BÁO CÁO KHOA HỌC : ẢNH HƯỞNG TỐC ĐỘ LY TÂM, CHẾ ĐỘ CÂN BĂNG, MÔI TRƯƠNG, THỜI GIAN ĐÔNG LẠNH VÀ CHẾ ĐỘ GIẢI ĐÔNG ĐẾN CHÂT LƯỢNG TINH DỊCH LỢN DẠNG CỌNG RẠ doc

ĐÀO ĐỨC THÀ – Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm

1

ẢNH HƯỞNG TỐC ĐỘ LY TÂM, CHẾ ĐỘ CÂN BĂNG, MÔI TRƯƠNG, THỜI
GIAN ĐÔNG LẠNH VÀ CHẾ ĐỘ GIẢI ĐÔNG ĐẾN CHÂT LƯỢNG TINH DỊCH
LỢN DẠNG CỌNG RẠ
Đào Đức Thà
1*
, Đỗ Hữu Hoan
1
, Nguyễn Đình Dũng
2

và

Văn lệ Hằng
3

1
Viện Chăn nuôi;
2
Khoa Khoa học Tự nhiên và Xã hội - Đại học Thái Nguyên;
3
Đại học Sư phạm - Hà Nội
*
Tác giả liên hệ: Đào Đức Thà - Bộ môn Sinh lý - Sinh sản và Tập tính vật nuôi
Viện Chăn nuôi - Thụy Phương - Từ Liêm - Hà Nôi
Tel: (04) 83.385.940 / 0903.222.229; Fax: (04) 38.389.775; E-mail:
ABSTRACT

Study on boar semen frozen in straw
The objective of this study was to assess the effects of centrifugation method, diluents and freezing method on
progressive motility of boar sperm in straw after freezing and thawing. Semen from boar of Yorkshine and
Landrace breed was used. To assess the effects of centrifugation speed, semen was diluted centrifuged with
speed of 2000 rpm and 2500 rpm for 10 min. The supernatant was discarded after centrifugation and the
precipitated spermatozoa were genlly resuspended with NSF extender. The equilibation was done in one and two
step. Then the sperm suspension was transferred into 0.5 plastic straws (1x 109 spermatozoa/ml). The straws
were placed in liquid nitrogen vapor for 10, 20, 30 min and stored in liquid nitrogen. After thawing, frozen
semen was evaluated for motility, progressive and viability of spermatozoa by Computer Assisted Sperm
Analyzer (Sperm Vision-Minitub, Germany). The result shown that with centrifugation speed of 2000 rpm, NFS
extender, two step of equilibation, 20 min of freeze and thawing in 37
o
C on 50 second we can get the highest
progressive motility of sperm (35.67%).
Key words: Cryopreservation, boar semen, progressive motility.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chăn nuôi lợn ở nước ta đã và đang là một ngành chăn nuôi chủ yếu trong cơ cấu chăn nuôi.
Việc nâng cao chất lượng đàn giống và phổ biến giống mới đồng thời làm tươi máu những
đàn giống hiện có là một khâu vô cùng quan trọng trong chăn nuôi lợn. Đông lạnh tinh dịch
lợn là một kỹ thuật có ý nghĩa kinh tế nhằm khai thác tiềm năng di truyền của con đực, bảo
đảm an toàn về dịch bệnh, bảo tồn các giống quý hiếm và đáp ứng nhu cầu thụ tinh nhân tạo
làm tươi máu một số dòng lợn như một số cơ sở chăn nuôi hiện nay đang làm thay cho nhập
đực giống trực tiếp từ nước ngoài.
Đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới như: Đức,
Nhật Bản, Hàn Quốc.vv… Tuy vậy, ở Việt Nam, kỹ thuật này vẫn là một vấn đề mới. Vì vậy,
trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ứng dụng tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo
và nhân giống lợn “thuộc chương trình công nghệ sinh học’’ chúng tôi tiến hành đề tài: “Kỹ
thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ” với mục tiêu nhằm đạt hoạt lực tinh trùng lợn sau
giải đông trên 30%.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu, thời gian, địa điểm nghiên cứu
Vật liệu: Sử dụng tinh dịch của hai giống lợn là Yorkshine và Landrace. Lợn đực giống khoẻ
mạnh, đang được khai thác tinh dịch. Các lợn đực này được chăm sóc và nuôi dưỡng theo tiêu
chuẩn lợn đực giống tại Trung tâm nghiên cứu lợn Thuỵ Phương thuộc Viện Chăn nuôi

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 18-Tháng 6-2009


2

Thời gian nghiên cứu: năm 2007
Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh sản Sinh sản và Tập tính vật nuôi - Viện Chăn nuôi
Phương pháp nghiên cứu
Khai thác tinh dịch và đánh giá chất lượng tinh nguyên
Tinh dịch được lấy theo phương pháp dùng tay. Lọc bỏ tinh thanh ngay sau khi lấy xong tinh
dịch. Chất lượng tinh nguyên của từng lợn đực giống được đánh giá bằng phần mềm Sperm
Vision của Hãng Minitub, (Đức) và các phương pháp thường quy trong phòng thí nghiệm
thông qua các chỉ tiêu: Thể tích tinh dịch (V), nồng độ tinh trùng (C), hoạt lực (A), áp suất
thẩm thấu (ASTT), kỳ hình (K), và pH.
Chỉ những lô tinh dịch có hoạt lực trên 70% mới được đưa vào xử lý và tiến hành đông lạnh.
Dung dịch ly tâm: Tinh dịch được pha loãng với môi trường BTS theo tỷ lệ 1:1 về thể tích,
sau đó làm lạnh từ từ đến 15
o
C trong vòng 2 giờ.
Phương pháp ly tâm (theo quy trình của Trung tâm giống quốc gia Nhật Bản): Sau khi được
làm lạnh đến 15
o
C, tinh pha được ly tâm trong 10 phút ở các chế độ 2000 vòng/phút và 2500
vòng/phút. Bỏ phần dung dịch phía trên ống ly tâm, lấy phần đậm đặc lắng ở đáy ống ly tâm.
Phương pháp cân bằng

Phương pháp cân bằng được sử dụng trong nghiên cứu này là phương pháp cân bằng một
bước và cân bằng hai bước vv…
Cân bằng một bước: Tinh dịch đậm đặc sau ly tâm ở 15
o
C được bổ sung NSF I hoặc MT1 (½
thể tích cuối cùng) tiếp đó pha luôn với môi trường NSF II hoặc MT2 để đạt được thể tích
cuối cùng và sau đó hạ nhiệt độ từ 15
o
C xuống 5
o
C trong 2 giờ.
Cân bằng hai bước (gồm 2 giai đoạn)
Cân bằng lần1: Tinh dịch đậm đặc sau ly tâm ở 15
o
C được bổ xung NSFI hoặc MT1 (½ thể
tích cuối cùng) và được hạ nhiệt độ từ 15
o
C xuống 5
o
C trong 1 giờ 30 phút.
Cân bằng lần 2: Tinh dịch đã cân bằng lần 1 được bổ xung thêm dung dịch pha loãng thứ 2 là
NSF II và MT2 đạt thể tích cuối cùng (sao cho 1ml dung dịch có chứa 1tỷ tinh trùng). Tinh
dịch sau khi pha loãng lần 2 được cân bằng ở 5
o
C trong 30 phút.
Môi trường
Môi trường NSF (Niwa and Sasaki freezing) theo công thức của Trung tâm giống Quốc gia
NLBC (Nhật Bản) có 6% glycerin và 1,48% OEP( Orvus Es Paste; Nova Chemical, Scituate,
MA, USA)
Môi trường MT( Môi trường theo công thức của Trung tâm INRA (Pháp) có 6% glycerin

Thời gian đông lạnh trong hơi nitơ
Tinh dịch sau khi cân bằng hai bước được hút vào các cọng rạ loại 0,5 ml và đông lạnh trong
hơi nitơ lỏng ( -80
o
C -90
o
C) theo phương pháp của trung tâm giống quốc gia Nhật bản ở ba
mức thời gian là 10 phút, 20 phút và 30 phút. Sau khi đông lạnh trong hơi nitơ lỏng, cọng rạ
được đông lạnh sâu trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196
o
C.
Phương pháp giải đông
Cọng rạ sau khi đông lạnh trong nitơ lỏng được giải đông với các thời gian giải đông là 30
giây và 50 giây và nhiệt độ giải đông là 37
o
C và 40
o
C.
Đánh giá hoạt lực tinh trùng sau giải đông

ĐÀO ĐỨC THÀ – Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm

3

Dùng micropipet hút 0,23 µl tinh dịch sau giải đông (được pha loãng bằng môi trường BTS)
nhỏ vào phiến kính Jeica (dùng riêng cho phần mềm Sperm Vision) có nhiệt độ 37
o
C và đánh
giá bằng phần mềm Sperm Vision 3.0 (hãng Minitab, Đức).
Xử lý số liệu

Số liệu được phân tích thông qua phần mềm Minitab.13. Số liệu được hiển thị dạng Mean±SE
có sai khác về ý nghĩa thống kê, với (P<0,05).
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chất lượng tinh nguyên
Tinh nguyên sau khi khai thác được đánh giá theo các chỉ tiêu sinh học: Thể tích tinh dịch (V,
ml), hoạt lực (A, %), nồng độ tinh trùng (C, triệu/ml), tổng số tinh trùng tiến thẳng (VAC,
tỷ/lần), pH của tinh dịch, áp suất thẩm thấu (ASTT, mosm), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K, %),
acrosome (Acr, %). Kết quả đánh giá được thể hiện trên Bảng 1.
Bảng 1: Một số chỉ tiêu của tinh dịch lợn
Chỉ tiêu Đông Xuân Hè Thu Cả hai vụ
Yorkshire Landrace Yorkshire Landrace Yorkshire Landrace
Mean±SE Mean±SE Mean±SE Mean±SE Mean±SE Mean±SE
V
321,60
± 12,60
222,50
± 13,25
221,71
± 10,33
211,25
± 12,43
271,53
± 11,4
217,13
± 12,84
A 0,72
± 0,013
0,73
± 0,010
0,72

± 0,007
0,73
± 0,004
0,72
± 0,010
0,73
± 0,007
C
304,53
± 16,22
269,15
± 20,72
243,51
± 16,34
234,30
± 9,75
274,05
± 16,28
251,08
± 15,24
VAC
49,63
± 1,02
48,19 ±
1,02
45,15
± 1,03
40,83
± 1,25
47,43 ±

1,03
44,86
± 1,14
pH
7,32
± 0,18
7,33
± 0,12
7,33
± 0,20
7,33
± 0,14
7,33 ± 0,19 7,33
± 0,13
K
6,17
± 0,09
6,23
± 0,20
6,59
± 0,12
6,42
± 0,09
6,40 ± 0,11 6,37
± 0,17
ASTT
- - - - 318,80
± 6,88
322,05
± 5,96

Acr
nguyên
- - - - 93,1 93,5
Cả hai giống lợn Yorshire (n=13) và Landrace (n=13) có thể tích tinh dịch trong khoảng 200 –
350 ml. Có sự sai khác về thể tích tinh dịch giữa vụ Đông Xuân và vụ Hè Thu (P<0,05) ở mỗi
giống lợn. Thể tích tinh dịch của một lần xuất tinh ở vụ Đông Xuân cao hơn ở vụ Hè Thu. Sự
sai khác này còn thấy ở các chỉ tiêu C, VAC. Các chỉ tiêu như A, pH, K không thấy có sự sai
khác giữa hai mùa vụ nêu trên.
Theo TCVN (1959 - 1976) thì các chỉ tiêu chất lượng của tinh lợn khai thác ở hai giống lợn
nói trên đủ tiêu chuẩn để sử dụng cho sản xuất tinh đông lạnh.
Ảnh hưởng của chế độ ly tâm đến một số chỉ tiêu sinh lý của tinh trùng
Ly tâm là một khâu rất quan trọng trong quy trình đông lạnh tinh dịch lợn. Chế độ ly tâm tốt
sẽ loại bỏ được nhiều nhất tinh thanh, thu được lượng tinh trùng tối đa trong tinh dịch, đồng
thời không gây những tổn thương đến cấu trúc của tinh trùng.

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 18-Tháng 6-2009


4

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ ly tâm đến một số chỉ tiêu sinh lý của tinh trùng
được thể hiện ở Bảng 2.
Bảng 2. Ảnh hưởng của chế độ ly tâm đến một số chỉ tiêu sinh lý của tinh trùng
Chế độ n Hoạt lực VCL VAP VSL
Mean±SE Mean±SE Mean±SE Mean±SE
Chế độ 1: 2500 vòng/phút

68 61,39± 0,92 89,36± 1,58 51,04 ± 0,71

30,36 ± 0,34

Chế độ 2: 2000 vòng/phút

68 72,84 ± 1,43

92,02 ± 1,43

53,17 ± 0,87

29,32± 0,75
VCL Velocity Curve Line (microns/ sec) -Vận tốc chuyển động của tinh trùng theo đường zíc
zắc. VAP Velocity Average Path (microns/ sec)- Vận tốc chuyển động của tinh trùng theo
đường trung bình. VSL Velocity Straight Line (microns/ sec)- Vận tốc chuyển động của tinh
trùng theo đường thẳng. Chế độ ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút cho kết quả hoạt lực tinh
trùng sau ly tâm đạt 72,03±1,27, có sự sai khác rõ rệt so với hoạt lực tinh trùng sau ly tâm ở
chế độ 2500 vòng/phút (61,392 ± 0,92) (P<0,05). Theo Almlid và Hofmo, (1996) thì hoạt lực
tinh trùng sau ly tâm phải lớn hơn 50%. Như vậy, cả hai chế độ ly tâm trên đều đáp ứng được
tiêu chuẩn này. Kết quả nghiên cứu cũng thống nhất với nghiên cứu của Pursel và Jonhson,
(1975), Westendorf và cs, (1975), Paquignon và Courot, (1976). Tuy vậy, không có sự sai
khác đáng kể giữa 2 chế độ ly tâm về các chỉ tiêu VCL, VAP và VSL
Ảnh hưởng của môi trường đông lạnh đến hoạt lực của tinh trùng
Môi trường pha loãng có tác dụng điều chỉnh mật độ tinh trùng, cung cấp năng lượng và bảo
vệ tinh trùng trước sự tấn công của vi sinh vật, bảo vệ cấu trúc của tinh trùng trong quá trình
đông lạnh.
Bảng 3. Ảnh hưởng của môi trường pha loãng đến hoạt lực tinh trùng
Hoạt lực
Thí nghiệm

n
Hoạt lực của tinh trùng sau

cân bằng lần thứ nhất
Hoạt lực của tinh trùng sau
cân bằng lần thứ hai
Mean±SE Mean±SE
Thí nghiệm 1 104

71,19 ± 0,818 69,748 ± 1,24
Thí nghiệm 2 104

72,03 ± 1,43 60,510 ± 0,71
Thí nghiệm 1: Cân bằng lần thứ nhất với NSF I, lần thứ hai với NSF II
Thí nghiệm 2: Cân bằng lần thứ nhất với MT1, lần thứ hai với MT2
Hoạt lực của tinh trùng sau khi pha loãng với môi trường NSF I không có sự sai khác so với
hoạt lực của tinh trùng sau khi pha loãng với môi trường MT1 (P>0,05). Điều này được giải
thích là do thành phần của hai môi trường tương đối giống nhau, chỉ khác ở loại đường sử
dụng (NSF I sử dụng đường lactoza còn MT1 sử dụng đường glucose ).
Hoạt lực tinh trùng khi sử dụng môi trường NSF II cho kết quả cao hơn khi sử dụng môi
trường MT2. Khi sử lý thống kê cho thấy các kết quả này có sự sai khác rõ rệt (P<0,05).
Các nghiên cứutrước đây của Graham và cs (1971), Pursel và Jonhson (1975), Westendorf và
cs (1975) đã chỉ ra rằng, OEP có ảnh hưởng tích cực trong bảo vệ hình thái, cấu trúc màng,
khả năng hoạt động và khả năng thụ thai của tinh trùng đông lạnh. Như vậy, sai khác giữa
hoạt lực của tinh trùng khi sử dụng hai môi trường NSF II và MT2 có thể là do môi trường
NSF II có bổ sung OEP.
Ảnh hưởng của chế độ cân bằng đến một số chỉ tiêu sinh lý của tinh trùng sau giải đông
Việc sử dụng chế độ cân bằng thích hợp sẽ giúp cho tinh trùng không bị sốc khi đông lạnh ở

ĐÀO ĐỨC THÀ – Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm

5

nhiệt độ thấp. Kết quả về chế độ cân bằng ở Bảng 4.
Bảng 4. Ảnh hưởng của chế độ cân bằng đến một số chỉ tiêu sinh lý của tinh trùng
sau giải đông
Chế độ cân bằng n Hoạt lực VCL VAP VSL
Mean±SE Mean±SE Mean±SE Mean±SE
Cân bằng 1 bước 24 31,98 ± 1,24 59,01 ± 4,17 36,02 ± 1,66 25,80 ± 1,40
Cân bằng 2 bước 24 36,53 ± 1,52 80,56 ± 2,84 47,79 ± 1,03 34,32 ± 1,25
Kết quả trên cho thấy, hoạt lực tinh trùng sau giải đông sử dụng phương pháp cân bằng hai
bước cho kết quả cao hơn so với khi sử dụng phương pháp cân bằng một bước. Có sự sai khác
rõ rệt về hoạt lực tinh trùng và VCL khi sử dụng hai phưong pháp cân bằng nói trên (P<0,05).
Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng sau giải đông
Giai đoạn đông lạnh trong hơi nitơ là một bước đông lạnh trung gian giữa 5
o
C đến đông lạnh
sâu trong nitơ lỏng (-196
o
C). Trong hơi nitơ, nhiệt độ khoảng -80
o
C -90
o
C .
Kết quả được thể hiện Bảng 5.
Bảng 5. Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực của tinh trùng
sau giải đông.
Hoạt lực của tinh trùng
Thời gian đông lạnh
n. Mean ± SE Cv%
10 phút 60 26,14 ± 0,812 14,09
20 phút 60 36,14 ± 1,97 12,15
30 phút 60 34,90 ± 1,86 7,040

Hoạt lực của tinh trùng sau giải đông với thời gian đông lạnh trong hơi nitơ là 20 phút và 30
phút cho kết quả cao hơn so với đông lạnh trong hơi nitơ ở 10 phút. Không có sự sai khác về
hoạt lực của tinh trùng sau giải đông khi sử dụng thời gian đông lạnh trong hơi nitơ là 20 phút
và 30 phút (P>0,05). Trạm thực nghiệm Ibaragi thuộc trung tâm giống quốc gia Nhật Bản đã
thành công trong việc đông lạnh tinh dịch của một số giống lợn địa phương với hoạt lực sau
giải đông đạt 33 – 40%. Theo Westendorf và cs, (1975), Pursel và Johnson, (1975) thì tinh
đông lạnh cọng rạ sau giải đông có hoạt lực trên 30%. Kết quả của chúng tôi giống nghiên cứu
của các tác giả này. Để quá trình thụ tinh được tốt, hoạt lực tinh trùng phải >30%. Như vậy,
kết quả của chúng tôi đáp ứng được yêu cầu về hoạt lực của tinh trùng cho phương pháp thụ
tinh nhân tạo. Thời gian khuyến cáo để đông lạnh tinh dịch lợn là trong vòng 20 phút.
Chế độ giải đông
Bảng 6. Ảnh hưởng của chế độ giải đông đến hoạt lực của tinh trùng
Hoạt lực tinh trùng
Chế độ giải đông
n. Mean ± SE C
v
%
37
o
C trong 30 giây 98 28,12 ± 1,90 12,04
37
o
C trong 50 giây 98 35,67 ± 1,14 11,27
40
o
C trong 30 giây 98 32,10 ± 0,97 7,45
40
o
C trong 50 giây 98 34,98 ± 1,57 9,23
Chế độ giải đông là một khâu quan trọng làm “thức tỉnh” khả năng hoạt động của tinh trùng.

Chế độ giải đông tốt sẽ “đánh thức” được nhiều tinh trùng hoạt động trở lại với khả năng hoạt
động chức năng cao nhất. Kết quả nhiệt độ và thời gian giải đông được thể hiện qua Bảng 6.

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 18-Tháng 6-2009


6

Qua Bảng 6 ta thấy, phương pháp giải đông ở nhiệt độ 37
o
C trong 50 giây cho kết quả cao
nhất. Không có sự sai khác giữa hoạt lực của phương pháp này so với hoạt lực của phương
pháp giải đông ở nhiệt độ 40
o
C trong 50 giây. Ngược lại, có sự sai khác về hoạt lực của tinh
trùng với phương pháp giải đông ở nhiệt độ 37
o
C trong 30 giây và 40
o
C trong 30 giây
(P<0,05).
So với các phương pháp giải đông đề xuất: 50
o
C trong 20 giây (Pursel và Johnson, 1975).
52°C trong 12 giây (Sellés và cs, 2003) nghiên cứu của chúng tôi cũng cho kết quả tương tự.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
Chế độ ly tâm ở 2000 vòng/phút cho kết quả tốt hơn chế độ ly tâm 2500 vòng/phút. Sử dụng
môi trường đông lạnh NSF I và NSF II tốt hơn môi trường MT1 và MT2.
Cân bằng 2 bước tốt hơn cân bằng 1 bước. Sử dụng phương pháp cân bằng 2 bước, đông lạnh

trong hơi nitơ 20 phút, giải đông ở 37
o
C trong 50 giây, cho kết quả hoạt lực tinh trùng sau giải
đông là 35,67%.
Đề nghị
Tiến hành phối giống kiểm tra tỷ lệ thụ thai khi sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh dạng cọng rạ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Almlid T and Hofmo PO, (1996). A brief review of frozen semen applications under Norwegian AI swine
conditions. Reprod Domest Anim. 1996; 31: p.169-173.
Graham, E.F., A.H.J. Rajamannan, M.K.L. Schmehl. M. Maki-Laurila and R.E. Bower, (1971). Preliminary
report on procedure and rationale for freezing boar semen. A.I. Digest, 1971; 19:p.12.
Niwa.T, (1989). Preparation of extender. Manual for cryopreservation of pig spermatozoa. Tokyo: Japanese
artificial insemination Association 1989; p.19-23 (in Japanese )
Paquignon M and Courot M, (1976). Fertilizing capacity of frozen boar spermatozoa. 8
th
International Congress
on Animal Reproductive Artificial Insemination, Cracow, Poland. 1976; 4: p.1041-1044.
Pursel, V.G. and L.A. Johnson, (1975). Freezing of boar spermatozoa: Fertilizing capacity with concentrated
semen and a new thawing procedure. J. Anim. Sci., 1975; 40: p. 99-102.
Sellés. E, Gadea. J, Romar. R, Matos.C and Ruiz. S, (2003). Analysis of in vitro fertilizing capacity to evaluate
the freezing procedures of boar semen and to predict the subsequent fertility. Reprod Domest Anim,
2003 (38): p. 66-72.
Uỷ ban Khoa học Kỹ thuật Nhà nước, (2003).Tiêu chuẩn Nhà nước về tinh dịch lợn,TCVN (1959-76) (Nhóm N)
Westendorf P, Ritcher L, Treu H, (1975). Zur Tiefgefrierung von Ebersperma. Labor-und Besamungsergebnisse
mit dem Hülsenberger Paillettenverfahren. DtschTierärztl Wschr. 1975; 82: p.261-267.
*Người phản biện : PGS.TS. Nguyễn Tấn Anh; Ths. Nguyễn Thị Thoa.