xây dựng quy trình chiết xuất nhóm hoạt chất saponin từ dược liệu tam thất panax pseudoginseng bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.76 MB, 101 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HỒNG VINH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT NHĨM HOẠT

CHẤT SAPONIN TỪ DƯỢC LIỆU TAM THẤT (Panaxpseudoginseng) BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LỎNG SIÊU

TỚI HẠN

ĐỀ ÁN THẠC SĨ ỨNG DỤNG DƯỢC HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HỒNG VINH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT NHĨM HOẠT

CHẤT SAPONIN TỪ DƯỢC LIỆU TAM THẤT (Panaxpseudoginseng) BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LỎNG SIÊU

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề án này là do bản thân thực hiện cùng sự hỗ trợ, tham khảotừ các tài liệu liên quan đến đề tài, khơng có sự đạo văn các tài liệu đó dưới bất kỳhình thức nào, các kết quả được trình bày trong đề án là trung thực và khách quan.

Tác giả đề án

Nguyễn Hoàng Vinh

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

PHỤ LỤC

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2. EFSA European Food SafetyAuthority

Cơ quan An toàn Thực phẩmchâu Âu

3. GRAS Generally Regarded asSafe

12. Tc Temperature critical Nhiệt độ siêu tới hạn

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Một số dung môi sử dụng cho phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn ... 16

Bảng 2.2. So sách đặc tính của chất ở 3 trạng thái lỏng khí và siêu tới hạn ... 16

Bảng 2.3. Bảng các chất đối chiếu và một số hóa chất ... 25

Bảng 2.4. Danh mục trang thiết bị ... 26

Bảng 2.5. Danh mục dụng cụ ... 27

Bảng 2.6. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dung môi ethanol phối trộn ... 34

Bảng 2.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết ... 35

Bảng 2.8. Khảo sát ảnh hưởng của áp suất chiết ... 35

Bảng 2.9. Khảo sát thời gian chiết ... 36

Bảng 2.10. Các chỉ tiêu định lượng của cao chiết Tam thất ... 42

Bảng 2.11. Kết quả đánh giá mất khối lượng do làm khô của bột Tam thất ... 44

Bảng 2.12. Kết quả hàm lượng tro toàn phần của bột Tam thất ... 45

Bảng 2.13. Kết quả hàm lượng tro không tan trong acid của bột Tam thất ... 45

Bảng 2.14. Kết quả hàm lượng chất chiết được của bột Tam thất ... 45

Bảng 2.15. Kết quả định tính bột dược liệu bằng phương pháp tạo bọt ... 46

Bảng 2.16. Kết quả quả định lượng tính trên dược liệu khơ kiệt ... 48

Bảng 2.17. Kết quả đánh giá chất lượng Tam thất đầu vào ... 48

Bảng 2.18. Kết quả khảo sát tốc độ dòng ... 50

Bảng 2.19. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết ... 51

Bảng 2.20. Kết quả khảo sát áp suất chiết xuất ... 53

Bảng 2.21. Kết quả nâng cấp cỡ lô chiết xuất ... 57

Bảng 2.22. Kết quả đánh giá cảm quan ... 57

Bảng 2.23. Kết quả mất khối lượng do làm khô ... 58

Bảng 2.24. Kết quả định tính ... 58

Bảng 2.25. Kết quả tro tồn phần ... 59

Bảng 2.26. Kết quả hàm lượng saponin toàn phần ... 59

Bảng 2.27. kết quả đánh giá chỉ tiêu giới hạn nhiễm khuẩn ... 60

Bảng 2.28. Tổng kết kết quả xây dựng chỉ tiêu chất lượng cao chiết Tam thất... 60

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1. Cây và củ Panax pseudoginseng (Burkill) F. H. Chen ... 8

Hình 2.2. Viên nang cứng Tam Thất OPC ... 13

Hình 2.3. Viên nang cứng OPCARDIO Viên hộ tâm ... 14

Hình 2.4. Viên nang cứng Não đắc sinh CERINPAS ... 14

Hình 2.5. Viên nén bao phim Đan sâm Tam thất ... 15

Hình 2.6. Giãn đồ pha trạng thái siêu tới hạn của một chất 21 ... 15

Hình 2.7. Sơ đồ quy trình cơng nghệ chiết SCO2 hiện nay ... 19

Hình 2.8. Sự biến đổi trạng thái của CO2 trong quá trình chiết ... 19

Hình 2.9. Lưu đồ điều chế cao Tam thất ... 33

Hình 2.10. Hình ảnh về rễ củ Tam thất ... 43

Hình 2.11. Hình ảnh về mặt cắt ngang của rễ củ Tam thất ... 43

Hình 2.12. Hình ảnh về đặc điểm vi học của bột Tam thất ... 44

Hình 2.13. Kết quả định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ... 47

Hình 2.14. Sắc ký đồ định lượng dược liệu Tam thất đầu vào ... 48

Hình 2.15. Sắc ký đồ mẫu chuẩn và thí nghiệm 5 ... 50

Hình 2.16. Biểu đồ ảnh hưởng của tốc độ dòng ethanol 96% đến hiệu suất chiết caovà HL Saponin ... 50

Hình 2.22. Sơ đồ điều chế cao Tam thất ... 55

Hình 2.23. Sắc ký đồ nâng cấp cỡ lô chiết suất ... 56

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU

1.1. Tên đề tài

Xây dựng quy trình chiết xuất nhóm hợp chất saponin từ dược liệu Tam thất

(panax pseudoginseng) bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn.

(Panax pseudoginseng) là một trong những nguồn chứa saponin hàng đầu có thể kể

đến. Thành phần hóa học chủ yếu của Tam thất là các ginsenosid saponin nhưnotoginsenosid R1, gingsenosid Rg1 và Rb1…2,3 Các thành phần này đã được chứngminh có tác dụng tốt đối với sức khoẻ, như các lợi ích đối với hệ tim mạch2,3,4, khả

năng chống xơ vữa động mạch 5, khả năng chống viêm6,7, chống oxi hoá8, giảm nồngđộ cholesterol trong máu cũng như điều hoà huyết áp9,10 và chống ung thư 11,12,13. Từ

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

những minh chứng trên, có thể thấy đây là dược liệu quý giàu saponin với nhiều tácdụng dụng có lợi đối với sức khoẻ con người, do đó cần có một phương pháp phù hợpđể chiết chọn lọc các hợp chất saponin từ Tam thất giúp tạo ra cao chiết saponin đểphát triển các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe.

Hiện nay, phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn cho thấy những ưu điểm vượttrội được dùng trong chiết xuất các hợp chất từ dược liệu như: chiết chọn lọc cácnhóm hợp chất, tạo ra sản phẩm có độ tinh khiết cao, giảm thiểu ơ nhiễm mơi trườngvà đặc biệt khơng để lại dư lượng hóa chất có hại cho sức khỏe con người. Mặt khác,hiện Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu chiết cao Tam thất bằng phương pháp chiếtlỏng siêu tới hạn, có thể coi nghiên cứu này là bước đi đầu ứng dụng công nghệ hiệnđại vào chiết xuất dược liệu này. Do đó, với mong muốn chiết xuất được nhiều các

hợp chất saponin từ Tam thất, đề tài “Xây dựng quy trình chiết xuất nhóm hợp

chất saponin từ dược liệu Tam thất (panax pseudoginseng) bằng phương pháp

chiết lỏng siêu tới hạn” được thực hiện với các mục tiêu chính được xác lập mục 1.4

1.4. Mục tiêu của đề án

Mục tiêu tổng qt: Xây dựng quy trình chiết xuất nhóm hợp chất saponin từ

dược liệu Tam thất (panax pseudoginseng) bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn

Mục tiêu cụ thể:



Khảo sát q trình chiết xuất, xác định được các thơng số thích hợp để chiếtxuất cao chiết Tam thất.



Hồn chỉnh quy trình chiết và nâng cỡ lơ chiết xuất.



Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho cao chiết Tam thất thu được từ quy trìnhchiết lỏng siêu tới hạn đã xác lập.

1.5. Nhiệm vụ của đề án

Từ mẫu củ Tam thất khô tiến hành kiểm tra chất lượng dược liệu đầu vào choq trình chiết xuất. Khảo sát các thơng số quy trình chiết xuất siêu tới hạn ảnh hưởngđến hàm lượng saponin trong cao chiết từ dược liệu Tam thất. Từ đó, tiến hành tối ưu

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

hóa quy trình chiết và nâng cấp cỡ lơ. Sản phẩm thu được được tiêu chuẩn hóa để tiếnđến sử dụng cho các mục đích thương mại hoặc nghiên cứu tiếp theo.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

CHƯƠNG II. NỘI DUNG

2.1. Cơ sở xây dựng đề án

2.1.1. Tổng quan về nhóm Saponin

2.1.1.1. Khái niệm về saponin

Saponin hay saponosid là một nhóm glycosid có phần genin có cấu trúc triterpenhay steroid gặp rộng rãi trong thực vật, cũng được tìm thấy trong động vật thân mềmở biển như Hải sâm, Sao biển.

Theo truyền thông, saponin thường được định nghĩa dựa trên một số tính chấtchung đặc trưng của nhóm hợp chất này là:

- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước.- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất lỗng.

- Độc vổi cá, diệt các lồi thân mềm như giun, sán, ốc sên…- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt.

- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất hydroxy steroid khác.

Tuy nhiên, không phải tất cả các saponin đều thể hiện đầy đủ các tính chất trên.Ngày nay, saponin thường được định nghĩa trên cơ sở cấu trúc hóa học đó là cáctriterpen glycosid hay các 27-C steroid glycosid 14.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

2.1.1.2. Cấu trúc hóa học và phân loại saponin

Trước đây, dựa vào khả năng tạo tủa trong các môi trường khác nhau, người tachia saponin thành 2 loại là saponin trung tính và saponin acid. Theo cách chia nàythì:

Saponin trung tính: cho tủa với dung dịch Ba (OH)2 và chì acetat kiềm.

Saponin acid: tan trong dung dịch kiềm, cho tủa với dung dịch chì acetat,ammonium sulfat.

Ngồi ra người ta cũng có thể chia saponin thành 3 loại:- Saponin acid: trong phân tử có nhóm –COOH

- Saponin kiềm: trong phân tử có N, khơng có nhóm –COOH- Saponin trung tính.

Hiện nay, dựa vào cấu trúc hóa học, người ta chia saponin thành 2 loại chính:saponin triterpenoid và saponin steroid, được trình bày trong sơ đồ sau 15:

 Saponin triterpenoid

Cấu trúc của Saponin triterpenoid rất đa dạng, dựa vào cấu trúc của genin ngườita chia thành 4 nhóm chính16,17:

 Dẫn xuất α-amyrin Dẫn xuất β-amyrin Dẫn xuất lupeol

 Triterpen: 4 vòng, 5 vòng.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Dưới đây là một số khung cơ bản Dẫn xuất amyrin

 Dẫn xuất lupeol

 Saponin steroid (SS)

Trừ hợp chất Criptogenin (có cấu trúc 4 vịng) tất cả các saponin steroid đều cóđặc điểm chung cấu trúc là hệ thống vòng spiroxetal (vòng E và F) nối nhau qua C22.

Các hợp chất này chỉ khác nhau 3 điểm:

- Ở C5 vịng A/B: Hydro có thể có cấu hình α và β hoặc dây nối đơi giữa C5- C6- Tuỳ theo cấu trúc của R1 và R2 (thường là H hoặc CH3) mà chúng có thể làđồng phân iso (cấu hình C25 là R) hoặc đồng phân neo (C25 có cấu hình S).

- Về số nhóm thế: tất cả các saponin streroid đều có nhóm OH ở C3; một số ítcịn có OH ở C2 hay C6 (hoặc cả hai). Vài sapogenin cịn có thêm C=O ở C12.

Khung sapogenin steroid

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Sự phân bố saponin trong tự nhiên

Saponin phân bố rất rộng trong thực vật (500 loài/90 họ). Saponin triterpenoidthường gặp ở cây thuộc lớp hai lá mầm và saponin steroid thường gặp ở cây thuộclớp một lá mầm.

– Các họ cây thường chứa saponin triterpenoid:+ Họ Nhân sâm (Araliaceae)

+ Họ Cà phê (Rubiaceae)+ Họ Đậu (Fabaceae)+ Họ Viễn chí (Polygalaceae)

+ Họ Rau dền (Amaranthaceae)+ Họ Bồ hịn (Sapindaceae)+ Họ Bầu bí (Cucurbitaceae)+ Họ Cải (Brassicaceae)– Các họ cây thường chứa saponin steroid:

Bên cạnh đó Saponin cịn có ở một số động vật như các loài:

Hải sâm (Actinopyga agassizi, Holothuria vagabunda, H. polii, H. scabra, H.leucospilota, H. librica, Stichopus japonicus, S. chloronotus…).

Sao biển, Hải quỳ (Acanthaster planci, Asterina pectinifera, A. forbesi, Patiriaminiata, Pisaster ochraceus, P. brevispinus, Pycnopodia helianthoides…).

2.1.1.3. Cơng dụng chung của nhóm saponin

- Tác dụng bồi bổ, tăng cường sinh lực (nhân sâm)- Tác dụng long đờm, dịu ho (cam thảo, cam thảo đất…)- Giảm đau khớp xương (ngưu tất, cỏ xước)

- Hạ cholesterol trong máu (ngưu tất, cỏ xước)

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

- Riêng nhóm saponin steroid là nguồn nguyên liệu quan trọng bán tổng hợp cácthuốc cocticoid và thuốc hạn chế sinh đẻ.

2.1.2. Giới thiệu về cây Tam thất

2.1.2.1. Phân loại khoa học của cây Tam thất

Tên Việt Nam: sâm tam thất, kim bất hoán, nhân sâm tam thất, điền thất 18,19.

Tên khoa học: Panax pseudoginseng (Burkill) F. H. Chen

Phân loại khoa học:

Ngành (Division): Thực vật hạt kín (Magnoliophyta)Lớp (Class): Thực vật hai mầm (Magnoliopsida)

Bộ (Order): Hoa tán (Apiales)

Họ (Family): Nhân Sâm (Araliaceae)

Chi (Genus): Sâm (Panax)

Loài (Species): Tam thất (pseudoginseng)

Tên đồng nghĩa: Aralia quinquefolia var. notoginseng Burkill; Panaxpseudoginseng var. notoginseng (Burkill) G.Hoo & C.L.Tseng hoặc Panaxpseudoginseng Wall

Hình 2.1. Cây và củ Panax pseudoginseng (Burkill) F. H. Chen

2.1.2.2. Phân bố của cây Tam thất

Tam thất có nguồn gốc ở phía nam Trung Quốc, được trồng từ lâu đời và khơngcịn được tìm thấy trong trạng thái mọc trong tự nhiên. Cây được nuôi trồng nhiềunhất ở tỉnh Vân Nam, sau đó là Quảng Tây và ở một số quốc gia khác như Đài Loan,

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Nhật Bản, Triều Tiên 19. Sự nhạy cảm với ánh sáng của cây hạn chế sự phân bố củaTam thất tại Trung Quốc 20.

Ở Việt Nam, Tam thất là một loại cây được nhập trồng từ Trung Quốc 19 đượctrồng với số lượng ít tại một số tỉnh như: Hà Giang (Đồng Văn), Lào Cai (MườngKhương, Bát Xát, Phà Lùng), Cao Bằng tại các vùng núi cao 1200 – 1500 m 18.

2.1.2.3. Đặc điểm thực vật của Tam thất

Tam thất là cây thân thảo, sống nhiều năm. Thân Tam thất mọc thẳng, khôngphân nhánh, cao 30 – 50 cm, màu tím tía. Lá kép chân vịt, màu xanh đậm, 3 – 4 lámọc vòng, cuống lá dài 3 – 6 cm, mỗi cuống lá gồm 5 – 7 lá chét hình mác, cuống láchét dài 0,6 – 1,2 cm, gốc thn, đầu có mũi nhọn, mép khía răng, hai mặt có lơngcứng ở gân, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt 19.

Cụm hoa hồn chỉnh có đường kính 5 – 25 mm, tổng chiều dài cuống từ 5 – 45mm. Cuống nhỏ ở một đầu và đầu còn lại chứa nhiều nụ hoa, với khoảng 130–230hoa. Cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có hoa đơn tính, có hoa lưỡng tínhcùng tồn tại. Hoa màu lục vàng nhạt, đài 5 răng ngắn, màu xanh, tràng 5 cánh rộng ởphía dưới, nhị 5, bầu 2 ơ. Quả mọng, hình cầu dẹt, khi chín màu đỏ, trong có hai hạthình cầu, màu trắng 19.

Rễ chính có hình nón hoặc trụ, với chiều dài từ 1 – 6 cm, có màu vàng hoặc nâuvới các vết nhăn và nếp rễ. Cây thường được thu hoạch vào mùa thu, trong thời giantrước khi nở hoa và có thể được nghiền thành bột sử dụng cho đường uống hoặc kếthợp với các thảo dược khác19.

2.1.2.4. Thành phần hóa học

Theo các nghiên cứu, hơn 200 thành phần hoá học đã được phân lập từ Tamthất. Trong số đó, saponin (4,42 – 12%) 19 chiếm hàm lượng lớn và được coi là thànhphần chính, ngồi ra trong tam thất còn chứa những thành phần khác như flavonoid,các peptit vịng, đường saccarid và các ngun tố vơ cơ. Những thành phần phân bốtrong các bộ phận khác nhau của cây như rễ, thân, hoa và lá với tỉ lệ khác nhau.

Saponin được coi là thành phần chính trong Panax pseudoginseng (PPG). Trong

thực tế, đã có hơn 100 loại saponin được phân lập và xác định, thuộc ba nhóm

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

ginsenosid, notoginsenosid và gypenosid. Hầu hết các saponin trong cây Tam thất làcác triterpen thuộc nhóm Dammarane với nhóm aglycon là 20(S)-protopanaxadiol(nhóm Rb) hoặc 20(S)-protopanaxatriol (nhóm Rg). PPG có thành phần khơng chứabất cứ saponin nào có nhóm axit oleanolic (nhóm Ro), đây là một khác biệt lớn so

với cây Panax ginseng C. A. Meyer và Panax quinquefolius L. Mỗi bộ phận khác

nhau của Tam thất sẽ chứa thành phần và tỉ lệ saponin khác nhau tuỳ theo từng bộphận cụ thể. Nghiên cứu cho thấy ginsenosid Rb1 có nhiều trong tất cả các bộ phậncủa cây, trong khi Rg1 giàu trong thân và rễ. Rg3 - một chất được báo cáo về khảnăng bảo vệ thần kinh - có hàm lượng lớn trong nụ hoa Tam thất. Thông thường, nămloại saponin chính là notoginsenosid R1 (7 - 10%), ginsenosid Rb1 (30 - 36%), Rg1(20 - 40%), Rd (5 - 8,4%) và Re (3,9 - 6%) chiếm tới khoảng 90% tổng số saponintrong Tam thất được nghiên cứu cùng ứng dụng trong thí nghiệm về dược lý. Trongsố đó, ba saponin lần lượt là ginsenosid Rb1, ginsenosid Rg1 và notoginsenosid R1được chọn làm hợp chất tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng Tam thất. Để tăng cườngsự đa dạng phân tử của ginsenosid, đồng nghĩa với khả năng tìm kiếm được các chấtcó hoạt tính sinh học mới, các nghiên cứu khoa học đã được thực hiện nhằm xác địnhcác sản phẩm thuỷ phân và các sản phẩm biến đổi sinh học của saponin nhằm tìmkiếm các chất có hoạt tính mới, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc ứng dụngTam thất trong điều trị 20.

Notoginsenoside R1 Ginsenosid Rb1

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

Ginsenosid Rg1 Ginsenosid Rd

Ginsenosid Re

Ngoài các loại saponin, các thành phần khác cũng được báo cáo có mặt trong

Panax pseudoginseng (PPG). Trong PPG các peptit vòng được tìm thấy có cấu trúc

là các hợp chất mạch vịng hình thành dựa trên các liên kết peptit do 2 – 37 proteinhoặc axit amin không phải protein tạo nên. Chúng được tìm thấy trong các thực vật

thuộc họ Caryophyllaceae và Rhamnaceae và được phân chia thành hai lớp, năm lớp

phụ và tám loại. Đã có 14 loại peptit vịng được phân lập và xác định về cấu trúc dựatrên phương pháp quang phổ, đó là các peptit vòng sáu: cyclo- (Leu-Thr), cyclo-(LeuIle), cyclo- (Leu-Val), cyclo- (Ile-Val), cyclo- (Leu-Ser), cyclo- (Leu-Tyr),cyclo- (Val-Pro), cyclo- (Ala-Pro), cyclo- (Phe-Tyr), cyclo- (Phe-Ala), cyclo- (Phe-Val), cyclo- (Leu-Ala), cyclo- (Ile-Ala) và cyclo- (Val-Ala).

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Saccarid phân lập từ cây bao gồm monosaccarid, oligosaccarid và polysaccarid.Polysaccarid tồn tại trong nhiều bộ phận, với hàm lượng cao nhất ở rễ chính. Tổnghàm lượng đường của rễ PPG gần gấp đôi so với thân rễ, và hàm lượng polysaccaridcủa hoa gấp đôi so với thân và lá của Tam thất. Các nghiên cứu khoa học đã chứngminh rằng các polysaccarid trong PPG có tác dụng bổ trợ và hoạt động kích thíchmiễn dịch.

Một số loại flavonoid đã được phân lập ra từ PPG, chủ yếu là flavonol vàflavonglycosid như liquiritigenin, quercetin hay kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside.

Có một lượng ít sterol đã được phân lập và xác định từ PPG, bao gồm sitosterol, daucosterol, stigmasterol, stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid vàstigmast-7-en-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosid.

β-Hơn 19 loại amino axit đã được phân lập trong PPG, với 7 trong số chúng đượccoi là thiết yếu 20.

Các thành phần dầu dễ bay hơi trong PPG gồm terpen, rượu, aldehit, olefin vàankan. Terpen được coi là một thành phần quan trọng vì tỷ lệ tương đối cao trong hợpchất. Hơn 91 chất dễ bay hơi đã được phân lập từ dầu của hoa nụ hoa Tam thất, vớicác thành phần chính là spathulenol (12,19%), α gurjunen (6,73%), bicyclogermacren(6,57%), germacrene D (5,26%) và bicycloelemen (3,55%) 21.

Ngoài các hợp chất hóa học được liệt kê ở trên, cịn có các thành phần khácđược phân lập từ PPG, bao gồm icarisid B6, guanosin hydrat, axit béo, các nguyên tốvô cơ và muối khống 20

2.1.2.5. Cơng dụng

Đúc kết từ các kinh nghiệm xưa cùng với các nghiên cứu hiện đại, Tam thất đãđược chứng minh là một loài cây với nhiều tác dụng dược lý tốt lên hệ tim mạch, hệmiễn dịch, khả năng chống xơ vữa động mạch, hoạt động cầm máu, khả năng chốngung thư,…

Rễ Tam thất được thu hái trước khi ra hoa, rửa sạch, phơi khô hoặc sấy khô, rồiphân loại thành rễ củ, rễ nhánh và thân rễ. Tam thất có vị đắng, ngọt, tính ẩm, vàocác kinh can, thận, có cơng năng hoạt huyết, bổ huyết, cầm huyết, tiêu ứ máu, tiêusưng, giảm đau. Tam thất được dùng làm vị thuốc trong các bài thuốc y học cổ truyền

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

của Việt Nam như chữa các chứng chảy máu khi bị thương hoặc chữa suy nhược cơthể ở người cao tuổi hoặc phụ nữ có thai. Trong y học cổ truyền Ấn Độ, tam thất làthuốc bổ và làm tăng khả năng thích nghi của cơ thể 19.

Tại Trung Quốc, từ xa xưa rễ của tam thất đã được sử dụng như một phươngthuốc cầm máu nổi tiếng, là thành phần chính trong Vân Nam Bạch Dược – mộtphương thuốc nổi tiếng của Trung Quốc. Các ghi chép về cây có thể được tìm thấytừ rất sớm trong cuốn Bản Thảo Cương Mục của Lý Thời Trân, với các tác dụng đượcđề cập đến như cầm máu, loại bỏ máu ứ, giảm đau và điều trị chảy máu do vật sắc,ho ra máu, nôn trớ, chảy máu cam và lỵ ra máu 20.

2.1.2.6. Một số chế phẩm trên thị trường chứa Tam thất hiện nay

Hiện nay, trên thị trường lưu hành nhiều chế phẩm với cao chiết Tam thất làmột trong các thành phần chính như:

Tam thất OPC: được chỉ định trong điều trị các chứng xuất huyết do bị rong

kinh, chấn thương, chảy máu cam, ho ra máu, tiểu tiện ra máu và trong các trườnghợp thiếu máu, hoa mắt, chóng mặt, ít ngủ, suy nhược cơ thể, đặc biệt đối với phụ nữsau khi sinh.

Hình 2.2. Viên nang cứng Tam Thất OPC

OPCARDIO Viên Hộ Tâm: có tác dụng khá tồn diện trên tim mạch, đặc biệtcó lợi trên mạch vành tim. Thuốc được chỉ định trong phòng ngừa và điều trị cácchứng đau thắt ngực, tim hồi hộp, phòng ngừa và điều trị bệnh xơ vữa mạch vành.

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

Hình 2.3. Viên nang cứng OPCARDIO Viên hộ tâm

NÃO ĐẮC SINH CERINPAS: tác dụng điều trị các triệu chứng của tai biến

mạch máu não (trúng phong) do ứ huyết gây tắc nghẽn kinh lạc như chóng mặt, hoamắt, cơ thể khó cử động, khó phát âm ngơn ngữ. Xơ cứng động mạch não, tai biếnmạch máu não do thiếu máu hoặc di chứng sau xuất huyết não.

Hình 2.4. Viên nang cứng Não đắc sinh CERINPAS

nhói vùng tim do huyết ứ, thiểu năng mạch vành, cảm giác ngột ngạt trong ngực. Đauđầu do huyết ứ (đau nhói từng cơn), thiểu năng tuần hồn não, sa sút trí nhớ do lưuthơng máu não kém.

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

Hình 2.5. Viên nén bao phim Đan sâm Tam thất

2.1.3. Giới thiệu về phương pháp chiết xuất lỏng siêu tới hạn

2.1.3.1. Định nghĩa

Trạng thái siêu tới hạn hình thành khi nhiệt độ và áp suất vượt quá điểm tới hạn(critical point) tại điểm cân bằng lỏng hơi. Khi đó chất ở trạng thái siêu tới hạn vừacó tính chất giống pha lỏng vừa có tính chất giống pha hơi. Ở trạng thái này, tỷ trọngcủa pha lỏng và pha hơi bằng nhau, ranh giới phân biệt giữa 2 pha biến mất. chất ởtrạng thái siêu tới hạn có tính chất nằm giữa pha lỏng và pha hơi 21.

Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn là phương pháp sử dụng dạng dung môiđặc biệt là dung mơi ở trạng thái siêu tới hạn.

Hình 2.6. Giãn đồ pha trạng thái siêu tới hạn của một chất 21

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Điểm ba là nơi mà ba trạng thái rắn, lỏng, khí giao nhau. Các đường cong là nơihai trạng thái cùng hiện diện. Quan sát dọc theo đường cong khí-lỏng hướng lên caogặp 1 điểm, nơi đó nồng độ của khí và lỏng bằng nhau. Điểm này được gọi là điểmsiêu tới hạn và hợp chất lúc đó gọi là chất lỏng siêu tới hạn. Tại điểm tới hạn, áp suấtvà nhiệt độ có giá trị được gọi lần lượt là áp suất siêu tới hạn (Pc) và nhiệt độ siêu tớihạn (Tc) Hai giá trị này đặc trưng cho từng chất 21.

Bảng 2.1. Một số dung môi sử dụng cho phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn 21

Dung môi Nhiệt độ tới hạn (oC) Áp suất tới hạn (Bar)

2.1.3.2. Nguyên lý của phương pháp

Bất kỳ dung môi nào cũng sẽ ở trạng thái siêu tới hạn nếu tồn tại ở nhiệt độ và

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

áp suất trên giá trị tới hạn.

Đối với mỗi chất thông thường, dưới mỗi một điều kiện nhất định chúng sẽ tồntại ở một trong 3 trạng thái rắn, lỏng hoặc khí. Nếu nén chất khí tới một áp suất đủcao, chất khí sẽ hóa lỏng. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở đó, nếu nâng dầnnhiệt độ lên thì chất lỏng khơng trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng tháiđặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (Supercritical). Vật chất ở trạng thái này mangnhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung mơi đó mang tính trunggian giữa khí và lỏng 22.

Vì vậy khi CO2 được đưa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ, áp suất tới hạncủa nó (trên Tc = 31,04 oC, Pc = 73,8 bar), sang CO2 sẽ chuyển trạng thái siêu tớihạn. Tại trạng thái này CO2 mang hai đặc tính: Đặc tính phân tách của q trình tríchly và đặc tính phân tách của q trình chưng cất 22.

Nó có khả năng hồ tan rất tốt các đối tượng cần tách ra khỏi mẫu ở cả 3 dạngrắn, lỏng, khí. Sau q trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần giảm áp suất thấp hơnáp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngồi cịn sản phẩm được tháo ra ởbình hứng. Ở mỗi điều kiện nhiệt độ, áp suất khác nhau sẽ tương ứng với mỗi mộtđối tượng cần chiết tách khác nhau 22.

Phương pháp chiết suất lỏng siêu tới hạn được áp dụng nhiều do việc chiết xuấtcó nhiều ưu điểm sau:

 Ưu điểm của phương pháp so với các phương pháp truyền thống

- Sản phẩm có chất lượng cao: đối với tinh dầu thì có màu, mùi tự nhiên, khônglẫn nhiều thành phần không mong muốn, với các hợp chất tự nhiên thì táchđược các chất có hoạt tính cao.

- Khơng cịn lượng dung mơi dư.

- Tách các hoạt chất với hàm lượng cao.- Không gây ô nhiễm môi trường.

- Là một phương pháp có cơng nghệ cao và an tồn với các sản phẩm tự nhiên.

 Ưu điểm của dung môi CO2 siêu tới hạn 22

Tính chất hố lý của CO2 siêu tới hạn:

CO2 ở trạng thái siêu tới hạn có các đặc tính nổi bật như:

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

- Sức căng bề mặt thấp- Độ linh động cao- Độ nhớt thấp

- Tỉ trọng xấp xỉ tỉ trọng của chất lỏng

- Khả năng hòa tan dễ điều chỉnh bằng nhiệt độ và áp suất

Ưu điểm so với các dung môi khác:

- CO2 là một chất dễ kiếm, rẻ tiền vì nó là sản phẩm phụ của nhiều ngành cơngnghệ hố chất khác.

- Là một chất an toàn được xếp trong nhóm GRAS (Generally Regarded asSafe) được FDA công nhận 22 và EFSA (European Food Safety Authority) 24- Là một chất trơ, ít có phản ứng kết hợp với các chất cần tách chiết.

- Khơng bắt lửa, khơng duy trì sự cháy.- Không làm ô nhiễm môi trường.

- CO2 không độc với cơ thể, khơng ăn mịn thiết bị.

- Có khả năng hồ tan tốt các chất tan hữu cơ ở thể rắn cũng như lỏng, đồngthời cũng hoà tan lẫn cả các chất thơm dễ bay hơi. Có sự chọn lọc khi hồtan, khơng hồ tan các kim loại nặng và dễ điều chỉnh các thông số trạng tháiđể có thể tạo ra các tính chất lựa chọn khác nhau của dung mơi.

- Khi CO2 hố hơi khơng để lại cặn độc hại.

Các chất có khả năng tan tốt trong CO2 siêu tới hạn

-

Các aldehyd, keton, ester, alcohol, và các dẫn xuất halogen có phân tử lượngnhỏ và trung bình.

-

Các hydrocacbon mạch thẳng, không phân cực, phân tử lượng thấp và cómạch cacbon dưới 20, các hydrocacbon thơm có phân tử lượng nhỏ.

Trên thực tế, để thay đổi tính phân cực của CO2 siêu tới hạn đồng thời tăng khảnăng hòa tan được nhiều hoạt chất hơn, người ta dùng thêm dung mơi hỗ trợ (co-solvent) như ethanol 24.

2.1.3.3. Quy trình chiết xuất lỏng siêu tới hạn

CO2 ở trạng thái lỏng từ trong bình chứa khí với áp suất (50 - 55 bar) được dẫnqua thiết bị truyền nhiệt làm lạnh xuống khoảng nhiệt độ 0 - 1 oC để tăng tỷ trọng

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

dịng dung mơi CO2 lỏng trước khi vào bơm cao áp. Bơm cao áp nén CO2 vào bìnhchiết ở áp suất làm việc đã đặt trước. Nhiệt độ của CO2 trong bình chiết được điềuchỉnh tự động bằng hệ thống điều khiển (4) nhằm duy trì trạng thái ổn định ở nhiệtđộ chiết. Dịng SCO2 ra khỏi bình chiết qua van tháo số 1 tiếp đó được giảm áp bằngvan tháo số 2, dịch chiết đi vào bình tách đã đặt trước nhiệt độ ổn định 35 oC và tạiđây CO2 hóa khí tách ra khỏi sản phẩm.

Hình 2.7. Sơ đồ quy trình cơng nghệ chiết SCO2 hiện nay

Hình 2.8. Sự biến đổi trạng thái của CO2 trong quá trình chiết

T (oC)

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Khí CO2 lúc ban đầu trong bình chứa ở trạng thái 1 (hình 2.8), thường là áp suấttrong khoảng 45 - 55 bar, nhiệt độ 12 - 20 oC. Khi được hạ nhiệt độ ở điều kiện đẳng

áp từ trạng thái 1 sang trạng thái 2, CO2 lỏng tới nhiệt độ 0 - 1 oC và tỷ trọng tăng dầnlên, ở điều kiện này CO2 lỏng có thể pha trộn với các dung môi như ethanol, methanol,

n-hexan,… dễ dàng. Quan trọng hơn, khi CO2 ở thể lỏng và có tỷ trọng cao, thì dễsử dụng bơm cao áp để nén lên áp suất cao và điều chỉnh lưu lượng vào bình chiếtthuận lợi.

Qua bộ phận làm lạnh, CO2 lỏng được bơm cao áp nén qua van điều chỉnh lưulượng vào bộ phận trao đổi nhiệt để điều chỉnh tỷ trọng và độ nhớt phù hợp với yêucầu công nghệ, CO2 đạt tới trạng thái 3 bên trong bình chiết. CO2 lỏng từ trạng thái 3được giữ ở điều kiện đẳng áp và tăng nhiệt độ dần dần để chuyển CO2 lỏng sang trạng

thái siêu tới hạn 4 trong bình chiết.

Quá trình chiết nguyên liệu thực vật bằng CO2 siêu tới hạn có thể thực hiện liêntục hoặc gián đoạn tùy theo yêu cầu công nghệ. Van bảo hiểm an toàn áp suất cho hệthống chiết (màng 3 - Rupture disk) được lắp trên đường dẫn CO2 vào bình chiết. Kếtthúc quá trình chiết, dịch chiết được dẫn vào bình phân tách. Tại đây quá trình táchsản phẩm ra khỏi CO2. Trạng thái từ 4 trở về trạng thái 5 là quá trình giảm áp. Khidịch chiết vào bình phân tách (5  1) để tạo các phân đoạn khác nhau thì có thể chọncác giá trị áp suất P và nhiệt độ thích hợp.

2.1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất lỏng siêu tới hạn

 Nhiệt độ và áp suất

Độ phân cực của CO2 siêu tới hạn phụ thuộc rất nhiều vào mỗi điều kiện nhiệtđộ và áp suất khác nhau. Chúng ảnh hưởng đến mật độ của CO2, khi tăng áp suất đếnđiều kiện tới hạn, CO2 đạt trạng thái gần giống chất lỏng, làm tăng diện tích tiếp xúcgiữa hoạt chất với dung mơi, dẫn đến tăng đáng kể độ hịa tan 24.

Nhiệt độ tăng sẽ làm giảm mật độ CO2 đồng thời tăng áp suất hơi của hoạtchất. Vì vậy, khi áp suất giảm gần tới điểm tới hạn, mật độ CO2 giảm đáng kể. Nếutăng nhiệt độ sẽ làm giảm độ hòa tan của hoạt chất. Trong khi ở áp suất cao hơn, mậtđộ CO2 tăng lên làm tăng khả năng hịa tan hoạt chất 24.

 Dung mơi phối hợp

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Do tính chất kém phân cực của CO2 nên khi chiết xuất các hoạt chất phân cực,các dung môi thường được phối hợp để làm tăng độ phân cực của dung môi CO2.Thông qua liên kết chủ yếu là liên kết hydro làm tăng mật độ của hỗn hợp dung mơi,tác động tích cực đến độ tan của hoạt chất. Dung môi phối hợp thường được sử dụngnhư: hexan, methanol, ethanol, isopropanol và dichloromethan,… Tuy nhiên, ethanollà dung mơi được sử dụng phổ biến vì ít độc và hỗn hòa với CO2 siêu tới hạn 24.

 Tốc độ dịng của dung mơi phối hợp

Độ phân cực của dung môi chiết xuất phụ thuộc bởi tỷ lệ phối trộn giữa 2 thànhphần: CO2 siêu tới hạn - không phân cực và dung môi phân cực hơn. Hiệu quả chiếtxuất tăng khi tốc độ dòng của dung mơi tăng, tuy nhiên đến một mức nào đó thì hiệuquả chiết khơng tăng nữa. Vì vậy, tùy vào hoạt chất khác nhau mà lựa chọn tốc độdòng cho phù hợp 24.

2.1.3.5. Ứng dụng của phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn

 Trên thế giới

Hiện nay công nghệ chiết bằng CO2 siêu tới hạn đã và đang được áp dụng phổbiến để chiết tách các hoạt chất sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm,dược phẩm, mỹ phẩm, các hoạt chất thiên nhiên,… với ưu điểm là thu được sản phẩmcó độ tinh khiết cao và dung môi tồn dư thấp. Đức là nước đầu tiên có nhà máy cơngnghiệp tách loại cafein ra khỏi nhân cà phê áp dụng công nghệ CO2 siêu tới hạn dohãng HAG.A.G xây dựng vào năm 1979 27.

Trong lĩnh vực thực phẩm, CO2 siêu tới hạn được dùng để chiết dầu từ nhiều

loại hạt giàu giá trị dinh dưỡng như hạt hạnh nhân (Prinus dulcis)28; hạt lưu ly

(Borago officinalis)29; hạt nho (Vitis vinifera)30; hạt phỉ (Corylus avellan)31;…Trong lĩnh vực mỹ phẩm, CO2 siêu tới hạn được dùng để chiết các loại tinh dầu

như các loài thuộc chi Citrus32, lavender (Lavandula angustifolia)33,…

Trong lĩnh vực dược phẩm, CO2 siêu tới hạn được dùng để chiết các hoạt chất

hay nhóm hoạt chất có tác dụng trị liệu từ dược liệu như trầm hương (Aquilariamalaccensis)34, Linh chi (Ganoderma lucidum)35…

 Ở Việt Nam

SCO2 chủ yếu được dùng để chiết xuất tinh dầu, hợp chất kém phân cực như

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

cafein, dầu cà phê, chiết xuất lycopen từ quả cà chua và dầu từ hạt vừng đen25, dầugấc26, tinh dầu tiêu, quế, trầm hương 27.

2.1.4. Một số nghiên cứu chiết xuất saponin bằng phương pháp chiết lỏngsiêu tới hạn

Chiết suất saponin từ hạt diêm mạch (Chenopodium quinoa):

Năm 2019, Yang Duan đã nghiên cứu quá trình chiết suất saponin từ hạt Diêmmạch (quinoa) ở Trung Quốc bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn 36. Nghiêncứu chỉ ra rằng các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ chiết xuất saponin của quinoa nhưsau: áp suất siêu tới hạn, thời gian chiết xuất, nhiệt độ siêu tới hạn, nồng độ ethanol.Kết quả cho thấy các thơng số q trình tối ưu là áp suất siêu tới hạn 37 Mpa, nhiệtđộ siêu tới hạn 60 oC, thời gian chiết 96 phút và nồng độ ethanol 74%. Trong điềukiện này, tỷ lệ chiết xuất saponin của diêm mạch diêm mạch là 0,96%. Việc chiếtxuất saponin từ hạt Diêm mạch bằng cơng nghệ siêu tới hạn có thể được sử dụng đểtham khảo nhằm nâng cao giá trị của quinoa và cung cấp tài liệu tham khảo kỹ thuậtđể phát triển thêm các sản phẩm mới.

Chiết suất saponin từ sâm Brazil (Panax ginseng C.A.Mey):

Năm 2014, Raphaela G.Bitencourt và cộng sự đã nghiên cứu chiết suất saponintrên 2 loài sâm Brazil là Hebanthe eriantha và Pfaffia glomerata bằng phương phápchiết lỏng siêu tới hạn 37. Trong nghiên cứu này để chiết xuất saponin tác giả sử dụngdung môi CO2 siêu tới hạn (SCO2) kết hợp với ethanol và nước. Tất cả quá trình chiếtxuất được thực hiện theo 4 khảo sát độ phân cực dung môi, ở cùng điều kiện 50 °Cvà 300 bar. Trong bước thí nghiệm đầu tiên, dung môi CO2 siêu tới hạn tinh khiếtđược sử dụng, trong khi (a) SCO2/ethanol (70:30, w/w); (b) ethanol và (c)ethanol/nước (70:30, v/v) được sử dụng làm dung môi trong ba thí nghiệm tiếp theo.Các chất chiết xuất được phân tích bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)và sức căng bề mặt. Hiệu suất chiết xuất của bốn thí nghiệm lần lượt là 0,16, 0,55,

1,00 và 6,90% đối với rễ P. Glomerata, và 0,17, 0,58, 0,89 và 28,00% đối với rễ H.Eriantha.

Chiết suất saponin từ Bồ kết (Gleditsia australis Hemsl):

Năm 2018, Xiaojuan Liu đã nghiên cứu chiết suất saponin trên bồ kết (Gleditsia

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

australis Hemsl) bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn 38. Các yếu tố quan trọngảnh hưởng đến hiệu suất chiết được nghiên cứu là áp suất chiết, nhiệt độ chiết, thờigian chiết, liều lượng dung môi và nồng độ dung môi ethanol. Kết quả nghiên cứuchỉ ra rằng, các điều kiện tối ưu để chiết xuất như sau: áp suất chiết là 35 Mpa, nhiệtđộ chiết là 45 °C, thời gian chiết là 2,5 giờ, tỷ lệ vật liệu/chất lỏng (g/mL) là 1:3,0,nồng độ ethanol là 70 %; trong điều kiện này, hiệu suất saponin chiết được là 0,975%.

Nghiên cứu khảo sát các điều kiện chiết xuất saponin từ lá Dâu tằm (Morusalba L.):

Năm 2021, Amin Hedayati Moghaddam và cộng sự đã nghiên cứu các khảo sátđiều kiện chiết xuất saponin từ dược liệu. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất saponinđã được khảo sát bao gồm: khối lượng dược liệu, phần trăm dung môi ethanol và thờigian chiết 39. Điều kiện tối ưu thu được: khối lượng dược liệu, phần trăm dung môiethanol và thời gian chiết lần lượt là 5,4 g, 77,5% và 7 giờ. Thu được hiệu suất chiếtlớn nhất là 1,12 mg saponin trên một gam dược liệu. Kết quả chỉ ra rằng thời gian vàtỷ lệ phần trăm dung môi là các thông số quan trọng.

Qua tham khảo tài liệu nhận thấy rằng, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suấtsaponin cần được quan tâm khảo sát là áp suất chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết,liều lượng dung môi và nồng độ dung môi ethanol. Theo các kết quả nghiên cứu trên,phương pháp chiết xuất lỏng siêu tới hạn cho độ chọn lọc và hiệu suất chiết saponincao hơn các phương pháp thông thường. Đồng thời, để đánh giá hiệu suất saponinchiết được các phương pháp phân tích được sử dụng là sắc ký lớp mỏng (TLC), địnhlượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và đo sức căng bề mặt.

2.2. Nội dung của đề án2.2.1. Nhiệm vụ cụ thể

-

Kiểm tra chất lượng dược liệu đầu vào cho quá trình chiết xuất.

-

Khảo sát các thơng số quy trình chiết xuất siêu tới hạn ảnh hưởng đến hàmlượng saponin trong cao chiết từ dược liệu Tam thất.

-

Tối ưu hóa quy trình chiết và nâng cấp cỡ lơ.

-

Tiêu chuẩn hóa cao chiết Tam thất thu được.

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

2.2.2. Giải pháp để thực hiện đề án

2.2.2.1. Kiểm tra chất lượng dược liệu Tam thất đầu vào

Kiểm tra chất lượng dược liệu Tam thất theo chuyên luận Tam thất (Panaxpseudoginseng) – DĐVN V, bao gồm các chỉ tiêu:

-

Tính chất cảm quan

-

Soi bột

-

Mất khối lượng làm khơ

-

Tro tồn phần

-

Tro không tan trong acid

-

Chất chiết được trong dược liệu

-

Định tính

-

Định lượng

2.2.2.2. Khảo sát các thơng số quy trình chiết xuất siêu tới hạn ảnh hưởng đếnhàm lượng saponin thu được từ dược liệu Tam thất

Các thơng số quy trình điều chế được khảo sát:

-

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết lần lượt ở các mức 35 oC, 40 oC, 45 oC,50 oC, 55 oC.

-

Khảo sát ảnh hưởng của áp suất lần lượt ở các mức 200 bar, 250 bar, 300 bar,350 bar, 400 bar, 450 bar

-

Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dung môi ethanol 96 % phối trộn lần lượt ởcác mức 0,3 ml/phút; 0,5 ml/phút; 0,8 ml/phút; 1,0 ml/phút và 1,2 ml/phút

-

Khảo sát thời gian chiết lần lượt trong 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ, 7 giờ và 8 giờ bằng

phương pháp sắc ký lớp mỏng.

-

Đánh giá kết quả khảo sát: bằng phương pháp định lượng hợp chất saponinnotoginsenosid-R1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid- Rg1 trong cao thu được bẳngphương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

2.2.2.3. Nâng cấp cỡ lô chiết xuất

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

-

Lựa chọn điều kiện chiết cho hàm lượng các saponin notoginsenosid-R1,ginsenosid-Rb1, ginsenosid- Rg1 lớn nhất và khối lượng cắn nhiều nhất. Từđó đưa ra quy trình hồn chỉnh.

-

Tiến hành chiết xuất trên quy mô 200 g dược liệu. Với điều kiện đã được khảosát ở mục 2.2.2.2

-

Đánh giá kết quả khảo sát: định lượng hợp chất saponin notoginsenosid-R1,ginsenosid-Rb1, ginsenosid- Rg1 trong cao thu được bẳng phương pháp sắcký lỏng hiệu năng cao.

2.2.2.4. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của cao chiết Tam thất

Đánh giá chất lượng 3 lô cao Tam thất ở quy mơ phịng thí nghiệm dựa trêntham khảo các yêu cầu chất lượng của cao thuốc được quy định trong DĐVN V. Thựchiện kiểm tra chất lượng 3 lô cao chiết Tam thất theo các chỉ tiêu sau:

-

Đánh giá cảm quan

-

Mất khối lượng làm khơ

-

Tro tồn phần

-

Định tính

-

Định lượng

-

Giới hạn nhiễm khuẩn

-

Tổng hợp các chỉ tiêu chất lượng của cao chiết

2.3. Tổ chức thực hiện đề án

2.3.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Danh sách các hóa chất, dung mơi được sử dụng trong quá trình nghiên cứuđược trình bày ở bảng 2.3.

Bảng 2.3. Bảng các chất đối chiếu và một số hóa chất

Chất đối chiếu Ginsenosid-Rb1 93,71% (C54H92O23)Ginsenosid-Rg1 99,41% (C42H72O14),Notoginsenosid R1 99,90% (C47H18O18)

Trung tâm khoa học cơngnghệ Dược Sài Gịn

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Hóa chất Ethanol tuyệt đối VWR, Pháp

Merck, ĐứcMerck, Đức

2.3.2. Thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

Danh sách các thiết bị, máy móc sử dụng trong q trình nghiên cứu chiếtxuất, kiểm nghiệm được trình bày ở bảng 2.4.

Bảng 2.4. Danh mục trang thiết bị

QuốcKính hiển vi quang học Eclipse 80i

Lị nung NaberthermTủ sấy đối lưu tự nhiên

Nikon Eclipse 80i, Nhật BảnNabertherm, Đức

JSR, Hàn QuốcMáy chiết xuất siêu tới hạn Model: 7071

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò PDA

Applied separations, MỹWater, Mỹ

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SPD-M20A đầu dị PDA

UFLC-UFLC-SHIMADZU, Nhật Bản

Các thiết bị phân tích được đặt tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ ChíMinh (200 Cơ Bắc, phường Cơ Giang, quận 1, TP. Hồ Chí Minh) đã được hiệuchuẩn theo quy định. Các dụng cụ đều đạt tiêu chuẩn phòng kiểm nghiệm. Danhsách các dụng cụ được trình bày ở bảng 2.5.

Bảng 2.5. Danh mục dụng cụ

- Pipet chính xác - Cốc có mỏ (becher)- Pipet khác vạch - Bình nón (erlen)

2.3.3. Kiểm nghiệm dược liệu Tam thất làm nguyên liệu cho chiết xuất

Kiểm tra chất lượng dược liệu Tam thất theo chuyên luận Tam thất (Panaxpseudoginseng) – DĐVN V, bao gồm các chỉ tiêu:

 Tính chất cảm quan

Bột khơ màu vàng nhạt, mùi thơm.

u cầu: Hình thái của dược liệu phải đúng với mơ tả theo DĐVN V.

 Soi bột

Dược liệu được xay nhỏ bằng cối xay, rây qua rây 355 µm, thu lấy phần bộtdưới rây để lên lam kính, nhỏ 1 giọt nước cất lên lam. Quan sát bột dưới kinh hiển viở các vật kính 10x, 40x. Ghi nhận lại các đặc điểm vi học quan sát được và chụp hình.

u cầu: Bột dược liệu phải có cảm quan và có các cấu tử như mơ tả trong DĐVN V

 Mất khối lượng do làm khô

Thực hiện theo Phụ lục 9.6. Xác định mất khối lượng do làm khô – DĐVN V.Tiến hành trong bình hút ẩm, thực hiên cân chính xác khoảng 1,0 g bột Tam thấtcho vào chén sứ. Đặt chén sứ vào tủ sấy ở nhiệt độ 105 oC trong 5 giờ. Sau đó mỗigiờ đem ra cân một lần. Đọc kết quả 3 lần cân liên tiếp mà số cân lệch nhau không

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

quá 5 mg thì ghi nhận kết quả và tính tốn lượng khối lượng mất do sấy. Thực hiệnlặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình.

Ghi chú: Mỗi lần lấy chén sứ ra khỏi tủ sấy thì đặt vào bình hút ẩm ổn địnhtrong 5 phút rồi cân. Theo quy định của DĐVN V thì số đo giữa 2 lần liên tiếp khơnglệch q 5 mg.

Phương pháp tính tốn: Hàm lượng ẩm được tính theo cơng thứcH%= 𝑏−𝑎

𝑃 × 100Trong đó H: độ ẩm (%)

a: khối lượng cốc để mẫu sau sấyb: khối lượng cốc để mẫu trước sấyP: khối lượng bột

Yêu cầu: độ ẩm khơng q 14,0%.

 Tro tồn phần

Thực hiện theo Phương pháp 1 Phụ lục 9.8. Xác định tro toàn phần – DĐVN V.Tiến hành nung chén sứ đến khối lượng không đổi. Cân vào chén sứ 1,0 g bộtTam thất.

Đốt trên bếp điện đến khi cao không cịn khói, sấy ở nhiệt độ 105oC trong 1 giờ.Tiếp tục cho mẫu vào lò nung ở nhiệt độ 450 oC trong 8 giờ. Để nguội trong bình hútẩm và tiến hành cân khối lượng.

Đặt chén đựng tro vào lò nung và tiếp tục nung trong khoảng 1 giờ. Lặp lại cácbước cho đến khi độ chênh lệch khối lượng giữa 2 lần cân khơng q 5 mg. Tiến hànhthí nghiệm 3 lần và lấy giá trị trung bình.

Phương pháp tính tốn: Tro tồn phần được tính theo cơng thứcX%= 𝑏−𝑎

𝑃 × 100Trong đó: X: tro tồn phần (%)

a: khối lượng bìb: khối lượng troP: khối lượng bột

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

u cầu: hàm lượng tro tồn phần khơng quá 6,0%.

 Tro không tan trong acid

Thực hiện theo Phụ lục 9.7. Xác định tro không tan trong acid, phương pháp 1– DĐVN V. Lượng mẫu thử: 2,0g.

Tiến hành cho 25 ml dung dịch acid hydrochloric 2M (TT) vào tro tồn phần,đun sơi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan vào một giấy lọc không tro, rữabằng nước nóng sau đó nung ở 500 oC đến khối lượng khơng đổi. Tính tỉ lệ phần trămcủa tro không tan trong acid so với dược liệu đã làm khơ trong khơng khí. Thực hiệnlặp lại 3 lần và tính kết quả trung bình.

Phương pháp tính tốn: Tro khơng tan trong acid được tính theo cơng thứcX%= 𝑏−𝑎

u cầu: hàm lượng tro không tan trong acid không quá 3%.

 Chất chiết được trong dược liệu

Thực hiện theo Phụ lục 12.10. Xác định các chất chiết được trong dược liệu –

DĐVN V. Dùng methanol (TT) làm dung môi, tiến hành theo phương pháp chiết

nóng. Lượng mẫu thử: 2,0 g bột dược liệu nửa thô.

Tiến hành áp dụng phương pháp chiết nóng. Cân chính xác khoảng 2,0 g bộtdược liệu cho vào bình nón nút mài 100 ml. Thêm chính xác 50 ml methanol (TT),đậy kín, cân xác định khối lượng để yên 1 giờ, sau đó đun hồi lưu 1 giờ và để nguội,đậy kín và cân xác định lại khối lượng, dung methanol để bổ sung khối lượng bị giảm.Lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khơ thích hợp.

Tiếp tục lấy chính xác 25 ml dịch lọc vào cốc đã cân bì trước, cô cánh thủy đếncắn khô, và sấy căn ở 105 oC trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút,cân xác định khối lượng cắn. Tính phân trăm lượng chất chiết được bằng methanoltheo dược liệu khơ. Thực hiện lặp lại 3 lần và tính kết quả trung bình.

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

Phương pháp tính tốn: hiệu suất chất chiết được được tính theo cơng thức:X%= 𝑏

𝑃 (1−𝑎)× 100

Trong đó X: hiệu suất chất chiết được (%)a: độ ẩm bột dược liệu

b: khối lượng cắnP: khối lượng bột

Yêu cầu: chất chiết được không ít hơn 16% tính theo dược liệu khô kiệt.

B. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4 – DĐVN V).

Bản mỏng: pha thường silica gel.

Dung môi khai triển: lắc đều hỗn hợp cloroform – ethyl acetat – methanol –

nước (15:40:22:10), gạn lấy lớp dưới.

Dung dịch thử: Cân 1,0 g bột dược liệu, trộn đều với 10 ml nước, thêm 10 ml

n-butanol đã bão hòa nước (TT) vào hồn hợp trên, lắc trong 10 phút, để yên trong 2giờ. Lọc lấy địch chiết butanol cho vào bình gạn. Thêm vào bình gạn 30 ml nước đãbão hòa butanol (TT), lắc kỹ, để yên cho tách lớp (ly tâm nếu cần). Gạn lấy lớpbutanol, cô trên cách thủy đến cạn. Hòa tan cắn trong 1 ml methanol (TT)

Dung dịch dược liệu đối chiếu: Cân 1,0 g bột Tam thất (mẫu chuẩn), tiến hành

chiết như mô tả ở phần dung dịch thử.

Dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và

notoginsenosid R1 chuẩn trong methanol (TT) để được dung địch chuẩn hỗn hợp cónồng độ mỗi chuẩn khoảng 0,5 mg/ml.

Cách tiến hành:

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 μl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đếnkhi dung môi đi được khoảng 12 cm, lấy bản mỏng ra, đổ khô ở nhiệt độ phòng, phundung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy ở 105 oC cho đến khi xuất hiệnrõ vết. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường hoặc dưới đèn tử ngoại ờ bước sóng366 nm.

Trên sác ký đồ của dung dịch thừ phải có các vết cùng màu sắc và giá trị Rf vớicác vết trên sắc ký đồ của dung dịch dược liệu đổi chiếu và có các vết cùng màu vàgiá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu.

 Định lượng

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Phụ lục 5.3 – DĐVN V).

Chuẩn bị mẫu:

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,6 g bột dược liệu (qua rây số 355) vào

bình nón có nút mài. Thêm chính xác 50 ml methanol (TT), đậy nút, cân. Tiến hànhđun hồi lưu trên cách thủy ở 80 oC trong 2 giờ, để nguội, cân lại và bổ sung methanol(TT) để được khối lượng ban đầu. Trộn đều và lọc qua màng lọc 0,45 μm.

Dung dịch chuẩn: Hòa tan ginsenosid Rg1 chuẩn, ginsenosid Rb1 chuẩn và

notoeinsenosid R1 chuẩn trong methanol (TT) để được dung dịch có nồng độ tươngứng chính xác khoảng 0,1-0,5 mg/ml.

Pha động A(% v/v)

Pha động B(% v/v)

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

Cách tiến hành:

Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Thứ tự rừa giải:Notoginsenosid R1; ginsenosid Rg1; ginsenosid Rb1. Kiểm tra tính phù hợp cùa hệthống: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, tính số đĩa lý thuyết của cột. Số đĩa lýthuyết của cột không được nhỏ hơn 4000 tính theo pic của notoginsenosid R1. Độlệch chuẩn tương đối của diện tích pic ginsenosid Rb1 trong 6 lần tiêm lặp lại khôngđược lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, dung dịch thử. Tính hàmlượng ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và notoginsenosid R1 trong dược liệu dựa vàodiện tích pic ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và notoginsenosid R1 trên sắc ký đồcủa dung dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lượng C42H72O14 trong ginsenosid Rg1,chuẩn, hàm lượng C54H92O23 trong ginsenosid Rb1 chuẩn và hàm lượng C47H80O18trong notoginsenosid R1 chuẩn.

Dược liệu phải chứa không ít hơn 0,4 % notoginsenosid R1 (C47H80O18) vàkhơng ít hơn 5,0% tổng hàm lượng ginsenosid Rg1 (C42H72O14), ginsenosid Rb1(C54H92O23) và notoginsenosid R1 (C47H80O18), tính theo dược liệu khơ kiệt.

2.3.4. Khảo sát các thơng số quy trình chiết xuất siêu tới hạn ảnh hưởngđến hàm lượng saponin thu được từ dược liệu Tam thất

Tiến hành thực nghiệm để xây dựng quy trình chiết xuất cao saponin bằngphương pháp chiết lỏng siêu tới hạn. Quy trình chiết xuất tổng quát được trình bàynhư hình 2.9.

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

Hình 2.9. Lưu đồ điều chế cao Tam thất

Mơ tả quy trình: CO2 ở trạng thái lỏng từ trong bình chứa được dẫn qua thiết bịtruyền nhiệt làm lạnh xuống khoảng nhiệt độ -5 oC để tăng tỷ trọng dịng dung mơiCO2 lỏng trước khi vào máy. Nạp mẫu vào bình chiết và cố định mẫu trong buồngchiết. Trên thiết bị chiết lỏng siêu tới hạn, mở van cho dòng CO2 vào bình chiết, tiếnhành gia nhiệt đến nhiệt độ chiết. Khi đạt được nhiệt độ mong muốn, tăng áp suất đểchuyển CO2 thành trạng thái siêu tới hạn. Ngâm dược liệu trong bình chiết trong vịng30 phút để CO2 cho ngấm đều. Mở van hứng bỏ 20 phút dịch chiết đầu tiên để loạicác thành phần diệp lục, sau đó hứng mẫu trong suốt thời gian chiết.

Các thơng số quy trình điều chế được khảo sát:

Cao dược liệu được sử dụng để bào chế chế phẩm thuốc dùng cho người, do đódung mơi chiết xuất được sử dụng là ethanol hay hỗn hợp ethanol và nước nhằm hạnchế độc tính của dung môi, đồng thời ethanol thân thiện với môi trường hơn các dungmôi khác. Qua một số nghiên cứu 36-38 cho thấy ethanol cao độ thích hợp hơn ethanolthấp độ vì hàm lượng nước ít hơn, tránh hiện tượng đóng băng, cô đặc và làm khôdịch chiết dễ dàng hơn. Việc sử dụng ethanol 96% tuy không kinh tế bằng các nồngđộ ethanol thấp hơn, tuy nhiên ethanol 96% rất dễ thu hồi, hàm lượng saponin toànphần cao hơn so với chiết bằng ethanol nồng độ thấp. Do đó, dung mơi ethanol 96%được lựa chọn để khảo sát q trình chiết xuất.

</div>

xây dựng quy trình chiết xuất nhóm hoạt chất saponin từ dược liệu tam thất panax pseudoginseng bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

<b>ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH</b>

<b>NGUYỄN HỒNG VINH</b>

<b>XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT NHĨM HOẠT</b>

<i><b>CHẤT SAPONIN TỪ DƯỢC LIỆU TAM THẤT (Panaxpseudoginseng) BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LỎNG SIÊU</b></i>

<b>TỚI HẠN</b>

<b>ĐỀ ÁN THẠC SĨ ỨNG DỤNG DƯỢC HỌC</b>

<b>TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023</b>

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO <b> BỘ Y TẾ</b>

<b>ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH</b>

<b>NGUYỄN HỒNG VINH</b>

<b>XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT NHĨM HOẠT</b>

<i><b>CHẤT SAPONIN TỪ DƯỢC LIỆU TAM THẤT (Panaxpseudoginseng) BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LỎNG SIÊU</b></i>

<b>LỜI CAM ĐOAN</b>

<b>Tác giả đề án</b>

<b>Nguyễn Hoàng Vinh</b>

<b>CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU</b>







<b>CHƯƠNG II. NỘI DUNG</b>

<b>2.1. Cơ sở xây dựng đề án</b>

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

<b>2.3. Tổ chức thực hiện đề án</b>

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về