(Luận án tiến sĩ) Nghiên Cứu Một Số Đa Hình Đơn Gen Pdcd1 Và Cd274 Ở Bệnh Nhân Nhiễm Virus Viêm Gan B Mạn Tính

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.44 MB, 186 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

ị GIO DC V O TắO Bị Y T TRõNG ắI HâC Y HÀ NÞI

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

Þ GIÁO DC V O TắO Bị Y T TRõNG ắI HõC Y H NịI

========

PHắM THà MINH HUYÂN

Chuyên ngành : Hóa sinh y hãc Mó sỗ : 9720101

LUÀN ÁN TIÀN SĨ Y HâC

NG¯äI H¯âNG DÀN KHOA HâC:

1. PGS.TS. Đ¿ng Thá Ngãc Dung 2.TS. Nghiêm Xn Hồn

HÀ NÞI - 2022

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

Trong suỗt quỏ trỡnh thc hiẫn tài này tôi đã nhận đ°āc rất nhiÃu sự giúp đÿ cąa lãnh đ¿o các c¢ quan, thầy cơ, đéng nghiÉp, các bÉnh nhân và gia đình thân yêu cąa mình.

Tr°ãc hÁt tơi xin bày tå lịng biÁt ¢n sâu sắc tãi PGS.TS. Đ¿ng Thá Ngãc Dung- Bá mơn Hóa sinh tr°ång Đ¿i hãc Y Hà Nái và TS. Nghiêm Xn Hồn- Phó chą nhiÉm khoa Sinh hãc phân tā, BÉnh viÉn TWQĐ 108, là nhăng ng°åi thầy đã trực tiÁp h°ãng dÁn tơi thực hiÉn nghiên cću, đã tận tình giỳp , ỏng viờn tụi trong suỗt quỏ trỡnh thc hiÉn đÃ tài, góp ý và sāa chăa luận án.

Tơi xin bày tå lịng biÁt ¢n chân thành đÁn q thầy cơ, đéng nghiÉp, nhăng ng°åi đã t¿o mãi điÃu kiÉn, giúp đÿ tôi trong quá trình thực hiÉn luận án này:

Ban giám hiÉu, Phòng Đào t¿o Sau Đ¿i Hãc- tr°ång Đ¿i hãc Y Hà Nái. Tồn thÅ q thầy cơ, cán bá trong Bá mơn Hóa Sinh- tr°ång Đ¿i hãc Y Hà Nỏi.

Ban giỏm ỗc bẫnh viẫn TWQ 108.

Ton th quý thầy cô, cán bá, sinh viên cąa Trung tâm nghiên cću y hãc ViÉt Đćc- BÉnh viÉn TWQĐ 108.

Toàn thÅ các bác sỹ, d°āc sỹ, kỹ s°, kỹ thuật viên cąa Trung tâm xét nghiÉm- BÉnh viÉn TWQĐ 108.

Tơi xin đ°āc gāi låi cảm ¢n tãi các bÉnh nhân và gia đình cąa hã đã giúp tụi cú c sỗ liẫu trong lun ỏn ny.

Tụi xin gāi låi cảm ¢n chân thành tãi quỹ Phát trin khoa hóc v cụng nghẫ quỗc gia (Nafosted) đã hß trā kinh phí cho nghiên cću này. KÁt quả nghiên cću là mát phần kÁt quả trong đÃ tài: <Nghiên cću vai trò các phân tā ćc chÁ điÅm kiÅm soát tín hiÉu miÇn dách cąa con ồng PD-1/PD-L1 v IDO/TDO-Kyn-AhR ỗi vói hu qu lõm sng ỗ bẫnh nhõn nhiầm vi rút viêm gan B m¿n tính=.

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

cću. Tơi xin gāi låi cảm ¢n chân thành tãi ThS Đào Ph°¢ng Giang- Trung tâm t° vấn di truyÃn và sàng lãc ung th°- BÉnh viÉn TWQĐ 108, BSNT Bùi Đình Tùng, BSNT Ngã Thá Un- Bá mơn Hóa Sinh tr°ång Đ¿i hãc Y Hà Nái, CN Bùi Thùy Linh đã nhiÉt tình giúp đÿ tơi trong q trình thc hiẫn ti.

Cuỗi cựng tụi xin ghi nhó cụng Ân sinh thnh, nuụi dng, dy dò, tỡnh yờu thÂng ca bỗ m hai bờn cựng s ng hỏ, đáng viên cąa chéng tôi và cąa hai con và các anh chá em trong gia đình, nhăng ng°åi đã luụn ỗ bờn, l chò da vng chc tụi yên tâm hãc tập và hoàn thành luận án.

Ph¿m Thá Minh HuyÃn

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Tôi là Ph¿m Thá Minh HuyÃn, nghiên cću sinh khóa 38 Tr°ång Đ¿i hãc Y Hà Nái, chuyên ngành Hóa sinh Y hãc, xin cam đoan:

1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiÁp thực hiÉn d°ãi sự h°ãng dÁn cąa cô PGS.TS. Đ¿ng Thá Ngãc Dung và thầy TS. Nghiêm Xuân Hoàn.

2. Cơng trình này khơng trùng l¿p vãi bất kỳ nghiên cću nào khác đã c cụng bỗ ti Viẫt Nam.

3. Cỏc sỗ liẫu v thụng tin trong nghiên cću là hoàn tồn chính xác, trung thực và khách quan, đã đ°āc xác nhận và chấp thuận cąa cÂ sỗ nÂi nghiờn cu.

Tụi xin hoàn toàn cháu trách nhiÉm tr°ãc pháp luật vÃ nhăng cam kÁt này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Ng°åi viÁt cam đoan

Ph¿m Thá Minh HuyÃn

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

ĂC LĂC

Đ¾T VÂN ĐÂ ... 1

CH¯¡NG 1: TọNG QUAN TI LIẩU... 3

1.1. ắI CĂNG V NHIặM VIRUS VIÊM GAN B ... 3

1.1.1. Virus viêm gan B ... 4

1.1.2. Sinh lý bÉnh trong nhiÇm virus viêm gan B ... 5

1.1.3. Đáp ćng miÇn dách trong nhiÇm virus viêm gan B ... 7

1.1.4. Ch¿n đốn và điÃu trá nhiÇm virus viêm gan B ... 14

1.2. CON Đ¯äNG TÍN HIÈU PD-1/PD-L1 ... 17

1.2.1. Tín hiÉu thơng qua con đ°ång PD-1/ PD-L1 ... 18

1.2.2. Vai trị cąa con đ°ång PD-1/PD-L1 trong nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính ... 19

1.2.3. Vai trò cąa con đ°ång PD-1/PD-L1 trong ung th° gan ... 22

1.2.4. Ćng dăng con đ°ång PD-1/ PD-L1 trong điÃu trá hiÉn nay ... 23

1.3. ĐA HÌNH Đ¡N NUCLEOTID CĄA GEN PDCD1, CD274 VÀ BIÄU HIÈN PROTEIN HUYÀT T¯¡NG CĄA GEN PD-1, PD-L1 ... 25

1.3.1. Khái niÉm vÃ đa hình đ¢n nucleotid ... 25

1.3.2. Đa hình đ¢n nucleotid cąa gen PDCD1 ... 28

1.3.3. Đa hình đ¢n nucleotid cąa gen CD274 ... 31

1.3.4. Protein sPD-1, sPD-L1 ... 33

CH¯¡NG 2: ĐàI T¯ĀNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU... 36

2.1. ĐæI T¯ĀNG NGHIÊN CĆU ... 36

2.1.1. Nhóm ng°åi khåe m¿nh ... 36

2.1.2. BÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính ... 36

2.1.3. Cÿ mÁu nghiên cću ... 40

2.2. PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU... 42

2.2.1. ThiÁt kÁ nghiên cću và s¢ đé nghiên cću ... 42

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

2.2.3. Trang thiÁt bá, dăng că, hóa chất nghiên cću... 46

2.2.4. Kỹ thuật phân tích đa hình đ¢n nucleotid gen PDCD1 và CD274 ... 48

2.2.5. Kỹ thuật đánh l°āng protein sPD-1 và sPD-L1 ... 52

2.3. XĀ LÝ VÀ PHÂN TÍCH Sỉ LIÈU ... 52

2.4. Đ¾O ĐĆC NGHIÊN CĆU ... 53

2.5. THäI GIAN VÀ ĐàA ĐIÄM NGHIÊN CĆU ... 53

2.6. CÁC BIÈN PHÁP KHæNG CHÀ SAI Sæ TRONG NGHIÊN CĆU ... 54

CH¯¡NG 3: KÀT QUÀ NGHIÊN CĆU ... 55

3.1. Đ¾C ĐIÄM CHUNG CĄA ĐæI T¯ĀNG NGHIÊN CĆU ... 55

3.1.1. Đ¿c điÅm phân bỗ v tui ca ỗi tng nghiờn cu ... 55

3.1.2. c im v giói ca ỗi tng nghiờn cu ... 56

3.1.3. c im cn lõm sng ỗ nhúm bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n ... 56

3.2. PHÂN Bỉ KIÄU GEN VÀ ALEN CĄA CÁC BIÀN THÄ PD-1.1, PD-1.5, PD-1.9 VÀ rs2297136, rs4143815 ỉ CÁC NHĨM NGHIÊN CĆU ... 57

3.3. PHÂN Bỉ HAPLOTYPE ỉ CÁC NHĨM NGHIÊN CĆU ... 73

3.3.1. Phõn bỗ haplotype ca 2 SNP trờn exon 5 ca gen PD-1 ỗ cỏc nhúm nghiờn cu ... 73

3.3.2. Phõn bỗ haplotype ca gen PD-1 ỗ cỏc nhúm nghiờn cu ... 75

3.3.3. Phõn bỗ haplotype ca gen PD-L1 ỗ cỏc nhúm nghiờn cu ... 78

3.4. NèNG Đà PROTEIN sPD-1 và sPD-L1 ... 79

3.4.1. Néng đá protein sPD-1 ... 79

3.4.2. Néng đá protein sPD-L1 ... 81

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

3.5. MæI LIÊN QUAN GIĂA KIÄU GEN VÀ NèNG Đà sPD-1, sPD-L1 ... 85

3.5.1. Mỗi liờn quan gia kiu gen PD-1 v nộng ỏ protein sPD-1 ... 85

3.5.2. Mỗi liờn quan giăa kiÅu gen PD-L1 vãi néng đá protein sPD-L1 .... 86

CH¯¡NG 4: BÀN LUÀN ... 87

4.1. PHÂN Bæ KIÄU GEN VÀ ALEN CĄA MàT Sỉ ĐA HÌNH Đ¡N

GEN PDCD1 VÀ CD274 ỉ BÈNH NHÂN NHIỈM VIRUS VIÊM GAN B M¾N TÍNH VÀ NG¯äI KHäE M¾NH ... 92 4.2. MỉI LIÊN QUAN GIĂA MàT Sỉ ĐA HÌNH Đ¡N GEN PDCD1,

VâI MàT Sæ THÄ BÈNH LÂM SÀNG æ BẩNH NHN NHIặM VIRUS VIấM GAN B MắN TNH ... 96

KÀT LUÀN ... 118 H¯àNG NGHIÊN CĆU TIÀP THEO ... 120 DANH MĂC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CĆU

ĐÃ CÔNG Bà LIÊN QUAN ĐÀN LUÀN ÁN TÀI LIÈU THAM KHÀO

PHĂ LĂC

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

Tĉ viÁt tÃt TiÁng Anh TiÁng ViÉt

a.a Amino acid Acid amin

AHB Acute hepatitis B virus Viêm gan virus B cấp ALT Alanine transaminase

APC Antigen presenting cell TÁ bào trình diÉn kháng nguyên AST Aspartate transaminase

cccDNA Covalently closed circular

DNA

DNA d¿ng vòng DC Dendritic cell TÁ bào gai

HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan B

HCC Hepatocellular cancer Ung th° biÅu mô tÁ bào gan HCV Hepatitis C virus Virus viêm gan C

INR International normalized ratio

ITIM Immunoreceptor

tyrosine-based inhibitory motif

Motif ćc chÁ phă thuác thă thÅ tyrosine

ITSM Immunoreceptor

tyrosine-based switch motif

Motif chuyÅn phă thuác thă thÅ tyrosine

LC Liver cirrhosis X¢ gan LCMV Lymphocytic chriomeningitis

virus

Virus gây viêm màng não lympho

MHC Major Histocompatibility Complex

Phćc hāp hịa hāp mơ chą u mPD-1 membrane PD-1 Protein PD-1 d¿ng gắn màng mPD-L1 membrane PD-L1 Protein PD-L1 d¿ng gắn màng NA Nucleos(t)ide analogue Ho¿t chất t°¢ng tự Nuclos(t)ide

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

NK Natural killer cell TÁ bào giÁt tự nhiên NKT Natural killer T cell TÁ bào T giÁt tự nhiên SNP Single nucleotide

polymorphism

Đa hình đ¢n nucleotid sPD-1 Soluble PD-1 Protein PD-1 d¿ng hòa tan sPD-L1 Soluble PD-L1 Protein PD-L1 d¿ng hòa tan

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

Bảng 2.1. Đánh giá chćc năng gan theo Child - Pugh ... 44

Bảng 2.2. Phân chia giai đo¿n HCC theo BCLC ... 44

Bảng 2.3. Trình tự méi cąa phản ćng PCR ... 47

Bảng 3.1. Phõn bỗ v tui ỗ cỏc nhúm nghiờn cu ... 55

Bng 3.2. Phõn bỗ giói tớnh ca cỏc nhúm nghiờn cu ... 56

Bng 3.3. c im cn lõm sng ỗ nhóm bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n ... 56

Bảng 3.4. Đa hỡnh PD-1.1 ỗ nhúm bẫnh nhõn nhiầm virus viờm gan B m¿n tính và ng°åi khåe m¿nh ... 59

Bảng 3.5. a hỡnh PD-1.1 ỗ cỏc nhúm bẫnh nhõn nhiầm virus viêm gan B m¿n ... 60

Bảng 3.6. Đa hình PD-1.5 ç nhóm bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n và ng°åi khåe mnh ... 62

Bng 3.7. a hỡnh PD-1.5 ỗ cỏc nhúm bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n .... 63

Bảng 3.8. a hỡnh PD-1.9 ỗ nhúm bẫnh nhõn nhiầm virus viêm gan B m¿n tính và ng°åi khåe m¿n ... 65

Bng 3.9. a hỡnh PD-1.9 ỗ cỏc nhúm bẫnh nhõn nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính... 66

Bảng 3.10. Đa hỡnh rs2297136 ỗ nhúm bẫnh nhõn v ngồi khồe mnh ... 68

Bng 3.11. a hỡnh rs2297136 ỗ cỏc nhúm bẫnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n ... 69

Bảng 3.12. a hỡnh rs4143815 ỗ nhúm bẫnh nhõn v ngồi khồe mnh ... 71

Bng 3.13. a hỡnh rs4143815 ỗ cỏc nhúm bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n ... 72

Bảng 3.14. Phõn bỗ haplotype ỗ nhúm bẫnh nhõn nhiầm HBV mn v nhúm ngồi khồe mnh... 73

Bng 3.15. Mỗi liờn quan giăa các haplotype PD-1.5/1.9 vãi các thÅ bÉnh cąa bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n tính ... 74

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

HBV mn ... 75Bng 3.17. Phõn bỗ cỏc haplotype in hỡnh ỗ cỏc nhúm bẫnh nhõn nhiầm

virus viờm gan B mn tớnh ... 76Bng 3.18. Mỗi liờn quan haplotype PD-1.1, PD1.5 v PD-1.9 vói cỏc th

bẫnh ỗ bẫnh nhõn nhiầm HBV mn ... 77Bng 3.19. Phõn bỗ haplotype gen PD-L1 ỗ nhúm ngồi khồe mnh v nhúm

bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n ... 78

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Hình 1.1. Cấu trúc phân tā cąa virus viêm gan B ... 5

Hình 1.2. Các pha cąa nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính. ... 6

Hỡnh 1.3. Tin trin lõm sng ỗ bẫnh nhõn nhiÇm virus viêm gan B. ... 7

Hình 1.4. Đáp ćng miÇn dách trong nhiÇm virus viêm gan B ... 11

Hỡnh 1.5. Thuỗc iu trỏ nhiầm HBV mn tính đã đ°āc chấp nhận. ... 16

Hình 1.6. Tín hiÉu PD-1 ćc chÁ sự ho¿t hóa cąa tÁ bào lympho T. ... 19

Hình 3.4. Hình ảnh đ¿i diÉn giải trình tự gen xác đánh tính đa hình PD-1.5 ... 61

Hình 3.5. Hình ảnh đ¿i diÉn giải trình tự gen xác đánh tính đa hình PD-1.9 ... 64

Hình 3.6. Hình ảnh điÉn di sản ph¿m PCR đ¿i diÉn xác đánh kiÅu gen rs2297136 .... 67

Hình 3.7. Hình ảnh đ¿i diÉn giải trình gen xác đánh tính đa hình rs2297136 ... 67

Hình 3.8. Hình ảnh điÉn di sản ph¿m PCR đ¿i diÉn xác đánh kiÅu gen rs4143815 ... 70

Hình 3.9. Hình ảnh đ¿i diÉn giải trình tự gen xác đánh tính đa hình rs4143815.... 70

Hình 3.10. Nộng ỏ sPD-1 ỗ nhúm bẫnh nhõn v nhúm ng°åi khåe m¿nh, trong nhóm nhiÇm HBV m¿n tính ... 79

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

nhân nhiÇm HBV m¿n tớnh ... 80 Hỡnh 3.12. Nộng ỏ protein sPD-1 ỗ các nhóm APRI và Fib-4 ... 81

Hình 3.13. Néng đá protein sPD-L1 giăa các nhóm nghiên cću ... 81

Hỡnh 3.14. Nộng ỏ protein sPD-L1 ỗ cỏc nhúm AST, ALT, Bilirubin toàn

phần, Bilirubin trực tiÁp, tiÅu cầu, prothrombin ... 82 Hỡnh 3.15. Nộng ỏ sPD-L1 ỗ cỏc nhúm theo phõn loi Child-Pugh v ... 83

Hỡnh 3.16. Mỗi t°¢ng quan giăa néng đá sPD-1 và sPD-L1 ... 84 Hỡnh 3.17. Mỗi liờn quan gia a hỡnh PD-1.1, PD-1.5, PD-1.9 vãi néng đá

protein sPD-1. ... 85

Hình 3.18. Mỗi liờn quan gia a hỡnh gen rs2297136 v rs4143815 vãi néng

đá protein sPD-L1. ... 86

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Đ¾T VÂN ĐÂ

Virus viêm gan B (HBV) là mát trong nhăng tác nhân gây bÉnh phổ biÁn nhất trên tồn cầu. Theo °ãc tính cąa tổ chćc y t th giói cú khong 3,5% dõn sỗ ton cầu nhiÇm virus viêm gan B.1 ViÉt Nam là mát trong nhăng n°ãc có tỷ lÉ nhiÇm virus viêm gan B cao nht th giói vói khong 10% dõn sỗ bá nhiÇm HBV dÁn đÁn tỷ lÉ tā vong cao do các biÁn chćng cąa bÉnh nh° suy gan cấp trên nÃn viêm gan m¿n tính, x¢ gan (XG) và ung th° biÅu mô tÁ bào gan (HCC).2, 3

Trong cÂ ch bẫnh sinh ca nhiầm HBV, ỏp ng miÇn dách tÁ bào đóng vai trị quan trãng nhất thông qua ho¿t đáng cąa tÁ bào lympho T. TÁ bào lympho T đóng vai trò nÃn tảng trong viÉc lo¿i bå virus.4-8 Sự suy giảm chćc năng miÇn dách cąa tÁ bào lympho T là c¢ chÁ chính dÁn đÁn sự tén t¿i dai dẳng cąa HBV trong c¢ thÅ và sự phát triÅn x¢ gan, ung th° gan sau thåi gian dài nhiÇm HBV. Sự suy giảm chćc năng miÇn dách tÁ bo lympho T gõy ra bỗi s biu hiẫn quỏ mćc cąa các phân tā ćc chÁ điÅm kiÅm soát tín hiÉu miÇn dách nh°: PD-1/PD-L1, 2B4, TIM-3, CTLA-4&9-11 Trong đó, con đ°ång tín hiÉu PD-1/PD-L1 (programmed cell death-1/ programmed cell death ligand-1) đ°āc cho là có vai trị quan trãng trong c¢ chÁ dÁn đÁn sự suy giảm chćc năng tÁ bào T trong nhiÇm HBV m¿n tính.12, 13

PD-1 là mát receptor ćc chÁ miÇn dách đ°āc biÅu hiÉn trên bÃ m¿t nhiÃu lo¿i tÁ bào miÇn dách và mỏt sỗ t bo ung th.14 Phỗi t PD-L1 ca nó là các protein xuyên màng. Khi PD-1 gắn vãi PD-L1 s¿ t¿o ra tín hiÉu ćc chÁ sự ho¿t hóa tÁ bào lympho T bằng nhiÃu q trình và tín hiÉu sinh hãc nái bo khỏc nhau.14 Gn õy, mỏt sỗ nghiờn cu ó chćng minh rằng ngoài d¿ng gắn màng, protein PD-1 và PD-L1 cịn có d¿ng hịa tan (sPD-1, sPD-L1) cũng có ho¿t tính sinh hãc.15, 16 Néng đá sPD-1, sPD-L1 có liên quan vãi mćc đá n¿ng và tiên l°āng trong nhiÃu lo¿i ung th°. 16,17

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Sự ho¿t hóa ćc chÁ miÇn dách cąa con đ°ång tín hiÉu PD-1/PD-L1 dÁn tãi sự suy giảm chćc năng miÇn dách tÁ bào lympho T là c¢ chÁ chính qut đánh sự tiÁn triÅn thành m¿n tính và các biÁn chćng cąa nhiÇm HBV. Các biÁn thÅ di truyÃn có thÅ làm thay đổi cu trỳc ca gen hoc nh hỗng tói viẫc tÂng tỏc vói cỏc yu tỗ phiờn mó do ú lm nh hỗng tói sỗ lng, chc nng ca protein do gen mã hóa. Vì vậy, các biÁn thÅ di truyÃn cąa gen

có liên quan vãi tính nh¿y cảm và tiÁn triÅn cąa bÉnh gan trong nhiÇm HBV.18, 19 Trong khi đó trên thÁ giãi có mát vài nghiên cu ỏnh giỏ mỗi liờn quan gia bin th di truyÃn gen PDCD1 vãi tiÁn triÅn cąa bÉnh lý gan trong

nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính,20, 21 ch°a có nghiên cću nào vÃ vai trị cąa biÁn thÅ gen CD274. ỉ ViÉt Nam, ch°a có nghiên cću nào vÃ vai trò cąa biÁn

thÅ di truyÃn gen PDCD1, CD274 cũng nh° néng đá protein sPD-1, sPD-L1.

Do đó, chúng tơi thực hiÉn đÃ tài <Nghiên cứu một số đa hình đơn gen

măc tiêu:

người khỏe mạnh.

ở bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

M¿t khác, XG và HCC là nguyên nhân ngày càng gia tăng gánh n¿ng bÉnh tật và tā vong trên toàn thÁ giãi.25 XG và HCC do nhiÇm HBV m¿n tính đã và đang là mát vấn đÃ y tÁ rất nghiờm tróng ỗ cỏc nóc chõu vỡ t lẫ nhiÇm HBV rất cao. Khoảng 80% các tr°ång hāp HCC ç nhăng khu vực này là do nhiÇm HBV.26 Đáng chú ý là phần lãn tr°ång hāp nhiÇm virus tÿ khi mang thai ho¿c giai đo¿n sãm cąa thåi thÂ u, mỏt sỗ bẫnh nhõn cú th nhiầm tip virus khỏc ỗ giai on sau ca cuỏc ồi. Cỏc c im ny u l yu tỗ nguy cÂ cao dÁn tãi hậu quả lâm sàng xấu. H¢n năa, nhăng nóc ỗ khu vc ny hu ht cú thu nhp quỗc gia tớnh trờn u ngồi ỗ mc thp tói trung bình.27

Do đó, chi phí cho viÉc điÃu trá nhiÇm virus viêm gan B lâu dài thực sự là mát gỏnh nng ỗi vói nn y t cng nh vói xã hái.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

1.1.1. Virus viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV)

HBV thuác hã Hepadnaviridae, gém các virus chća chi DNA nhå, có vå, có ái tính vãi gan, có dải vật chą hẹp. Hã Hepanaviridae gém 2 nhánh khác nhau vÃ kiÅu gen: avihepadnaviridae và orthohepadnaviridae. Avihepadnavirus lây nhiÇm cho vát (duck HBV hay DHBV), diÉc (heron HBV) và chim. Orthohepadviridae nhiÇm cho đáng vật có vú, gém HBV gây bÉnh cho ng°åi và WHV (Woodchuck hepatitis virus) gây bÉnh cho chuát chũi.22 Do thiÁu ho¿t tính đãc và sāa bản nháp có thÅ phiên mã ng°āc dÁn tãi sự đát biÁn th°ång xuyên cąa các kiÅu gen cąa virus, vì vậy tén t¿i đéng thåi các virus khác biÉt vÃ kiÅu gen trong các cá thÅ bá nhiÇm, đ°āc gãi là

ćng miần dỏch hoc thuỗc khỏng virus to ra cỏc ỏt bin HBV cú kh nng ln trỗn ỏp ng miần dách. HBV có ít nhất 8 kiÅu gen, đ°āc ký hiÉu tÿ A đÁn H vãi sự khác biÉt vÃ gen trên 8% nh°ng d°ãi 17% giăa mßi tuyp.28,29 Typ thć 9 (typ I) có sự khác vÃ kiÅu gen khoảng 8% vãi typ C làm cho viÉc phân lo¿i nó thành mát typ riêng vÁn cịn gây tranh cãi. Typ 10 là J đ°āc mô tả gần đây và d°ång nh° là kÁt quả tÿ sự kÁt hāp giăa kiu gen C v HBV Gibbon.30

Cỏc typ HBV phõn bỗ khác nhau giăa các quần thÅ khác nhau, các vùng ỏa lý khỏc nhau, cú mỗi liờn quan gia kiu gen vãi mćc đá n¿ng cąa bÉnh và đáp ćng iu trỏ. Vớ d kiu gen C ph bin ỗ ng°åi châu Á, liên quan vãi bÉnh n¿ng h¢n và đáp ćng vãi điÃu trá bằng interferon kém h¢n.31,32

DNA cąa HBV có d¿ng vịng khơng ch¿t (relaxed-circular DNA genome), chi đơi mỏt phn, mó húa cho 4 khung óc mỗ chộng ln. Khung óc mỗ lón nht mó húa polymerase ca virus, có ho¿t tính phiên mã ng°āc. Khung lãn thć hai mã hóa 3 protein vå cąa virus: S, M và L là các kháng nguyên bÃ mt HBsAg. Mỏt khung óc mỗ khỏc mó húa cho precore, liên quan vãi kháng nguyên E cąa virus (HBeAg) và protein lõi t¿o thành vå capsid ca virus. Cuỗi cựng, khung nhồ nht mó húa protein X (HBx), mát

protein điÃu chßnh nhå cần cho sự nhân lên cąa virus in vitro và in vivo.33

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Hình 1.1. CÃu trúc phân tċ cąa virus viêm gan B 22

(A) HÉ gen cąa HBV. Chi đơi mát phần gắn vào protein polymerase. rcDNA (relaxed circular DNA)

(B) S¢ đé thÅ hiẫn bn cht chộng ln ca khung óc mỗ ca HBV. (C) Virion ca virus HBV trỗng thnh (mnh Dane).

1.1.2. Sinh lý bÉnh trong nhiÇm virus viêm gan B

Khi nhiầm HBV, cÂ th cú th cú viờm gan ho¿c có thÅ khơng có triÉu chćng. NhiÇm virus viêm gan B ỗ ngồi trỗng thnh 95% cú kh nng tự lo¿i bå virus trong vòng 6 tháng. Ng°āc l¿i, trẻ nhiÇm virus trong giai đo¿n 1 đÁn 5 tuổi thì 30 đÁn 90% chun thành nhiÇm m¿n tính.34 Trong nhiÇm virus cấp, đáp ćng cąa hÉ miÇn dách vãi HBV là hiÉu quả và đúng thåi điÅm. ViÉc lo¿i bå virus liên quan vãi sự đáp ćng cąa tÁ bào T m¿nh m¿ t¿o ra tác đáng kháng virus theo cả c¢ chÁ phă thuác và khơng phă thc hąy tÁ bào. Khi nhiÇm cấp tính chun thành m¿n tính, có sự suy u tiÁn triÅn vÃ chćc năng tÁ bào T đ¿c hiÉu HBV.35

NhiÇm HBV m¿n là mát quá trình đáng hãc phản ánh sự t°¢ng tác giăa sự nhân lên cąa HBV và đáp ćng miÇn dách cąa vật chą. DiÇn biÁn cąa nhiÇm HBV m¿n đ°āc chia ra d°ãi d¿ng biÅu đé thành 5 pha.

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Hình 1.2. Các pha cąa nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính.36

DiÇn biÁn cąa bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n khơng nhất thiÁt theo thć tự tÿ pha 1 đÁn pha 5. Sự ho¿t húa cỏc cÂ ch miần dỏch loi bồ virus đéng thåi gây viêm và ho¿i tā mô gan. Quá trình này diÇn ra khơng liên tăc. Mát bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n tính có thÅ chun đổi giăa các pha có ho¿t tính miÇn dách và bất ho¿t vài ln trong suỗt cuỏc ồi. S lp li cỏc giai on hot ỏng miần dỏch dn tói tn thÂng xÂ hóa và ung th° biÅu mơ tÁ bào gan.37

Nguy c¢ tiÁn triÅn thành x¢ gan và ung th° gan thì rất khác nhau giăa các cá thÅ và cháu ảnh hỗng phn lón bỗi ỏp ng miần dỏch ca vt chą. Khoảng 30% bÉnh nhân viêm gan B m¿n tính s¿ phát triÅn thành x¢ gan. Nguy cÂ HCC ca bẫnh nhõn xÂ gan l 2-5% mòi nm, l mỗi lo ngi chớnh hiẫn nay ỗi vói bÉnh nhân viêm gan B m¿n.38

HuyÁt t°¢ng

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

Hình 1.3. TiÁn triÅn lâm sàng å bẫnh nhõn nhiầm virus viờm gan B.38

Nguy cÂ phỏt trin HCC cao hÂn ỗ cỏc bẫnh nhõn vói mỏt hoc nhiu yu tỗ liờn quan tói vt ch (xÂ gan, viêm ho¿i tā gan m¿n, tuổi già h¢n, giãi nam, chąng tác châu Phi, nghiÉn r°āu, đéng nhiÇm m¿n tính virus viêm gan khác ho¿c HIV, tiÅu đ°ång ho¿c hái chng chuyn húa, hỳt thuỗc, tin s gia ỡnh d°¢ng tính) và/ho¿c vãi HBV (HBV DNA cao và/ ho¿c HBsAg cao, kiÅu gen HBV chuyÅn tÿ C>B, đát bin c hiẫu).35 Nhiu nghiờn cu v yu tỗ gen cąa vật chą đã cho thấy đa hình gen cąa vt ch cú th nh hỗng tói viẫc nhiầm HBV, tiÁn triÅn bÉnh, đáp ćng vãi vaccine và đáp ćng vói thuỗc khỏng virus nh a hỡnh ỗ cỏc gen mó hóa HLA (human leukocyte antigens)39, cytokine, chemokine, toll like receptor, microRNAs, gen liên quan vãi vitamin D, NTCP (Natri taurocholate cotransporting polypeptide).40

1.1.3. Đáp ćng miÇn dách trong nhiÇm virus viêm gan B

Gan là c¢ quan duy nhất đ°āc cung cp bỗi c mỏu tnh mch v ỏng mch. Dòng máu đáng m¿ch giàu oxy vào gan qua đáng m¿ch gan, tuy nhiên đây là nguén máu nhå cung cấp cho gan. Phần lãn máu vào gan đ°āc cung cp bỗi tnh mch ca. Dũng mỏu t tnh mch cāa vÿa giàu dinh d°ÿng vÿa chća mầm bÉnh. Ngoài chćc năng sản xuất protein, chuyÅn hóa các chất dinh

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

dng, loi bồ ỏc tỗ, gan cũn c thit k tÂng tỏc tỗi a vói mầm bÉnh trong máu. Vá trí quan trãng cąa gan nằm phía d°ãi đ°ång đi cąa hÉ tiêu hóa, vì vậy đáp ćng miÇn dách trong gan t¿o ra mát cõn bng phc tp gia dung np ỗi vói nhng cái khơng gây h¿i và miÇn dách vãi mầm bÉnh. Mỏt c im quan tróng l ỗ gan t bo lympho T, tÁ bào trình diÉn kháng nguyên m¿c dù có thÅ ho¿t hóa, nhân dịng nh°ng l¿i khơng đ°āc khuyÁn khích chćc năng đáp ćng, nhằm tránh gây tổn thÂng cÂ quan nu ỏp ng miần dỏch mnh m chỗng li cỏc khỏng nguyờn thụng thồng t thc n và các vi sinh vật bình th°ång cąa đ°ång tiêu hóa. Hay nói cách khác gan thiên vÃ dung n¿p miÇn dách. Mơi tr°ång thiÁu miÇn dách này đ°āc thÅ hiÉn rõ nhất vãi thành công cąa ghép gan và sự khai thác mụi trồng ny bỗi mỏt sỗ virus nh: HBV, HCV dn tói viêm gan m¿n tính.41

Khi virus viêm gan B xâm nhập vào c¢ thÅ, c¢ thÅ vật chą phản ćng l¿i bằng cả đáp ćng miÇn dách tự nhiên (đáp ćng miÇn dách khơng đ¿c hiÉu) và đáp ćng miÇn dách thu đ°āc (đáp ćng miÇn dách đ¿c hiÉu).

1.1.3.1. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên

Đáp ćng miÇn dách tự nhiên th°ång đóng vai trị trung gian sau nhiÇm đÅ h¿n chÁ sự lan ráng cąa mầm bÉnh và kích ho¿t đáp ćng miÇn dách thu đ°āc. Các tÁ bào NK, đ¿i thực bào, tÁ bào gai& nhå các receptor khuôn mÁu nh°: Toll-like receptor, RNA helicase, receptor protein kinase&nhn ra cỏc yu tỗ c hiẫu ca mầm bÉnh nh° chußi RNA, lipopolysaccharide ỗ vồ, peptidoglycan& cm ćng sản xuất interferon typ I (IFNs) và sản xuất các cytokine khác ho¿t hóa đáp ćng miÇn dách và thúc đ¿y viÉc lo¿i bå virus.34

Đáp ćng miÇn dách tự nhiên cąa vật chą trong pha sãm cąa nhiÇm virus c c trng bỗi viẫc sn xut interferon typ I (IFN α/³) và ho¿t hóa cąa tÁ bào diÉt tự nhiên (NK).42 Sự ho¿t hóa tÁ bào NK, NKT sản xuất IFN ´ ćc chÁ quá trình tái sinh cąa virus ngay t¿i chß và tránh lan ra các tÁ bào xung quanh, do đó h¿n chÁ sự lan tràn cąa virus. TÁ bào gan, tÁ bào Kupffer sau khi ho¿t hóa

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

s¿ sản xuất các chemokine khác nhau. Chúng thu hút các tÁ bào đ¢n nhân, đ¿i thực bào, NK, NKT và tÁ bào T vào gan dÁn tãi sản xuất mát l°āng lãn TNF-α, ngồi ra cịn IFN-´, TNF-³, IL-10 (các cytokine đác tÁ bào). Đây cũng là nguyên nhân chính dÁn tãi tổn th°¢ng gan.34

1.1.3.2. Đáp ứng miễn dịch thu được

Đáp ćng miÇn dách dách thÅ đóng vai trị chą u khi virus cũn ỗ ngoi t bo. Vỡ vy nú quan trãng trong giai đo¿n sãm vãi vai trò ngăn sự kÁt hāp cąa virus vãi receptor t°¢ng ćng, ngăn hịa màng giăa vå virus và màng tÁ bào. Đơi khi chúng khơng có tác dăng tiêu diÉt vì chúng chò chỗng li cỏc epitope khụng quan tróng ca virus. ỏp ng miần dỏch t bo l phÂng thc bo vẫ chớnh ca cÂ th chỗng li virus. Khi virus vào c¢ thÅ nó bá các tÁ bào trình diÉn kháng nguyên (đ¿i thực bào, tÁ bào gai, lympho B) bắt, chÁ biÁn t¿o nên các đo¿n peptide kháng nguyên đ¿c tr°ng cho virus. Các kháng nguyên này đ°āc gắn vãi phân tā MHC-I trong bào t°¢ng cąa tÁ bào trình diÉn kháng ngun. Sau đó phćc hāp MHC-kháng nguyên đ°āc đ°a ra bÃ m¿t tÁ bào, trình kháng nguyên cho tÁ bào lympho T. TÁ bào lympho T sau khi gắn vãi kháng nguyên s¿ đ°āc ho¿t hóa, phân chia, biÉt hóa t¿o thành dòng tÁ bào lympho T phù hāp đÅ lo¿i bå kháng nguyên (pha méi). Sau khi đ°āc ho¿t hóa, tÁ bào T ho¿t hóa s¿ tãi tÁ bào đích (tÁ bào mang virus) và tấn cơng tÁ bào đích bằng các c¢ chÁ đ¿c hiÉu (pha ho¿t đáng).

NhiÇm HBV ho¿t hóa cả lympho TCD4+ và TCD8+. TCD4+ nhận ra epitope kháng nguyên lõi cąa HBV, ho¿t hóa phân chia, biÉt hóa thành Th17 sản xuất IL-17 cảm ćng tÁ bào biÅu mô sản xuất chemokine thu hút b¿ch cầu đa nhân tãi vá trí nhiÇm. Đéng thåi TCD4+ cịn tiÁt IL-2 giúp TCD8+ đ°āc ho¿t hóa dầ dng hÂn. ổ cỏc bẫnh nhõn HBV, sỗ lng tÁ bào Th17 tăng đáng kÅ trong máu và gan, đ°āc đéng hành bỗi tng mc IL-17 v IL-22 trong máu.12 Đéng thåi Th1 sản xuất cytokine IFN-´ và TNF-α.43

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

TÁ bào TCD8+ khi đ°āc ho¿t hĩa s¿ phân chia và biÉt hĩa thành tÁ bào T gây đác (cytotoxic T cell hay Tc). Nĩ tiêu diÉt tÁ bào mang virus bằng cách giải phĩng perforin (giúp granzyme vào tÁ bào đích), granzyme (các pro-protease đ°āc ho¿t hĩa bên trong tÁ bào đÅ kích ho¿t apoptosis cąa tÁ bào đích), IFN-gamma (ngăn ch¿n sự nhân lên/giÁt virus). Chúng cũng mang phân tā tác đáng gắn màng Fas ligand (CD178), gắn vãi Fas (CD95) trên tÁ bào đích làm ho¿t ha apoptosis ỗ t bo mang Fas.

T bo TCD8+ đ¿c hiÉu HBV cĩ vai trị nÃn tảng trong viÉc lo¿i bå virus và trong tiÁn triÅn cąa nhiÇm HBV. Nghiên cću trên tÁ bào ng°åi cho thấy tÁ bào TCD8+ ćc chÁ sự nhân lên cąa HBV bằng cả c¢ chÁ phá hąy tÁ bào và c¢ chÁ khơng phá hąy tÁ bào. Trong quá trình khơng phá hąy tÁ bào, TCD8 nạve, TCD8+ ho¿t hĩa di c° tãi gan. Khi tãi gan, tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV và tÁ bào miÇn dách t nhiờn khng c hiẫu HBV (i thc bo) trỗ nên ho¿t hĩa, sản xuất IFN-´ và TNF-α làm ćc sự nhân lên cąa HBV trong tÁ bào gan nhiÇm, dÁn tãi viÉc lo¿i bå virus mà khơng làm tổn th°¢ng tÁ bào.44 Chćc năng kháng HBV theo c¢ chÁ hy t bo c thc hiẫn bỗi tớnh gõy ỏc cąa TCD8+. Khi so sánh hiÉu quả cąa hai c¢ chÁ này, thấy rằng sự ćc chÁ nhân lên cąa HBV bằng c¢ chÁ khơng gây phá hąy tÁ bào hiÉu quả h¢n.44 M¿c dù, tÁ bào TCD8+ cĩ thÅ cảm ćng tÁ bào chÁt theo ch°¢ng trình nh°ng tổn th°¢ng gan chą yÁu gây ra bỗi cỏc t bo viờm khng c hiẫu HBV. T các kÁt quả này cho rằng cĩ c¢ chÁ đÅ kiÅm sốt sự cân bằng giăa chćc năng gây đác tÁ bào và khơng gây đác tÁ bào cąa tÁ bào TCD8+. ViÉc duy trì sự cân bằng này là vai trị cąa con đ°ång PD-1. Con đ°ång này liên quan vãi tăng c°ång dung n¿p cąa tÁ bào T trong nhiÃu lo¿i nhiÇm virus m¿n tính nh°: lymphocytic choriomeningitis virus, HIV, HBV, HCV. Cĩ mát sỗ bng chng cho thy chn con ồng PD-1/PD-L1 c thÅ thay đổi sự cân bằng giăa chćc năng gây đác tÁ bào và chćc năng khơng gây đác tÁ bào cąa tÁ bào TCD8+ đáp ćng, dÁn tãi làm gim tn thÂng m do miần dỏch.44

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Sau pha cp, mỏt sỗ t bo TCD8+ c hiẫu HBV biÉt hĩa thành tÁ bào TCD8+ nhã, đÅ ngăn viẫc tỏi nhiầm HBV trong tÂng lai. Tuy nhiờn, trong nhiÇm HBV m¿n- là tình tr¿ng phổ biÁn nhất cąa virus này, tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV bá suy giảm chćc năng miÇn dách, biÅu hiÉn sự ćc chÁ vÃ chćc năng, thậm chí chÁt theo ch°¢ng trình.12

Hình 1.4. Đáp ćng miÇn dách trong nhiÇm virus viêm gan B 45

Vậy tình tr¿ng suy kiÉt cąa tÁ bào lympho T là gì? Bình th°ång sau pha nhiÇm cấp tính, các tÁ bào lympho T s trỗ thnh t bo T nhó mang mỏt sỗ đ¿c điÅm giúp phân biÉt chúng vãi tÁ bào T nạve gém: chćc năng đáp ćng phản ćng nhanh sau khi ỗi mt li vói khỏng nguyờn, c li kh nng trỗ v m lympho th hai, tiÃm năng sinh sơi lãn và cĩ khả năng tén t¿i lâu mà khơng cĩ kháng nguyên thơng qua sự phân chia ổn đánh nái mơi nhå IL-17, IL-15. Các đ¿c tính này đ¿t đ°āc dần dần theo thåi gian giúp tÁ bào T nhã thực hiÉn miÇn dách bảo vÉ.46 Tuy nhiên, trong nhiÃu lo¿i nhiÇm m¿n tính và

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

ung th° thấy có sự suy kiÉt chćc năng cąa tÁ bào lympho T. õy l tỡnh trng c trng bỗi hot tớnh gây đác cąa tÁ bào lympho T kém, xóa tÁ bào TCD4+ và TCD8+ đ¿c hiÉu virus, thay đổi tỷ lÉ giăa cytokine duy trì tÁ bào T (IL-2) và cytokine ćc chÁ (IL-10, TGF-³). KÁt quả làm nhấn chìm đáp ćng cąa tÁ bào T đ¿c hiÉu virus.13 Sự suy kiÉt chćc năng cąa tÁ bào lympho T tiÁn triÅn dần dần: đầu tiên là mất khả năng sản xuất IL-2 (mát cytokine giúp sinh sôi tÁ bào T), tiÁp theo tÁ bào T mất ho¿t tính gây đác, giảm sản xuất TNF-α và IFN-´.13 Nh° vậy trong nhiầm mn tớnh, t bo T khụng chò thay đổi vÃ kiÅu hình mà cịn thay đổi vÃ chćc nng. Cuỗi cựng, cỏc t bo T suy kiẫt ny chÁt theo ch°¢ng trình do khơng biÉt hóa thành tÁ bào T nhã đ°āc.43

Nguyên nhân suy kiÉt tÁ bào lympho T trong viêm gan B m¿n tính gém: PhÂi nhiầm kộo di vói khỏng nguyờn virus lm gim sỗ lng, chc năng cąa tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu virus.

Sự biÅu hiÉn cąa các lo¿i receptor ćc chÁ trên bÃ m¿t tÁ bào lympho T nh°: PD-1, lymphocyte activation gene-3 (LAG-3),43 cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 (CTLA-4), CD244& Ng°åi ta cho rằng mßi receptor ćc chÁ điÃu khiÅn các chćc năng tÁ bào khác nhau. Nh° con đ°ång PD-1 có tác đáng m¿nh lên sự tén t¿i và /ho¿c sinh sôi cąa tÁ bào TCD8+ suy kiẫt. LAG-3 nh hỗng tói tin trin ca chu k t bo nhng ớt nh hỗng tói s tén t¿i cąa tÁ bào và apoptosis&

Mát c¢ chÁ khác liên quan vãi kích thích các tÁ bào điÃu hịa miÇn dách: tÁ bào CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg (tÁ bào Treg) ćc chÁ tÁ bào T trā giúp đ¿c hiÉu HBV (HBV-specific T helper cells). æ nhăng bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n tính, các tÁ bào Tregs ho¿t ỏng mnh v tng sỗ lng trong mỏu ngoi vi so vãi nhóm chćng. Sự hiÉn diÉn cąa các tÁ bào Tregs đ¿c hiÉu HBV đóng vai trị quan trãng vào đáp ćng miÇn dách khơng đầy đą, khơng hiÉu quả đÅ tiêu diÉt virus và dÁn đÁn tình tr¿ng nhiÇm m¿n tính.47-49 Sự suy kiÉt cąa tÁ bào lympho T lm cn trỗ s loi bồ virus v s héi phăc sau viêm gan.

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Đáp ćng miÇn dách khơng đầy đą trong nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính dÁn tãi sự tén t¿i lâu dài cąa virus trong c¢ thÅ sinh ra x¢ gan và ung th° biÅu mơ tÁ bào gan. Nh ỗ trờn ó trỡnh by t bo TCD8 c hiÉu HBV đóng vai trị quan trãng nhất trong viÉc tiêu diÉt virus. Ban đầu tÁ bào TCD8 diÉt tÁ bào gan nhiÇm HBV bằng cách cảm ćng tÁ bào gan chÁt theo ch°¢ng trình thơng qua c¢ chÁ phă thuác perforin và Fas. Nhăng tÁ bào gan bá chÁt theo chÂng trỡnh s nhanh chúng c loi bồ bỗi tÁ bào Kuffer. Tuy nhiên, khi virus vÁn tăng lên, ç giai đo¿n tiÁn triÅn tÁ bào Kupffer bá ho¿i tā thć phát giải phóng các kháng nguyên liên quan vãi tổn th°¢ng thu hút b¿ch cầu đa nhân trung tính vãi ổ viêm ho¿i tā. B¿ch cầu đa nhân trung tính ho¿t hóa giải phóng các chất trung gian viêm thu hút mát sỗ lng lón t bo Ân nhõn (bao gộm t bào lympho T, B, NK, NKT, tÁ bào gai&) tãi viờm. S thõm nhiầm sỗ lng lón cỏc t bào đ¢n nhân là ngun nhân chính dÁn tãi các tổn th°¢ng gan.44 Sự ho¿i tā tÁ bào gan dÁn tãi tăng sinh tÁ bào thay thÁ cho tÁ bào chÁt. Trong q trình này sự tích tă chất nÃn ngoi bo trong mụi trồng viờm lm gim sỗ lng và kích th°ãc các cāa sổ cąa tÁ bào nái mơ hình sin, dÁn tãi giảm tính đàn héi cąa gan. TÁ bào hình sao ho¿t hóa các con đ°ång tăng sinh m¿ch tr°ãc tình tr¿ng thiÁu oxy t¿i ổ viêm, tăng giải phóng chemokine và các chất hóa ćng đáng b¿ch cầu... KÁt quả hình thành sẹo x¢ thay thÁ cho mơ bá tổn th°¢ng và q trình x¢ hóa gan tiÁp tăc tiÁn triÅn. X¢ gan là giai on cuỗi ca quỏ trỡnh xÂ húa c c trng bỗi s hỡnh thnh tng bóc cỏc vũng xÂ xung quanh cỏc khỗi t bo gan. XÂ gan in hỡnh th°ång tiÁn triÅn hàng năm tãi hàng chăc năm mãi có biÅu hiÉn rõ ràng vÃ lâm sàng.50

Viêm gan m¿n dÁn tãi tăng xâm lấn cąa các tÁ bào miÇn dách, ho¿t hóa tÁ bào sao, t¿o ra vi mơi tr°ång bÉnh lý, tăng các thành phần collagen bÉnh lý, cỏc protein cht nn ngoi bo, yu tỗ phỏt trin và cytokine dÁn tãi x¢ gan và có thÅ hình thành chất nÃn tiÃn ung th°.51 Ho¿i tā tÁ bào gan hậu quả là tái t¿o

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

dÁn tãi x¢ gan, ung th° gan. Sự nhân lên liên tăc cąa tÁ bào gan có thÅ làm lan ráng cąa các tổn th°¢ng sinh ung th°.52 Tuy nhiên, ç bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n tính có thÅ tiÁn triÅn thành ung th° gan mà khơng qua x¢ gan. Virus viêm gan B có thÅ cảm ćng sinh ung th theo mỏt sỗ cÂ ch. Th nht, s tớch hāp kiÅu gen cąa HBV vào DNA cąa vật chą có liên quan vãi viÉc xóa các đo¿n DNA nhå chća các gen liên quan đÁn ung th°: đo¿n phiên mó ngc ỗ u mỳt NST (telomerase reverse transcriptase (TERT), platelet-derived-growth-factor receptor-³ (PDGFR ³), PDGF ³ and mitogen activated protein kinase 1 (MAPK1) & Thć 2 là ho¿t tính ho¿t hóa phiên mã cąa HBx có thÅ thay đổi sự biÅu hiÉn cąa các gen kiÅm soát phát triÅn nh° SRC tyrosine kinase, Ras, Raf, MAPK, ERK, JNK & Cuỗi cùng HBx có thÅ gắn và ćc chÁ p53- yÁu tỗ c ch mụ vỡ vy tng sinh t bo và thåa hiÉp các điÅm kiÅm sốt tổn th°¢ng DNA. TiÃm năng sinh ung th° gan cąa HBx đã đ°āc khng ỏnh trờn thớ nghiẫm ỗ chuát chuyÅn gen HBx thấy 90% phát triÅn HCC. C¢ ch khỏc sinh HCC c cm ng bỗi HBV cú thÅ bắt nguén tÿ sự t°¢ng tác vật lý giăa virus v hẫ thỗng ỗng nỏi bo gõy ra stress ca hẫ thỗng ỗng nỏi bo v cuỗi cựng cm ćng stress oxy hóa, thúc đ¿y các con đ°ång tín hiÉu cąa sự tén t¿i và phát triÅn, gây ra cỏc ỏt bin thụng qua viẫc to ra cỏc gỗc tự do và ho¿t hóa các tÁ bào sao. Tóm l¿i, HBV có thÅ gây ra tr¿ng thái tiÃn ung th, ung th gan thụng qua nhiu cÂ ch.52

1.1.4. Chần đốn và điÃu trá nhiÇm virus viêm gan B

Ch¿n đốn nhiÇm HBV m¿n theo <H°ãng dÁn ch¿n đoán và điÃu trá viêm gan virus B-Bá Y tÁ ViÉt Nam- 2014,53 2019=54. Ch¿n đoán các giai đo¿n bÉnh dựa trên triÉu chćng vÃ lâm sàng, xét nghiÉm sinh hóa, xét nghiÉm hut hãc, ch¿n đốn hình ảnh (siêu âm gan đ°ång băng, đo đá đàn héi gan hay Fibroscan đÅ đánh giá mćc đá x¢ gan, hình ảnh chăp cắt lãp vi tính

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

(CLVT/MRI) và sinh thiÁt gan. Ch¿n đốn viêm gan B m¿n tính, x¢ gan, ung th° gan theo <H°ãng ch¿n đoán ch¿n đoán và điÃu trá viêm gan virus B- Bá Y tÁ ViÉt Nam-2014,53 2019=54 và <H°ãng dÁn ch¿n đoán, điÃu trá ung th° gan nguyên phát-Bá Y tÁ ViÉt Nam- 201255, 2020=.56 ViÉc đánh giá mćc đá n¿ng cąa tổn th°¢ng gan là quan trãng đÅ xác đánh các bÉnh nhân cần điÃu trá và theo dõi sự tiÁn triÅn thành x¢ gan và ung th° gan.

Chß đánh điÃu trá phă thuác vào các pha khác nhau cąa nhiÇm HBV m¿n tính, đ°āc xác đánh dựa vào néng đá HBV-DNA, ALT huyÁt tÂng v mc ỏ nng ca bẫnh gan. Mỏt sỗ yu tỗ khỏc cng cn xem xột gộm: tui (tui gi hÂn l mỏt yu tỗ nờn xem xột iu trá), tiÃn sā gia đình vÃ ung th° gan, bÉnh kÁt hāp (béo phì, bÉnh gan do r°āu), nguy c¢ truyÃn HBV và các biÅu hiÉn ngoài gan cąa viêm gan B.45, 53, 54 ĐiÃu trá bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n tính nhằm măc đích ćc chÁ lâu dài sự sao chép cąa virus HBV, nâng cao chất lng cuỏc sỗng, kộo di thồi gian sỗng, ngn s tiÁn triÅn sang x¢ gan, ung th° gan, dự phịng lây truyÃn HBV cho cáng đéng bao gém ngăn truyÃn tÿ mẹ sang con, dự phòng đāt bùng phát cąa viêm gan virus B. ĐiÃu trá khåi vÃ chćc năng là HBsAg huyÁt thanh âm tính, nh°ng hiÁm khi đ¿t c vói thuỗc khỏng HBV hiẫn nay. Vỡ vy, ớch thực tÁ h¢n là ćc chÁ virus kéo dài ho¿c duy trì, đ°āc thÅ hiÉn bằng HBV DNA khơng phát hiÉn đ°āc và chuyÅn đảo huyÁt thanh HBeAg.45 Tÿ đó, khôi phăc chćc năng gan (giá trá ALT quay vÃ bình th°ång), cải thiÉn vÃ mơ hãc, ngăn tiÁn triÅn tãi x¢ gan và ung th° gan. Vãi măc tiêu ú hiẫn nay cú hai nhúm thuỗc c chp nhn bỗi FDA v cÂ quan dc chõu u v nhiu n°ãc châu Á trong điÃu trá nhiÇm virus viêm gan B gộm: thuỗc khỏng virus (nucleos(t)ide analogue, NA) v thuỗc điÃu hịa miÇn dách.

Thc kháng virus (NA): NA đóng vai trị ch chỗt trong iu trỏ

nhiầm virus viờm gan B mn tớnh ỗ hu ht cỏc nóc. n nay 6 thuỗc c FDA cp phộp.

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Hình 1.5. Thc điÃu trá nhiÇm HBV m¿n tính đã đ°āc chÃp nhÁn.45

Trong đó Entecavir, TDF và TAF l thuỗc hng u vỡ kh nng v t lẫ khỏng thuỗc thp. Entecavir cú cỏc tỏc dng ph không đáng kÅ. Tuy nhiên, nhăng bÉnh nhân kháng vãi Lamivudine thì TDF và TAF là lựa chãn điÃu trá tỗt nht. HBsAg õm tớnh xut hiẫn ỗ 3-11% bẫnh nhân điÃu trá bằng NA. NA trực tiÁp ćc chÁ sự nhân lên cąa virus, nh°ng khơng có tác đáng tãi sự tén t¿i cąa cccDNA (covalently closed circular DNA), do ú khi ngng thuỗc virus cú th phc hội. Vì vậy vãi phần lãn bÉnh nhân phải điÃu trá lõu di, thm chớ suỗt ồi. ộng thồi iu trỏ bằng NA khơng lo¿i bå hồn tồn nguy c¢ HCC. Vì vậy, khi HBsAg âm tính có thÅ dÿng NA nh°ng vÁn phải theo dõi sự phát triÅn HCC đ¿c biÉt vãi bÉnh nhân trên 50 tuổi ho¿c có x¢ gan. 45

LiÉu pháp interferon: IFN-α và PEG-IFN-α

LiÉu pháp interferon vÿa có tác dăng kháng virus vÿa tăng cồng miần dỏch. Tuy nhiờn HBsAg õm tớnh chò t ç 10% bÉnh nhân điÃu trá sau 1 năm. ĐiÃu trá kéo dài h¢n có thÅ có tỷ lÉ đáp ćng cao h¢n nh°ng khó dung n¿p vãi nhiÃu bÉnh nhân. BÉnh nhân điÃu trá IFN cần theo dõi ch¿t ch vỡ thuỗc cú nhiu tỏc dng ph: suy nhc, sỗt, nhiầm ỏc giỏp& Liẫu phỏp interferon chỗng chò đánh vãi x¢ gan mất bù. ỉ nhăng bÉnh nhân điÃu trá không liên tăc, hiÉu quả ćc chÁ virus khụng bng NA. Do t lẫ ỏp ng khiờm tỗn, tác dăng phă cần phải xem xét, liÉu pháp IFN chß nên điÃu trá cho nhóm bÉnh nhân đ°āc dự đốn là có đáp ćng tỗt vói thuỗc: bẫnh nhõn HBeAg d°¢ng tính, HBV typ A, B, bÉnh nhân trẻ, không bÉnh kÁt hāp và HBV DNA thấp.

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

Mát vài nghiên cću đã tiÁn hnh ỏnh giỏ hiẫu qu kt hp hai loi thuỗc trên nh°ng kÁt quả không rõ ràng.45

Nh° vậy, vãi các thuỗc iu trỏ truyn thỗng hiẫn nay viẫc loi hon tồn HBV khåi c¢ thÅ nghĩa là lo¿i bå cccDNA v HBV DNA tớch hp ỗ gan l cha t đ°āc. Vì vậy, viÉc điÃu trá nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính vÁn cịn nhiÃu khó khăn. Trong khi đó sự suy yÁu vÃ chćc năng cąa các tÁ bào T đ¿c hiÉu kháng nguyên là mát đ¿c tr°ng đã đ°āc khẳng đánh trong nhiÇm HBV m¿n tính. Mát trong các nguyên nhân dÁn tãi sự suy kiÉt cąa các tÁ bào T là sự tăng biÅu hiÉn các receptor ćc chÁ. Trong đó con đ°ång PD-1/PD-L1 là con đ°ång ćc chÁ chính liên quan vãi sự suy kiÉt cąa tÁ bào T.46 Khám phá này đã mang l¿i gii thỗng Nobel trong lnh vc y hóc cho hai nhà khoa hãc Honjo và Allison năm 2018.57 Khám phá vÃ con ồng PD-1 ó mỗ ra ph°¢ng pháp điÃu trá đích thu hút sự quan tâm lãn trong điÃu trá nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính cũng nh° ung th° biÅu mơ tÁ bào gan do nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính.

1.2. CON Đ¯âNG TÍN HIÈU PD-1/PD-L1

Protein PD-1 là mát protein xuyên màng typ I gém 288 a.a. đ°āc biu hiẫn ỗ cỏc t bo miần dỏch nh: t bo lympho T, B, c bo ang trỗng thnh, tÁ bào NK, NKT, mát sỗ t bo dũng ty, tÁ bào trình diÉn kháng nguyờn v mỏt sỗ t bo ung th.14 PD-1 cú hai phỗi t l PD-L1 v PD-L2. PD-L1 cng l mát protein xuyên màng typ I đ°āc biÅu hiÉn ráng bỗi nhiu loi t bo khỏc nhau gộm c t bào t¿o máu (tÁ bào T, B, DCs, đ¿i thực bào) và tÁ bào khơng phải dịng tÁ bào t¿o máu (tÁ bào nái mô m¿ch, tÁ bào nái mô chất nÃn, tÁ bào đảo tăy, tÁ bào keratin, lá ni hāp bào). Ng°āc l¿i sự biÅu hiÉn PD-L2 thì giói hn hÂn nhiu, biu hiẫn ch yu ỗ t bào gai, đ¿i thực bào, quần thÅ tÁ bào B.14 Cả PD-L1 và PD-L2 đÃu có thÅ đ°āc biÅu hiÉn bỗi t bo ung th, nhng PD-L1 thỡ ph bin hÂn.14 Nh vy trong hai phỗi t

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

cąa PD-1 là PD-L1 và PD-L2 thì PD-L1 đ°āc biu hiẫn rỏng hÂn ỗ nhiu loi t bo. iu này gāi ý rằng PD-L1 đóng vai trị quan trãng h¢n trong ho¿t đáng cąa con đ°ång tín hiÉu PD-1. Trong các nghiên cću PD-L1 cũng nhận đ°āc nhiÃu sự quan tâm h¢n, vì vậy trong phần này chúng tơi chß đÃ cập tãi vai trị cąa con đ°ång PD-1/PD-L1.

1.2.1. Tín hiÉu thơng qua con đ°ãng PD-1/ PD-L1

PD-1 gn vói PD-L1 khỗi phỏt cỏc tớn hiẫu trong t bào chą yÁu dÁn tãi ćc chÁ 2 con đ°ång chính: PI3K-Atk-mTOR và RAS-MEK-ERK. Sự ćc chÁ các con đ°ång ny nh hỗng tói s tin trin ca chu k tÁ bào, sự phát triÅn, biÉt hóa, sự nhân lên và tén t¿i cąa tÁ bào. Că thÅ:

PD-1 khi gn vói phỗi t, uụi trong bào t°¢ng cąa PD-1 chća motif ITSM thu nhận SHP-1/2 khi phosphoryl hóa dÁn tãi sự phosphoryl hóa cąa ZAP70 và LCK bá lßi, hậu quả làm ćc chÁ con đ°ång PI3K-AKT-mTOR. Ngồi ra PD-1 cịn ćc chÁ con đ°ång PI3K-AKT-mTOR thơng qua ho¿t tính phosphoryl hóa và phosphatase cąa PTEN. Sự ćc chÁ con đ°ång PI3K ćc chÁ tiêu thă oxy lm nh hỗng tói con đ°ång đ°ång phân và giáng hóa glutamine, trong khi đó q trình này đ°āc tăng lên khi ho¿t hóa tÁ bào T. Nó ćc chÁ ty thÅ và chuyÅn hóa a.a trong khi tăng beta-oxy hóa acid béo. ViÉc gắn PD-1 cũng liên quan vãi sự tích lũy acid béo khơng no tÿ đó có thÅ ćc chÁ tính miÇn dách cąa tÁ bào T.58

PD-1 ćc chÁ con đ°ång RAS-MEK-ERK thông qua sự ćc chÁ PLC-´1. KÁt quả làm giảm sự ho¿t hóa cąa các TFs (transcription factors) nh°: protein 1 ho¿t hóa (AP-1 activator protein), NFAT (nuclear factor of activated T cells) v nuclear factor B (NF-B). Nhng yu tỗ này cần cho sự phiên mã và sự ổn đánh mRNA cąa IL-2 (cytokine cần cho sự ho¿t hóa cąa tÁ bào lympho T). 14

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Hình 1.6. Tín hiÉu PD-1 ćc chÁ sď ho¿t hóa cąa tÁ bào lympho T.14

Con đ°ång PD-1/PD-L1 điÅn hình có tác đáng tãi sản xuất cytokine (TNF- ´, TNF- α và IL-2) h¢n là tác đáng tãi sự nhân lên cąa tÁ bào. Tín hiÉu ćc chÁ qua trung gian PD-1 phă thuác vào đá m¿nh cąa tín hiÉu TCR. Sự kích thích cąa TCR ỗ mc thp thỡ c ch mnh hÂn.59

Tóm l¿i con đ°ång PD-1/PD-L1 ćc chÁ sự ho¿t hóa cąa tÁ bào lympho T bằng nhiÃu cách: làm giảm tín hiÉu TCR và CD28,58 giảm sản xuất cytokine ho¿t hóa (IL-2, IFN-´), tăng cytokine ćc chÁ (IL-10) dÁn tãi giảm sinh sơi, giảm biÉt hóa tÁ bào TCD8+ và TCD4+ (thiÁu TCD4+ làm ćc chÁ thêm TCD8+), tăng chÁt theo ch°¢ng trình.

1.2.2. Vai trị cąa con đ°ãng PD-1/PD-L1 trong nhiÇm virus viêm gan B mn tớnh

Con ồng PD-1 l mỏt yu tỗ iu khin quan tróng ỗi vói chc nng miần dỏch trong điÃu kiÉn sinh lý cąa vật chą. PD-1 đ°āc biu hiẫn bỗi cỏc t bo T trong quỏ trỡnh ho¿t hóa và đóng vai trị nh° cái phanh đÅ làm dáu sự phản ćng quá mćc cąa tÁ bào T. Khơng có PD-1, tổn th°¢ng mơ do đáp ćng

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

miÇn dách q mćc có thÅ dn tói hu qu phỏ hy hon ton ỗi vói vật chą. H¢n năa, PD-1 đóng vai trị quan trãng trong dung np ca t bo T ỗ trung Âng và ngo¿i vi, hß trā bảo vÉ bản thân mơ khåi đáp ćng tự miÇn.

ỉ ng°åi, PD-1 biÅu hiÉn cao h¢n trên các tÁ bào T đ¿c hiÉu HIV, HBV, HCV trong nhiÇm m¿n tính. Ng°āc l¿i, các tÁ bào T đ¿c hiÉu cho các virus không tén t¿i lâu nh° virus influenza, vaccinia thì biÅu hiÉn PD-1 thấp.60

Ch¿n sự t°¢ng tác PD-1/ PD-L1 in vitro làm đảo ng°āc sự suy kiÉt cąa tÁ bào

T đ¿c hiÉu HIV, HBV, HCV vãi biÅu hiÉn tăng sản xuất cytokine59 và tăng phân chia tÁ bào.60 Tÿ các kÁt quả trên cho thấy vai trò quan trãng cąa con đ°ång PD-1/PD-L1 trong nhiÇm virus m¿n tính nói chung.

Trong q trình sinh lý bÉnh cąa nhiÇm HBV, đáp ćng miÇn dách tÁ bào đóng vai trị quan trãng nhất trong thơng qua ho¿t đáng cąa tÁ bào TCD8+ và TCD4+, đ¿c biÉt là tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV.4-8 æ các bÉnh nhân viêm gan B m¿n tính, tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV trong tun hon ch yu dÂng tớnh vói PD-1.61 Trong sỗ các receptor ćc chÁ biÅu hiÉn trên tÁ bào T suy kiÉt, PD-1 đ°āc xem là receptor ćc chÁ nổi trái 43,62,63 TÁ bào TCD8+ đáp ćng có các chćc năng bao gém: tiÁt cytokine nh° IL-2, IFN-´, TNF-α và ho¿t tính gây đác tÁ bào qua trung gian perforin, granzyme B. Mất chćc năng cąa tÁ bào TCD8+ suy kiÉt diÇn ra theo nhiÃu b°ãc. Các kÁt quả thực nghiÉm đã cho thấy tùy thuác vào đá m¿nh cąa tín hiÉu PD-1 mà TCD8+ mất dần các chćc năng đáp ćng quan trãng: đầu tiên là mất khả năng sản xuất IL-2, tiÁp theo mất ho¿t tớnh gõy ỏc, gim sn xut TNF- v IFN-,13 cuỗi cùng tÁ bào T suy kiÉt trải qua chÁt theo ch°¢ng trình.64 Nh° vậy con đ°ång PD-1/PD-L1 đóng vai trị quan trãng trong viÉc suy giảm miÇn dách cąa TCD8+ đ¿c hiÉu HBV-tÁ bào có vai trị nÃn tảng tiêu diÉt virus HBV.

Con đ°ång PD-1/PD-L1 không nhăng làm mất chćc năng cąa tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV thụng qua mỏt sỗ cÂ ch chung nh: lm giảm tín hiÉu TCR dÁn tãi giảm khả năng nhân lên và sản xuất cytokine, lßi trong q trình biÉt hóa thành tÁ bào T nhã dÁn tãi chÁt tÁ bo theo chÂng trỡnh. Mỏt sỗ yu

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

tỗ khỏc úng gúp vo s mt chc nng cąa tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV trong nhiÇm HBV m¿n tính: tăng ho¿t đáng cąa tÁ bào Tregs, viÉc xóa arginine trong mơi tr°ång gan viêm làm giảm tín hiÉu TCR, giải phóng các cytokine iu chònh miần dỏch, phÂi nhiÇm vãi tải l°āng cao cąa kháng nguyên virus và môi tr°ång dung n¿p cąa gan.65 Ngoài ra, sự biÅu hiÉn PD-1 làm thay i mỏt sỗ con ồng chuyn húa diần ra rt sãm trong quá trình suy kiÉt cąa tÁ bào T.64 PD-1 ćc chÁ đ°ång phân ái khí, do đó tÁ bào T lập trình l¿i con đ°ång chun hóa tÿ đ°ång phân ái khí sang tăng c°ång oxy hóa acid béo t¿o ra nhiÃu ROS. Sự mất chćc năng này cąa ty thÅ này làm cho tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV ít khả năng sā dăng phosphoryl oxy hóa đÅ cung cấp cho nhu cầu vÃ năng l°āng.66 Sự thiÁu dinh d°ÿng cũng là mát nguyên nhân dÁn tãi sự suy kiÉt cąa tÁ bào lympho T.

TÁ bào T suy kiÉt trong nhiÇm virus viêm gan B mn tớnh cú mỏt sỗ c im ni bt:

Hiẫu quả cąa viÉc ch¿n PD-1/PD-L1 khác đáng kÅ giăa tÁ bào T trong gan và tÁ bào T ngo¿i vi. Nghiên cću cąa Fisicaro P (2010) trên tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV tách tÿ máu ngo¿i vi và mô gan sinh thiÁt ç 42 bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n tính thấy rằng: chćc năng cąa tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV có thÅ đ°āc cải thiÉn bằng cách ch¿n PD-1/PD-L1 và tác ỏng ny trờn gan lón hÂn so vói ỗ ngoi vi.67

Quần thÅ tÁ bào lympho TCD8+ đ¿c hiÉu HBV bá suy kiÉt không đéng nhất. Nghiên cću in vitro tÿ tÁ bào b¿ch cầu đ¢n nhân đ°āc phân lập tÿ máu

bÉnh nhân viêm gan B m¿n tính thấy rằng tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV vå suy kiÉt n¿ng h¢n so vãi TCD8+ đ¿c hiÉu polymerase và protein lõi.61 Nghiên cću cho rằng do néng đá kháng nguyên vå có m¿t th°ång xuyên vãi néng đá cao trong nhiÇm HBV m¿n tính.61 Trong nhiÇm m¿n tính, có mát nhóm tÁ bào T 8progenitor-like9 biÅu hiÉn PD-1 mćc thấp h¢n, nh¿y cảm h¢n vãi viÉc ch¿n PD-1, khả năng nhân lên cao h¢n và khả năng sản xuất cytokine đáp ćng lãn h¢n và là d¿ng ít biÉt húa hÂn. Ngc li nhúm t bo biẫt húa cuỗi cùng cąa

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

tÁ bào T thì đáp ćng kém vãi viÉc ch¿n PD-1, sinh sơi ít h¢n và sản xuất các cytokine đáp ćng ít h¢n nh°ng vÁn duy trì đác tính cao h¢n.14

Bên c¿nh PD-1, sự kích thích kéo dài cąa TCR có thÅ dÁn tãi tăng biÅu hiÉn cąa các receptor ćc chÁ khác nh° 2B4, CTLA-4, Tim3, Lag3, TIGIT, BTLA, CD160 v PSGL1. Sỗ l°āng receptor ćc chÁ đ°āc đéng biÅu hiÉn càng nhiÃu thì mćc đá suy kiÉt cąa tÁ bào T càng n¿ng. Trong nhiÇm HBV m¿n tính các phân tā đéng ćc chÁ đ°āc biÅu hiÉn phổ biÁn nhất trong gan là PD-1 và 2B4 (phát hiÉn đ°āc trên 90% tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV thâm nhiÇm gan), tiÁp theo là sự biÅu hiÉn cąa LAG3 và CD160.66

1.2.3. Vai trò cąa con đ°ãng PD-1/PD-L1 trong ung th° gan

Sự tăng biÅu hiÉn PD-L1 là mát trong các c¢ chÁ quan trãng giúp tÁ bào u l¿n tránh miÇn dách cąa vật chą. Con đ°ång PD-1/PD-L1 vÿa ćc chÁ sự ho¿t hóa cąa tÁ bào T đ¿c hiÉu u, vÿa ćc chÁ sự di c° cąa tÁ bào T tãi u. Các cytokine tiÃn viêm (IFN-, IL-4, IL-10, VEGF) c sn xut bỗi cỏc t bào T thâm nhiÇm u có thÅ làm tăng thêm sự biÅu hiÉn cąa PD-L1 và thúc đ¿y ćc chÁ miÇn dách.14,68 ỉ mćc gen, các con đ°ång tín hiÉu oncogen trong tÁ bào u nh° IFN-´/ JAK2/IFN, PI3K và MEK/ERK/STAT1 có thÅ ho¿t hóa sự biÅu hiÉn cąa PD-L1.68

Sự ho¿t hóa con đ°ång PD-1/PD-L1 khơng chß làm giảm chćc năng cąa tÁ bào T đáp ćng mà còn làm tăng chćc năng cąa tÁ bào Treg c ch miần dỏch. CÂ ch c ch chớnh ca tÁ bào Treg là tiÁt các cytokine ćc chÁ (IL-10, TGF-³ &).12 Nghiên cću in vitro, tÁ bào TCD4 PD-1-/- có xu h°ãng giảm

đáng kÅ sự biÉt húa thnh Tregs cm ng ỗ ngoi vi. Trong vi môi tr°ång u, PD-1 đ°āc biÅu hiÉn trên tÁ bào TCD4+ làm tăng biÉt hóa thành Tregs- Foxp3+. Tregs-Foxp3+ là mát d°ãi nhóm ćc chÁ miÇn dách cao cąa TCD4+, đóng vai trị quan trãng vãi sự ćc chÁ nhân lên và sản xuất cytokine cąa các tÁ bào T khác, ćc chÁ đáp ćng miÇn dách đ¿c hiÉu u và duy trì dung n¿p ngo¿i vi ç bÉnh nhân ung th°. Khi các tÁ bào Tregs biÅu hiÉn cao PD-1 thì tăng c°ång đáp ćng vÃ chćc năng, tăng phân chia cąa tÁ bào Treg và ćc chÁ đáp ćng cąa

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

tÁ bào T.68 ỉ bÉnh nhân HCC thấy có sự xâm nhập đáng kÅ cąa tÁ bào Treg trong gan, sỗ lng t bo Treg ỗ u tng so vói vựng bờn ngoi u v vựng ngoi vi, khi sỗ l°āng tÁ bào Treg xâm nhập gan tng thỡ sỗ lng t bo TCD8+ trong gan giảm. Ghép tự thân các tÁ bào Treg đ°āc phân lập tÿ bÉnh nhân HCC thấy giảm sự sinh sôi, giảm sản xuất perforin cąa tÁ bào TCD8+. Đéng thåi các tÁ bào Treg này ćc chÁ hiÉu quả sự sinh sôi và tiÁt cytokine cąa tÁ bào T CD4CD25. H¢n năa, khi điÃu trá bÉnh nhân HCC bng cyclophosphamide liu thp lm gim sỗ lng t bo Treg thỡ thy sỗ lng t bo TCD4+ đ¿c hiÉu AFP tiÁt IFN-´ tăng. Các nghiên cću này chß ra rằng, các tÁ bào Treg vÿa ćc chÁ trực tiÁp TCD8+ đéng thåi ćc chÁ gián tiÁp TCD8+ thông qua ćc chÁ TCD4+. Nh° vậy sự ho¿t hóa Treg t¿o ra mát vũng feedback c ch miần dỏch dÂng trong HCC.12

1.2.4. Ćng dăng con đ°ãng PD-1/ PD-L1 trong điÃu trá hiÉn nay

Con đ°ång PD-1/PD-L1 là mát liẫu phỏp ớch thu hỳt bỗi vỡ PD-1 chò c biÅu hiÉn trên các tÁ bào T đáp ćng vãi kháng ngun. Do đó, viÉc điÃu chßnh con đ°ång PD-1 có thÅ tác đáng mát cách chãn lãc vãi đáp ćng miÇn dách đang tiÁn triÅn so vãi các liÉu pháp khác có tác đáng ráng trên tÁ bào miÇn dách cąa vật chą (nh° corticosterioids, cyclophosphamide). Đây cũng là liÉu pháp tiÃm năng trong điÃu trá ung th° biÅu mơ tÁ bào gan (HCC) có liên quan vãi nhiÇm HBV bỗi t bo lympho TCD8+ c hiẫu HBV ch yÁu biÅu hiÉn PD-1.61

ViÉc sā dăng kháng thÅ kháng PD-1 ho¿c PD-L1 đã thành công đáng kÅ trong nhiu th nghiẫm lõm sng: trong ung th hc tỗ, ung th° phổi tÁ bào nhå, ung th° thận,69,70 ung th° buéng trćng, ung th° đ¿i trực tràng,71 ung th° bàng quang72 và cả HCC vãi kÁt quả làm tăng thồi gian sỗng, lm chm tin trin ca ung th.14 Tuy nhiờn, hiẫu qu chò xut hiẫn ỗ mỏt sỗ bÉnh nhân và hầu hÁt bÉnh nhân không thuyên giảm ổn đánh sau khi sā dăng liÉu pháp. Vì vậy, cần thêm các nghiên cću lâm sàng và c¢ bản đÅ xác đánh xem t¿i sao viÉc ch¿n con ồng PD-1/PD-L1 li hiẫu qu ỗ mỏt sỗ bẫnh nhõn nh°ng l¿i

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

không hiÉu quả ỗ sỗ khỏc.14 S kt hp gia viÉc sā dăng kháng thÅ ch¿n t°¢ng tác PD-1/PD-L1 vãi các liÉu pháp khác: ćc chÁ PD-1 kÁt hāp vói c ch CTLA-4 lm tng hiẫu qu ỗ bẫnh nhõn ung th hc tỗ di cn,73 tng thồi gian sỗng ỗ bẫnh nhõn ung th hc tỗ, ung th biÅu mô thận74,75 nh°ng cũng làm tăng tác dăng phă.76 KÁt hāp x¿ trá t¿i chß vãi kháng thÅ ch¿n điÅm kiÅm soát nh° PD-1, PD-L1 cho kÁt quả khả quan trong điÃu trá ung th° đ¿i trực tràng, ung th° hầu hãng, ung th° đầu m¿t cổ.77 KÁt hāp gia c ch PD-1/PD-L1 v húa trỏ ỗ bẫnh nhõn ung th° phổi không tÁ bào nhå tiÁn triÅn làm tng thồi gian sỗng vói t lẫ bẫnh nhõn ỏp ćng cao h¢n so vãi đ¢n trá liÉu bằng ćc chÁ PD-1/PD-L1. Tuy nhiên làm tăng đác tính trên thận.76

HiÉn nay vãi nhăng nß lực đÅ xác đánh các marker có thÅ tiên đốn bÉnh nhân nào s¿ c hỗng li t viẫc ch¿n con đ°ång PD-1/PD-L1, sự biÅu hiÉn cąa PD-L1 bằng hóa mơ miÇn dách (immunohistochemical, IHC) đã đ°āc xem là marker đánh h°ãng lựa chãn bÉnh nhân điÃu trá bằng kháng thÅ kháng PD-1 ho¿c PD-L1 ỗi vói nhiu loi ung th: ung th phi khụng tÁ bào nhå, ung th° d¿ dày, ung th° biÅu mô đ°ång tiÁt niÉu, ung th° cổ tā cung, ung th° thực quản. Protein PD-L1 có thÅ đ°āc phát hiẫn bỗi phÂng phỏp nhuỏm húa mụ miần dỏch. Mu c cỗ ỏnh bng formalin, gn parafin. Sau ú, các kháng thÅ đ¢n dịng gắn trực tiÁp vãi PD-L1 ç đo¿n ngo¿i bào. Nhuám tÁ bào u, t bo miần dỏch bng phÂng phỏp húa mụ miần dỏch vói phc hp thuỗc nhuỏm bo tÂng v màng tÁ bào. TiÁn hành so sánh mÁu mô cąa bÉnh nhân vãi chćng âm và chćng d°¢ng. Tÿ đó xỏc ỏnh chò sỗ CPS (combined positive score) c tớnh bng t sỗ ca t bào bắt màu PD-L1 (gém cả tÁ bo u v t bo miần dỏch) trờn tng sỗ t bo u quan sỏt c hoc chò sỗ TPS (tumour positive score) c tớnh bng t sỗ t bo u bt mu PD-L1 trờn tng sỗ t bo u quan sát đ°āc. Giá trá CPS ho¿c TPS lãn h¢n giá trá cut off kÁt luận là PD-L1 d°¢ng tính.78

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

1.3. ĐA HÌNH Đ¡N NUCLEOTID CĄA GEN PDCD1 (PD-1), CD274 (PD-L1) VÀ BIÄU HIÈN PROTEIN HUYÀT T¯¡NG CĄA GEN PD-1 (sPD-1), PD-L1 (sPD-L1)

1.3.1. Khái niÉm vÃ đa hình đ¢n nucleotid (Single nucleotide polymorphism, SNP)

1.3.1.1. Định nghĩa đa hình đơn nucleotid

Đa hình đ¢n nucleotid (single nucleotide polymorphism hay SNP) là lo¿i biÁn thÅ di truyÃn trong bá gen, chß khác biÉt 1 nucleotid. Trung bình chúng xuất hiÉn gần nh° mát lần trong mßi 1.000 nucleotid, có nghĩa là có khoảng 4 đÁn 5 triÉu SNP trong bá gen cąa mát ng°åi. Nhăng biÁn thÅ này cú th l duy nht hoc xy ra ỗ nhiu cá nhân; các nhà khoa hãc đã tìm thấy h¢n 100 triÉu SNP trong các quần thÅ trên khắp thÁ giãi. Thông th°ång, nhăng biÁn thÅ này đ°āc tỡm thy trong DNA ỗ vùng quanh vùng mã hóa protein cąa gen- vùng mà hiÉn nay đ°āc nhận ra là quan trãng vãi viÉc gắn miRNA và điÃu chßnh biÅu hiÉn gen ho¿c protein.79 Tuy nhiên, SNP cũng có thÅ xuất hiẫn ỗ trỡnh t mó húa, intron hoc vựng gia các gen.

1.3.1.2. Ý nghĩa của các đa hình đơn nucleotid trong y học

Các SNP hầu hÁt là vơ h¿i và khơng có bất kỳ tác đáng no ỗi vói sc khồe v s phỏt trin. Tuy nhiờn, SNP nm ỗ vựng mó húa ca gen hoc ç vùng điÃu khiÅn cąa gen có thÅ đóng vai trị trực tiÁp vãi bÉnh thơng qua điÃu chßnh chćc năng gen. Do chúng làm thay đổi cấu trúc cąa gen mó húa, hoc nh hỗng tói viẫc gn ca yu tỗ phiờn mó hoc microRNA lm nh hỗng tói mćc đá biÅu hiÉn cąa gen cũng nh° có thÅ gõy nh hỗng tói kh nng tip cn vói chromatin hoc cỏc vũng DNA (DNA-looping) lm nh hỗng tói hiẫu qu sao mó ca gen.80 Mỏt sỗ SNP c cho là không trực tiÁp liên quan vãi bÉnh mà tác đáng đÁn bÉnh thơng qua sự có m¿t cąa SNP làm mất cân bằng, t¿o haplotype vãi SNP có liên quan trực tiÁp vãi bÉnh.81 SNP đ°āc

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

sā dăng nh° là dấu hiÉu vÃ gen trong qun th nghiờn cu xu hóng ỗi vói bẫnh. Mỏt sỗ SNP cng c xem l cỏc marker sinh hóc, giỳp cỏc nh khoa hóc xỏc ỏnh mỗi liờn quan giăa gen vãi bÉnh. Sự khác biÉt cąa SNP cú liờn quan n mỏt sỗ bẫnh: thiu mỏu hộng cu li lim, -thalassemia, ung th & Mỏt sỗ SNP có vai trị trong dự đốn đáp ćng cąa cá nhõn vói mỏt sỗ loi thuỗc, tớnh nhy cm vói yu tỗ mụi trồng, tng nguy cÂ hỡnh thnh, tin triÅn ung th°.82 Các nghiên cću vÁn đang đ°āc tiÁn hành đÅ xác đánh SNP có liên quan đÁn các bÉnh phćc t¿p nh° bÉnh tim, tiÅu đ°ång, ung th°& đÅ góp thêm cơng că trong ch¿n đốn, theo dõi điÃu trá và tiên l°āng bÉnh nhân. Vãi xu h°ãng phát triÅn cąa y hãc hiÉn đ¿i theo h°ãng cá thÅ hóa điÃu trá vãi măc tiêu nâng cao chất lng iu trỏ cng nh ci thiẫn cht lng sỗng ca ngồi bẫnh thỡ cỏc nghiờn cu v mỗi liờn quan giăa bÉnh và các đ¿c điÅm di truyÃn nói chung và SNP nói riêng ngày càng quan trãng đóng gúp vo cỏ nhõn húa iu trỏ ỗi vói la chón thuỗc v ch ỏ iu trỏ.83

quan n con ng PD-1/PD-L1

Các kỹ thuật sinh hãc phân tā đÅ phát hiÉn các đa hình đ¢n nucleotid rất đa d¿ng. Tuy nhiên, viÉc phát hiÉn các SNP đÅ phăc vă cho ch¿n đốn, điÃu trá bÉnh nhân thì khó h¢n so vãi viÉc phát hiÉn sự thay đổi cąa nhiÃu nucleotid. Các ph°¢ng pháp phát hiÉn này vÿa phải đ¿c hiÉu cao đÅ phân biÉt sự thay th chò ỗ mỏt nucleotid đéng thåi vÁn phải có đá nh¿y cao vì hai nucleotid thay thÁ th°ång đ°āc kÁt hāp trong mÁu bÉnh nhân. ĐÅ giải quyÁt thách thćc này các ph°¢ng pháp phát hiÉn SNP dựa trên phản ćng PCR là phù hāp nh°: giải trình tự gen, ARMS-PCR, RFLP-PCR&

Trong nghiên cću này chúng tơi lựa chãn ph°¢ng pháp giải trình tự gen tự đáng dựa trên nguyên lý cąa Sanger và ph°¢ng pháp Tetra primer- ARMS- PCR.

</div>