nghiên cứu xây dựng mô hình sàng lọc ảo các chất ức chế bơm ngược mrp4 được mã hóa bởi gen abcc4

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

<b>ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH</b>

<b>NGUYỄN VŨ THỤY VY</b>

<b>NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MƠ HÌNH SÀNG LỌC ẢOCÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC MRP4 ĐƯỢC MÃ HOÁ</b>

<i><b>BỞI GEN ABCC4</b></i>

<b>LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC</b>

<b>THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

<b>ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH</b>

<b>NGUYỄN VŨ THỤY VY</b>

<b>NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MƠ HÌNH SÀNG LỌC ẢOCÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC MRP4 ĐƯỢC MÃ HỐ</b>

<i><b>BỞI GEN ABCC4</b></i>

<b>NGÀNH: CƠNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐCMÃ SỐ: 8720202</b>

<b>LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC</b>

<b>NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:GS.TS. THÁI KHẮC MINH</b>

<b>THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học – Năm học 2020 – 2022

<b>NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MƠ HÌNH SÀNG LỌC ẢO</b>

<b>CÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC MRP4 ĐƯỢC MÃ HOÁ BỞI GEN ABCC4</b>

<b>Đối tượng và phương pháp nghiên cứu</b>

Dựa trên cơ sở dữ liệu gồm 206 chất thu thập từ 18 bài báo khoa học xây dựng được mơhình sàng lọc 3D – pharmacophore và hai mơ hình 2D – QSAR dự đốn hoạt tính ức chếbơm ngược MRP4 trên cơ chất nội sinh và ngoại sinh. Từ cấu trúc bơm ngược MRP4(8I4A) xác định khoang gắn kết gồm các acid amin thân nước và kỵ nước. Sau khi tiếnhành sàng lọc qua mơ hình pharmacophore, QSAR và docking, các chất ức chế tiềm năngđược tiến hành mô phỏng động lực học phân tử (MD) ở 100 ns, tính tốn năng lượng liênkết tự do và dự đoán ADMET.

<b>Kết quả và bàn luận</b>

Sau q trình sàng lọc ảo và mơ phỏng MD, tìm thấy DB12204 và DB02651 là nhữngchất ức chế tiềm năng với G<small>bind</small> là tương ứng là -22,28 kcal/mol và -31,48 kcal/mol.

<b>Kết luận</b>

<i>Từ hai ngân hàng dữ liệu DrugBank và TCM, tiến hành sàng lọc qua các mơ hình in</i>

<i>silico, kết quả tìm thấy hai chất ức chế bơm MRP4 tiềm năng. Nghiên cứu kiến nghị tiến</i>

<i>hành thử nghiệm in vitro để đánh giá khả năng ức chế bơm ngược.Từ khoá: MRP4, in silico, QSAR, pharmacophore, bơm ngược</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

Final thesis for degree of Master Pharm. – Academic year 2020 – 2022

<b>VIRTUAL SCREENING MODELS OF MRP4 EFFLUX PUMP INHIBITORS</b>

<i><b>ENCODE BY THE ABCC4 GEN</b></i>

Vu-Thuy-Vy NguyenSupervisor: Prof. Khac-Minh Thai

The MRP4 efflux pump is a member of the ATP-binding cassette transporter family,which is highly expressed in platelets and some cancer cells. It has been shown totransport a variety of endogenous and exogenous substrates, which can affect theeffectiveness of therapeutic drugs and be involved in some cases of clinical druginteractions.

<b>Material and method</b>

A database of 206 substances collected from 18 scientific articles was used to build a3D - pharmacophore and two 2D - QSAR models to predict MRP4 efflux pumpinhibitory activity on endogenous and exogenous substrates. From the MRP4 (8I4A)efflux pump structure, the binding cavity consisting of hydrophilic and hydrophobicresidues was also determined. After screening through pharmacophore, QSAR anddocking models, potential inhibitors were subjected to molecular dynamics simulation at100 ns and ADMET evaluation.

<b>Result and discussion</b>

The results found that DB12204 and DB02651 are potential inhibitors with ∆G<small>bind</small> valuesof -20.23 and -31.48 kcal/mol, respectively.

<i>The DrugBank and TCM databank were screened through in silico models. The results</i>

identified two potential MRP4 pump inhibitors were DB12204 and DB02651. The study

<i>recommends conducting in vitro tests to evaluate the inhibitory of potential candidates.</i>

<i><b>Keywords: MRP4, in silico, QSAR, pharmacophore, efflux pump</b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>LỜI CAM ĐOAN</b>

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học của tơi, các kết quả nghiêncứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được côngbố ở bất kỳ nơi nào khác.

<b>Tác giả luận văn</b>

<b>Nguyễn Vũ Thuỵ Vy</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 3

<i>1.1. Bơm đa kháng thuốc MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4 ... 3</i>

1.1.1. Họ bơm ngược ABC (ATP-Binding Cassette) ... 3

1.1.2. Cấu trúc và vị trí phân bố của bơm ngược MRP4 ... 3

1.1.3. Cơ chế vận chuyển của bơm ngược MRP4 ... 6

1.2. Cơ chất và tác động của bơm ngược MRP4 trên lâm sàng ... 8

<i>1.2.1. Phương pháp xác định cơ chất và chất ức chế bơm ngược in vitro ... 8</i>

1.2.2. Cơ chất của bơm ngược MRP4 ... 10

1.2.3. Tác động của bơm ngược MRP4 trên lâm sàng ... 11

1.3. Khám phá thuốc dưới sự hỗ trợ của máy tính ... 12

1.3.1. Khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu ... 12

1.3.2. Khám phá thuốc dựa trên phối tử ... 13

1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước các chất ức chế bơm MRP4 ... 15

1.4.1. Các chất ức chế bơm ngược MRP4 ... 15

<i>1.4.2. Các nghiên cứu in silico tìm kiếm các chất ức chế bơm ngược MRP4 ... 17</i>

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 20

2.1. Thiết kế nghiên cứu ... 20

2.2. Đối tượng nghiên cứu... 20

2.2.1. Cơ sở dữ liệu xây dựng mơ hình sàng lọc dựa trên phối tử ... 20

2.2.2. Cấu trúc bơm ngược MRP4 ... 21

2.2.3. Ngân hàng dữ liệu sử dụng để sàng lọc ... 22

2.2.4. Các phần mềm máy tính sử dụng trong nghiên cứu ... 22

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ... 23

2.4. Quy trình nghiên cứu ... 23

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

2.5. Phương pháp nghiên cứu, công cụ đo lường và thu thập số liệu ... 24

2.5.1. Chuẩn bị cơ sở dữ liệu ... 24

2.5.2. Xây dựng mơ hình pharmacophore ... 24

2.5.3. Quy trình xây dựng mơ hình 2D – QSAR ... 26

2.5.4. Phương pháp xây dựng mơ hình docking phân tử ... 30

2.5.5. Ứng dụng sàng lọc ảo và mô phỏng động lực học phân tử ... 33

2.5.6. Mô phỏng động lực học phân tử (MD) ... 33

2.5.7. Dự đoán ADMET ... 36

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ... 37

3.1. Kết quả mơ hình 3D – pharmacophore ... 37

3.2. Kết quả mơ hình 2D – QSAR ... 40

3.2.1. Kết quả mơ hình 2D – QSAR dự đốn hoạt tính ức chế bơm ngược MRP4trên cơ chất ngoại sinh ... 40

3.2.2. Kết quả mơ hình 2D – QSAR dự đốn hoạt tính ức chế bơm ngược MRP4trên cơ chất nội sinh ... 42

3.3. Kết quả mơ hình docking phân tử ... 47

3.3.1. Đánh giá cấu trúc bơm ngược MRP4 ... 47

3.3.2. Kết quả re – docking và chọn khoang gắn kết ... 49

3.3.3. Kết quả mơ hình docking phân tử ... 50

3.3.4. Đánh giá mơ hình docking ... 52

3.4. Kết quả sàng lọc qua mơ hình pharmacophore, 2D – QSAR và docking phân tửcác chất ức chế bơm ngược MRP4... 53

3.5. Kết quả mô phỏng động lực học phân tử và dự đoán ADMET các chất ức chếbơm ngược MRP4 tiềm năng ... 54

3.5.1. Kết quả mô phỏng động lực học phân tử các chất ức chế bơm ngược MRP4tiềm năng ... 54

3.5.2. Dự đoán ADMET các chất ức chế bơm MRP4 tiềm năng sau sàng lọc ảo .... 59

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ... 60

4.1. Các mơ hình sàng lọc ảo tìm kiếm các chất ức chế trên bơm ngược MRP4 ... 60

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

4.2. Sàng lọc ảo các chất ức chế bơm MRP4 tiềm năng ... 64

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 71

5.1. Kết luận ... 71

5.2. Kiến nghị ... 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 73PHỤ LỤC

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT</b>

<b>Chữ viết tắtTừ viết đầy đủ bằng tiếng AnhNghĩa tiếng Việt</b>

ABC ATP-Binding Cassette transporterfamily

Họ vận chuyển sử dụng nănglượng ATP

ABCC4 ATP-Binding Cassette sub-familyC member 4

Bơm vận chuyển sử dụng nănglượng ATP thứ 4 thuốc phân họ CABCG2 ATP-Binding Cassette sub-family

G member 2

Bơm vận chuyển sử dụng nănglượng ATP thứ 2 thuốc phân họ G

ADMET Absorption, Distribution,Metabolism, Excretion, andToxicity

Hấp thu, phân bố, chuyển hố,thải trừ và độc tính

cAMP Cyclic adenosine monophosphate Adenosin monophosphat vòngCADD Computer aided drug design Khám phá thuốc dưới sự hỗ trợ

của máy tínhCCC Concordance Correlation

HEK Human Embryonic Kidney cell Dòng tế bào phôi thận ngườiHIV Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch ở

HTS Hight throughput screening Sàng lọc hiệu năng cao

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>Chữ viết tắtTừ viết đầy đủ bằng tiếng AnhNghĩa tiếng Việt</b>

IC<small>50</small> 50% inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

MRP1 Multidrug resistance protein 1 Protein đa kháng thuốc 1MRP4 Multidrug resistance protein 4 Protein đa kháng thuốc 4MOE Molecular Operating Environment -

NBD Nucleotide binding domain Vùng liên kết nucleotideNSAID Nonsteroidal anti-inflammatory

Thuốc kháng viêm không steroid

QSAR Quantitative Structure ActivityRelationship

Mối quan hệ định lượng cấu trúcvà tác dụng

ROC Receiver operating characteristic Đặc trưng của bộ thu nhận

RMSD Root-Mean-Square Deviation Căn bậc hai trung bình bìnhphương độ lệch

RMSF Root-Mean-Square Fluctuation Căn bậc hai trung bình bìnhphương độ dao động

SASA Solvent Accessible Surface Area Diện tích bề mặt tiếp cận dungmôi

TCM Traditional Chinese Medicine Ngân hàng dữ liệu các bài thuốccổ truyền Trung Hoa

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>DANH MỤC BẢNG</b>

<b>Bảng 1.1. So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp xác định cơ chất và chất ức</b>

<i>chế bơm ngược in vitro</i><small>23</small> ... 9

<b>Bảng 1.2. Các cơ chất nội và ngoại sinh của bơm ngược MRP4</b><small>2</small> ... 10

<b>Bảng 1.3. Một số phần mềm hỗ trợ thường dùng trong docking</b>²⁸ ... 13

<b>Bảng 1.4. Một số điểm khác biệt giữa khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu và</b>khám phá thuốc dựa trên phối tử²⁸ ... 14

<b>Bảng 1.5. So sánh IC</b><small>50 trên các cơ chất và các tế bào khác nhau ... 17</small>

<b>Bảng 1.6. Tóm tắt các mơ hình docking chất ức chế bơm ngược MRP4 cơng bố trong</b>nghiên cứu trước đó ... 19

<b>Bảng 2.1. Các phần mềm sử dụng trong nghiên cứu ... 22</b>

<b>Bảng 3.1. Năm chất sử dụng để xây dựng mơ hình 3D – pharmacophore ... 37</b>

<b>Bảng 3.2. Thông số đánh giá và yếu tố tạo thành của sáu truy vấn pharmacophore 38Bảng 3.3. Kết quả đánh giá truy vấn pharmacophore trên tập có hoạt tính ức chế mạnh</b>và khơng có hoạt tính ... 38

<b>Bảng 3.4. Kết quả đánh giá truy vấn trên tập có hoạt tính yếu ... 39</b>

<b>Bảng 3.5. Kết quả đánh giá tồn tập 15 mơ hình 2D – QSAR trên cơ chất ngoại sinh</b>... 40

<b>Bảng 3.6. Kết quả đánh giá hai mơ hình 2D – QSAR tốt nhất dự đốn hoạt tính ức</b>chế cơ chất ngoại sinh ... 41

<b>Bảng 3.7. Kết quả đánh giá tồn tập 31 mơ hình 2D – QSAR trên tập Endo_1 ... 43</b>

<b>Bảng 3.8. Kết quả đánh giá mơ hình 2D – QSAR dự đốn hoạt tính ức chế tốt nhất</b>trên tập Endo_1 ... 44

<b>Bảng 3.9. Kết quả đánh giá tồn tập 31 mơ hình 2D – QSAR trên tập Endo_2 ... 45</b>

<b>Bảng 3.10. Kết quả đánh giá ba mơ hình 2D – QSAR dự đốn hoạt tính ức chế tốt</b>nhất trên tập Endo_2 ... 46

<b>Bảng 3.11. Kết quả đánh giá cấu trúc bơm MRP4 bằng đồ thị Ramachandran ... 48</b>

<b>Bảng 3.12. Kết quả re – dock cấu dạng của dipyridamol với khoang gắn kết ... 49</b>

<b>Bảng 3.13. Tần suất liên kết của các acid amin với các chất ức chế MRP4 ... 51</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<b>Bảng 3.14. Giá trị trung bình RMSD</b><small>phối tử, giá trị RMSDprotein, RMSF, SASA và Rg</small>... 55

<b>Bảng 3.15. Các giá trị năng lượng thành phần của năng lượng liên kết tự do</b>

MM/GMSA từ dữ liệu mô phỏng MD 100 ns của phức hợp phối tử – MRP4 ... 57

<b>Bảng 4.1. Tóm tắt các mơ hình 3D – pharmacophore chất ức chế bơm ngược MRP4</b>

công bố trong nghiên cứu trước và nghiên cứu này ... 60

<b>Bảng 4.3. Thông tin về các chất ức chế bơm ngược MRP4 tiềm năng trên cơ chất nội</b>

sinh và ngoại sinh ... 64

<b>Bảng 4.4. Các khung cấu trúc phổ biến của các chất ức chế bơm ngược MRP4 trên</b>

cơ chất ngoại sinh ... 67

<b>Bảng 4.5. Các khung cấu trúc phổ biến của các chất ức chế bơm ngược MRP4 trên</b>

cơ chất nội sinh ... 68

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<b>DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ</b>

<b>Hình 1.1. Cấu trúc bơm ngược MRP4</b>¹⁹ ... 5

<b>Hình 1.2. Mơ hình cơng tắc của các bơm ngược thuộc họ ABC</b><small>12</small> ... 7

<b>Hình 1.3. Mơ hình tiếp xúc liên tục của các bơm ABC</b><small>11</small> ... 7

<b>Hình 1.4. Mơ hình trao đổi của bơm ABC</b>¹² ... 8

<b>Hình 1.5. Một số chất ức chế bơm ngược MRP4 ... 16</b>

<b>Hình 2.1. Quy trình thực hiện nghiên cứu ... 23</b>

<b>Hình 2.2. Quy trình xây dựng mơ hình 3D – pharmacophore trên các chất ức chế bơm</b>MRP4 ... 25

<b>Hình 2.3. Quy trình xây dựng mơ hình 2D-QSAR trên các chất ức chế bơm MRP4</b>... 26

<b>Hình 2.4. Quy trình xây dựng mơ hình docking ... 32</b>

<b>Hình 2.5. Quy trình mơ phỏng động lực học phân tử... 34</b>

<b>Hình 3.1. Truy vấn RHHa_3 các chất ức chế bơm MRP4: (A) Các khoảng cách và</b>góc (B) Các chất ức chế bơm ngược MRP4 dùng để xây dựng mơ hình ... 39

<b>Hình 3.2. Đồ thị tương quan giữa giá trị pIC</b><small>50 dự đoán và thực nghiệm của hai mơ</small>hình 2D – QSAR dự đốn hoạt tính ức chế trên cơ chất ngoại sinh ... 42

<b>Hình 3.3. Đồ thị tương quan giữa giá trị pIC</b><small>50 dự đoán và thực nghiệm của mơ hình</small>2D – QSAR dự đốn hoạt tính ức chế trên tập Endo_1 ... 44

<b>Hình 3.4. Đồ thị tương quan giữa giá trị pIC</b><small>50 dự đoán và thực nghiệm của ba mơ</small>hình 2D – QSAR dự đốn hoạt tính ức chế trên tập Endo_2 ... 47

<b>Hình 3.5. Đồ thị Ramachandran của bốn mơ hình bơm ngược MRP4_1 (A), MRP4_2</b>(B), MRP4_3 (C), MRP4_4 (D) ... 48

<b>Hình 3.6. Cấu dạng dipyridamol trong các khoang gắn kết có bán kính khác nhau 50Hình 3.7. Biểu đồ thống kê điểm số docking của các chất trên MRP4 ... 51</b>

<b>Hình 3.8. 10 chất có điểm số docking tốt nhất tại khoang gắn kết (A) Vị trí gắn kết</b>của 10 chất (B) Tương tác ADMET_2016_4_302_Tozasertib và các acid amin ... 52

<b>Hình 3.9. Đánh giá mơ hình docking các chất ức chế đã biết trên MRP4 (A) Diện tích</b>dưới đường cong, (B) đường cong dự đốn ... 52

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>Hình 3.10. Sơ đồ kết quả sàng lọc các chất ức chế trên cơ chất nội sinh và ngoại sinh</b>

từ ngân hàng dữ liệu ... 53

<b>Hình 3.11. Cấu trúc các chất được tiến hành mơ phỏng động lực học phân tử ... 54Hình 3.12. Đường biểu diễn giá trị RMSD</b><small>protein (A) và giá trị RMSDphối tử (B) của</small>phức hợp phối tử – MRP4 trong mơ phỏng 100 ns ... 55

<b>Hình 3.13. Đường biểu diễn giá trị RMSF của các acid amin trong mơ phỏng 100 ns</b>

... 56

<b>Hình 3.14. Đường biểu diễn giá trị R</b><small>g (A) và giá trị SASA (B) của phức hợp phối tử</small>- MRP4 trong mô phỏng 100 ns ... 56

<b>Hình 3.15. Năng lượng liên kết tự do MM/GBSA của phức hợp phối tử - MRP4 được</b>

tính từ dữ liệu 100 ns của q trình mơ phỏng ... 57

<b>Hình 3.16. Sự tương tác của các phối tử với acid amin tại khoang gắn kết của bơm</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

<b>MỞ ĐẦU</b>

<i>Bơm ngược MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4 là protein đa kháng thuốc thuộc</i>

họ ABC được tìm thấy lần đầu tiên ở tế bào lympho T của người vào năm 1999. Bơmgồm 1325 acid amin, phân bố ở màng đỉnh của tế bào ống lượn gần, nội mô maomạch não, màng đáy của tế bào tuyến tiền liệt, tế bào gan và đám rối màng mạch.MRP4 vận chuyển nhiều cơ chất nội sinh và ngoại sinh ra ngoài tế bào, đồng thởiđóng vai trị quan trọng trong việc cân bằng nội sinh của một số các phân tử tín hiệu.<small>1</small>Các cơ chất nội sinh của bơm ngược MRP4 bao gồm các phân tử tín hiệu nhưprostaglandin E2, leukotrien B4, thromboxan B2 (TXB2), chất truyền tin thứ cấp nhưcAMP và cGMP, các acid mật, steroid liên hợp và acid folic. Ngoài ra, MRP4 cũngcó khả năng vận chuyển một loạt các cơ chất ngoại sinh là thuốc như các thuốc chốngung thư, kháng sinh, thuốc kháng virus và thuốc tim mạch ra khỏi tế bào, gây ra tìnhtrạng đa kháng thuốc thường gặp trong điều trị các bệnh HIV, ung thư và tim mạch.²Một số nghiên cứu đã chứng minh bơm ngược MRP4 biểu hiện quá mức trong các tếbào ung thư tuyến tiền liệt,<small>3</small> u nguyên bào thần kinh<small>4</small> và dòng tế bào bệnh bạch cầunguyên bào lympho T⁵ gây ảnh hưởng đến hiệu quả của thuốc điều trị.

Những dữ liệu lâm sàng cịn cho biết bơm MRP4 có liên quan đến một số trườnghợp tương tác thuốc trên lâm sàng. Nghiên cứu hồi cứu về tương tác giữa NSAID –các thuốc có khả năng ức chế bơm MRP4 với tenofovir trên bệnh nhân nhiễm HIVcho thấy các NSAID ảnh hưởng đến quá trình bài tiết tenofovir gây viêm kẽ thậncấp.<small>6</small> Các NSAID còn ức chế quá trình vận chuyển methotrexat bởi bơm ngược MRP2và MRP4 ở thận, gây ảnh hưởng đến sự đào thải của methotrexat ra khỏi cơ thể.<small>7</small> Vìvậy, bơm MRP4 và các chất ức chế có tiềm năng trở thành một trong những mục tiêunghiên cứu về tương tác thuốc trong tương lai.

Tuy nhiên việc nghiên cứu về bơm ngược MRP4 vẫn gặp một số trở ngại,tháng 6 năm 2023, cấu trúc bơm được chụp bằng kính hiển vi nghiệm lạnh mới đượccông bố, nhưng một số acid amin ở vùng linh động của bơm vẫn chưa được làm rõ.Các nghiên cứu về cấu trúc MRP4 trước đó chủ yếu sử dụng các mơ hình tương đồnghoặc phương pháp đột biến điểm định hướng nhằm xác định các acid amin quan trọng

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

liên quan đến quá trình gắn kết và vận chuyển cơ chất.<small>8,9</small> Giống như các bơm ngượckhác thuộc họ ABC, MRP4 được giả định có nhiều hơn một vị trí gắn kết với cơ chất

<i>và cơ chế vận chuyển cơ chất vẫn đang được dự đốn thơng qua các mơ hình insilico.</i><small>10-12</small> Việc xây dựng các mơ hình pharmacophore, QSAR, docking có thể giúpbổ sung một số thông tin về cấu trúc của bơm, mối liên hệ định lượng giữa cấu trúc– tác động ức chế, khảo sát khả năng gắn kết của chất ức chế vào mục tiêu tác động.

<i>Đồng thời, các mơ hình in silico được ứng dụng để sàng lọc các chất ức chế bơm từ</i>

các ngân hàng dữ liệu sẵn có cũng như dự đoán khả năng ức chế và tương tác thuốccó thể xảy ra trong tương lai.

<i>Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu xây dựng mơ hình in silico có khả năng dự đốn</i>

các chất ức chế bơm ngược MRP4 ở người. MRP4 có khả năng đào thải một loạt cácthuốc điều trị ung thư, HIV, tim mạch và gây tương tác thuốc trên lâm sàng.Ức chế MRP4 có thể làm tăng nồng độ thuốc điều trị trong nội bào, từ đó khơi phụchiệu lực và làm giảm tình đa kháng thuốc xảy ra ở một số bệnh nhân.<small>13</small> Để đạt đượcmục tiêu chung đã đặt ra, cần thực hiện các mục tiêu cụ thể như sau:

1. Xây dựng mơ hình 3D – pharmacophore dựa trên phối tử để sàng lọc nhanhcác chất có khả năng ức chế bơm ngược MRP4.

2. Xây dựng mơ hình QSAR nhằm dự đốn hoạt tính các chất ức chế bơm MRP4.3. Thu thập và đánh giá cấu trúc bơm ngược MRP4, nghiên cứu mô hình dockingphân tử nhằm nghiên cứu tương tác và khả năng gắn kết của các chất ức chếbơm ngược.

4. Ứng dụng sàng lọc trên các tập cơ sở dữ liệu DrugBank và ngân hàng dữ liệucác bài thuốc cổ truyền Trung Hoa (TCM) nhằm tìm ra các hợp chất có khảnăng ức chế bơm ngược MRP4.

5. Nghiên cứu mơ phỏng động lực học phân tử (MD) dự đốn dược động học vàđộc tính (ADMET) của các chất có khả năng ức chế MRP4 tiềm năng.

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

<b>CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU</b>

<i><b>1.1. Bơm đa kháng thuốc MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4</b></i>

<b>1.1.1. Họ bơm ngược ABC (ATP-Binding Cassette)</b>

Họ bơm ABC được xem là một trong những họ protein xuyên màng lớn nhất baogồm 49 protein vận chuyển được chia thành 7 phân họ khác nhau, ký hiệu từ A đếnG, dựa trên sự tương đồng về trình tự. Họ bơm này được tìm thấy ở tất cả các sinhvật và ở tế bào người.¹ Ở vi sinh vật, các bơm thuộc họ này có khả năng đẩy cáckháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn, góp phần gia tăng tình trạng đề kháng kháng sinh.Ở người, họ bơm ABC thường có mặt ở các tế bào ung thư, sử dụng năng lượng ATPđào thải một loạt các thuốc điều trị ung thư ngược với gradient nồng độ ra mơi trường

<i>ngồi. Một số bơm ngược như P-glycoprotein (ABCB1/P-gp), protein đa khángthuốc 1 (ABCC1/MRP1) và protein kháng ung thư vú (ABCG2/BCRP) đều cho thấy</i>

các bơm vận chuyển thuộc họ ABC đóng vai trị quan trọng trong việc đề kháng thuốcở bệnh nhân ung thư.<small>14</small>

Phân họ ABCC gồm 12 protein vận chuyển, trong đó có 9 protein là các bơmngược đa kháng thuốc. Các nghiên cứu về đặc điểm, vị trí phân bố và khả năng saochép cho thấy, 9 protein này là các bơm ngược phụ thuộc ATP vận chuyển các cơchất nội sinh và ngoại sinh đa dạng về cấu trúc ra khỏi tế bào. Cấu trúc của họ bơmABCC thường chứa bốn thành phần thiết yếu, gồm hai vùng liên kết nucleotid(Nucleotide binding domain – NBD) và hai vùng xuyên màng (Transmembranedomain – TMD). Phân họ ABCC được chia thành hai nhóm, nhóm protein đa khángthuốc ngắn gồm các bơm MRP4, MRP5, MRP11, MRP3 và nhóm protein đa khángthuốc dài, có thêm vùng xuyên màng bổ sung gồm MRP1, MRP2, MRP3, MRP6.<small>1</small>

<b>1.1.2. Cấu trúc và vị trí phân bố của bơm ngược MRP4</b>

<i>Bơm ngược MRP4 được mã hoá bởi gen ABCC4 nằm trên nhiễm sắc thể 13q32.1.</i>

Bơm gồm 1325 acid amin, là bơm ngược ngắn nhất trong phân họ ABCC. MRP4được mô tả lần đầu vào năm 1999 trên tế bào lympho T ở người cho thấy khả nănglàm giảm hiệu quả trị liệu của thuốc kháng virus có cấu trúc tương tự nucleosid.<small>15</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

MRP4 là bơm ngược duy nhất của phân họ bơm ABCC có vị trí nằm ở màng képcủa tế bào phân cực. Bơm ngược này phân bố ở màng đáy của các tế bào biểu môtuyến tiền liệt, tế bào gan và đám rối màng mạch. Ở tế bào ống lượn gần và nội mômao mạch não, MRP4 khu trú ở màng đỉnh. Ngồi ra, MRP4 cịn được tìm thấy trongtế bào tinh hoàn, buồng trứng, tuyến thượng thận và tế bào máu.¹⁵

MRP4 có cấu trúc điển hình của các bơm ngược thuộc phân họ ABCC, gồm haivùng xuyên màng (TMD1 và TMD2), mỗi vùng gồm sáu chuỗi protein xuyên màng(TMH1-12) và hai vùng liên kết nucleotid (NBD1 và NBD2) có chức năng thuỷ phânATP để cung cấp năng lượng cho quá trình vận chuyển cơ chất.<small>16</small> Chuỗi protein xuyênmàng TMH4, TMH5 của TMD1 và TMH10, TMH11 của TMD2 được hoán đổi vị trívới nhau.<small>17</small>

So với các protein MRP5, MRP8, MRP9 cùng nhóm, đầu N của bơm MRP4 ngắnhơn 87 – 255 acid amin và chứa trình tự acid amin đặc trưng. Đầu C của MRP4 lạidài hơn 40 acid amin và chứa trình tự acid amin được bảo tồn.<small>15</small> Trong nghiên cứugần đây, trình tự acid amin bảo tồn ở đầu C được xác định là đóng vai trị quan trọngảnh hưởng đến chức năng truyền tín hiệu protein kinase A của MRP4 trong bệnh bạchcầu cấp dòng tuỷ.<small>18</small> Ngoài ra, chuỗi TMH6 của bơm MRP4 chứa hai acid aminphenylalanin ở vị trí 368, 369 đặc trưng và khơng có ở protein đa kháng thuốc khác.<small>15</small>Chuỗi TMH7 là một chuỗi xoắn dài hơn so với các chuỗi xoắn cịn lại nên có mộtphần cấu trúc mở rộng đến vùng ngoại bào.<small>19</small> Cấu trúc của bơm ngược MRP4 đượcmô tả ở Hình 1.1.

Ngày 24/05/2023, một số cấu trúc của bơm ngược MRP4 được chụp bằng kínhhiển vi nghiệm lạnh đã được công bố.<small>19-21</small> Cấu trúc bơm ngược MRP4 (mã ProteinData Bank – PDB 8I4A) được chụp cùng với phối tử đồng kết tinh là dipyridamol,một chất ức chế bơm ngược có IC50 là 2,1 µM và hằng số phân ly Kd là 23 µM.<small>20</small>Trong báo cáo này, phần lớn cấu trúc và khoang gắn kết của bơm MRP4 đã được xácđịnh, ngoại trừ vùng acid amin linh động gồm 8 acid amin đầu N, 27 acid amin đầuC, 63 acid amin của dây nối hai nửa cấu trúc của protein và 9 acid amin thuộc chuỗiTMH7 ở vùng ngoại bào.<small>20</small> Khoang gắn kết của bơm được tạo thành bởi các acid

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

amin kỵ nước Phe 211 của chuỗi TMH3, Phe 324 của chuỗi TMH5, Leu 367, Phe368, Arg 375 chuỗi TMH6 và Tryp 995, Arg 998 của chuỗi TMH12. Trong đó Arg375, Arg 998 là hai acid amin thân nước có khả năng cho hai cặp liên kết hydro.<small>20</small>

<b>Hình 1.1. Cấu trúc bơm ngược MRP4</b><small>19</small>

<i>ABCC4 là một gen có tính đa hình cao. Năm 2008, trong nghiên cứu của NadaAbla và cộng sự cho thấy một số kiểu đa hình của gen ABCC4 ảnh hưởng đến quá</i>

trình vận chuyển cơ chất, đặc biệt là các thuốc điều trị ung thư và kháng virus bằngcách tác động đến vị trí và biểu hiện của MRP4, từ đó ảnh hưởng đến dược động họccủa các loại thuốc này.<small>22</small>

Để tìm hiểu về cách thức vận chuyển cơ chất ra khỏi tế bào, bằng phương phápđột biến điểm định hướng (Site-Directed Mutagenesis), El-Sheikh và cộng sự đã xácđịnh Phe 368, Phe 369, Glu 374, Arg 375, Glu 378 ở chuỗi TMH6 và Arg 998 ở chuỗiTMH12 ảnh hưởng đến chức năng vận chuyển cơ chất của bơm MRP4. Ngoài ra,thay thế Arg 375 bằng serin không làm ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển cơ chất

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

cGMP nhưng lại làm giảm đáng kể ái lực của bơm với cơ chất methotrexat, từ đó chothấy Arg 375 tham gia vào quá trình vận chuyển của methotrexat.⁸

Năm 2012, khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của Phe 368 ở chuỗi TMH6,Trp 995 và Arg 998 của chuỗi TMH12 lên khả năng vận chuyển cơ chất của bơm,Wittgen và các cộng sự thấy rằng, thay thế Phe 368 ở chuỗi TMH6 bằng tryptophanđã làm tăng khả năng đào thải estradiol-17β-ᴅ-glucuronid (EG) nhưng làm mất chứcnăng vận chuyển methotrexat. Phe 368 và Trp 995 khơng liên quan đến q trình hìnhthành liên kết ban đầu với cơ chất, tuy nhiên, hai acid amin này có thể tạo tương tácvới cơ chất trong quá trình sắp xếp lại các chuỗi xoắn để chuyển vị và đồng thời đẩycơ chất ra ngoài tế bào.<small>9</small>

<b>1.1.3. Cơ chế vận chuyển của bơm ngược MRP4</b>

Giống như các bơm ngược khác thuộc họ ABC, quá trình vận chuyển các cơ chấtcủa bơm MPR4 dựa trên sự kết hợp của quá trình thuỷ phân ATP tại NBD và chuyểnvị của 2 TMD. Bên cạnh đó, một số các nghiên cứu cho rằng, MRP4 có nhiều hơnmột vị trí liên kết cơ chất, điều này làm đa dạng hoá các phản ứng kết hợp giữa cơchất và chất ức chế.¹⁰ Cho đến thời điểm hiện tại, có ba mơ hình giải thích cho qtrình vận chuyển cơ chất của bơm bao gồm mơ hình cơng tắc,<small>11</small> mơ hình tiếp xúc liêntục<small>11</small> và mơ hình trao đổi.<small>12</small>

Mơ hình cơng tắc (Switch model) được Higgin và Linton đề cập vào năm 2004,là mơ hình đầu tiên được đề xuất nhằm giải thích cách thức vận chuyển cơ chất củacác bơm thuộc họ ABC. Mơ hình cơng tắc được trình bày ở Hình 1.2, giả định rằnghai NBD có thể chuyển đổi giữa trạng thái monomer và dimer. Ở điều kiện bìnhthường như giai đoạn 1, TMD1 và TMD2 tồn tại ở dạng hướng vào trong nội bào,NBD tồn tại ở trạng thái monomer. Giai đoạn 2, bắt đầu có sự xuất hiện của cơ chấtvà hình thành liên kết giữa hai phân tử ATP với NBD. Giai đoạn 3, NBD sẽ chuyểntừ trạng thái monomer thành dimer đồng thời hướng hai TMD ra mơi trường ngồi,đẩy cơ chất ra khỏi tế bào. Ở các giai đoạn cịn lại, sau q trình thuỷ phân ATP,NBD ở dạng dimer sẽ được phân tách thành các monomer và chuyển các TMD trởvề trạng thái ở điều kiện bình thường.<small>11</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

<b>Hình 1.2. Mơ hình cơng tắc của các bơm ngược thuộc họ ABC</b><small>12</small>

Khơng giống như mơ hình cơng tắc, mơ hình tiếp xúc liên tục (Constant contactmodel) ở Hình 1.3 cho rằng quá trình thuỷ phân ATP xảy ra tuần tự ở hai vị trí liênkết với NBD. Khi một phân tử ATP mới liên kết với NBD, NBD này sẽ đóng lạichuẩn bị cho q trình thuỷ phân trong khi NBD cịn lại sẽ mở ra để giải phóng ADPvà Pi. Quá trình này được lặp lại và là kết quả của sự thuỷ phân mỗi phân tử ATP, tạora sự đóng mở của TMD, vận chuyển cơ chất ra mơi trường ngồi.¹¹

<b>Hình 1.3. Mơ hình tiếp xúc liên tục của các bơm ABC</b><small>11</small>

Mơ hình trao đổi (Reciprocating model) là mơ hình ở dạng phức tạp hơn nhưngphù hợp với các dữ liệu thực nghiệm. Mơ hình này giả định sự phân ly của các ATPtại NBD xảy ra luân phiên, mỗi cơ chất sẽ gắn vào vị trí có ái lực cao tương ứng vàđược vận chuyển ra mơi trường ngồi. Quy trình được mơ tả ở Hình 1.4.

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

<b>Hình 1.4. Mơ hình trao đổi của bơm ABC</b>¹²

• Giai đoạn 1, kênh 2 mở vị trí gắn kết có ái lực cao với cơ chất trong nội bào.• Giai đoạn 2, cơ chất gắn vào vị trí gắn kết ở kênh 2, cơ chất ở kênh 1 giải phóng

ra ngoại bào.

• Giai đoạn 3, ADP được giải phóng khỏi kênh 2, tạo thành cấu trúc có ái lực thấp(T), ngăn cơ chất khác bên trong nội bào gắn vào vị trí này, cơ chất ở kênh 2được vận chuyển về phía màng ngồi tế bào.

• Giai đoạn 4, kênh 1 xảy ra quá trình thuỷ phân ATP tạo ADP, Pi và chuẩn bị vịtrí gắn kết có ái lực cao (C).

• Giai đoạn 5, ATP gắn vào kênh 2, mở vị trí gắn kết ở kênh 1 và giải phóng cơchất ở kênh 2 ra ngoại bào.

• Giai đoạn 6 đến 8 lặp lại quy trình từ giai đoạn 1 đến 3.<small>12</small>

<b>1.2.Cơ chất và tác động của bơm ngược MRP4 trên lâm sàng</b>

<i><b>1.2.1. Phương pháp xác định cơ chất và chất ức chế bơm ngược in vitro</b></i>

Hiện nay, có nhiều phương pháp được dùng để đánh giá các chất là cơ chất haychất ức chế bơm như phương pháp vận chuyển qua màng túi (vesicular transportassay), phương pháp hoạt hoá ATPase (ATPase activity), phương pháp gây độc tếbào (cytotoxicity activity), phương pháp hấp thu (uptake assay).<small>23</small> Ưu nhược điểmcủa các phương pháp được tóm tắt trong Bảng 1.1.²³

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

<b>Bảng 1.1. So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp xác định cơ chất và chất ức</b>

<i>chế bơm ngược in vitro</i>²³

Hoạt hố ATPase(ATPase activity)

Chất ứcchế

Khơng cần phươngpháp phát hiện hợpchất đặc hiệu

- Khả năng dự đoán cơ chấthoặc chất ức chế yếu

- Kết quả phụ thuộc nhiều vàođiều kiện thử nghiệm- Khó khăn cho các bơm

ngược do hoạt hoá ATPaseở môi trường nền caoVận chuyển qua

màng túi(Vesiculartransport)

Cơ chất vàchất ứcchế

- Xác định cơ chất- Có thơng số động

học k<small>m</small>, k<small>i</small>, IC<small>50</small>- Có hiệu năng cao

- Kết quả âm tính giả với cáccơ chất có tính thấm thụđộng cao hoặc liên kếtkhông đặc hiệu với bơmĐộc tế bào

Cơ chất vàchất ứcchế

- Không cần phươngpháp phát hiện hợpchất đặc hiệu

- Chỉ có các chất gây độc tếbào mới được xem là cơ chất- Khả năng gây độc tính khác

nhau giữa các tế bàoPhương pháp hấp

(Uptake transport)

Cơ chất vàchất ứcchế

- Xác định cơ chất- Có thơng số động

học k<small>m</small> và k<small>i</small>- Có hiệu năng cao

- Các chất có tính thấm thấpcó xu hướng bị bỏ qua- Kết quả âm tính giả với các

cơ chất có tính thấm thụđộng cao

Bên cạnh đó, cũng có một số dịng tế bào thường dùng trong các thử nghiệm hoạt

<i>tính in vitro thường là dịng tế bào phơi thận người 293 (HEK293), dịng tế bào côntrùng Spodoptera frugiperda (Sf9) hoặc tế bào chuột hamster V79 Trung Quốc được</i>

tăng biểu hiện bơm MRP4.<small>2</small>

<i>Ngoài ra đột biến một số acid amin của bơm MRP4 khi thử nghiệm hoạt tính invitro có thể tìm thấy acid amin quan trọng trong quá trình gắn kết cơ chất với bơm</i>

hoặc trong các giai đoạn khác của quá trình vận chuyển cơ chất ra mơi trường ngồi.^8,9

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

<b>1.2.2. Cơ chất của bơm ngược MRP4</b>

Trong các bơm ngược thuộc phân họ ABCC, MRP4 nổi bật với khả năng vậnchuyển một loạt các cơ chất nội sinh đóng vai trị quan trọng trong q trình truyềntín hiệu tế bào, bao gồm các chất truyền tin cAMP, cGMP, ADP, eicosanoid, urat vàcác hormon steroid. Ngồi ra, nó cịn có khả năng vận chuyển các cơ chất sinh lýkhác như folat, acid mật, glutathion và các chất đồng vận chuyển với acid mật. MRP4cũng tham gia vào quá trình hấp thu, phân bố và bài tiết nhiều loại thuốc như thuốckháng virus, kháng sinh nhóm cephalosporin, thuốc điều trị các bệnh tim mạch và cáctác nhân độc tế bào dùng trong điều trị ung thư.<small>2</small> Một số hợp chất polyphenol trongtự nhiên cũng là cơ chất của bơm như resveratrol và quercetin.²⁴ Các cơ chất của bơmMRP4 được thể hiện trong Bảng 1.2.<small>2</small>

<b>Bảng 1.2. Các cơ chất nội và ngoại sinh của bơm ngược MRP4</b><small>2</small>

<b>Cyclic và ADP nucleotid:</b>

Cyclic adenosine monophosphat (cAMP),Cyclic guanosine monophosphat (cGMP),ADP

<b>Các chất tương tự purin: UratCác eicosanoid:</b>

Leukotrien B<small>4</small>, leukotrien C<small>4</small>, prostaglandin E<small>1</small>,prostaglandin E<small>2</small> (PGE<small>2</small>), prostaglandin F<small>2α</small>,TXB<small>2</small>, thromboxan A<small>2</small> (TXA<small>2</small>)

<b>Folat và muối mật:</b>

Acid folic, chenodeoxycholylglycin,taurocholat, chenodeoxycholultaurin,cholylglycin, ursodeoxycholylglycin, cholat,cholyltaurin, deoxycholylglycin,ursodeoxycholyltaurin.

<b>Hormon steroid:</b>

EG, dehydroepiandrosteron sulphat (DHEAS)

<b>Thuốc chống ung thư:</b>

Topotecan, 6-thioguanin nucleotid,

methotrexat, 6-mercaptopurin,troxacitabin, cytarabin, dasatinib,leucovorin

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

<b>1.2.3. Tác động của bơm ngược MRP4 trên lâm sàng</b>

Sự hiện diện của bơm ngược MRP4 trong tế bào ung thư là một trong những yếutố then chốt quyết định hiệu quả trị liệu của các thuốc này.

Một nghiên cứu vào năm 2007 được thực hiện trên các dòng tế bào bệnh bạchcầu nguyên bào lympho T ở người đã chứng minh biểu hiện quá mức của bơm ngượcMRP4 làm giảm nồng độ 6 – mercaptopurin (6 – MP) và các chất chuyển hoá trongnội bào. Các kết quả cho thấy điều hoà cảm ứng bơm ngược MRP4 và các proteinvận chuyển vào nội bào đóng vai trị quan trọng đề kháng thuốc 6 – MP.<small>5</small> Năm 2017,Ho và cộng sự đã nhận thấy sự biểu hiện quá mức của bơm ngược MRP4 trong cáctế bào ung thư tuyến tiền liệt C4 – 2/D kháng docetaxel ở bệnh nhân ung thư tiền liệttuyến kháng hormon testosterol.<small>3</small>

Ngoài ra một số dữ liệu lâm sàng còn cho thấy biểu hiện quá mức của bơm MRP4và MRP1 có liên quan đến các tiên lượng xấu trong chẩn đoán u nguyên bào thầnkinh.<small>4</small> MRP4 cũng điều chỉnh nồng độ cAMP trong các tế bào bệnh bạch cầu cấp tínhdịng tuỷ ở người, ức chế MRP4 gây gia tăng cAMP nội bào, làm kết thúc q trìnhtăng sinh và thúc đẩy biệt hố các tế bào trên.<small>25</small>

Bơm MRP4 xuất hiện trong màng tiểu cầu dưới dạng các hạt dày đặc và biểu hiệncao ở bệnh nhân phẫu thuật bắc cầu động mạch vành, gây ra tình trạng đề khángaspirin và làm tăng nguy cơ biến chứng tim mạch.²⁶ Ngoài ra một số giả thuyết chothấy TXA2 – một chất chủ vận gây kết tập tiểu cầu có thể được vận chuyển tích cựcbởi bơm MRP4. Vì vậy, ức chế bơm ngược MRP4 vận chuyển các chất gây kết tậptiểu cầu có thể trở thành mục tiêu đầy hứa hẹn trong điều trị các bệnh về tim mạch.<small>20</small>Bên cạnh đó MRP4 còn liên quan đến một số trường hợp tương tác thuốc trênlâm sàng. Kết quả nghiên cứu của Clemete vào năm 2009 cho thấy khi ức chế MRP4bằng các NSAID như ibuprofen và indomethacin trên các tế bào lympho T nhiễmHIV – 1 dẫn đến sự gia tăng đáng kể nồng độ các thuốc ức chế men sao chép ngượcnucleotid như zidovudin, abacavir, lamivudin và tenofovir.²⁷ Tuy nhiên đối với bệnhnhân nhiễm HIV-1 điều trị bằng tenofovir trong thời gian dài, sử dụng NSAID khôngchỉ làm thay đổi độ lọc cầu thận mà còn ảnh hưởng đến quá trình bài tiết tenofovir

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

qua các bơm MRP4 phân bố ở ống lượn gần, làm tăng độc tính trên thận và gây viêmkẽ thận cấp.⁶

Trong một nghiên cứu về tác động của các NSAID đối với quá trình đào thảimethotrexat bởi các bơm ngược MRP2 và MRP4 bằng thử nghiệm vận chuyển quamàng túi cho thấy methotrexat được vận chuyển qua bơm với giá trị Km lần lượt là480 ± 90 µM và 220 ± 70 µM. Hoạt tính ức chế của NSAID trên bơm MRP4 vậnchuyển methotrexat cao hơn bơm MRP2. Kết quả này cho thấy ức chế bơm ngượcMRP2 và MRP4 vận chuyển methotrexat ở thận có thể làm giảm tình trạng đề khángmethotrexat trong tương lai.<small>7</small>

<b>1.3. Khám phá thuốc dưới sự hỗ trợ của máy tính</b>

Q trình khám phá và phát triển thuốc bao gồm một loạt các bước bao gồm lựachọn bệnh lý và xác định mục tiêu của thuốc, tìm kiếm và tối ưu hố chất khởi nguồn,tiến hành các thử nghiệm tiền lâm sàng và độc tính của thuốc. Các cơng cụ khám pháthuốc dưới sự hỗ trợ của máy tính (Computer aided drug design – CADD) có thểđược sử dụng với mục đích tự động hố, tiết kiệm thời gian đồng thời làm giảm chiphí và rủi ro trong quá trình nghiên cứu. Ngày nay, CADD đã trở thành một cơng cụthiết yếu trong q trình phát triển thuốc, nó cung cấp một lượng đáng kể các nguồnthơng tin dữ liệu như cấu trúc sinh học của mục tiêu tác động, cơ sở dữ liệu của cácphối tử, các thông số mô tả phân tử liên quan và các cơng cụ tính tốn có thể được sửdụng trong các giai đoạn khác nhau của quá trình phát triển thuốc. Nhìn chung,CADD có thể được chia làm hai phương pháp: khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mụctiêu và dựa vào phối tử.<small>28</small>

<b>1.3.1. Khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu</b>

Khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu phụ thuộc vào các tài liệu nghiên cứutrước đó về cấu trúc protein mục tiêu đã được xác định bằng các phương pháp thựcnghiệm như chụp bằng khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), chụp tinh thể nhiễuxạ tia X, chụp kính hiển vi nghiệm lạnh (CryO – EM) hoặc được xây dựng bằng kỹthuật protein tương đồng (homology) trên máy tính. Phương pháp này dự đốn khá

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

chính xác về vị trí gắn kết tiềm năng giữa phối tử và đích tác động (phương phápdocking) đồng thời có thể ước tính ái lực gắn kết giữa 2 yếu tố này (scoring).

Docking là phương pháp dùng để dự đoán khả năng gắn kết hoặc tương tác giữa2 cấu tử bằng máy tính, trong đó cấu tử lớn là thụ thể còn cấu tử nhỏ là các phối tửđược xem như một chất tương tác với thụ thể. Thông thường, ái lực gắn kết mạnh làyếu tố tiên quyết giúp cho phối tử có hoạt tính trên cấu trúc mục tiêu, các lực tương

<i>tác này có thể là các liên kết ion, liên kết hydro và liên kết van der Waals… Vì vậy,</i>

phương pháp này có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm ra các nhóm cấu trúc ảnhhưởng đến hoạt tính, từ đó định hướng tổng hợp các chất có hoạt tính tốt trên mụctiêu tác động. Thêm vào đó, docking cịn được ứng dụng trong việc sàng lọc ảo, nhằmtìm kiếm các chất có khả năng liên kết với điểm tác động của các mục tiêu nghiêncứu từ một số ngân hàng dữ liệu lớn sẵn có như DrugBank, ZINC… Một số phầnmềm dùng trong thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc được liệt kê trong Bảng 1.3.²⁸

<b>Bảng 1.3. Một số phần mềm hỗ trợ thường dùng trong docking</b><small>28</small>

Xây dựng mơ hìnhhomology

Insight, Prime, LOOK, Sybyl, MODELLER, MOE,Swiss – Model, I – Tasser…

Dự đốn vị trí gắn kết tối ưu FINDSITE, Pocket – Finder, Site – hound,3DligandSite, CASTp, POOL, Meta Pocket…

Docking _{AutoDock Vina, Dock Blaster, Schrondinger,}

GOLD, Libdock, FlexX, Glide, Fred, ICM, PyRx…Động lực học phân tử _{GROMACS, Amber, CHARM, ADF, Desmond,}

<b>1.3.2. Khám phá thuốc dựa trên phối tử</b>

Khám phá thuốc dựa trên phối tử cần phải có một tập hợp đã biết các phối tử cócấu trúc đa dạng và hoạt tính sinh học trên mục tiêu tác động. Tiếp đó các mơ hìnhcó khả năng dự đốn hoạt tính được xây dựng dựa trên tập dữ liệu khai thác từ các

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

tập phối tử này. Các mô hình này có thể là mơ hình pharmacophore hoặc mơ hình2D-QSAR và 3D-QSAR. Sau khi đánh giá mơ hình bằng các phương pháp khác nhau,một phối tử mới có thể được áp dụng lên mơ hình để dự đốn hoạt tính của nó trên

<i>mục tiêu tác động. Một số điểm khác biệt giữa hai phương pháp khám phá thuốc insilico dựa trên cấu trúc mục tiêu và phối tử được trình bày trong Bảng 1.4.</i>²⁸

<b>Bảng 1.4. Một số điểm khác biệt giữa khám phá thuốc dựa trên cấu trúc mục tiêu và</b>

khám phá thuốc dựa trên phối tử²⁸

<b>Yếu tố^{Khám phá thuốc dựa trên cấu}trúc mục tiêu</b>

<b>Khám phá thuốc dựa trên phốitử</b>

Xác định được cấu trúc mục tiêu đểcó thể tính tốn năng lượng tươngtác

Có cấu trúc và hoạt tính phối tửvà hoạt tính sinh học để xây dựngmơ hình dự đốn hoạt tính

Ưu tiên khi có sẵn cấu trúc mục tiêutác động có độ phân giải cao

Thích hợp đối với trường hợpkhông có hoăc có ít thơng tin vềcấu trúc – mục tiêu tác động

Thiết kế hoặc tìm kiếm được cácchất có ái lực tốt với mục tiêu tácđộng

Sàng lọc trên các tập dữ liệu phốitử có sẵn

Docking, động lực học phân tử, thiết

<i>kế de novo, mơ hình pharmacophore</i>

Mơ hình QSAR, sàng lọc hiệunăng cao (HTS) và mô hìnhpharmacophore

Mơ hình QSAR là một mơ hình tốn học rút ra từ mối tương quan giữa các thôngsố mô tả phân tử và hoạt tính sinh học của một nhóm chất được xác định bằng cácphương pháp thực nghiệm. Mô hình QSAR lần đầu tiên được đề xuất bởi Hansch vàFujita vào năm 1964 cùng với công bố mối tương quan giữa hoạt tính sinh học và cấutrúc tác dụng. Mơ hình 1D và 2D – QSAR được gọi là phương pháp QSAR cổ điển,trong đó 1D – QSAR thể hiện mối tương quan giữa hoạt tính sinh học và các đặc tínhphân tử như pKa và logP. Mơ hình 2D – QSAR cho thấy mối tương quan giữa hoạt

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

tính sinh học bộ thơng số mơ tả phân tử dựa trên cấu trúc 2D. 3D – QSAR tính tốnsự biểu diễn trong khơng gian ba chiều của các phân tử, chẳng hạn như các cấu dạngvà đồng phân hoá học của các cấu trúc. Mục tiêu chính của mơ hình 3D – QSAR làcho thấy mối tương quan giữa tác dụng và tính chất trong khơng gian của phân tử, vìvậy chất lượng cơ sở dữ liệu và sự đa dạng về cấu trúc là những yếu tố quan trọng đểcó thể xây dựng mơ hình 3D – QSAR có khả năng dự đốn tốt.<small>29</small>

Mơ hình pharmacophore dựa trên phối tử được xây dựng dựa vào các cấu dạngtrong khơng gian của các hợp chất có hoạt tính. Các cấu dạng này sẽ được gióng hàngvà tìm ra các yếu tố để tạo thành mơ hình pharmacophore. Sáu yếu tố thường gặp củamơ hình pharmacophore là nhóm nhận liên kết hydro, nhóm cho liên kết hydro, vịngthơm, nhóm kỵ nước, ion âm và ion dương. Kỹ thuật gióng hàng được chia thành haiphương pháp là phương pháp gióng hàng dựa trên điểm và phương pháp gióng hàngdựa trên đặc tính. Trong phương pháp gióng hàng dựa trên điểm, các nguyên tử, mảnhhoặc khoảng cách điểm đặc trưng được giảm thiểu và xếp chồng lên nhau bằng cáchgiảm thiểu khoảng cách. Một số ví dụ về các phần mềm ứng dụng phương pháp giónghàng dựa trên điểm bao gồm HipHop, Phase và Galahad. Ngược lại, các phương phápgióng hàng dựa trên đặc tính (ví dụ: MOE) tạo ra sự sắp xếp dựa trên các bộ mô tảtrường phân tử, chẳng hạn như mật độ electron, thế tĩnh điện, hình dạng và thể tíchphân tử…²⁹

<b>1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước các chất ức chế bơm MRP41.4.1. Các chất ức chế bơm ngược MRP4</b>

MRP4 được chứng minh là có khả năng vận chuyển nhiều nhóm cơ chất khácnhau, và bơm có nhiều hơn một vị trí gắn kết với cơ chất,<small>10</small> chính vì vậy việc thiết kếmột chất ức chế bơm ngược chọn lọc có hoạt tính tốt trên MRP4 được xem là mộtchất ức chế lý tưởng. Tuy nhiên cho đến thời điểm hiện tại, vẫn chưa có bất kỳ mộtchất nào có thể đạt được mục tiêu lý tưởng này được thử nghiệm trên lâm sàng.

MK571 là một chất ức chế bơm ngược không chọn lọc, ngoài tác động ức chếtrên bơm MRP4, MK571 cịn có thể ức chế một loạt các bơm ngược khác từ MRP1đến MRP5 và enzym phosphodiesterase. Một số các thuốc có mặt trên thị trường như

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

indomethacin, dipiridamol, sildenafil, benzbromaron, montelukast và pranlukastcũng được xem là những thuốc có khả năng ức chế bơm MRP4, nhưng có hoạt tínhthấp và không chọn lọc.<small>7,30-33</small>

Năm 2014, bằng thử nghiệm sàng lọc hiệu năng cao (High-throughput screening– HTS) trên một thư viện nội bộ các hợp chất thiên nhiên đa dạng, Cheung và cộngsự đã xác định được ceefourin 1 và ceefourin 2 có khả năng ức chế vận chuyển một

<i>loạt cơ chất của bơm MRP4 in vitro, hai chất này có hoạt tính chọn lọc trên bơm</i>

MRP4 hơn so với các bơm ngược khác thuộc họ ABC. Ngồi ra, ceefourin 1 và 2 cịncó hoạt tính ức chế mạnh MRP4 mạnh, độc tính thấp trên tế bào và ổn định trong mơitrường có nồng độ acid và microsom cao.<small>34</small> Cùng với phương pháp HTS, sàng lọc ảolà một trong những phương pháp hiệu quả áp dụng trên cơ sở dữ liệu lớn để tìm kiếmcác chất ức chế MRP4, từ đó thu thập thơng tin về mối tương quan về cấu trúc – tácdụng ức chế.

<b>Hình 1.5. Một số chất ức chế bơm ngược MRP4</b>

<i>Ngồi ra khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính in vitro, tuỳ thuộc vào cơ chất, một</i>

chất có thể ức chế sự vận chuyển của cơ chất này nhưng chưa chắc đã ức chế được

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

sự vận chuyển của cơ chất khác. Giá trị IC50 của các chất ức chế trên cơ chất khácnhau được trình bày trong Bảng 1.5.

<b>Bảng 1.5. So sánh IC</b><small>50 trên các cơ chất và các tế bào khác nhau</small>

<b><small>Hợp chấtPhương</small></b>

<b><small>Tài liệutham khảo</small></b>

<small>MK-571</small> ^{Vận chuyển}<small>qua màng túi</small>

<small>EG 30 µM, 60nCi HEK293 2,1</small>

<small>Csandl, 2016</small>³⁰<small>PGE2 5µM HEK293 7,0</small>

<small>PMEA 1 µM HEK293 10 Reid, 2003</small>³³<small>DHEAS 2 µM HEK293 2,04 Hardwick, 2016</small>³⁵<small>EG 30-60 Ci/mmol Sf9 6 Morgan, 201336</small>

<small>Dipiridamol</small> ^{Vận chuyển}<small>qua màng túi</small>

<small>PMEA 1µM HEK293 2 Reid, 2003</small>³³<small>cGMP 2µM Sf9 12 Jedlitschky, 200432</small>

<small>Indomethacin</small> ^{Vận chuyển}<small>qua màng túi</small>

<small>Methotrexat 0,5µM HEK293 6,1 Reid, 2003</small>³³<small>cGMP 2µM Sf9 22 Jedlitschky, 2004</small>³²<small>Benzbromaron</small> ^{Vận chuyển}

<small>qua màng túi</small>

<small>PMEA 1µM HEK293 150 Reid, 2003</small>³³<small>Urat 100µM HEK293 15,6 El-sheikh, 2008</small>³¹

<i><b>1.4.2. Các nghiên cứu in silico tìm kiếm các chất ức chế bơm ngược MRP4</b></i>

Những năm gần đây, các công cụ khám phá thuốc dưới sự hỗ trợ của máy tính đãđược áp dụng nhằm tìm kiếm các chất ức chế bơm MRP4. Tuy nhiên ở Việt Nam,vẫn chưa có nghiên cứu nào được thực hiện trên bơm MRP4. Trên thế giới đã có một

<i>số nghiên cứu in silico được thực hiện trên cấu trúc và các chất ức chế MRP4, trong</i>

đó chủ yếu là các mơ hình 3D-pharmacophore và docking.

Bằng phương pháp sàng lọc ảo dựa trên phối tử, năm 2013, Fukuda và cộng sựđã tiến hành xây dựng mơ hình 3D-pharmacophore trên 10 chất ức chế MRP4 có giátrị hoạt tính sinh học là IC50 bằng phần mềm Discovery Studio và thuật tốnCAESAR, mơ hình này tiếp tục được áp dụng để sàng lọc qua tập cơ sở dữ liệu SCUTđể tìm ra các chất tiềm năng nhất.<small>37</small> Năm 2015, bằng phần mềm LigandScout và thuậttoán mạng Bayesian, Matthew và cộng sự đã xây dựng được 4 mơ hình 3D-pharmacophore dựa trên tập dữ liệu gồm 86 chất có khả năng ức chế trên 21% cơ chất

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

DHEAS của bơm MRP4. Kết quả mơ hình được ứng dụng để sàng lọc 1510 thuốcđược FDA chấp thuận trên thư viện DrugBank.<small>38</small>

<i>So với phương pháp sàng lọc dựa trên phối tử, các mô hình in silico dựa trên cấu</i>

trúc MRP4 nhận được nhiều sự quan tâm hơn. Tuy nhiên do sự hạn chế về cấu trúctinh thể nhiễu xạ tia X của bơm, các cấu trúc MRP4 chủ yếu được xây dựng bằng cácmơ hình homology dựa trên khuôn mẫu là cấu trúc tinh thể bơm ngược Sav1866

<i>hướng ngoại bào của vi khuẩn Staphylococcus aureus,</i><small>39</small> cấu trúc bơm

<i>P – glycoprotein từ Caenorhabditis elegans và vùng NDB1 của MRP1 từ người,</i><small>40,41</small>và mơ hình tương đồng xây dựng bằng server I – TASSER với trình tự acid aminMRP4 tải từ trang Uniprot.^42,43 Khoang gắn kết được xác định dựa vào vị trí các acidamin quan trọng ảnh hưởng đến chức năng vận chuyển của bơm<small>42</small> hoặc bằng phươngpháp docking mù.<small>41</small> Năm 2018, Chen và cộng sự đã áp dụng phương pháp dockingphân tử trên mơ hình homology của MRP4 nhằm tìm kiếm các chất ức chế bơm trên

<i>cơ chất 6-MP từ thư viện SPECS và thực hiện các thử nghiệm in vitro để xác định</i>

hoạt tính của các chất tiềm năng.<small>40</small> Năm 2021, nghiên cứu về tương tác của các cơchất nội sinh, ngoại sinh và các chất ức chế trên dòng tế bào MRP4 hoang dại và cácbiến thể bằng phương pháp docking và động lực học phân tử được thực hiện bởiBeccera và cộng sự. Mục đích của nghiên cứu này nhằm xác định sự khác biệt trong

<i>tương tác giữa các phân tử và ái lực của đa hình đơn nucleotid có trong gen ABCC4,</i>

các đa hình đơn nucleotic khơng đồng nghĩa này có thể thúc đẩy sự thay đổi trongcấu trúc và chức năng của MRP4.⁴² Tóm tắt các mơ hình docking chất ức chế bơmngược MRP4 của nghiên cứu trước và nghiên cứu này được trình bày trong Bảng 1.6.Năm 2023, cấu trúc bơm ngược MRP4 có độ phân giải cao đã được xác định.<small>19,20</small>Cấu trúc MRP4 được chụp ở những trạng thái khác nhau như trạng thái đơn lẻ(apo-protein), trạng thái hướng vào trong và mở ra ngồi khi có sự liên kết với ATP.Ngoài ra, cấu trúc phức hợp MRP4 – cơ chất và MRP4 – chất ức chế cũng được cơngbố góp phần làm sáng tỏ cơ chế ức chế bơm ngược là do sự cạnh tranh của chất ứcchế và cơ chất tại khoang gắn kết.<small>19</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

<b>Bảng 1.6. Tóm tắt các mơ hình docking chất ức chế bơm ngược MRP4 cơng bố</b>

trong nghiên cứu trước đó

<b><small>Nghiên cứu</small>^{Các acid amin tại vị}</b>

<b><small>Các acid amin quantrọng</small></b>

<small>Ravna vàcộng sự,200839</small>

<small>Khoang vận chuyển cơchất: 99-110, 140-148,152-156, 321-329, 332,352 -356, 358-360, 362-366, 716, 719-723,726-727, 730, 780 -788,842-849, 948 -960, 980-997</small>

<small>MRP4 tươngđồng, khuôn mẫulà cấu trúc tinhthể Sav1866hướng ngoại bào</small>

<small>Phần mềmICM 3.4</small>

<small>Glu 103, Ser 328, Gly359, Arg 362, Val 726,Leu 987</small>

<small>Chen vàcộng sự,201840</small>

<small>103, 105-106, 110-109,213-214, 221, 328, 359,361-362, 726, 875-876,963-967, 987</small>

<small>MRP4 tươngđồng từ serverI – TASSER,khuôn mẫu P –glycoprotein vàMRP1</small>

<small>AutodockVina, toạ độ26 x 26 x 26Å3</small>

<small>Gln 109, Arg 362, Gln221, Phe 875, Ile 876,Ile 962, Phe 965, Ser967</small>

<small>Berthier vàcộng sự,202141</small>

<small>Khoang 1: 54, 371, 374,</small>

<small>375, 879, 994, 995, 998 MRP4 tươngđồng từ serverI – TASSER,khuôn mẫu P –glycoprotein vàMRP1</small>

<small>AutodockVina toạ độ29 x 29 x 29Å3</small>

<small>Khoang 1: Arg 998Khoang 2: 207, 951,</small>

<small>881, 886, 894, 896, 897</small>

<small>Khoang 2: Arg 951,Arg 887, Arg 897Khoang 3: 262, 265,</small>

<small>272, 303, 314, 317</small>

<small>Khoang 3: Arg 272,Arg 303, Arg 317Khoang 4: 106, 221,</small>

<small>Becerra vàcộng sự,202143</small>

<small>Khoang NBD1Khoang NBD2Khoang TMD</small>

<small>MRP4 tươngđồng từ serverI – TASSER,khuôn mẫuMRP1 (5UJ9)</small>

<small>Autodock4.3.6 toạ độ22,5 x 22,5 x22,5 Å3</small>

<small>Cơ chất nội sinh: Lys106, Gln 251, Lys 329,Glu 374, Phe 698, Lys702, Thr 839, Glu 1002Cơ chất ngoại sinh: Arg312, Lys 329, Phe 698,Lys 702, Arg 946, Thr994, Arg 998</small>

<small>Chất ức chế: Gln 251,Leu 247, Arg 362, Thr366, Pro 867, Arg 951,Phe 993</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

<b>CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. Thiết kế nghiên cứu</b>

<i>Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu xây dựng mô hình in silico có khả năng dự đốn</i>

các chất ức chế bơm ngược MRP4 ở người. Sàng lọc trên ngân hàng DrugBank vàTCM nhằm tìm ra các hợp chất ức chế bơm ngược MRP4 tiềm năng, giúp làm tăngnồng độ thuốc điều trị ung thư trong nội bào, từ đó làm giảm tình đa kháng thuốc ởmột số bệnh nhân ung thư

Dựa vào tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước, có rất ít mơ hìnhpharmacophore dựa trên phối tử thực hiện trên bơm MRP4 và chưa có nghiên cứunào về mơ hình 2D-QSAR trên các chất ức chế được công bố. Với các chất ức chế cógiá trị hoạt tính là IC50 trên các cơ chất khác nhau, nghiên cứu tiến hành xây dựng mơhình pharmacophore và mơ hình 2D-QSAR giúp sàng lọc nhanh và dự đốn hoạt tínhcủa các chất ức chế tiềm năng.

Trước đây, mơ hình docking phân tử với cấu trúc MRP4 được xây dựng chủ yếulà các mơ hình tương đồng bởi các server khác nhau. Tuy nhiên gần đây, cấu trúcbơm ngược ABCC4 được chụp bằng phương pháp CryO – EM (8I4A) có độ phângiải cao là 3,40 Å đã được cơng bố. Vì vậy trong nghiên cứu này, cấu trúc mới 8I4Acũng được thu thập và đánh giá để xây dựng mơ hình docking. Cuối cùng, mơ phỏngMD và dự đoán ADMET được tiến hành trên các chất ức chế bơm ngược MRP4 tiềmnăng nhất.

<b>2.2. Đối tượng nghiên cứu</b>

<b>2.2.1. Cơ sở dữ liệu xây dựng mơ hình sàng lọc dựa trên phối tử</b>

Tổng cộng 206 chất có hoặc khơng có hoạt tính ức chế bơm ngược MRP4 thuộccác nhóm cấu trúc khác nhau được thu thập từ 18 bài báo khoa học.^{7,24,30,31,33-36,44-53}Trong đó, 142 chất ức chế có giá trị hoạt tính sinh học là IC50 (µM) (Bảng Phụ lục 1)được sử dụng để xây dựng các mơ hình sàng lọc ảo dựa trên phối tử. 64 chất khơngcó hoạt tính ức chế được trình bày trong Bảng Phụ lục 2. Khả năng ức chế bơm ngượcMRP4 của các chất được xác định bằng phương pháp vận chuyển qua màng túi. Cơsỡ dữ liệu được kiểm tra và điều chỉnh để sử dụng xây dựng mơ hình sàng lọc ảo.

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

• Cơ sở dữ liệu xây dựng mơ hình 3D – pharmacophore:

˗ Tập xây dựng mơ hình pharmacophore được lựa chọn là các chất có hoạt tínhức chế mạnh (IC50 ≤ 5 µM) và đại diện cho các nhóm cấu trúc khác nhau.˗ Tập kiểm tra mơ hình pharmacophore được chia thành 3 nhóm, nhóm có hoạt

tính mạnh gồm 30 chất có IC50 ≤ 5 µM, nhóm 112 chất có hoạt tính yếu(IC50 > 5 µM) và nhóm 64 chất khơng có hoạt tính.

• Cơ sở dữ liệu xây dựng mơ hình QSAR:

˗ Tập ức chế cơ chất ngoại sinh: 32 chất ức chế sự vận chuyển cơ chất là cácchất ngoại sinh là thuốc và chất phát quang như 6-thioguanin,ρ-methoxyethylamphetamin, methotrexat và D-luciferin thu thập từ 5 bàibáo.<small>7,33,34,45,52</small>

˗ Tập ức chế cơ chất nội sinh là hormon và các chất truyền tín hiệu

<small>o</small> Tập Endo_1 gồm 89 chất ức chế sự vận chuyển cơ chất EG thu thập từ 2bài báo.^36,49

<small>o</small> Tập Endo_2 gồm 38 chất ức chế sự vận chuyển cơ chất nội sinh khác ngoạitrừ EG như DHEAS, cAMP, urat, acid uric, PGE2 và F-S1P thu thập từ 8bài báo.^{24,30-32,35,50,51,53}

<b>2.2.2. Cấu trúc bơm ngược MRP4</b>

Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2021, nghiên cứu tiến hành thu thập cấu trúcMRP4 được xây dựng từ các nguồn dữ liệu khác nhau như I – TASSER và Alphafold.Cấu trúc CryO – EM của MRP4 (ngày đăng tải 24/05/2023) (PDB: 8I4A) vẫn khó cóthể sử dụng do thiếu 107 acid amin ở vùng linh động và đặc trưng của bơm gồm 8acid amin (Met 1 đến Val 8) đầu N, 63 acid amin (Asp 634 đến Val 696) của dây liênkết, 9 acid amin (Val 747 đến Val 755) vùng ngoại bào và 27 acid amin (His 1299đến Leu 1325) đầu C. Nghiên cứu tiến hành đánh giá để lựa chọn cấu trúc phù hợpnhất để tiến hành docking. Đối với các cấu trúc tương đồng được xây dựng bằngserver Alphafold và I – TASSER, trình tự acid amin của bơm ngược MRP4 được tảitừ trang web mã Uniprot O15439 (Phụ lục 1). Các cấu trúcMRP4 thu thập được bao gồm:

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

• MRP4_1: Cấu trúc MRP4 được chụp CryO – EM (PDB: 8I4A) từ PDB( đăng tải ngày 24/05/2023.<small>20</small>

• MRP4_2: Cấu trúc MRP4 tương đồng xây dựng bằng server AlphaFold( MRP4_3: Cấu trúc MRP4 tương đồng xây dựng bằng server tự động I-TASSER( khơng sử dụng khn mẫu

• MRP4_4: Cấu trúc MRP4 xây dựng bằng server I-TASSER từ khuôn 8I4A.

<b>2.2.3. Ngân hàng dữ liệu sử dụng để sàng lọc</b>

Ngân hàng dữ liệu DrugBank ( ngày truy cập10/09/2023) gồm 11.586 chất. Ngân hàng các hợp chất tự nhiên từ các bài thuốc cổtruyền Trung Hoa (TCM) gồm 57.423 chất, trong đó có 18.435 chất thoả luật nămcủa Lipinski.⁵⁴

<b>2.2.4. Các phần mềm máy tính sử dụng trong nghiên cứu</b>

Phần mềm sử dụng trong đề tài được trình bày trong Bảng 2.1.

<b>Bảng 2.1. Các phần mềm sử dụng trong nghiên cứu</b>

pharmacophore, QSAR, tính tốnthơng số mơ tả phân tử, bổ sungacid amin, phân tích tương tác từkết quả docking và MD

Studio 9.10 ^Mở ^{RapidMiner GmbH} ^{Lọc thông số mô tả phân tử}

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

<b>Phần mềm Bản quyền Nhà sản xuất Chức năng</b>

bị phối tử

Open Babel

O'Boyle N., BanckM., James C., MorleyC., VandermeerschT., Hutchison R G.

Chuyển định dạng tệp

tương tác protein – phối tửMicrosoft

Tính tốn miền ứng dụng, thốngkê kết quả

<b>2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu</b>

Đề tài tiến hành tại phịng máy Bộ mơn Hố Dược – Khoa Dược – Đại học YDược Thành phố Hồ Chí Minh (41 Đinh Tiên Hoàng, quận 1, thành phố Hồ ChíMinh) và máy tính cá nhân từ tháng 10/2021 đến 10/2023.

<b>2.4. Quy trình nghiên cứu</b>

Quy trình nghiên cứu được mơ tả trong Hình 2.1.

<b>Hình 2.1. Quy trình thực hiện nghiên cứu</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

Quy trình cụ thể gồm các bước như sau:

(i) Tiến hành thu thập, xử lý cơ sở dữ liệu gồm các chất ức chế và cấu trúc củabơm ngược MRP4;

(ii) Xây dựng, đánh giá mơ hình sàng lọc ảo dựa trên phối tử (mô hìnhpharmacophore và 2D – QSAR) và mơ hình sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc(mơ hình docking);

(iii) Tiến hành sàng lọc ảo ngân hàng dữ liệu DrugBank và TCM qua các mơhình tốt nhất đã được xây dựng để tìm ra các các chất ức chế tiềm năngnhất;

(iv) Mô phỏng động lực học phân tử, thống kê tương tác và tính tốn nănglượng liên kết tự do của các chất tiềm năng;

(v) Dự đoán ADMET cho các chất tiềm năng nhất.

<b>2.5. Phương pháp nghiên cứu, công cụ đo lường và thu thập số liệu2.5.1. Chuẩn bị cơ sở dữ liệu</b>

Cấu trúc các chất ức chế được vẽ bằng phần mềm MOE 2022.02<small>55</small> lưu dưới dạngdữ liệu *.mdb.

<i>Các chất ức chế được tiến hành tối thiểu hố năng lượng bằng cơng cụ EnergyMinimize của MOE, thông số RMS Gradient được điều chỉnh là 0,0001 kcal/mol/A^2,</i>

các thơng số cịn lại để mặc định (Trường lực: Amber10:EHT, R-field 1:80, Cutoff[8,10]).

Giá trị hoạt tính IC50 (M) được chuyển thành giá trị pIC50 = -logIC50.

Tập decoy được tạo bằng công cụ DUD.E decoy ( Tậpdecoy được tiến hành tối thiểu hố năng lượng theo quy trình giống như trên.

<b>2.5.2. Xây dựng mơ hình pharmacophore</b>

Mơ hình pharmacophore được xây dựng dựa trên các chất ức chế có hoạt tính đãbiết bằng phần mềm MOE 2022.02.<small>55</small> Quy trình xây dựng mơ hình pharmacophoređược trình bày trong Hình 2.2.

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

<b>Hình 2.2. Quy trình xây dựng mơ hình 3D – pharmacophore trên các chất ức chế</b>

bơm MRP4

Các bước xây dựng mơ hình pharmacophore được tiến hành như sau:

Chuẩn bị cơ sở dữ liệu: Các chất ức chế được tạo cấu dạng bằng công cụ

<i>Conformations Import với các thông số được điều chỉnh như sau: Giới hạn cấu hìnhsàng lọc (Refinement Conformation Limit) là 10.000, Giới hạn lỗi tìm kiếm ngẫunhiên (Stochastic Search Failure Limit) là 1.000, Giới hạn lặp lại tối thiểu hoá nănglượng (Energy Minimization Iteration Limit) là 1.000, Giới hạn độ dốc tối thiểu hoánăng lượng (Energy Minimization Gradient Limit) là 0,0001. Các thơng số cịn lại để</i>

mặc định.

Tạo truy vấn pharmacophore: Truy vấn (queries) được tạo bằng công cụ

<i>Pharmacophore Elucidator. Các thông số của các truy vấn gồm: độ bao phủ (cover);</i>

độ chồng phủ (overlap) và độ đúng (accuracy).

Các truy vấn tạo thành sẽ được đánh giá trên tập có hoạt tính mạnh, tập có hoạt

<i>tính yếu và tập khơng có hoạt tính bằng cơng cụ Pharmacophore Search bởi các giá</i>

trị dựa trên bốn đại lượng là số chất dương tính thật (true positives – TP), số chấtdương tính giả (false positives – FP), số chất âm tính thật (true negatives –TN), sốchất âm tính giả (false negatives – FN)<small>56</small>:

• Độ đúng trên các chất có hoạt tính (độ nhạy)<small>56</small>: là tỷ lệ các kết quả dự đốn dươngtính thật trong tất cả các chất có hoạt tính.

Độ đúng trên các chất có hoạt tính = ^TP

<small>TP + FN</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

• Độ chính xác trên các chất có hoạt tính<small>56</small>: là tỷ lệ các kết quả dự đốn dương tínhthật trong tất cả các chất dương tính do cơng cụ xác định:

Điểm số GH của các chất có hoạt tính: = ^{TP×[(TP+FN)+(TP+FP)]}

Điểm số GH của các chất khơng có hoạt tính = ^{TN×[(FP+TN)+(TN+FN)]}

<b>2.5.3. Quy trình xây dựng mơ hình 2D – QSAR</b>

Mơ hình 2D-QSAR được xây dựng từ các chất có giá trị IC50 bằng phương phápbình phương tối thiểu từng phần (Partial Least Square – PLS). Quy trình tổng qtxây dựng mơ hình QSAR được mơ tả ở Hình 2.3.

<b>Hình 2.3. Quy trình xây dựng mơ hình 2D-QSAR trên các chất ức chế bơm MRP4</b>

</div>