pH trong khoảng 3, 4, 5, 6, 7, 8. Sau đó xác định FC và FS. Quy trình thực hiện và tính tốn kết quả được trình bày

<b>trong phụ lục A. </b>

2.4.7.4 Đánh giá khả năng tạo nhũ và độ bền nhũ của dịch thuỷ phân

Khả năng tạo nhũ và độ bền nhũ của DTP được thực hiện theo phương pháp của Li và cộng sự [68]. Mẫu DTP được điều chỉnh pH trong khoảng 3, 4, 5, 6, 7, 8. Sau đó xác định EAI và ESI. Quy trình thực hiện và tính tốn kết quả được trình bày

<b>trong phụ lục A. </b>

2.4.7.5 Đánh giá khả năng giữ nước của bột dịch thuỷ phân

Khả năng giữ nước của bột DTP được thực hiện theo phương pháp của Putra và cộng sự [59]. Mẫu bột sấy đông khô được pha với nước cất và được xác định

<b>WHC. Quy trình thực hiện và tính tốn kết quả được trình bày trong phụ lục A. </b>

2.4.7.6 Đánh giá khả năng giữ dầu của bột dịch thuỷ phân

Khả năng giữ dầu của bột DTP được thực hiện theo phương pháp của Putra và cộng sự [59]. Mẫu bột sấy đông khô được trộn với dầu thực vật và được xác định

<b>OHC. Quy trình thực hiện và tính tốn kết quả được trình bày trong phụ lục A. </b>

<i>2.4.8 Đánh giá độ ổn định hoạt tính ức chế lipase </i>

2.4.8.1 Phương pháp đánh giá độ ổn định hoạt tính ức chế lipase theo pH Độ ổn định hoạt tính ức chế lipase theo pH được thực hiện theo phương pháp của Sripokar và cộng sự [69]. Mẫu DTP được khảo sát độ ổn định hoạt tính ức chế lipase sau khi đã được điều chỉnh pH từ 1 đến 11. Quy trình thực hiện và tính tốn

<b>kết quả được trình bày trong phụ lục A. </b>

2.4.8.2 Phương pháp đánh giá độ ổn định hoạt tính ức chế lipase theo nhiệt độ Độ ổn định hoạt tính ức chế lipase theo nhiệt độ được thực hiện theo phương pháp của Sripokar và cộng sự [69]. Mẫu DTP được khảo sát độ ổn định hoạt tính ức

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

chế lipase sau khi đã xử lý ở 100℃ từ 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 phút. Quy

<b>trình thực hiện và tính tốn kết quả được trình bày trong phụ lục A. </b>

<i>2.4.9 Xử lý thống kê </i>

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện lặp lại ít nhất 3 lần. Tất cả dữ liệu được phân tích ANOVA, ý nghĩa khác biệt và độ lệch chuẩn sử dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 và Excel 2016.

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

<b>3 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN </b>

<b>3.1 Xác định hàm lượng kim loại nặng của thịt hến </b>

Kết quả phân tích cho thấy thịt hến An Giang sử dụng trong nghiên cứu này (Bảng 3.1) có hàm lượng Cd và Pb lần lượt đạt 0,20 mg/kg và 0,14 mg/kg, thấp hơn so với giới hạn ô nhiễm Cd và Pb trong thực phẩm được quy định trong QCVN 8-2:2011/BYT (mức tối đa (ML: maximum limit) cho nhuyễn thể hai mảnh vỏ đối với Cd là 2,0 mg/kg và đối với chì là 1,5 mg/kg). Đồng thời, Hg không được phát hiện trong thịt hến với ngưỡng phát hiện của phương pháp là 0,01 mg/kg.

Bảng 3.1. Hàm lượng kim loại nặng trong thịt hến

Hg Không phát hiện

<b>3.2 Đánh giá thành phần acid amin và tính chất chức năng của dịch thủy phân </b>

<i>3.2.1 Thành phần acid amin của dịch thuỷ phân </i>

DTP hến có hoạt tính ức chế lipase cao nhất đạt 36,83 ± 1,17% (cao hơn Orlistat 1,16 lần) với điều kiện thủy phân bao gồm chế phẩm enzyme Alcalase, tỷ lệ thịt hến : nước là 1:4 (w/v); tỷ lệ E:S 30 U/g protein; pH 7,5; nhiệt độ 55℃ và thời gian thủy phân 4 h có giá trị DH là 12,66 ± 0,26%. DH là một yếu tố ảnh hưởng đến các thành phần và trình tự acid amin có thể ảnh hưởng đến hoạt tính ức chế lipase. DH quá cao hoặc quá thấp đều khơng thích hợp cho hoạt tính ức chế lipase [43]. Lý do của hiện tượng này là do quá trình thủy phân thuận lợi cho sự phơi bày của các nhóm kỵ nước, góp phần vào sự tương tác giữa peptide và lipase [70].

Kết quả ước tính và phân tích sơ bộ thành phần acid amin của DTP hến có hoạt tính ức chế lipase cao nhất được thể hiện ở Bảng 3.2. Đứng trên góc độ dinh dưỡng, DTP từ hến có thể cung cấp 8 trong số 9 acid amin cần thiết cho con người.

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

Hàm lượng acid amin cần thiết chiếm khoảng 44,86% tổng lượng acid amin. Acid amin Glu chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần acid amin của dịch, với 284,74 mg/100 g, tiếp đến là Lys với 176,48 mg/100 g. Các acid amin phổ biến tiếp theo là Asp, Thr, Leu. Các acid amin ưa béo Val, Ala, Gly, Leu cũng được tìm thấy đáng kể trong DTP hến. Từ kết quả xác định thành phần acid amin, DTP thịt hến có tiềm năng rất lớn trong ứng dụng làm chế phẩm bổ sung acid amin làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm.

Bảng 3.2. Đánh giá sơ bộ thành phần acid amin trong DTP hến có hoạt tính ức chế lipase cao nhất

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

Các peptide khối lượng phân tử thấp (< 5 kDa) được phân lập từ các DTP của

<i>cơ cá, tảo Spirulina platensis và cả từ các sản phẩm sữa lên men thể hiện hoạt tính chống béo phì in vitro bằng cách giảm hoạt động thủy phân của enzyme lipase tuyến </i>

tụy [31, 32, 36]. Hoạt tính ức chế lipase của DTP được cho là do thành phần acid amin và cấu trúc của các peptide có trong DTP. Một số nghiên cứu nhận thấy rằng các peptide ức chế lipase tuyến tụy sở hữu một số gốc Pro, Gly, Arg, Leu, Met, Glu, Phe trong trình tự của chúng [35, 39, 40, 73].

Các peptide thể hiện hoạt tính ức chế lipase thông qua việc tương tác với lipase tuyến tuỵ bằng tương tác ưa nước, liên kết hydro, tương tác kỵ nước, tương tác/xếp chồng π-π và tương tác Van der Waals [70, 74]. Các peptide có thể tương tác với trung tâm xúc tác, bằng cách này, ở xung quanh các vị trí liên kết cơ chất mà cơ chất sẽ ít có khả năng tiếp cận lipase do hiện tượng án ngữ khơng gian. Bên cạnh đó, gốc Gly-77 trong vùng nắp mở của lipase tuyến tuỵ có khả năng liên kết cao với các peptide. Sự tương tác làm giảm tính linh hoạt của nắp enzyme, làm cho enzyme khó mở nắp hơn và do đó enzyme vẫn ở dạng không hoạt động. Cuối cùng, enzyme không thể lộ trung tâm xúc tác hoặc chuyển sang dạng hoạt động một phần [70].

Chế phẩm enzyme Alcalase có tính đặc hiệu rộng, nghĩa là nó có thể cắt nhiều liên kết peptide trong một phân tử protein [75]. Trong quá trình thuỷ phân, Alcalase phân cắt các liên kết peptide tại vị trí ở đầu carboxyl của Glu, Met, Tyr, Phe, Trp, Lys, Leu, Ala và Ser [76, 77]; tạo ra các peptide có các acid amin này tại đầu carboxyl và các peptide này thể hiện hoạt tính ức chế lipase. Sự khác biệt về hoạt tính ức chế lipase giữa các DTP khác nhau là do sự khác biệt về thành phần acid amin, trình tự và độ dài của các peptide được tạo ra sau quá trình thủy phân tùy thuộc vào enzyme và nguồn protein [78]. Thành phần và trình tự của các phân đoạn peptide phụ thuộc rất nhiều vào enzyme thủy phân được sử dụng [79].

</div>