tần suất một số gen mã hóa yếu tố độc của escherichia coli sinh b lactamase phổ mở rộng phân lập từ máu mủ và nước tiểu

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (7.81 MB, 114 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞---

NGUYỄN THỊ KIM QUYÊN

TẦN SUẤT MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ

ĐỘC CỦA Escherichia coli SINH

MÁU, MỦ VÀ NƯỚC TIỂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuTan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieu

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞---

NGUYỄN THỊ KIM QUYÊN

TẦN SUẤT MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ

ĐỘC CỦA Escherichia coli SINH

β- LACTAMASE PHỔ MỞ RỘNG PHÂN LẬP TỪ MÁU, MỦ VÀ NƯỚC TIỂU

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Wednesday, June 12, 20247:36:23 PM7:36:23 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:23 PM7:36:23 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:23 PM7:36:23 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: NGUYỄN THỊ KIM QUYÊN

Ngày sinh: 24/05/1980 Nơi sinh: Tây Ninh

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã học viên: 1884202010014 Tơi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin luận văn tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối tồn văn thơng tin luận văn tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: PGS. TS. PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG Học viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM QUYÊN Lớp: MBIO18B

Ngày sinh: 24/05/1980. Nơi sinh: Xã Long Thuận, huyện Bến Cầu, tỉnh Tây Ninh.

Tên đề tài: “TẦN SUẤT MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ ĐỘC CỦA Escherichia coli

SINH β- LACTAMASE PHỔ MỞ RỘNG PHÂN LẬP TỪ MÁU, MỦ, VÀ NƯỚC TIỂU”

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên………..

được bảo vệ luận văn trước Hội đồng: ...

PGS. TS. PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “TẦN SUẤT MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU

TỐ ĐỘC CỦA Escherichia coli SINH β- LACTAMASE PHỔ MỞ RỘNG PHÂN

LẬP TỪ MÁU, MỦ VÀ NƯỚC TIỂU” là bài nghiên cứu của chính tơi.

Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tơi cam đoan rằng tồn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được công bố hoặc được sử dụng để nhận bằng cấp ở những nơi khác.

Khơng có sản phẩm/nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận văn này mà khơng được trích dẫn theo đúng quy định.

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các trường đại học hoặc cơ sở đào tạo khác.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2021

Nguyễn Thị Kim Quyên

123docz.net - File bi loi xin lienhe:

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

LỜI CẢM ƠN

Em đặc biệt cảm ơn Cô PGS. TS Phan Thị Phượng Trang đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cô cũng là người đặt nhiều tâm

huyết hơn ai hết giúp em thêm tự tin hoàn thành luận văn này một cách tốt nhất.

Em gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cơ NCS Nguyễn Lý Hồng Ngân trong thời gian thực hiện đề tài. Cơ đã nhiệt tình chia sẻ và truyền đạt những kiến thức thực tế

vô cùng quý giá để nội dung của luận văn này hoàn chỉnh hơn. Chân thành cảm ơn

sự giúp đỡ nhiệt tình của em NCS Tinh Tươm giúp chị hồn thành tốt nhất luận văn

này.

Em chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ từ Ban Giám hiệu, Quý Thầy, Cô

khoa Công Nghệ Sinh Học và Quý Thầy Cô khoa Đào Tạo Sau Đại Học trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian qua. Đồng thời, cảm ơn Ban Lãnh đạo Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học (CBB) - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, Ban lãnh đạo Viện Y tế cơng cộng thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em học tập, thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ.

Chân thành cảm ơn những người bạn đã đồng hành và chia sẻ cùng Quyên những kiến thức mà chúng ta lĩnh hội được trong suốt quá trình học tập.

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình đã luôn là điểm tựa vững chắc cho em trong bất cứ hoàn cảnh nào.

Trân trọng cảm ơn!

123docz.net - File bi loi xin lienhe:

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

TÓM TẮT

E. coli mang gen kháng kháng sinh β-lactamase phổ mở rộng (ESBL) hiện là

mối quan tâm hàng đầu của y tế công cộng. Hiện tại đã có nhiều nghiên cứu về E.

coli sinh ESBL phân lập từ người lành và bệnh phẩm. Tuy nhiên, nghiên cứu về E. coli sinh ESBL phân lập từ bệnh phẩm và đồng thời mang gen mã hóa yếu tố độc lực

ở Việt Nam chưa được tiến hành. Vì vậy, nghiên cứu này sẽ xác định tần suất một số

gen mã hóa yếu tố độc lực của E. coli sinh ESBL phân lập từ bệnh phẩm tại Bệnh

viện Bình Dân, TP. Hồ Chí Minh bằng cách sử dụng phương pháp cắt ngang, mô tả cùng kỹ thuật multiplex-PCR và monoplex-PCR với các cặp mồi đặc hiệu để phát

hiện 16 gen mã hóa yếu tố độc: fimH, fyuA, iutA, PAI, kpsMTII, papC, hlyA,

kpsMTK1, ompT, hlyF, iroN, ireA, ibeA, sfa, iss và cvaC của 127 chủng phân lập từ

các loại bệnh phẩm khác nhau. Kết quả phân tích cho thấy, khơng có sự khác biệt về tần suất 16 gen quan tâm giữa các nhóm bệnh nhân đến từ khu vực TP. Hồ Chí Minh và các khu vực khác, cũng như khơng có sự khác biệt về tần suất tìm thấy các gen

này trong các chủng phân lập từ nhóm bệnh nhân nam và nữ. 4 gen fyuA, iutA, PAI,

fimH chiếm tỷ lệ cao nhất trong cả 3 loại bệnh phẩm nên có thể dùng làm gen chỉ dấu

cho các chủng ExPEC. Khác biệt về tần suất của các gen papC, ibeA, kps MTII giữa các chủng phân lập từ 3 loại bệnh phẩm có ý nghĩa thống kê. Các chủng E. coli sinh

ESBL phân lập từ máu thường mang 6 – 7 gen mã hóa yếu tố độc, trong khi các chủng từ mẫu mủ và nước tiểu thường mang 4 – 7 gen. Có đến 42 kiểu tổ hợp gen mã hóa yếu tố độc khác nhau được phát hiện trong các chủng. Chủng mang nhiều nhất là 12 gen, phân lập từ mẫu nước tiểu. Nghiên cứu này đã phản ánh phần nào mức độ phổ biến của các chủng ExPEC và tiềm năng gây bệnh của chúng.

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

ABSTRACT

ESBL-producing E. coli carrying virulence genes is a concern for public health

and studies on these strains isolated from clinical specimens is lacking. Because of

that, this study aims to determine the prevalence of ESBL-producing E. coli carrying

virulence genes isolated from clinical specimens in Ho Chi Minh city. A prospective, cross-sectional study was conducted in Binh Dan hospital with a total of 127 isolated

from clinical specimens were tested for 16 virulence genes including: fimH, fyuA,

iutA, PAI, kpsMTII, papC, hlyA, kpsMTK1, ompT, hlyF, iroN, ireA, ibeA, sfa, iss and cvaC by 4 multiplex-PCR sets and 3 monoplex-PCR with specific primers. The

analysis results showed that there was no difference in the frequency of 16 genes of interest between groups of patients from HCMC and other areas. There was also no difference in the frequency of these genes found in strains isolated from male and

female patients. The four genes fyuA, iutA, PAI, and fimH account for the highest

percentage in all three types of clinical samples, so they can be used as markers for

ExPEC strains in general. The difference in frequency of papC, ibeA, kps MTII genes

among strains isolated from 3 types of specimens is statistically significant.

ESBL-producing strains of E. coli isolated from blood usually carry 6-7 genes encoding

virulence factors while strains from pus and urine samples usually carry 4-7 genes. Up to 42 different combinations of genes encoding virulence factors were detected in the strains. The strain carried at most 12 genes was isolated from urine sample. Higher

virulence gene diversity was found among clinical isolates of ESBL- producing E.

coli showing that clinical strains need more virulence factors.

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ... 1

1.1. Cơ sở hình thành luận văn ... 1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu ... 1

1.3. Câu hỏi nghiên cứu ... 1

1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ... 2

1.5. Phương pháp nghiên cứu ... 2

1.6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ... 2

CHƯƠNG 2. CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ... 3

2.3. E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng (ESBL) ... 10

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

2.3.1. Kháng với β-lactam ... 10

2.3.2. β-lactamase phổ mở rộng ... 10

2.3.3. Phương pháp phát hiện E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ... 12

2.4. Các yếu tố độc lực trong E. coli ... 13

2.4.1. Yếu tố bám dính và xâm lấn ... 14

2.4.2. Yếu tố thu nhận sắt ... 15

2.4.3. Yếu tố vượt qua hệ miễn dịch của vật chủ ... 16

2.4.4. Độc tố ... 16

2.5. Tình hình nghiên cứu E. coli sinh ESBL... 17

2.5.1. Tỷ lệ E. coli sinh ESBL trên thế giới ... 17

2.5.2. Tỷ lệ E. coli sinh ESBL tại Việt Nam ... 18

2.5.3. Nghiên cứu gen mã hóa yếu tố độc của E. coli sinh ESBL trên thế giới ... 19

2.5.4. Nghiên cứu gen mã hóa yếu tố độc của E. coli sinh ESBL tại Việt Nam ... 19

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ... 21

3.2.1. Phương pháp thu thập chủng E. coli có nguồn gốc từ bệnh phẩm .... 26

3.2.2. Phương pháp kiểm tra E. coli ... 26

3.2.3. Phương pháp đĩa kháng sinh khuếch tán trên môi trường thạch ... 26

3.2.4. Phương pháp xác định kiểu gen mã hóa yếu tố độc lực ... 28

3.3. Phân tích số liệu ... 31

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ... 32

4.1. Định danh sinh hóa các chủng E. coli thu nhận từ mẫu bệnh phẩm . 32

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

4.2. Xác định các chủng E. coli mang kiểu hình ESBL bằng phương pháp

khuếch tán trên đĩa thạch ... 35

4.3. Phát hiện 16 gen mã hóa yếu tố độc lực của E. coli sinh ESBL bằng PCR ... 37

4.3.1. Phát hiện sự hiện diện 16 gen mã hóa yếu tố độc của E. coli bằng PCR ... 37

4.3.2. Phân tích tỷ lệ 16 gen mã hóa các yếu tố độc lực của các chủng E. coli sinh ESBL phân lập từ các mẫu bệnh phẩm ... 44

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 64

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 2.1. Vi khuẩn E. coli... 5

Hình 3.1. Điều kiện khuếch đại của các phản ứng PCR ... 30

Hình 4.1. Khuẩn lạc E. coli trên mơi trường Mac Conkey ... 32

Hình 4.2. Kết quả thử nghiệm IMViC cho E. coli ... 33

Hình 4.3. Tỷ lệ các chủng E. coli thu nhận được từ các mẫu bệnh phẩm... 34

Hình 4.4. Xác định kiểu hình E. coli sinh ESBL bằng phương pháp khuếch tán đĩa kháng sinh kết hợp ... 35

Hình 4.5. Số lượng các chủng E. coli sinh ESBL phát hiện được trong các mẫu bệnh phẩm ... 36

Hình 4.6. Kết quả điện di các phản ứng monoplex-PCR ... 38

Hình 4.7. Hình điện di multiplex-PCR I phát hiện gen PAI, ibeA, fimH ... 40

Hình 4.8. Hình điện di multiplex-PCR II phát hiện gen fyuA, iutA, sfa, kpsMTK1 . 41Hình 4.9. Hình điện di multiplex-PCR III phát hiện 4 gen ironN, ompT, iss, ireA . 42Hình 4.10. Hình điện di multiplex-PCR IV phát hiện gen hlyA và kpsMTII ... 43

Hình 4.11. So sánh tỷ lệ các gen mã hóa yếu tố độc lực ở các khu vực ... Error! Bookmark not defined. Hình 4.12. So sánh tỷ lệ các gen mã hóa yếu tố độc lực ở 2 giới tính ... 47

Hình 4.13. So sánh tỷ lệ các gen mã hóa yếu tố độc lực theo mẫu bệnh ... 49

Hình 4.14. So sánh số lượng chủng E. coli theo số lượng gen mã hóa yếu tố độc phân theo 3 loại bệnh phẩm ... 58

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1. Các đặc tính sinh hóa của E. coli ... 4

Bảng 2.2. Các đảo độc lực và các sản phẩm mã hóa ... 14

Bảng 2.3. Gen mã hóa các yếu tố bám dính và xâm lấn ... 15

Bảng 2.4. Gen mã hóa các yếu tố thu nhận sắt ... 15

Bảng 2.5. Gen mã hóa yếu tố giúp E. coli trốn miễn dịch của vật chủ ... 16

Bảng 2.6. Gen mã hóa những ngoại độc tố của E. coli ... 17

Bảng 2.7. Tỷ lệ E. coli sinh ESBL trên thế giới... 18

Bảng 3.1. Các loại kháng sinh sử dụng ... 23

Bảng 3.2. Các chủng chứng dương được sử dụng ... 23

Bảng 3.3. Thông tin các mồi dùng trong phát hiện 16 gen mã hóa các yếu tố gây độc ... 24

Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR phát hiện các gen mã hóa yếu tố độc ... 29

Bảng 3.5. Các phản ứng PCR phát hiện các gen mã hóa yếu tố độc lực ... 30

Bảng 4.1. Tóm tắt các nghiên cứu về tỷ lệ E. coli sinh ESBL phân lập từ mẫu bệnh phẩm trong nước và trên thế giới ... 37

Bảng 4.2. Tỷ lệ gen mã hóa yếu tố độc lực phân theo khu vực ... 44

Bảng 4.3. Tỷ lệ gen mã hóa yếu tố độc lực phân theo giới tính ... 46

Bảng 4.4. Tỷ lệ gen mã hóa yếu tố độc lực phân theo loại bệnh phẩm ... 48

Bảng 4.5. Số lượng gen mã hóa yếu tố độc lực của các chủng E. coli sinh ESBL phân theo 3 loại bệnh phẩm ... 58

Bảng 4.6. Các tổ hợp kiểu gen mã hóa yếu tố độc trong các chủng E. coli sinh ESBL phân theo từng loại mẫu bệnh phẩm ... 59

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AAC Enzyme chuyển nhóm acetyl (Aminoglycoside acetyltransferase) ABC Hộp gắn ATP (ATP-binding cassette)

AIE E. coli bám dính xâm lấn (Adherent invasive E. coli)

APEC E. coli gây bệnh cho gia cầm (Avian pathogenic E. coli)

CLSI Viện tiêu chuẩn phòng thí nghiệm và lâm sàng (Clinical and

Laboratory Standards Institute)

CRE Vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae)

CTX-M Enzyme cefotaximase-Munich (Cefotaximase - Munich)

CVP Vùng plasmid mang gen mã hóa yếu tố độc lực bảo tồn (Conserved virulence plasmidic)

DAEC E. coli bám dính phân tán (Diffusely adherent E. coli)

DEC E. coli gây tiêu chảy (Diarrheagenic E. coli)

DHFR Enzyme khử nhóm dihydrofolate (Dihydrofolate reductase)

DHPS Enzyme tổng hợp nhóm dihydropteroate (Dihydropteroate synthetase)

DNA Acid Deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid)

E. coli Escherichia coli

EAEC E. coli bám dính ngưng tập đường ruột (Enteroaggregative E. coli)

EHEC E. coli gây xuất huyết ruột (Enterohemorrhagic E. coli)

EIEC E. coli xâm lấn đường ruột (Enteroinvasive E. coli)

EPEC E. coli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic E. coli)

ESBL β-lactamase phổ mở rộng (Extended-spectrum β-lactamase) ETEC E. coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic E. coli)

ExPEC E. coli gây bệnh ngoài ruột (Extraintestinal pathogenic E. coli)

HUS Hội chứng tán huyết tăng urê máu (Hemolytic-uremic syndrome)

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

ibeA Protein A xâm lấn tế bào nội mô hàng rào máu não (Invasion of the brain endothelium protein A)

IMViC I: Indole, M: Methyl - red, V: Voges - Proskauer, C: Citrate IPEC E. coli gây bệnh đường ruột (intestinal pathogenic E. coli)

UPEC E. coli gây bệnh đường niệu (Uropathogenic E. coli)

WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World health organization)

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Cơ sở hình thành luận văn

Escherichia coli (E. coli) gây bệnh ngoài ruột là nguyên nhân gây nhiễm trùng

hàng đầu, đặc biệt nhiễm trùng tiết niệu và viêm màng não trẻ em do vi khuẩn (PB Smith et al., 2006; Ana L. Flores-Mireles et al., 2015) nhờ vào khả năng tiến hóa thu

nhận các gen độc lực (Toni A et al., 2006). Đến nay, phương pháp điều trị hiệu quả

các bệnh trên là sử dụng kháng sinh. Trong bối cảnh hiện tại, phương pháp này đang

bị thách thức bởi các chủng E. coli kháng kháng sinh đặc biệt là các chủng E. coli

kháng cephalosporin thế hệ thứ 3 (tỷ lệ kháng ở Việt Nam lên đến 71%). ( cập nhật năm 2016). Nguyên nhân chủ yếu của sự đề kháng này là do vi khuẩn tiết enzyme -lactamase

phổ mở rộng (ESBL). Các chủng E. coli sinh ESBL gây bệnh nguy hiểm thường

mang các gen đặc trưng mã hóa cho các yếu tố độc. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có

nghiên cứu nào về E. coli sinh ESBL có mang các gen mã hóa yếu tố độc lực. Vì vậy, đề tài này được thực hiện nhằm cung cấp thông tin về các chủng E. coli sinh ESBL

và mang gen độc được phân lập ở Bệnh viện Bình Dân – Thành phố Hồ Chí Minh.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

• Phát hiện E. coli sinh ESBL được phân lập từ máu, mủ và nước tiểu tại Bệnh

viện Bình Dân.

• Xác định sự hiện diện của 16 gen mã hóa các yếu tố độc lực từ các chủng E.

coli mang gen ESBL và phân tích, đánh giá sự xuất hiện của các yếu tố độc

lực dựa trên khu vực sinh sống, độ tuổi, giới tính và loại bệnh.

1.3. Câu hỏi nghiên cứu

Liệu kiểu gen mã hóa yếu tố độc phổ biến trong nhóm E. coli gây bệnh ngồi

ruột (ExPEC) và sinh ESBL tại Việt Nam có tương đồng so với những nghiên cứu

khác trên thế giới hay không?

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn E. coli gây bệnh

• Phạm vi nghiên cứu: E. coli phân lập từ máu, mủ và nước tiểu tại Bệnh viện Bình Dân, Thành phố Hồ Chí Minh trong 4 tháng nghiên cứu.

1.5. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu mô tả, hồi cứu cắt ngang

1.6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học: Đóng góp số liệu về kiểu gen mã hóa yếu tố độc trong nhóm

E. coli gây bệnh ngồi ruột (ExPEC) và sinh ESBL tại Thành phố Hồ Chí Minh nói

riêng và Việt Nam nói chung.

Ý nghĩa thực tiễn: cung cấp thơng tin hữu ích về mặt y tế cơng cộng để có thể đưa ra các liệu pháp chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả cũng như đề phòng các đợt

dịch do E. coli sinh ESBL gây ra tại Việt Nam.

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

CHƯƠNG 2. CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1. Vi khuẩn E. coli

2.1.1. Lịch sử

Vi khuẩn E. coli (Hình 2.1.A) lần đầu tiên được xác định vào năm 1885 và

được đặt tên là Bacterium coli bởi Tiến sĩ Theodor Escherich, một bác sĩ nhi người

Đức. Ơng xác định vi khuẩn này thơng qua các nghiên cứu về hệ vi sinh vật đường ruột có nguồn gốc từ trẻ sơ sinh. Ban đầu, vi khuẩn này được miêu tả là trực khuẩn có thể lên men, bắt màu thuốc nhuộm anilin và mất màu khi xử lý lugol. Sau đó, vi khuẩn này cịn được phát hiện có đặc tính gây bệnh trên đường tiêu hóa (Escherich, 1885).

Cho đến năm 1919, người ta dùng phổ biến tên Bacterium coli và sau đó Castellani và Chalmers đã xác định chi Escherichia và đặt lại tên vi khuẩn này là

E. coli (Castellani & Chalmers, 1919). Cho đến nay, danh pháp khoa học của E. coli

được xác định là một vi khuẩn (Bacteria) thuộc ngành Proteobacteria với bộ và họ là Enterobacteriales và Enterobacteriaceae. Vi khuẩn này thuộc vào một chi tương đối rộng lớn và gần gũi với con người nói chung và xuất hiện nhiều trong các nghiên cứu

về vi sinh vật học từ trước tới nay là Escherichia.

2.1.2. Đặc tính chung

E. coli là vi khuẩn Gram âm, hình que (dài 2,0 - 6,0 μm và rộng 1,1 - 1,5 μm).

Hình dạng thực tế của vi khuẩn này thay đổi từ trực cầu khuẩn đến hình que. E. coli

khơng hình thành bào tử, thường di động thông qua hoạt động của lơng roi. Đây là vi khuẩn kỵ khí tùy ý và sinh hơi từ quá trình lên men carbohydrate mà thường gặp nhất

là lactose ở 37°C và 44°C. Phần lớn vi khuẩn E. coli có phản ứng ortho-nitrophenyl-

β-D-galactoside (ONPG) dương tính, cho thấy hoạt tính của β-galactosidase. Phản ứng methyl red cũng dương tính cho thấy q trình lên men tạo acid từ glucose của

E. coli nhưng phản ứng Voges - Proskauer (sản xuất acetoin) lại âm tính. Vi khuẩn

này có enzyme tryptophanase phân giải trypton nhưng không thể thủy phân urê và không thể phát triển khi có mặt xyanua. Đa số chủng có khả năng khử gốc carboxyl

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

của lysine, không thể dùng citrate như nguồn carbon duy nhất nên không phát triển

được trên thạch Simmons’s citrate. Vì vậy, để phân biệt E. coli với các vi khuẩn

đường ruột khác có thể dùng thử nghiệm IMViC (I: Indole, M: Methyl red, V: Voges - Proskauer, C: Citrate).

E. coli có nguồn gốc từ phân và hầu như chỉ được tìm thấy ở đường tiêu hóa

của động vật, đặc biệt là con người. Do đó, việc phát hiện E. coli trong nước uống

được sử dụng như một dấu chỉ về sự ô nhiễm phân và được gọi là chỉ số coliform

(Leclerc et al., 2001). Các đặc tính sinh hóa chính của E. coli được nêu ra trong Bảng

2.1 (Percival & Williams, 2014).

Bảng 2.1. Các đặc tính sinh hóa của E. coli

Mọc trên mơi trường MacConkey Có

Lên men lactose ở 37 – 44oC Có, sinh hơi, tạo mơi trường acid Adonitol và Inositol Có (90% các chủng)

Khử amin hóa phenylalanine Khơng

Khử carboxyl hóa glutamine acid Có Khử carboxyl hóa lysine Có

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

E. coli phát triển tốt trên nhiều môi trường nuôi cấy khác nhau ở 37°C, pH 7,0

- 7,2 với thời gian nhân đôi từ 20 - 30 phút. E. coli làm đục môi trường lỏng sau 3 - 4 giờ. Đặc biệt, trên môi trường Mac Conkey ở 37°C sau 18 - 24 giờ, E. coli tạo khuẩn

lạc dạng S từ 1 - 2 mm, lên men lactose làm đổi màu mơi trường thành đỏ hồng (Hình

2.1.B) (Al-Zarouni et al., 2008).

Hình 2.1. Vi khuẩn E. coli

A. Dưới kính hiển vi quang học (Erjavec, 2019)

B. Khuẩn lạc trên môi trường Mac Conkey (Al-Zarouni et al., 2008)

2.1.3. Các dạng kháng nguyên của E. coli

Các dạng kháng nguyên của E. coli được chia làm 3 loại chính: kháng ngun

vỏ K (80 nhóm), kháng ngun lơng H (53 nhóm), kháng nguyên thân O (186 nhóm).

2.1.3.1. Kháng nguyên O

Thuộc nhóm kháng nguyên vách hay bề mặt tế bào, nhóm này hình thành từ lipopolysacharide (LPS). Chúng có các đặc tính: bền nhiệt (chịu nhiệt 100°C trong 2 - 4 giờ), có khả năng cảm ứng hệ miễn dịch của con người tạo nên các kháng thể đặc hiệu tương ứng với kháng nguyên hoặc cũng có thể gây ngưng kết chéo giữa các

nhóm. Vi khuẩn E. coli có 186 loại kháng nguyên O được kí hiệu từ O1 đến O188

ngoại trừ một số loại như O31,… (Rivas et al., 2015).

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

2.1.3.2. Kháng nguyên H

Cho tới ngày nay, 53 nhóm kháng ngun lơng H của E. coli đã được phát hiện

nhờ các kỹ thuật huyết thanh học (kí hiệu từ H1 đến H56 ngoại trừ một số loại như H13,…) (ørskov et al., 1975). Ngồi ra, các kháng ngun H cũng có thể được phân biệt nhờ vào phương pháp MALDI-TOF hoặc phổ biến nhất là phương pháp phân tử

(PCR) dựa trên vùng giữa của gen fliC (kháng ngun lơng), mã hóa cho FliC là một

protein cấu trúc vùng filament của lơng (flagella), do có nhiều khác biệt ở các acid amin ở vùng này. Tuy nhiên, kỹ thuật này còn gặp khó khăn khi phân biệt một số kháng nguyên như H1, H12, H25, H28 (Beutin et al., 2016).

2.1.3.3. Kháng nguyên K

Lên đến 80 nhóm kháng nguyên nang K (kháng nguyên vi hay kháng nguyên

vỏ bản chất polysaccharide) trong E. coli đã được phát hiện. Chúng thường có tính

kháng ngun yếu, khơng kích thích được đáp ứng ở vật chủ. Nhiều loại kháng nguyên K ngưng kết chéo lẫn nhau hoặc với kháng nguyên O của một số chủng

E. coli khác ("The Serology of the Coli Group," 1947).

Sự kết hợp của ba nhóm kháng nguyên này là ngẫu nhiên theo nhiều cách khác nhau. Vì vậy, cho đến nay đã có hơn 100.000 kiểu kháng huyết thanh khác nhau của

E. coli. Trước khi sinh học phân tử ra đời, E. coli thường được phân loại dựa trên

kháng nguyên (Fratamico et al., 2016). Một trong những chủng E. coli được phân loại dựa trên kháng nguyên nổi tiếng phải kể đến là E. coli O157:H7 (serogroup O157 và

serotype H7) (Bavaro, 2012). Đây là serotype được nghiên cứu nhiều trên thế giới do có khả năng gây bệnh trên diện rộng và khả năng sống sót rất cao ngay cả trong điều kiện nhiệt độ thấp (Watterworth et al., 2006).

2.2. Các dạng E. coli thường gặp 2.2.1. E. coli hội sinh

Một trong những chủng vi khuẩn xuất hiện đầu tiên trong ruột người là E. coli,

góp phần tạo mơi trường kỵ khí cho vi khuẩn khác xuất hiện và phát triển ở cơ quan

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

này. Mơi trường sống chính của E. coli trong hệ tiêu hóa là lớp nhầy ruột già. Thơng thường, E. coli và vật chủ cùng tồn tại và cùng có lợi: E. coli nhận thức ăn (prebiotic),

nơi cư trú từ vật chủ đồng thời sản xuất vitamin K và bảo vệ vật chủ thông qua việc chống lại các vi khuẩn có hại bằng phương thức cạnh tranh. Những chủng này được

gọi là E. coli hội sinh và gồm 2 nhóm: nhóm E. coli thường trú trong ruột nhiều tháng đến nhiều năm và nhóm E. coli thống qua (biến mất sau vài tuần tồn tại). Các chủng

E. coli thường trú thường mang các gen độc lực mã hóa các yếu tố: lơng loại, vỏ, tan

máu, thu nhận sắt (aerobactin)... Chúng được xem là điều kiện thích ứng giúp vi khuẩn tồn tại trong ruột người mặc dù không phải lúc nào cũng gây độc (Kaper et al., 2004).

Phần lớn E. coli là vi khuẩn thường trú không gây hại. Dù vậy, nhiều chủng

E. coli có thể gây nhiều bệnh nhiễm trùng nặng thậm chí tử vong. Một số chủng E. coli thu nhận được những yếu tố độc lực, đặc biệt thơng qua chuyển gen ngang trong

q trình tiến hóa giúp thích nghi với điều kiện mơi trường ln biến động và gây ra

các bệnh ngồi ruột (Kaper et al., 2004).

2.2.2. E. coli gây bệnh 2.2.2.1. Định nghĩa

E. coli thường gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng ở người như nhiễm trùng đường

tiết niệu (UTIs) thường xảy ra do E. coli di chuyển từ trực tràng đến niệu đạo. Nhiễm

trùng tại các vị trí khác của cơ thể thường phát sinh do vi khuẩn di chuyển theo đường

máu như gây bệnh viêm màng não ở trẻ nhỏ. E. coli cũng là một trong số những

nguyên nhân phổ biến gây nhiễm trùng vết thương sau phẫu thuật - nơi có thể phát sinh nhiễm trùng trực tiếp vào vết thương (khi ruột bị hở) hoặc nhiễm bẩn gián tiếp qua phân bệnh nhân.

Muir và Ritchie (1921) là những nhà khoa học đầu tiên mô tả khả năng gây

bệnh của E. coli liên quan đến nhiễm trùng đường ruột và đường tiết niệu, tiêu chảy ở trẻ nhỏ và ngộ độc thực phẩm. Ngày nay, người ta phân loại E. coli theo vị trí gây bệnh trên cơ thể, có thể phân thành hai nhóm chính gồm nhóm E. coli gây bệnh đường

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

ruột (intestinal pathogenic E. coli - IPEC) và nhóm E. coli gây bệnh ngoài ruột (extraintestinal pathogenic E. coli - ExPEC) gây nhiễm trùng tại các vị trí ngồi

đường tiêu hóa (Percival & Williams, 2014).

2.2.2.2. E. coli gây bệnh đường ruột

E. coli gây bệnh đường ruột có thể nhận biết dựa trên những yếu tố độc lực

đặc trưng. Có ít nhất sáu nhóm E. coli gây bệnh đường ruột khác nhau và mỗi loại

bao gồm một số hình thức bám dính ban đầu vào tế bào chủ thơng qua việc tạo độc

tố hoặc tác động trực tiếp. Các nhóm E. coli này bao gồm enteroinvasive E. coli (EIEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enterohaemorrhagic E. coli (EHEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), và diffuse adherent E. coli (DAEC). Mỗi nhóm gây ra bệnh thơng qua các cơ chế khác nhau và

mỗi bệnh lại biểu hiện các triệu chứng khác nhau trên cơ thể người (Croxen & Finlay, 2010).

2.2.2.3. E. coli gây bệnh ngồi ruột

Khác với nhóm E. coli gây bệnh đường ruột, E. coli gây bệnh ngoài ruột là

những tác nhân gây bệnh tiềm tàng. Mặc dù thường trú trong ruột người, chúng có thể gây bệnh khi vật chủ bị suy giảm miễn dịch hoặc khi một số yếu tố mơi trường làm biểu hiện các gen mã hóa yếu tố độc lực cũng như kháng kháng sinh trong q trình thích nghi. Các chủng này là những ổ chứa gen mã hóa yếu tố độc lực và kháng kháng sinh có thể được lan truyền qua q trình gọi là chuyển gen ngang (Bailey et

al., 2010). Các chủng E. coli gây bệnh ngoài ruột được chia làm 2 nhóm chính: UPEC - nhiễm trùng đường tiết niệu (uropathogenic E. coli) và NMEC - nhiễm trùng máu hoặc viêm màng não (neonatal meningitis E. coli) (Clements et al., 2012).

Nhiễm trùng đường tiết niệu chiếm khoảng 40% tổng số loại nhiễm trùng và 10 - 20% nhiễm trùng bệnh viện, trong đó 81% xảy ra ở phụ nữ 16-35 tuổi. Các chủng

E. coli UPEC là nguyên nhân gây ra 75 - 95% các trường hợp nhiễm trùng tiểu không

biến chứng và 40 - 50% các trường hợp nhiễm trùng tiểu phức tạp. Nhóm UPEC gây nhiễm trùng đường tiểu mang những gen mã hóa cho yếu tố bám dính giúp vi khuẩn

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

bám vào biểu mô đường tiết niệu như lông loại 1, F1C, lông loại P (Pap), S…; yếu tố tan máu α, yếu tố hoại tử tế bào, protease vận chuyển chủ động Sat, … Đầu tiên, một chủng UPEC tấn công vào đường ruột vật chủ nhờ các yếu tố độc lực trên đảo độc lực bằng cách đi vào niệu đạo đến bàng quang. Sau khi xâm lấn, vi khuẩn biểu hiện lông loại 1 nhờ vào môi trường chọn lọc trong bàng quang. Lông loại này gắn vào đường mannose nằm trên thụ thể uroplakin của biểu mô bàng quang nhằm thúc đẩy chết theo chương trình và làm bong các tế bào biểu mơ. Tuy nhiên, ở các chủng UPEC gây viêm bể thận, lơng loại 1 ít biểu hiện nên cho phép vi khuẩn đi từ niệu quản đến thận, biểu hiện lông loại P gắn vào thụ thể ở tế bào biểu mơ thận. Sau đó, vi khuẩn tiết ra các yếu tố tan máu (haemolysin α) gây tổn thương biểu mô thận. Sự tiết Sat sẽ làm tổn thương tiểu cầu thận và các tế bào liền kề. Trong vài điều kiện đặc biệt, vi khuẩn có thể gây ra nhiễm trùng máu (Kaper et al., 2004).

Nhóm E. coli NMEC gây nhiễm trùng máu là tác nhân gây viêm màng não sơ

sinh hàng đầu với tỷ lệ tử vong khá cao lên đến 15 - 40%. Có sự liên kết giữa lượng vi khuẩn trong máu với bệnh viêm màng não. Cụ thể nếu số lượng vi khuẩn gây nhiễm trùng trên 103 CFU/mL máu sẽ dễ diễn tiến sang viêm màng não. Protein vỏ K1 không ảnh hưởng tới khả năng vượt qua hàng rào máu não của vi khuẩn, tuy nhiên chỉ có chủng có vỏ K1 mới có thể gây bệnh. Khả năng gây bệnh phụ thuộc vào cấu trúc di truyền và các gen mã hóa yếu tố độc lực. Các yếu tố độc lực nổi bật trong chủng

NMEC phải kể đến kháng nguyên K1 có chức năng giúp E. coli chống lại thực bào, giúp vi khuẩn lây lan, tăng cường xâm nhập vào tế bào và mô (ibeA, ibeB, ibeC); Iss protein giúp E. coli chống lại thực bào và yếu tố kích thích khuẩn lạc V (không hiện

diện trong các chủng UPEC) (Kaper et al., 2004).

Họ β-lactam (cephalosporin), aminoglycoside (gắn vào tiểu đơn vị 30S ribosome của vi khuẩn tại đoạn 16S rRNA làm ức chế tổng hợp protein), fluoroquinolon (ức chế DNA gygrase hoặc topoisomerase IV ngăn cản quá trình sao chép DNA) và trimethoprim – sulfamethoxa (ức chế cạnh tranh các enzyme trong con đường sinh tổng hợp folate) được coi là các loại kháng sinh đầu tiên thường được sử

dụng để điều trị nhiễm trùng cộng đồng và bệnh viện do E. coli gây ra. Việc quản lý

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

các bệnh nhiễm trùng do ExPEC gây ra rất phức tạp do sự xuất hiện của các chủng kháng kháng sinh. Cho đến cuối những năm 1990, ExPEC tương đối nhạy cảm với các kháng sinh kể trên; tuy nhiên, từ những năm 2000 đã xuất hiện 20 đến 45% ExPEC kháng với cephalosporin, fluoroquinolones và trimethoprim – sulfamethoxazole trên toàn thế giới, gây ra sự chậm trễ trong điều trị thích hợp và gia tăng tỷ lệ mắc bệnh và tử vong sau đó (Tumbarello et al., 2007).

2.3. E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng (ESBL)

2.3.1. Kháng với β-lactam

Các kháng sinh nhóm β-lactam, đặc biệt là các cephalosporin thế hệ thứ ba, là một nhóm kháng sinh chính dùng điều trị nhiều bệnh nhiễm trùng nặng khởi phát tại

cộng đồng hoặc bệnh viện do E. coli gây ra. Cấu trúc của chúng bao gồm lõi chứa

vịng β-lactam có 4 cạnh. β-lactamase (penicillase, extended spetrum β-lactamase, metallo β-lactamase, cephalosporinase và carbapenemase) là các enzyme do vi khuẩn sản sinh làm thay đổi cấu trúc các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam bằng cơ chế thủy phân làm mở vòng β-lactam, tạo thành các hợp chất mất hoạt tính kháng khuẩn.

Quan trọng nhất trong số các chủng ExPEC là sự xuất hiện ngày một tăng của các biến chủng có khả năng sinh β-lactamase bao gồm những chủng β-lactamase AmpC qua trung gian plasmid (CMY), chủng sinh β-lactamase phổ mở rộng (ESBL như CTX-M) và carbapenemase. Việc các chủng vi khuẩn sản xuất được β-lactamase thường dẫn đến kháng phổ rộng đối với phần nhiều kháng sinh thuộc nhóm β-lactam và trong đó các chủng sản sinh ra β-lactamase phổ mở rộng là nguyên nhân chính gây

ra sự đề kháng mới nổi đối với các kháng sinh nhóm β-lactam ở E. coli (Pitout, 2012).

2.3.2. β-lactamase phổ mở rộng

β-lactamase phổ mở rộng được viết tắt là ESBL, các enzyme này lần đầu tiên được mô tả năm 1983 do khả năng kháng được với các cephalosporin thế hệ thứ 3 và thế hệ thứ 4. Chúng có thể phân giải penicilin, cephalosporin và monobactam nhưng không phân giải cephamycin và carbapenem. β-lactamase phổ mở rộng bị ức chế bởi các chất ngăn cản β-lactamase ‘cổ điển’ như acid clavulanic, sulbactam và

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

tazobactam. Mặc dù ESBL đã được tìm thấy trong nhiều vi khuẩn thuộc

Enterobacteriaceae, chúng thường hiện diện nhất ở E. coli và Klebsiella pneumoniae.

Phần nhiều các ESBL được phân lập từ mẫu lâm sàng ở những năm 1980 và 1990 thuộc các họ: họ TEM (Temoneira - 223 biến thể), họ SHV (sulfhydryl variable - 193 biến thể), biến thể sulphydryl và họ CTX-M (cefotaximase Munich - 172 biến thể) (Paterson & Bonomo, 2005).

CTX-M β-lactamase có nguồn gốc từ Kluyvera spp. trở nên nổi bật vào những năm 2000 với những báo cáo về các chủng E. coli phân lập từ mẫu lâm sàng sản sinh

được các enzyme này từ châu Âu, châu Phi, châu Á, Nam và Bắc Mỹ. Kể từ giữa những năm 2000, CTX-M β-lactamase cũng đã được xác định trong các thành viên

khác nhau của Enterobacteriaceae nhưng vẫn đặc biệt phổ biến ở E. coli và đã trở

thành loại ESBL phổ biến và lan rộng nhất được xác định trên toàn thế giới (Pitout & Laupland, 2008).

Hiện nay, loại enzyme CTX-M phổ biến nhất trong số các chủng vi khuẩn

E. coli phân lập trên lâm sàng ở người là CTX-M-15. ExPEC sản xuất được enzyme

này thường thuộc các chủng ST131 và ít gặp hơn là ST38, ST405 và ST648. Các biến thể của ST131 có thể khác nhau về cấu hình độc lực và khả năng lây lan. Sự phân bố toàn cầu của ST131 cũng phản ánh sự chọn lọc có tính lặp lại của các biến thể địa phương và kết quả là thu được một số plasmid kháng nhất định (J. R. Johnson et al.,

2012). Một nghiên cứu từ Canada về E. coli sản sinh ESBL gây nhiễm trùng máu từ

giai đoạn 2000 - 2010 cho thấy ST131 là loại trình tự kháng kháng sinh và có tính phổ biến nhất (Peirano et al., 2012). Johnson và cộng sự đã nghiên cứu 199 chủng vi

khuẩn E. coli kháng trimethoprim - sulfamethox azole và kháng fluoroquinolone,

được phân lập từ các mẫu nước tiểu ở Canada trong giai đoạn 2002 - 2004 đã xác định được ST131 trong 23% số chủng phân lập; gần như tất cả chúng đều kháng fluoroquinolon (99%). Đáng chú ý, các chủng này vẫn nhạy cảm với cephalosporin (chỉ 2% ST131 trong nghiên cứu đó kháng lại cephalosporin) và ST131 có độc lực cao hơn đáng kể so với các ExPEC khác nhờ vào sự hiện diện của một số loại protein

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

kháng độc tố như protein đặc hiệu gây viêm đường tiết niệu (usp); protein màng ngoài (ompT); độc tố autotransporter (sat), thụ thể aerobactin (iutA). Kết quả nghiên cứu

này cũng cho thấy ST131 có đặc điểm độc lực và tính kháng đặc biệt so với các chủng

E. coli khác. Do vậy, các tác giả đã kết luận rằng sự kết hợp giữa việc sử dụng thuốc

kháng sinh của con người và một số yếu tố độc lực nhất định sẵn có của vi khuẩn có thể là nguyên nhân dẫn đến khả năng thành công cao khi vượt qua các biện pháp dịch tễ học chống lại các chủng này (James R. Johnson et al., 2009). Kết quả từ các nghiên cứu điều tra các yếu tố độc lực giữa các loại trình tự cho thấy rằng các yếu tố độc lực

nhất định, chẳng hạn như sat, iutA, malX, usp và ompT làm tăng khả năng thích ứng, tăng sức cạnh tranh và xâm chiếm cơ thể người một cách hiệu quả. Ngày nay, E. coli

sản sinh ESBL là vi khuẩn được quan tâm đặc biệt trong thế giới vi khuẩn kháng

thuốc. Một báo cáo từ Hiệp hội bệnh Truyền nhiễm Hoa Kỳ đã liệt kê E. coli sản sinh

ESBL là vi khuẩn kháng thuốc cần được ưu tiên tìm kiếm các liệu pháp điều trị mới (Talbot et al., 2006).

2.3.3. Phương pháp phát hiện E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng

Việc phát hiện sớm các chủng E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng trong

cộng đồng sẽ đặt ra các cảnh báo sớm có giá trị cho y tế cơng cộng về những cơ chế kháng thuốc mới ở các vi khuẩn quan trọng trong lâm sàng, góp phần đưa ra liệu pháp trị bệnh do nhiễm khuẩn thích hợp và hiệu quả, ngăn ngừa và kiểm soát sự nhiễm trùng.

Các phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh β-lactamase có thể được chia thành hai nhóm: (i) các xét nghiệm kiểu hình nhằm phát hiện khả năng thủy phân các cephalosporin và/hoặc carbapenem khác nhau của các chủng thử nghiệm, (ii) sử dụng kỹ thuật phân tử để phát hiện các gen chịu trách nhiệm sản xuất β-lactamase.

Năm 2010, Viện Tiêu chuẩn Phịng thí nghiệm và Lâm sàng (CLSI) đã xuất bản các hướng dẫn đầu tiên về phát hiện ESBL trong Enterobacteriaceae, bao gồm sàng lọc với cefpodoxime, cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone hoặc aztreonam. CLSI hiện khuyến cáo rằng các phịng thí nghiệm lâm sàng nên báo cáo tính nhạy

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

cảm của cephalosporin thế hệ thứ ba và thứ tư. Trong văn bản cập nhật mới nhất năm 2017, CLSI đã sửa đổi và cải tiến quy trình phát hiện ESBL thông qua 4 kháng sinh cefotaxime/clavulanic acid, ceftazidime/clavulanic acid, cefotaxime và ceftazidime. Các xét nghiệm kiểu hình ESBL vẫn được dùng tương đối phổ biến cho các mục đích dịch tễ học hoặc kiểm sốt nhiễm trùng. Các phương pháp kiểu hình khác bao gồm một số hệ thống tự động và que thử ESBL E-test, …

Kỹ thuật phân tử được sử dụng phổ biến nhất để phát hiện ESBL là PCR

khuếch đại gen TEM, SHV hay CTX-M rồi sau đó giải trình tự. Ngồi ra cịn có một

số phương pháp microarray DNA thương mại và phương pháp PCR thời gian thực để phát hiện các loại ESBL khác nhau.

Nhìn chung, các phương pháp kiểu hình có hiệu quả về chi phí và có thể được tiến hành một cách tương đối dễ dàng. Do đó vẫn được sử dụng phổ biến trong hầu hết các phịng thí nghiệm vi sinh ngày nay. Các phương pháp phân tử thường đắt hơn so với các xét nghiệm kiểu hình và hầu như chỉ có sẵn trong các viện nghiên cứu hiện đại và phịng thí nghiệm lớn (Pitout, 2012).

2.4. Các yếu tố độc lực trong E. coli

E. coli tích lũy nhiều yếu tố độc lực qua tiến hóa nên chúng dễ dàng tấn cơng

vật chủ. Các chủng E. coli gây bệnh ngoài ruột cần những yếu tố độc lực đặc trưng

để gây bệnh tại các vị trí khác nhau trên cơ thể. Các gen mã hóa các yếu tố độc lực này thường nằm trên đảo độc lực (PAI) hoặc các plasmid độc lực.

Đảo độc lực là nơi đặc biệt tích lũy các gen độc lực nằm trên nhiễm sắc thể. Đảo độc lực lan truyền giữa các quần thể vi khuẩn bằng cách chuyển gen ngang. Một

số đảo độc lực trên E. coli sản sinh các sản phẩm mã hóa có liên quan được trình bày

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Bảng 2.2. Các đảo độc lực và các sản phẩm mã hóa

IICFT073 Lông bám B, các protein thu nhận sắt

I536 α-Hemolysin, F-17-like fimbriae, CS12-like fimbriae

II536 Yếu tố bám dính Hek, lơng bám loại P, α-Hemolysin, yếu tố bám dính hemagglutinin

III536 Lơng bám S, salmochelin, HmuR-like heme receptor, độc tố Sat, Tsh-like hemoglobin protease

IV536 Hệ thống siderophore Yersiniabactin IIJ96 α -Hemolysin, độc tố, yếu tố hoại tử tế bào

Các plasmid tự nhiên tiến hóa theo chiều hướng thúc đẩy sự phổ biến của nhiều

yếu tố như khả năng kháng thuốc, độc lực và chuyển hóa các chất hiếm. E. coli có

mang nhiều loại plasmid khác nhau, bao gồm những loại liên quan đến độc lực. Các plasmid mã hóa các đặc điểm liên quan đến độc lực hầu như chỉ nằm trong một họ khơng tương thích duy nhất được gọi là IncF. Giống như các chủng vi khuẩn gây

bệnh đường ruột, nhiều chủng E. coli gây bệnh ngoài ruột cũng chứa plasmid độc lực

(Tivendale et al., 2010).

Ngày nay, người ta đã tìm ra gần 60 gen mã hóa cho các yếu tố độc lực khác

nhau trên E. coli. Dựa trên chức năng, có thể phân loại chúng thành các nhóm: (i) yếu

tố bám dính và xâm lấn mô, (ii) yếu tố thu nhận sắt, (iii) yếu tố vượt qua hệ miễn dịch vật chủ, (iv) yếu tố mã hóa độc tố.

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Yếu tố bám dính khơng thuộc lơng là những protein nằm sẵn trên mặt tế bào vi khuẩn giúp tăng cường liên kết với vật chủ thông qua sự sắp xếp lại sợi actin từ đó kích thích tế bào chủ thực bào.

Các yếu tố bám dính và xâm lấn phổ biến nhất trong E. coli được liệt kê trong

Bảng 2.3 (Erjavec, 2019).

Bảng 2.3. Gen mã hóa các yếu tố bám dính và xâm lấn

Thụ thể enterobactin và tác nhân kết dính iha

Yếu tố bám dính khơng thuộc lơng (Afa) afa/draBC

Yếu tố tấn công hàng rào máu não (IbeA) ibeA

Kháng nguyên yếu tố xâm lấn I (CFA/I) cfaB

E. coli bao gồm các hợp chất trọng lượng phân tử thấp, ái lực cao với sắt vi lượng.

Những hệ thống thu nhận sắt phổ biến được trình bày trong Bảng 2.4.

Bảng 2.4. Gen mã hóa các yếu tố thu nhận sắt

Yếu tố ngưng kết nhạy nhiệt (Tsh), enzyme phân hủy protein sắc tố máu (Hbp)

tsh, hbp

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

Các yếu tố thu nhận sắt Gen mã hóa

Thụ thể gắn sắt ferrichrome (Fhu) fhuA

2.4.3. Yếu tố vượt qua hệ miễn dịch của vật chủ

Cơ thể con người qua q trình tiến hóa đã hình thành nhiều cơ chế ngăn sự tấn công của tác nhân bên ngoài mà hiệu quả nhất là hệ thống miễn dịch. Song song với q trình tiến hóa đó, vi khuẩn cũng đã phát triển những cơ chế nhằm vượt qua các cơ chế miễn dịch bẩm sinh và các cơ chế miễn dịch đặc hiệu của vật chủ.

Vỏ là một mạng lưới polymer bao bên ngoài bảo vệ vi khuẩn khỏi đáp ứng của vật chủ cũng như giúp vi khuẩn đề kháng với huyết thanh (ngăn hoạt hóa bổ thể) ở vi khuẩn do thay đổi lớp lipopolysaccharide bằng cách gắn acid sialic hay làm biến đổi của kháng nguyên O. Một ví dụ khác là protein traT liên quan đến tiếp hợp hay protein chứa thụ thể Toll/interleukin-1 (Tcp) bất hoạt hoạt động của hệ thống TLR ở vật chủ.

Các yếu tố vượt qua hệ miễn dịch vật chủ nổi bật được liệt kê trong Bảng 2.5 (Erjavec,

2019).

Bảng 2.5. Gen mã hóa yếu tố giúp E. coli trốn miễn dịch của vật chủ

2.4.4. Độc tố

Độc tố là những chất E. coli sinh ra làm tổn thương vật chủ. Độc tố giữ vai trị

thiết yếu trong q trình nhiễm trùng vì chúng góp phần vào việc phát tán vi khuẩn

Protein bề mặt (tiếp hợp - chuyển gen ngang) (TraT) traT

Yếu tố cải thiện khả năng sống trong huyết thanh (Iss) iss

Yếu tố ức chế miễn dịch bẩm sinh (Toll/ protein chứa vùng thụ thể interleukin-1 -Tcp)

tcpC

Yếu tố tạo điều kiện hình thành khuẩn lạc cvaC, colV

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

trong các mơ, tăng độc tính tế bào và giảm sự nhạy cảm với bạch cầu trung tính (Sarowska et al., 2019).

Ngoại độc tố (exotoxin) là những protein được sinh ra trong E. coli sau đó tiết

vào mơi trường hoặc nằm trong chu chất và giải phóng ra ngồi khi ly giải vi khuẩn.

Chúng khác nhau về hoạt tính cũng như tế bào đích mà chúng tác động (Bảng 2.6).

Nội độc tố (endotoxin) trong E. coli là lipid A (thuộc màng ngoài

lipopolysaccharide của vi khuẩn Gram âm). Lipid A có có khả năng hoạt hóa, kích thích giải phóng các cytokine và thường chỉ có tác dụng khi ly giải tế bào.

Bảng 2.6. Gen mã hóa những ngoại độc tố của E. coli

Yếu tố hoại tử tế bào - 1 (CNF-1) cnf-1

Yếu tố biến dạng tế bào (CDT1) cdtB

Protein đặc hiệu gây bệnh tiết niệu (Usp) usp

Độc tố không bền nhiệt loại I (LTI), loại II (LTII) eltI, eltIIa

Độc tố bền nhiệt có trọng lượng phân tử thấp (EAST1) ast

Kênh vận chuyển chủ động hemagglutinin nhạy nhiệt tsh

Kênh vận chuyển chủ động vacuolating vat

2.5. Tình hình nghiên cứu E. coli sinh ESBL 2.5.1. Tỷ lệ E. coli sinh ESBL trên thế giới

Các nghiên cứu trên đối tượng E. coli kháng kháng sinh và E. coli sinh ESBL

nói riêng có nguồn gốc từ người bệnh và người khỏe mạnh đã và đang được tiến hành tại nhiều quốc gia trên thế giới nhằm kiểm soát và dự đoán, đối phó kịp thời với thực

trạng vi khuẩn kháng kháng sinh đang trầm trọng trên quy mơ tồn cầu. Bảng 2.7

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

tóm tắt một số báo cáo về tỷ lệ E. coli sinh ESBL trên thế giới trong thời gian gần

đây.

Bảng 2.7. Tỷ lệ E. coli sinh ESBL trên thế giới

sinh ESBL

Nguồn

Châu Á Trung Quốc 2017 55,5% (Quan et al., 2017) Ấn Độ 2015 55,69% (Shaikh et al., 2015) Ai Cập 2020 40% (ElBaradei et al., 2020) Iran 2021 35,7% (Gharavi et al., 2021) Châu Âu Anh 2019 11% (Day et al., 2019)

Libya 2014 13,4% (S. F. Ahmed et al., 2014) Thụy sĩ 2012 5,8% (Geser et al., 2012)

Châu Phi 2019 29,9% (Malande et al., 2019)

Các báo cáo này cho thấy tần suất xuất hiện của vi khuẩn E. coli sinh ESBL

tại các quốc gia, khu vực đang phát triển như Châu Á, Châu Phi, … cịn tương đối cao. Trong khi đó, tại các khu vực có nhiều quốc gia phát triển như châu Âu, tỷ lệ

hiện diện vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong các nghiên cứu thấp vì chất lượng cuộc

sống cao, kiểm soát lượng kháng sinh trong thực phẩm cũng như trong y tế rất nghiêm ngặt. Ngoài ra, một nghiên cứu meta-analysis vào năm 2020 cho thấy, tỷ lệ lưu hành

toàn cầu của E. coli sinh ESBL trong ruột là 16,5% và có xu hướng tăng theo từng

năm. Trong đó, tỷ lệ lưu hành của các chủng này cao nhất ở khu vực Đông Nam Á (27%) và thấp nhất ở khu vực châu Âu (6%) (Bezabih et al., 2020).

2.5.2. Tỷ lệ E. coli sinh ESBL tại Việt Nam

Tần suất xuất hiện của E. coli sinh ESBL tại Việt Nam biến động qua các năm

gần đây cho thấy không tuân theo quy luật. Con số thống kê tăng từ 2010 đến 2015 và giảm từ 2015 đến 2017. Tuy nhiên, cho tới năm 2020, bằng việc áp dụng các

phương pháp sinh học phân tử kết hợp với tin sinh học đã cho thấy tỷ lệ E. coli sinh

ESBL lại đang có xu hướng tăng. Cụ thể: 2010- 40%, 2013 - 44%, 2015 - 51%, 2016

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

- 45%, 2017 - 15%, 2020 - 89% (Bui et al., 2015; T. A. V. Hoang et al., 2017; Nakayama et al., 2015; Roberts et al., 2020; Trang et al., 2013).

2.5.3. Nghiên cứu gen mã hóa yếu tố độc của E. coli sinh ESBL trên thế giới

Nhiều nghiên cứu về các gen mã hóa yếu tố độc của E. coli trên thế giới chỉ ra

rằng những gen này thường nằm thành cụm chung với các vùng gen mới của vi khuẩn và được lây lan thơng qua q trình gọi là chuyển gen ngang nhờ các đảo độc lực (T.

J. Johnson & Nolan, 2009) hoặc trên plasmid (các gen thường gặp: ompT, hlyF, cvaC,

iutA, iroN, iss, cnf-1) (Sabaté et al., 2006).

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về gen mã hóa yếu tố độc lực của nhóm

E. coli gây bệnh ngoài ruột và sinh ESBL được phân lập từ người khỏe mạnh, từ mẫu

bệnh phẩm (viêm màng não, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng tiết niệu). Nhìn chung

tần suất gen mã hóa yếu tố độc lực trong nhóm E. coli gây bệnh cao hơn nhóm E. coli

phân lập từ người khỏe mạnh(các gen traT, ompT, afa, fimH, kpsII, fyuA, ireA, iroN,

iutA và papC) (Munkhdelger et al., 2017; Rodríguez-Bo et al., 2012).

2.5.4. Nghiên cứu gen mã hóa yếu tố độc của E. coli sinh ESBL tại Việt Nam

Nghiên cứu gen mã hóa yếu tố độc lực trên E. coli hiện nay tại Việt Nam chủ yếu trên các chủng E. coli có nguồn gốc từ động vật (Trung et al., 2016; Vu-Khac &

Cornick, 2008) hoặc thực phẩm (Van et al., 2008).

Đối với đối tượng là người khỏe mạnh, chỉ có một báo cáo về các gen mã hóa

yếu tố độc lực của nhóm E. coli sinh ESBL gây bệnh đường ruột. Báo cáo này chỉ ra một số gen phổ biến có thể kể đến là ast, eaf, eaeA, elt và eag (P. H. Hoang et al.,

2017).

Cho tới nay, chưa có nghiên cứu nào ở Việt Nam tập trung vào các chủng E.

coli sinh ESBL gây bệnh ngoài ruột cũng như các yếu tố độc lực của chúng. Việc

nghiên cứu về chủ đề trên sẽ cung cấp nhiều thông tin cho nền y tế cộng đồng ở Việt

Nam nói chung và cho các nghiên cứu sâu hơn về E. coli phân lập từ bệnh phẩm nói

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

riêng. Chính vì vậy, nội dung của nghiên cứu này chỉ tập trung vào 16 gen mã hóa

các yếu tố độc lực của E. coli sinh ESBL phân lập từ mẫu bệnh phẩm ở Việt Nam.

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Vật liệu

3.1.1. Dụng cụ và thiết bị

- Tủ cấy vô trùng (Telstar, Hà Lan)

- Tủ lạnh -20°C (Panasonic U 34 PE, Nhật) - Tủ lạnh 4oC (LG GRE402 PG, Hàn Quốc)

- Máy PCR (Eppendorf Master cycler nexus GX2, Đức) - Máy điện di (Takara Mupid – exu advance, Nhật) - Máy đo nồng độ DNA bằng huỳnh quang (Quawell) - Máy ly tâm lạnh (Hecttich Mikro 22R, Đức)

- Máy vortex (VY Labnet, Mỹ)

- Máy ly tâm nhỏ (Minispin Dragon-Lab, Đức)

- Bộ ủ nhiệt (Sci Giene Hybex Microsample Incubator, Mỹ) - Khay giữ lạnh (Biocision CoolBox XT)

- Cân điện tử (Sartorius, Đức)

- Nồi hấp nhiệt ướt (Hyrayama, Nhật) - Bể điều nhiệt (Memmert, Đức) - Tủ ủ (Memmert, Đức)

- Lị vi sóng (Sharp, Nhật)

- Máy heat nhiệt khô (SciGene, Mỹ)

- Máy đọc gel (Dark Reader transilluminator, Mỹ) - Máy ổn nhiệt Hybex Microsample

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

- Đĩa petri 90 mm, 150 mm - Que cấy

- Pipette thủy tinh loại 1 mL, 10 mL - Ống nghiệm thủy tinh các loại

- Micropipette với các thể tích khác nhau - Đầu tip các loại

- Eppendorf 1,5 mL, 2 mL - PCR tube

- Tăm bông vô trùng - Đĩa nhựa 96 giếng

Ngồi ra cịn có các dụng cụ cơ bản phịng thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử.

- Chất nhuộm DNA DiamondTM nucleic acid dye (Promega)

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

- Các đĩa giấy kháng sinh sử dụng trong luận văn được trình bày trong Bảng 3.1.

3.1.3. Vật liệu sinh học

3.1.3.1. Chủng vi sinh vật

− 629 chủng E. coli được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm: máu, mủ, nước tiểu

tại bệnh viện Bình Dân - Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2018.

− Chủng chuẩn (là chủng được thương mại dùng để kiểm tra quy trình xác định kiểu hình ESBL):

o E. coli ATCC 25922

o K. pneumoniae ATCC700603

− Chủng chứng dương cho phản ứng PCR (là các chủng vi khuẩn E. coli có mang

16 gen mã hóa các yếu tố độc lực cần phát hiện) được trình bày trong Bảng

3.2.

Bảng 3.2. Các chủng chứng dương được sử dụng

CI-32-1 papC, iroN

Giáo sư Shinji Yamasaki Trường Đại học phủ Osaka – Nhật Bản

CD-1-1 fyuA, iroN

CD-27-1 iroN, kpsII, PAI

P48 sfa, fimH, fyuA, iroN, kpsII, iutA

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

P165 sfa, fimH, fyuA, hlyA, kpsII, hlyF

P168-1 sfa, fimH, fyuA, hlyA, kpsII, ibeA, ireA, iss

16 cặp mồi để phát hiện các gen mã hóa các yếu tố độc lực trong vi khuẩn

E. coli được trình bày trong Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Thông tin các mồi dùng trong phát hiện 16 gen mã hóa các yếu tố gây độc

Gen mục tiêu

Mồi

Sản phẩm

(bp)

Nồng độ (µM)

Tài liệu tham khảo

papC PapC - F GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGG

PapC - R

ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA

1177 0,6 (T. J. Johns

on et al., 2008) Hly-R ACCATATAAGCGGTCATTCCCGT

TTA CC

450 HlyF-R GGC GGT TTA GGC ATT CCG ATA

CTC AG

cvaC F

ColV-C-CAC ACA CAA ACG GGA GCT GTT

680 0,6ColV-C-

CTT CCC GCA GCA TAG TTC CAT

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

ompT ompT-F TCA TCC CGG AAG CCT CCC TCA CTA CTA T

on & Stell, 2000) Sfa-R CCG CCA GCA TTC CCT GTA TTC

FyuA-R CGC AGT AGG CAC GAT GTT GTA

kpsII Kps-II-F GCGCATTTGCTGATACTGTTG

272 0,3 Kps-II-

CATCCAGACGATAAGCATGAGCA

K1 K1-fc-F TAG CAA ACG TTC TAT TGG TGC

156 0,6 Kps-II-

164 0,6 pman (Chaet al., 2006)

FimH-R TGGAATAATCGTACCGTTGCG

665 0,6 IRON-F GACGCCGACATTAAGACGCAG

300 0,6 AerJ-R CGTCGGGAACGGGTAGAATCG

254 0.6 IRE-R CCAGGACTCACCTCACGAAT

PAI RPAi-F GGACATCCTGTTACAGCGCGCA

930 0,6 RPAi-R TCGCCACCAATCACAGCCGAAC

*: (Le Bouguenec et al., 1992)

114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM114Wednesday, June 12, 20247:36:09 PM7:36:09 PM

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

</div>

tần suất một số gen mã hóa yếu tố độc của escherichia coli sinh b lactamase phổ mở rộng phân lập từ máu mủ và nước tiểu

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞--- </b>

<b>NGUYỄN THỊ KIM QUYÊN </b>

<b>TẦN SUẤT MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ </b>

<i><b>ĐỘC CỦA Escherichia coli SINH </b></i>

<b>MÁU, MỦ VÀ NƯỚC TIỂU </b>

<b>LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC </b>

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞--- </b>

<b>NGUYỄN THỊ KIM QUYÊN </b>

<b>TẦN SUẤT MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ </b>

<i><b>ĐỘC CỦA Escherichia coli SINH </b></i>

<b>β- LACTAMASE PHỔ MỞ RỘNG PHÂN LẬP TỪ MÁU, MỦ VÀ NƯỚC TIỂU </b>

<b>Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01 </b>

<b>LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC</b>

<b>Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG </b>

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

<b>GIẤY XÁC NHẬN </b>

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

<b>Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN </b>

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

114Tan suat mot so GEN ma hoa yeu to doc cua Escherichia coli sinh B Lactamase pho mo rong phan lap tu mau mu va nuoc tieuWednesday, June 12, 2024

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về