sử dụng kỹ thuật pcr để phân loại sán dây moniezia nhiễm gia súc ăn cỏ

i
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Đồ án này:
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban
Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau
đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS Nguyễn Đức Tân -
Phân Viện trưởng - Phân viện Thú y Miền Trung, TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc
Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, ThS. Lê
Đức Quyết - Phó trưởng Bộ môn Ký sinh trùng - Phân viện Thú y Miền Trung đã
tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Xin cám ơn: ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh
học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình
nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong
Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường
Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các cán bộ - Bộ
môn Ký sinh trùng và tập thể cán bộ công nhân viên – Phân viện Thú y miền Trung
đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực
hiện đồ án này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều
kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua.

Nha Trang, tháng 7 năm 2011
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Loan
ii
MỤC LỤC
Trang

LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC HÌNH v
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH SÁN DÂY TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 3
1.1.1. Trên thế giới 3
1.1.2. Trong nước 4
1.2. ĐẶC ĐIỂM VỀ HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA SÁN DÂY MONIEZIA 4
1.3. CHU KỲ SINH HỌC CỦA SÁN DÂY MONIEZIA 8
1.4. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH Ở BÒ, DÊ, CỪU DO SÁN DÂY MONIEZIA
GÂY RA 10
1.4.1. Tình hình nhiễm sán dây theo loài gia súc 10
1.4.2 Tình hình nhiễm sán dây theo lứa tuổi 11
1.4.3 Tình hình nhiễm sán dây theo mùa 12
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ PHÂN LOẠI SÁN DÂY 13
1.5.1. Chuẩn đoán trong phòng thí nghiệm 13
1.5.2. Phương pháp chẩn đoán trên gia súc chết 16
1.5.3. Phương pháp phân loại dựa vào hình thái cấu tạo 17
1.5.4. Phương pháp phân loại sán dây dựa vào kỹ thuật phân tử PCR 18
1.5.4.1. Kỹ thuật PCR (Polymerasa Chain Reaction) 18
1.5.4.2. Phân loại sán dây dựa vào kỹ thuật PCR 29
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1. ĐỐI TƯỢNG 31
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 31
2.2.1. Nguyên vật liệu 31
2.2.2. Thiết bị chủ yếu 32
iii
2.3. Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1. Phương pháp thu thập mẫu sán dây 32
2.3.2. Phương pháp bảo quản mẫu nghiên cứu 32
2.3.3. Phương pháp xét nghiệm phân 33
2.3.4. Phương pháp mổ khám phi toàn diện của Skrjabin 34
2.3.5. Phương pháp phân loại sán dây dựa vào hình thái cấu tạo 34
2.3.6. Chiết tách DNA của sán dây Moniezia 35
2.3.7. Thiết kế mồi 36
2.3.8. Tối ưu hóa phản ứng PCR 38
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 41
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42
3.1. TÌNH HÌNH NHIỄM SÁN DÂY Ở GIA SÚC ĂN CỎ (BÒ, DÊ, CỪU) 42
3.1.1. Tình hình nhiễm sán dây ở gia súc tại một số tỉnh Nam Trung bộ
và Tây Nguyên 42
3.1.2. Tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo vùng sinh thái 43
3.1.3. Tình hình nhiễm sán dây theo loài gia súc 44
3.1.4. Tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo mùa vụ 45
3.1.5. Tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo lứa tuổi 47
3.2. XÁC ĐịNH THÀNH PHẦN LOÀI SÁN DÂY BẰNG PHƯƠNG
PHÁP NHUỘM CÁC MIN 49
3.3. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI SÁN DÂY BẰNG PCR 52
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA sán dây 52
3.3.2. Xác định nồng độ DNA mẫu 52
3.3.3. Xác định nhiệt độ tối ưu cho một số cặp mồi 53
3.3.3. Xác định thành phần loài sán dây bằng phản ứng PCR 54
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 58
1. KẾT LUẬN 58
2. ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO 61
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1. Tỷ lệ nhiễm sán dây theo loài gia súc 11
Bảng 1.2. Tỷ lệ nhiễm sán dây Moniezia theo lứa tuổi 12
Bảng 2.1. Biến đổi dãy nồng độ 38
Bảng 2.2. Biến đổi dãy nhiệt độ 40
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm sán dây của gia súc nhai lại ở các tỉnh 42
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo vùng sinh thái 44
Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm sán dây theo loài gia súc 44
Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm sán dây theo mùa vụ 45
Bảng 3.5. Tỷ lệ nhiễm sán dây theo lứa tuổi 48
Bảng 3.6. Kết quả xác định loài sán dây ở bò, dê, cừu bằng phương pháp
nhuộm Các min 50
Bảng 3.7. Kết quả xác định nhiệt độ gắn thích hợp của một số mồi 54
Bảng 3.8. Kết quả xác định loài bằng phương pháp PCR và phương pháp
nhuộm Các min 55













v
DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Hình dạng bên ngoài của sán dây Moniezia 5
Hình 1.2. Hình thái sán dây 5
Hình 1.3. Cấu tạo một đốt thân sán dây Moniezia 6
Hình 1.4. Vòng đời của sán dây Moniezia 8
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng gradient-PCR 39
Hình 3.1. Trứng sán dây Moniezia sp 42
Hình 3.2. Sán dây Moniezia sp và các đốt sán 49
Hình 3.3. Tuyến giữa đốt của loài Moniezia expansa 51
Hình 3.4. Tuyến giữa đốt của loài Moniezia benedeni 52
Hình 3.5. Kết quả chạy PCR ở các nồng độ DNA mẫu khác nhau 53
Hình 3.6. Kết quả chạy gradient-PCR sử dụng mồi 53
Hình 4.7. Kết quả chạy điện di phân loài sán dây Moniezia 54

1



ĐẶT VẤN ĐỀ

Dịch bệnh trong đó có bệnh sán dây
Moniezia
thường gặp ở súc vật ăn cỏ nhất
là gia súc còn non. Bệnh xảy ra chủ yếu do hai loài sán dây thuộc lớp
Cestoda
kí
sinh ở ruột non. Gia súc bị bệnh sán dây thì gầy yếu, thiếu máu, suy nhược và dễ
chết nếu nhiễm nặng.
Bệnh ký sinh trùng không gây thành dịch ổ dịch lớn như các bệnh do vi khuẩn
và vi rút khác, nhưng thường kéo dài âm ỉ, làm giảm năng suất chăn nuôi, ảnh
hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của gia súc, giảm hiệu quả kinh tế tạo
điều kiện cho các bệnh truyền nhiễm phát sinh mà còn tác động không tốt đến chủ
trương phát triển chăn nuôi gia súc nhai lại ở các vùng đồng bào dân tộc thiểu số
nhằm xóa đói giảm nghèo, chuyển dịch cơ cấu nông nhiệp.
Việc chẩn đoán, giám định và phân loại nhiều loại sinh vật, trong đó có ký
sinh trùng ở gia súc cho đến gần đây chủ yếu vẫn dựa vào xác định đặc tính hình
thái học và nuôi cấy. Mặc dầu hình thái học (kiểu hình) trong phân loại là rất thông
dụng và đã có những thành tựu hết sức to lớn, nhưng trong nhiều trường hợp khó
khăn gặp phải là khó phân biệt loài và dưới loài một cách chính xác (McCarthya,
Moore, 2000). Do tiêu tốn thời gian và khó tìm kiếm đúng môi trường thích hợp

nuôi cấy cho một số loại vi khuẩn/virus, hay vật chủ cho ký sinh trùng, bệnh phẩm
đòi hỏi phải hoàn chỉnh hoặc phải ở trạng thái sống, nên các phương pháp chẩn
đoán dựa trên nuôi cấy và hình thái học có rất nhiều hạn chế (Gilbert, 2002; Parida,
2008; Mori và Notomi, 2009). Các phương pháp chẩn đoán truyền thống áp dụng
trong lâm sàng và dịch tễ học như xét nghiệm tìm trứng/ấu trùng hay các sản phẩm
của ký sinh trùng hoặc các kỹ thuật miễn dịch học đều có những sai số nhất định,
tuỳ từng loài ký sinh trùng, đặc biệt khi các dạng ký sinh trùng cùng tồn tại ở một
nơi như đường ruột ở hệ tiêu hóa, chất thải ở hệ hô hấp hay máu của hệ tuần hoàn.
Phương pháp sinh học phân tử nhân bản DNA và phân tích đặc tính sản phẩm thu
được, đặc biệt là phân tích biến đổi gen/hệ gen được ứng dụng trong chẩn đoán
phân loại và lập phả hệ sinh vật, đã bước đầu chứng minh cho kết quả chính xác
hơn nhiều so với phương pháp truyền thống (Elnifro
et al.,
2000; De Lellis
et al.,
2



2008; Mori và Notomi, 2009). Các số liệu chính xác của các phương pháp sinh học
phân tử đã cho phép ứng dụng những hướng mới và rất có thể sẽ làm thay đổi một
phần hệ thống phân loại và chẩn đoán phân biệt loài hiện có (Galluzzi
et al.,
2007;
Littlewood, 2008).
Trong hai thập kỷ qua, công nghệ ứng dụng kỹ thuật mới đã có những định
hướng phát triển vượt bậc. Một trong những thành tựu lớn của nhân loại là sự phát
triển phương pháp PCR (Polymerasa Chain Reaction) được ứng dụng cho giám
định, chẩn đoán, phân loại, di truyền quần thể, phả hệ và tiến hoá sinh vật, trong đó
có ký sinh trùng (Chandler và Colitz, 2006; Littlewood, 2008) và trở thành một

công cụ không thể thiếu được trong công tác giám định, phát hiện sinh vật (kể cả ký
sinh trùng) gây bệnh bằng kỹ thuật cao (Ishmael và Stellato, 2008). Do có tính nhạy
và đặc hiệu rất cao, đồng thời chỉ cần một lượng rất ít khuôn DNA của đối tượng
sinh vật bất kể giai đoạn sinh trưởng nào, PCR đã có thể cho sản phẩm với độ chính
xác cao về loại sinh vật cần nghiên cứu.
Từ thực tế trên, dưới sự giúp đỡ của Bộ môn nghiên cứu Ký sinh trùng Phân
viện Thú y Miền Trung, chúng tôi đã tiến hành đề tài:
“Sử dụng kỹ thuật PCR để
phân loại sán dây Moniezia nhiễm gia súc ăn cỏ”
với mục đích sử dụng kỹ thuật
sinh học phân tử để xác định nhanh các loài sán dây phổ biến nhiễm ở một số loại
gia suac ăn cỏ làm cơ sở cho việc phòng bệnh cho gia súc một cách có hiệu quả.

Nội dung của đồ án:
1) Đánh giá tình hình nhiễm sán dây ở bò, dê, cừu ở một số tỉnh Miền Trung
và Tây Nguyên,
2) Xác định thành phần loài và tỷ lệ nhiễm sán dây ở bò, dê, cừu,
3) Sử dụng kỹ thuật PCR để xác định thành phần loài sán dây Moniezia nhiễm
ở bò, dê, cừu.
Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn các hạn chế,
em kính mong nhận được các ý kiến góp ý của quý thầy cô và bạn bè đồng nghiệp
để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn!
3



CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH SÁN DÂY TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.1.1. Trên thế giới

Bệnh sán dây ở động vật nhai lại (bò, dê, cừu) do các loài
Moniezia expansa

và
Moniezia benedeni
cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu sau:
Năm 2001, Borges và cộng sự cho biết bò vùng Saopaulo của Brazin nhiễm
một loài sán dây là
Moniezia expansa
với tỷ lệ là 4,76%. Năm 2003, Achi và cộng
sự đã điều tra tình hình nhiễm giun sán ở bò tại các lò mổ ở vùng Savannah của
Pháp và xác định loại sán thường gặp nhất là sán dây với tỷ lệ nhiễm là 31%.
Nwosu và cộng sự (1996) cho biết tỷ lệ nhiễm sán dây ở dê tại Nigeria là 31%.
Ở Ethiopia kết quả điều tra tình hình nhiễm ký sinh trùng đường ruột ở dê cho thấy
tỷ lệ nhiễm sán dây
Moniezia expansa
là 32,2% và số lượng trứng/gam phân là
545,2 trứng (Etana debela, 2002). Trong quá trình điều tra ký sinh trùng đường hô
hấp và tiêu hóa ở dê Iceland tác giả Yfirrlot đã phát hiện thấy tỷ lệ nhiễm
Moniezia
expansa
là 20%.
Ở cừu, tỷ lệ nhiễm sán dây theo điều tra của Eeroanska và cộng sự (2005) tại
Slovakia là 19,2%. Cũng trên đối tượng cừu, kết quả điều tra của Munib và cộng sự
(2006) cho thấy sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm giữa các loài sán
dây trên đàn cừu ở Pakistan: tỷ lệ nhiễm
M. expansa
là 71,3% trong khi đó
M.
benedeni

là 2,17% và số lượng trứng/gam phân (EPG= eggs per gram faeces) tương
ứng là 388,85 và 11,8 trứng.
Lughano Kusiluka và Dominic Kambarage (2006) cho biết có thể dùng một
trong các loại thuốc: Niclosamide (liều 80mg/kg), Resoranttel (75 mg/kg),
Paraziquantel (15 mg/kg), Albendazole (5mg/kg), Mebendazole (10 mg/kg) để điều
trị bệnh sán dây. Đặc biệt thuốc Benzimidazole có hiệu lực cao trong việc điều trị
bệnh sán dây họ
Anoplocephatidae.

4



1.1.2. Trong nước
Việc nghiên cứu sán dây ở Việt Nam được bắt đầu hơn một thế kỷ nay. Năm
1870, Can de J. lần đầu tiên mô tả loài sán dây
Diphyllobothrium latum
tìm thấy ở
người Nam Bộ (Việt Nam). Sau đó 10 năm mới xuất hiện các công trình nghiên cứu
lẻ tẻ về 1 số loài sán dây gây bệnh cho người. Từ đó việc nghiên cứu về thành phần
ở người được chú ý hơn, rồi mở rộng phạm vi nghiên cứu sang một số loài động vật
hoang dã.

Tổng hợp có hệ thống về sán dây ở gia súc nhai lại Việt Nam, Drozdz j. và
Malcrewski A. (1971) cho biết, trong họ
Acanthocephalidae
có giống
Moniezia
gây
bệnh cho dê, cừu; hiếm hơn ở bò, trâu, và các thú nhai lại khác. Giống

Moniezia
có
2 loài là
M. expansa
và
M. benedeni
phân bố khắp các vùng trong cả nước.
Theo Phan Địch Lân và cộng sự (1975) bệnh sán dây là một trong những
nguyên nhân gây chết ở dê với tỷ lệ khá cao (40%) vì vậy việc khống chế bệnh sán
dây cần được quan tâm.
Đào Hữu Thanh và Lê Sinh Ngoạn (1980), Phan Địch Lân Và cộng sự
(1975), Nguyễn Thế Hùng (1994) cũng xác nhận 2 loài sán dây thuộc giống
Moniezia
ký sinh ở dê và các thú nhai lại khác.
Nguyễn Thị Kim Lan (2000) cho biết, loài
M. expansa
phổ biến hơn so với
loài
M. benedeni
(hệ số thường gặp loài
M. expansa
là 100, trong khi loài
M.
benedeni
là 75). Tác giả đã thử nghiệm một số thuốc điều trị bệnh giun sán đường
tiêu hóa ở dê và nhận thấy Niclosamid-Tetramisol B và Vermitan rất an toàn và có
hiệu quả trong việc điều trị sán dây.
1.2. ĐẶC ĐIỂM VỀ HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA SÁN DÂY MONIEZIA
Sán dây
Moniezia

có hình dải băng màu trắng, cơ thể dài, hẹp chia thành ba
phần: đầu hơi tròn (phần đầu có các giác bám), cổ (là những đốt sán nối tiếp sau
đầu, có khả năng sinh ra các đốt thân, cơ quan sinh sản ở các đốt cổ chưa hình thành
rõ), thân (gồm những đốt sau cổ, có hình dạng và cấu tạo khác nhau) (Hình 1.1).
5



Thân sán dây gồm ba loại đốt: những đốt chưa thành thục về sinh dục (ở gần
cổ), cơ quan sinh dục chưa phát triển đầy đủ, chỉ thấy cơ quan sinh dục đực. Những
đốt thành thục về sinh dục (ở giữa thân), cơ quan sinh dục đực và cái, có hệ bài tiết,
cấu tạo mỗi đốt tương tự như mỗi cơ thể sán lá nhưng khác là không có hệ tiêu hóa.
Những đốt già (ở cuối thân sán), bên trong đốt sán chứa đầy tử cung với vô số trứng
sán dây. Ở những đốt già, cơ quan sinh dục đực bị thoái hóa. Những đốt già thường
xuyên rụng xuống, rời khỏi cơ thể sán và theo phân ra ngoài.

Hình 1.1. Hình dạng bên ngoài của sán dây Moniezia









Hình 1.2. Hình thái sán dây
A. Moniezia expansa ; B. Moniezia benedeni
1. Đầu ; 2. Đốt sán ; 3. Trứng
6

Sán dây
Moniezia
được bao bọc bằng lớp da cơ gồm các lớp: cuticun, màng
bazan và lớp dưới cuticun, tiếp theo là lớp cơ. Ở lớp cuticun bên ngoài có nhiều lỗ
thoát nhỏ, lớp cơ gồm nhiều bó cơ vòng và cơ dọc. Bên trong lớp cơ là các khí quan
của sán.
Sán dây
Moniezia
cũng giống các sán dây khác ở đặc điểm không có hệ tiêu
hóa, sán lấy thức ăn bằng phương thức thẩm thấu qua bề mặt cơ thể.
Hệ thần kinh của sán gồm các hách phân bố ở đầu, nối với 2 dây thần kinh
chạy qua các đốt sán về cuối thân. Hệ tuần hoàn và hô hấp tiêu giảm, hô hấp theo
kiểu yếm khí. Hệ bài tiết gồm 2 ống chính đi từ đầu sán đi về cuối thân thông với lỗ
bài tiết. Ngoài ra, ở mỗi đốt sán còn có những ống ngang nối liền với 2 ống chính.
Hệ sinh dục có trong mỗi đốt sán. Cơ quan sinh dục đực gồm nhiều tinh hoàn.
Mỗi tinh hoàn được nối với ống dẫn tinh riêng, các ống này đổ vào ống dẫn tinh
chung và thông với túi sinh sản. Phần cuối của ống dẫn tinh trong túi sinh sản là
dương vật thông với bên ngoài qua lỗ sinh dục đực. Cơ quan sinh sản cái gồm
Ootype ( ngã tư sinh dục ). Ootype thông với tử cung, buồng trứng tuyến noãn hoàn,
tuyến Mehlis, âm đạo. Phần cuối của âm đạo là lỗ sinh dục cái thông với bên ngoài
và ở cạnh lỗ sinh dục đực.

Hình 1.3. Cấu tạo một đốt thân sán dây Moniezia
7



Sán dây
Moniezia
thuộc bộ
Cyclophyllidae
nên có đặc điểm tử cung phân
nhánh, không có lỗ thông với bên ngoài. Tuyến noãn hoàn tập trung có hình khối.
Trứng nằm trong tử cung. Sán
Moniezia
không đẻ trứng mà đốt sán già sẽ tách khỏi
thân và theo phân ra ngoài. Hình thái của
Moniezia expansa
và
Moniezia benedeni

có những đặc điểm riêng:
M.expansa
: dài 1 - 5m, chỗ rộng nhất có thể tới 1,6cm. Đầu sán hơi tròn, có 4
giác bám hình bầu dục hơi tròn. Chiều rộng đốt sán lớn gấp 4 lần chiều dài đốt sán.
Mối đốt sán có cả cơ quan sinh dục đực và cái. Cơ quan sinh dục đực gồm nhiều
tinh hoàn (300 - 400 cái) hình cầu nhỏ ở giữa đốt sán. Mỗi tinh hoàn có ống dẫn
tinh riêng, hợp thành ống chung thông với túi dương vật hình quả lê và lỗ sinh dục

đực. Cơ quan sinh dục cái kép, gồm buồng trứng phân thùy hình quạt, tuyến dinh
dưỡng, tử cung và âm đạo có lỗ thông ra cạnh bên đốt sán. Phần sau mỗi đốt sán có
tuyến giữa đốt hình hoa thị xếp thành hàng ngang. Đốt sán già có tử cung hình túi
chứa đầy trứng sán. Trứng của
M. expansa
hình ba cạnh hoặc bốn cạnh hơi tròn,
trong ấu trùng có 6 móc được bao bọc trong cơ quan hình lê. Kích thước trứng
khoảng 0,05 x 0,06 mm.
M.benedeni:
dài 2 - 4m, đốt rộng hơn một chút so với đốt của
M.expansa
. Đầu
có 4 giác bám tròn, sâu. Nhìn chung, hình thái của sán dây
M.benedeni
tương đối
giống với
M.expansa
. Có một điểm quan trọng để phân biệt 2 loài là sự sắp xếp của
tuyến giữa đốt. Ở loại này, tuyến giữa đốt có dạng vạch, nằm tập trung ở giữa đốt
sán. Trứng sán cũng có hình 3 cạnh hoặc 4 cạnh hơi tròn, trong ấu trùng có 6 móc,
kích thước trứng khoảng 0,063 x 0,086mm.
Vị trí của sán dây Moniezia trong hệ thống phân loại giun sán ở động vật nuôi

Trong hệ thống phân loại động vật học, theo Phan Thế Việt và cộng sự
(1977), sán dây
Moniezia
có vị trí như sau:
Lớp sán dây
Cestoda
Rudolphi, 1808

Phân lớp
Eucestoda
Southwell, 1930
Bộ
Cyclophyllidae
Benede in Braun, 1900
8



Phân bộ
Anoplocephalata
Skrjbin, 1933
Họ
Anoplocephalidae
Cholodkowski, 1902
Phân họ
Anoplocephalinae
Blanchard, 1891
Giống
Moniezia
Blanchard,1891
Loài
Moniezia expansa
( Ridolphi, 1810) Blanchard, 1891
Loài
Moniezia benedeni
(Moniez, 1879) Banchard, 1891
1.3. CHU KỲ SINH HỌC CỦA SÁN DÂY MONIEZIA
M. expansa

và
M. benedeni
là hai loại sán dây ký sinh ở ruột non của gia súc
nhai lại. Gia súc nhai lại là vật chủ cuối cùng của sán, giúp sán hoàn thành vòng đời
và kí sinh ở giai đoạn thành thục. Để hoàn thành vòng đời, sán dây
Moniezia
cần vật
chủ trung gian là nhiều loại nhện đất thuộc họ
Orbatidae
như
Galumna
,
G. Obvius
,
G. nigara,Scheloribates laevigatus, S. latipes
(Trịnh Văn Thịnh, 1963; Phan Địch
Lân và Nguyễn Thị Kim Lan, 2002).



Hình 1.4. Vòng đời của sán dây Moniezia
9



Vòng đời của sán dây
Moniezia
diễn ra như sau:
- Đốt sán già rụng, theo phân dê, cừu, bò, trâu ra ngoài (sán dây
Moniezia

thuộc họ
Anoplocephalidae
, bộ
Cyclophyllidea
nên không đẻ trứng). Đốt sán phân
huỷ ở ngoại cảnh, giải phóng nhiều trứng sán. Trứng sán dây phát tán ở trong đất,
được các loài nhện đất họ
Oribatidae
ăn phải. Vào đường tiêu hoá của nhện đất,
trứng nở thành ấu trùng 6 móc, rồi phát triển thành ấu trùng có sức gây bệnh
(
Cysticercoid
) trong cơ thể nhện đất. Thời gian từ khi nhện đất nuốt trứng sán đến
khi phát triển thành
Cysticercoid
cần khoảng 120 - 180 ngày.
- Nhiều tác giả cho biết, có 28 loài nhện đất thuộc họ
Oribatidae
, nhưng phổ
biến là hai loài:
Scheloribates laevigatus
và
S. latipes
là ký chủ trung gian của sán
dây
Moniezia
. Thời gian nhện đất phát triển từ ấu trùng thành trưởng thành rất ngắn,
thời gian sống của chúng lại dài (14 - 19 tháng). Vì vậy, ấu trùng gây bệnh cũng tồn
tại lâu trong thiên nhiên.

Nhện đất có đặc điểm là ưa sống trên đất bỏ hoang, số lượng rất lớn, mỗi mét
vuông có thể có từ vài nghìn đến hàng chục nghìn con. Nếu đồng cỏ được cải tạo
luôn thì số lượng nhện đất giảm. Nhện đất sống ở môi trường có nhiệt độ, ẩm độ
nhất định. Nếu quá lạnh hoặc quá nóng thì nhện đất di chuyển đi chỗ khác. Khi
nóng (30
o
C) ánh sáng mạnh và khô, chúng từ thân cây, cỏ bò xuống rễ, có khi
xuống sâu 4 - 5 cm. Khi trời mưa, đất ẩm ướt và ít ánh sáng mặt trời, chúng lại bò
từ dưới đất lên cây cỏ. Thường thì chúng hoạt động vào sáng sớm, buổi chiều và tối.
Giữa trưa ánh sáng mạnh, ít thấy nhện đất. Nhện đất họ
Oribatidae
có kích thước
nhỏ, thân phủ lớp kính cứng, màu nâu đỏ.
- Ký chủ cuối cùng là gia súc nhai lại dê, cừu, bò. Khi gia súc nhai lại ăn cỏ có
lẫn nhện đất thì bị nhiễm bệnh sán dây. Vào đường tiêu hoá, nhện đất được tiêu hoá
nhờ enzyme trong đường tiêu hoá gia súc nhai lại, ấu trùng được giải phóng ra, bám
vào niêm mạc ruột non, thẩm thấu dinh dưỡng qua bề mặt cơ thể, phát triển thành
sán dây trưởng thành. Thời gian từ lúc súc vật nhai lại nuốt phải nhện đất mang ấu
trùng gây bệnh, đến khi phát triển thành sán dây trưởng thành dài ngắn tuỳ loài sán:
10



M. expansa
cần khoảng 37 - 40 ngày,
M. benedeni
cần khoảng 50 ngày.
Theo Drozdz J. và Malcrewski A. (1971), Trịnh Văn Thịnh (1978), 24 - 48 giờ
sau khi trứng sán dây

Moniezia
được nhện đất nuốt, đã thấy ấu trùng trong xoang cơ
thể nhện. Thời gian ấu trùng phát triển trong cơ thể nhện đất khoảng 120 - 180
ngày, thời gian
Moniezia
phát triển thành trưởng thành ở cơ thể loài nhai lại khoảng
1 tháng. Sán dây trưởng thành sống trong cơ thể ký chủ khoảng 75 ngày, trường hợp
lâu nhất tới 5 - 6 tháng.
Sengbusch H. G. (1977) cho rằng, những đốt sán và trứng sán được thải theo
phân của động vật nhiễm sán. Những đốt này có thể bị chim ăn và chim trở thành
nguồn gieo rắc căn bệnh.
Cysticercoid
phát triển trong ký chủ trung gian xấp xỉ 4
tháng. Thời gian phát triển thành ấu trùng gây nhiễm
Cysticercoid
ở trong cơ thể
nhện đất - ký chủ trung gian có thể ngắn hơn (l - 4 tháng) (Urquhart và cộng sự, 1996).
1.4. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH Ở BÒ, DÊ, CỪU DO SÁN DÂY MONIEZIA
GÂY RA
1.4.1. Tình hình nhiễm sán dây theo loài gia súc
Rao J. R. và Deorani V. P. S. (1988) cho biết, xét nghiệm phân trâu, bò, dê ở
huyện Port Blair (Ấn Độ), thấy bò nhiễm sán dây
Moniezia
là 2,1%, dê là 3%. Xét
nghiệm các mẫu phân của bò, trâu, dê, cừu ở thung lũng Kangra - Ấn Độ, kết quả là
trong số 1194 gia súc có 1017 con nhiễm từ một đến nhiều loại ký sinh trùng (85%).
Riêng tỷ lệ nhiễm sán dây
Moniezia
thì bò nhiễm 1%, trâu 0,7%, không thấy dê và
cừu nhiễm (Krishna L.và cộng sự, 1989). Năm 2003, Achi và cộng sự đã điều tra

tình hình nhiễm giun sán ở bò tại các lò mổ ở vùng Savannah của Pháp và xác định
loại sán lá thường gặp nhất là sán dây với tỷ lệ nhiễm là 31%.
Nwosu và cộng sự (1996) cho biết tỷ lệ nhiễm sán dây ở dê tại Nigeria là 31%.
Ở Ethiopia kết quả điều tra tình hình nhiễm ký sinh trùng đường ruột ở dê cho thấy
tỷ lệ nhiễm sán dây
Moniezia expansa
là 32,2% và số lượng trứng/gam phân là
545,2 trứng (Etana Debela, 2002). Trong quá trình điều tra ký sinh trùng đường hô
11



hấp và tiêu hóa ở dê Iceland tác giả Yfirlot đã phát hiện thấy tỷ lệ nhiễm
Moniezia
expansa
là 20%.
Ở cừu, tỷ lệ nhiễm sán dây theo điều tra của Eeroanska và cộng sự (2005) tại
Slovakia là 19,2%. Cũng trên đối tượng cừu kết quả điều tra của Munib và cộng sự
(2006) cho thấy sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm giữa các loài sán
dây trên đàn cừu ở Pakistan: tỷ lệ nhiễm
Moniezia expansa
là 71,3% trong khi đó
Moniezia benedeni
là 2,17% và số lượng trứng/gam phân (EPG = eggs per gram
faeces) tương ứng là 388,85 và 11,8 trứng.
Nguyễn Đức Tân và cộng sự (2010) cho biết tỷ lệ nhiễm sán dây theo loài gia
súc ở một số tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên như sau .
Bảng 1.1. Tỷ lệ nhiễm sán dây theo loài gia súc
Loài gia súc
Số gia súc điều tra

(con)
Số gia súc nhiễm
(con)
Tỷ lệ nhiễm (%)
Bò
333 18 5,41
Dê
392 81 20,66
Cừu
238 39 16,39
Tổng cộng 963 138 14,33

1.4.2 Tình hình nhiễm sán dây theo lứa tuổi

Theo kết quả điều tra của Phan Địch Lân và Phạm Sỹ Lăng (1975), đàn dê của
trại X (Nam Hà) nhiễm sán dây như sau: dê đực giống nhiễm 40%, dê cái hậu bị
nhiễm 66,6%, dê dưới 1 năm tuổi nhiễm 80%; cường độ nhiễm từ 5 - 14 sán
dây/con dê.
Theo Phạm Văn Khuê và Phan Lục (1996), tuổi động vật càng cao thì tỷ lệ
nhiễm càng thấp. Bệnh thường thấy ở cừu, dê, bê từ một tháng rưỡi đến tám tháng
tuổi, bê có sức thải sán ra ngoài do đó tỷ lệ bệnh giảm. Qua xét nghiệm 666 mẫu
phân và mổ khám 27 dê thuộc 3 giống (Bách Thảo, Ấn Độ và dê cỏ) ở một số cơ sở
nuôi dê, Nguyễn Thế Hùng (1996) cho biết, dê 4 - 7 tháng tuổi nhiễm nặng nhất
(43,7%), thấp nhất là dê trên 12 tháng tuổi (8%).
12



Bảng 1.2. Tỷ lệ nhiễm sán dây Moniezia theo lứa tuổi
Lứa tuổi Số kiểm tra Số nhiễm Tỷ lệ (%)

1 - 3 tháng 52 11 21
4 - 7 tháng 64 28 44
8 - 12 tháng 75 23 30
Trên 12 tháng 87 7 8

1.4.3 Tình hình nhiễm sán dây theo mùa

Mùa xuân và mùa hè là các mùa ấm, ẩm ướt, mưa nhiều. Vì vậy, vào mùa
xuân và mùa hè, nhện đất có điều kiện sống, phát triển nhanh về số lượng. Đồng
thời vào những mùa này, nhện đất trưởng thành cũng có điều kiện thuận lợi hơn để
di chuyển từ dưới đất lên thân cây, cỏ. Súc vật nhai lại chăn thả vào những thời
điểm này dễ cảm nhiễm sán dây
Moniezia
do ăn cỏ cây có lẫn nhện đất mang
Cysticercoid.

Sengbusch H. G. (1977) cho biết, bệnh có tính chất mùa vụ rõ rệt. Tỷ lệ nhiễm
Moniezia
tăng lên vào mùa hè và giảm đi vào mùa đông. Tác giả giải thích, nguyên
nhân là do nhện đất - ký chủ trung gian của
Moniezia
ở trên đồng cỏ phát triển
nhiều hơn trong mùa hè, và giảm đi ở mùa đông.
Nguyễn Thế Hùng (1994) cũng xác nhận quy luật mùa vụ khi điều tra tình
hình nhiễm giun sán ở đàn dê của Trung tâm nghiên cứu dê, thỏ Sơn Tây và nông
trường Đồng Mô: tỷ lệ nhiễm ở vụ Hè - Thu cao hơn vụ Đông - Xuân.
Nghiên cứu tỷ lệ và cường độ nhiễm sán dây
Moniezia
ở đàn dê địa phương
của tỉnh Bắc Thái (cũ), Nguyễn Thị Kim Lan và cộng sự (1998) thấy, tỷ lệ nhiễm

Moniezia
ở dê trong vụ Đông - Xuân là 12,3 - 15,4%; trong khi tỷ lệ nhiễm trong vụ
Hè - Thu là 20,8 - 28,8%, cường độ nhiễm trong vụ Hè - Thu cũng nặng hơn vụ
Đông - Xuân. Theo dõi lặp lại hai lần và xử lý thống kê, tác giả khẳng định, sự sai
khác về tỷ lệ nhiễm này là rõ rệt.
13



1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ PHÂN LOẠI SÁN DÂY
1.5.1. Chuẩn đoán trong phòng thí nghiệm
Mục đích của phương pháp này là tìm các đốt sán hoặc trứng sán dây có trong
phân của gia súc nhai lại.
Kỹ thuật lấy phân để xét nghiệm: trong đất hoặc trên nền chuồng có chứa số
lượng lớn trứng và ấu trùng giun sán sống tự do. Khi gia cầm, gia súc thải phân
trứng và ấu trùng giun tròn sống tự do có thể dính vào phân gây khó khăn cho việc
xét nghiệm chuẩn đoán. Vì vậy cần lấy trực tiếp qua hậu môn của con vật. Phân của
mỗi con vật để riêng vào túi nilon sạch, mỗi mẫu khoảng 20 - 30 gam, có nhãn ghi
số thứ tự mẫu, tính biệt, khối lượng con vật, địa điểm thu thập mẫu. Mẫu phân phải
đưa về phòng thí nghiệm hoặc cơ sở nghiên cứu để xét nghiệm ngay hoặc bảo quản
ở tủ lạnh dưới < 10 ºC , thời gian bảo quản không quá 7 ngày.
* Chẩn đoán định tính
Là phương pháp xác định có hoặc không có các loài giun sán ký sinh ở gia
súc, gia cầm tức là tìm giun sán trưởng thành hoặc đốt sán dây, trứng hoặc ấu trùng
giun sán trong phân. Đây là những phương pháp thông dụng để đánh giá tình hình
nhiễm giun sán ở các đàn gia súc, gia cầm.
• Phương pháp tìm giun sán trưởng thành
Để tìm giun sán trưởng thành hoặc các đốt sán dây được thải ra theo phân (đặc
biệt là khi tẩy giun sán thăm dò), có thể dùng que bới phân và quan sát bằng mắt
thường hoặc quan sát kỹ hậu môn của từng con vật (có thể phát hiện cả đoạn sán

dây lủng lẳng ở hậu môn gia súc), thu gom toàn bộ phân của mỗi con vật vào chậu
rồi hoà tan trong nước, để lắng, gạn nhiều lần cho đến khi cặn lắng trong thì gạn
nước đi để tìm giun sán, đốt sán dây trong cặn.
• Phương pháp tìm trứng giun sán
Có nhiều phương pháp tìm trứng giun sán, nhưng đạt hiệu quả cao và đơn
14



giản, dễ làm là: phương pháp phù nổi Fulleborn (1927), phương pháp Darling,
phương pháp Cherbovick và phương pháp gạn rửa sa lắng Benedek (1943).
-
Phương pháp Fulleborn:
là một trong các phương pháp phù nổi dễ làm và
rẻ tiền. Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng dung dịch muối ăn (Nacl) bão
hoà có tỷ trọng d = 1,18, lớn hơn tỷ trọng của trứng giun sán, làm cho trứng giun
sán nổi lên bề mặt dung dịch. Dung dịch nước muối bão hoà pha bằng cách: cho
tinh thể muối ăn (Nacl) vào chậu hoặc nồi nước sôi, vừa cho vào vừa khuấy cho đến
khi muối không hoà tan được nữa (thường dùng 380 - 400 gam muối tinh thể không
ngậm nước, hoặc 450 gam muối tinh thể ngậm nước). Để nguội, được dung dịch
muối bão hoà dùng để xét nghiệm trứng giun sán.
-
Phương pháp Darling
: là phương pháp phù nổi có độ chính xác cao, tuy
nhiên dụng cụ và thao tác có phức tạp hơn so với phương pháp Fulleborn. Trong
phương pháp Darling, dung dịch nước muối bão hoà (NaCl) vẫn được sử dụng làm
dung dịch xét nghiệm chẩn đoán, song cần có máy ly tâm để thực hiện phương pháp
này. Sau hai lần ly tâm, trứng giun sán dễ dàng nổi lên bề mặt dung dịch nước muối
bão hoà. Đồng thời, tiêu bản làm từ phương pháp Darling được loại bỏ cặn tốt hơn
nên "sạch" hơn, dễ phát hiện trứng giun sán hơn pháp Fulleborn.

-
Phương pháp Cherbovick
: là phương pháp có độ chính xác cao trong xét
nghiệm trứng giun sán. Cách tiến hành phương pháp Cherbovick cũng gồm hai lần
ly tâm như phương pháp Darling, song tuỳ mục đích chẩn đoán mà có thể dùng
dung dịch bão hoà khác nhau (dung dịch ma giê sunfat bão hoà, dung dịch nam
hyposunfit bão hoà).
-
Phương pháp gạn rửa sa lắng:
(còn gọi là phương pháp lắng cặn trứng giun
sán): nguyên tắc của phương pháp này là dùng nước lã sạch tách trứng giun sán ra
khỏi phân. Trứng giun sán có tỷ trọng lớn hơn tỷ trọng của nước lã sẽ chìm xuống,
có thể thu nhận để quan sát chẩn đoán dưới kính hiển vi.
Phương pháp gạn rửa sa lắng có thể phát hiện khá tốt trứng sán lá gan, trứng
15



sán lá dạ cỏ, trứng sán lá ruột lợn, đốt sán dây. Nếu để lắng cặn 30 - 60 phút có thể
phát hiện trứng giun đũa và một số trứng giun tròn có kích thước lớn khác.
Chú ý, khi xét nghiệm phân cần phân biệt trứng giun sán với cặn thức ăn, bào
tử nang của nấm, trứng của các loài tiết túc có thể có trong phân, cũng như phải
phân biệt đặc điểm hình thái của từng loại trứng. Trứng giun sán thường có 2 hoặc 4
lớp vỏ, nhẵn hoặc lồi lõm, trong trứng có phôi bào hoặc ấu trùng.
* Chẩn đoán định lượng

Để đếm số lượng trứng và ấu trùng giun sán trong phân, có thể dùng các
phương pháp sau:
• Phương pháp đếm trứng Stoll
Cho 5 gam phân vào trong một ống có vạch đo, cho dung dịch NaOH 0,1N tới

vạch 75 ml. Khuấy đều bằng đũa thuỷ tinh cho tan phân rồi dừng lại đột ngột, dùng
pipet lấy ra 0,05 ml nước phân loãng cho lên phiến kính, đậy lá kính và quan sát
dưới kính hiển vi. Số trứng đếm được nhân với 320 sẽ cho biết số trứng trong 1 gam
phân. Tốt nhất nên làm vài lần để lấy số trung bình. Có thể dùng phương pháp phù
nổi và gạn rửa sa lắng để đánh giá hiệu quả của thuốc sau khi tẩy giun sán mà
không nhất thiết phải dùng phương pháp Stoll. Trong trường hợp này phải lấy số
lượng phân như nhau, các dụng cụ phải cùng kích thước, dung dịch dùng xét
nghiệm phải như nhau. So sánh số trứng trong một giọt váng bề mặt hoặc trong thị
trường kính hiển vi (Nguyễn Thị Lê và cs, 1996).
• Phương pháp đếm trứng Mc. Master
Phương pháp này dùng để xác định số lượng trứng giun tròn, trứng sán dây và
Oocyst cầu trùng trong 1 gam phân bằng buồng đếm Mc. Master. Cân 4 gam phân
cho vào cốc thuỷ tinh, thêm 56 ml dung dịch nước muối bão hoà, khuấy đều cho tan
phân. Lọc qua lưới thép vào một cốc khác và khuấy đều. Trong khi đang khuấy, lấy
công tơ hút 1ml cho vào 2 buồng đếm (mỗi buồng đếm có dung tích là 0,15ml). Để
yên 5 phút rồi kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 10).
16



Trong thực tế, để dễ phát hiện và dễ đếm trứng, có thể cải tiến như sau:
+ Bước l: cân 4 gam phân vào cốc thuỷ tinh, thêm nước lã sạch (khoảng 100 -
150 ml), khuấy tan phân, lọc bỏ cặn bã thô. Nước lọc để lắng trong 1 - 2 giờ, gạn bỏ
nước, giữ lại cặn.
+ Bước 2: cho 56 ml dung dịch nước muối bão hoà, khuấy đều cho tan cặn.
Trong khi đang khuấy, lấy công tơ hút, hút 1 ml dung dịch phân cho đầy 2 buồng
đếm Mc. Master (mỗi buồng đếm có dung tích là 0,15ml). Để yên 5 phút rồi kiểm
tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10x10). Đếm toàn bộ số trứng trong những ô
của hai buồng đếm, rồi tính theo công thức sau:
Số trứng/1(g) phân =

tổng số trứng trên 2 buồng đếm x 200
4

1.5.2. Phương pháp chẩn đoán trên gia súc chết

Phương pháp mổ khám gia súc
Phương pháp này chủ yếu là tìm giun sán và ấu trùng giun sán ở các cơ quan
nội tạng khi mổ khám xác con vật đã chết. Ưu điểm của phương pháp mổ khám là
biết được chính xác thành phần loài giun sán ký sinh và mức độ nhiễm nặng hay nhẹ.
Tuỳ theo mục đích mổ khám mà chúng ta có thể dùng phương pháp mổ khám
toàn diện hoặc phương pháp mổ khám cục bộ hay còn gọi là phương pháp mổ khám
phi toàn diện của Skrjabin K. I. (1928).
Mổ khám toàn diện là phương pháp mổ khám giun sán ở tất cả các cơ quan, tổ
chức của cơ thể gia súc, gia cầm (phát hiện giun, sán ở xoang mắt, xoang miệng,
xoang mũi, xoang ngực, xoang bụng, mô não; toàn bộ hệ tiêu hoá, kể cả gan, tuỵ; hệ
hô hấp; hệ bài tiết; hệ sinh dục; các tổ chức dưới da).
Mổ khám phi toàn diện là phương pháp mổ khám một hệ cơ quan hoặc một cơ
quan để phát hiện các loài giun sán nào đó trong cơ thể gia súc, gia cầm.
17



1.5.3. Phương pháp phân loại dựa vào hình thái cấu tạo
Lớp Sán dây được chia làm 2 lớp phụ và 9 bộ, có nhiều loài ký sinh gây bệnh
cho người và gia súc thuộc các bộ như
Cyclophyllidea
và
Pseudophyllidea.
Trên thế
giới có khoảng 130 triệu người bị nhiễm bệnh sán dây. Ở Việt Nam có 200 loài, có

một số bộ quan trọng liên quan đến khả năng gây bệnh cho người và gia súc.
- Phân lớp
Cestodaria:
Bao gồm các loài sán dây có cơ thể không chia đốt, chỉ
có 1 hệ sinh dục. Ví dụ loài
Amphilina foliacea
ký sinh trong cơ thể cá tầm. Dạng
trưởng thành không sống trong ruột mà sống trong xoang, vật chủ trung gian là giáp
xác bơi nghiêng. Ấu trùng của loài này sống trong xoang của giáp xác, khi cá ăn
giáp xác thì chuyển sang giai đoạn trưởng thành.
- Phân lớp sán dây chính thức
(Cestoda):
Bộ
Pseudophyllidea
bao gồm các
loài sán dây có cơ quan bám là mép, đôi khi có móc. Một số họ đáng chú ý là
Diphyllobothrridae
và
Lingulidae
. Một số loài ký sinh gây bệnh cho người và gia
súc là: sán mép
Diphyllobothrium latum
có giai đoạn trưởng thành sống trong ruột
người, thú nuôi và thú hoang. Chiều dài cơ thể đạt đến 9 m và có khoảng ba đến bốn
nghìn đốt. Phát triển phức tạp qua giáp xác chân kiếm và cá, ấu trùng là
Procercoid

và
Pleurocercoid
. Người bị nhiễm bệnh do ăn phải cá khô hay cá không nấu chín. Ở

Việt Nam thường gặp loài
Diphyllobothrium mansoni
có giai đoạn trưởng thành ký
sinh ở chó, cáo, mèo… có thể dài tới 2,5m, ấu trùng ký sinh trong giáp xác chân
kiếm.
Ligulata intestinalis
là loài gây bệnh trầm trọng cho cá. Cơ thể hình dải, có
nhiều hệ sinh dục nhưng chưa chia thành từng đốt. Đầu không phân hoá rõ rệt và có
giác bám kém phát triển, ấu trùng là
leurocercoid
dài tới 50- 80cm.
Taeniarhynchus
saginatus
ký sinh ở người và
Taenia solium
ký sinh ở lợn
.
Cơ thể chỉ có 3 - 4 đốt,
đầu có 2 vành móc và 4 giác bám. Trưởng thành ký sinh trong ruột chó và thú ăn
thịt. Nang sán ở trong nội quan của dê, cừu, bò, lợn và người. Nang sán lớn (có thể
nặng tới 60 kg), có nhiều đầu gọi là bao nang nhiều đầu, chèn ép vật chủ gây đau đớn
.
Sán dây
Moniezia
ở gia súc nhai lại phổ biến nhất là hai loài
Moniezia expansa

và
Moniezia benedeni
. Hình thái của

Moniezia expansa
và
Moniezia benedeni
có
những đặc điểm riêng:
18




M.expansa
: dài 1 - 5m, chỗ rộng nhất có thể tới 1,6cm. Đầu sán hơi tròn, có 4
giác bám hình bầu dục hơi tròn. Chiều rộng đốt sán lớn gấp 4 lần chiều dài đốt sán.
Mỗi đốt sán có cả cơ quan sinh dục đực và cái. Cơ quan sinh dục đực gồm nhiều tinh
hoàn (300 - 400 cái) hình cầu nhỏ ở giữa đốt sán. Mỗi tinh hoàn có ống dẫn tinh riêng,
hợp thành ống chung thông với túi dương vật hình lê và lỗ sinh dục đực. Cơ quan sinh
dục cái kép, gồm buồng trứng phân thùy hình quạt, tuyến dinh dưỡng, tử cung và âm
đạo có lỗ thông ra cạnh bên đốt sán. Phần sau mỗi đốt sán có tuyến gian đốt hình hoa
thị xếp thành hàng ngang. Đốt sán già có tử cung hình túi chứa đầy trứng sán. Trứng
của
M. expansa
hình ba cạnh hoặc bốn cạnh hơi tròn, trong ấu trùng có 6 móc được bao
bọc trong cơ quan hình lê. Kích thước trứng khoảng 0,05 x 0,06 mm.
M. benedeni
sán dài 2 - 4m, đốt rộng hơn một chút so với đốt của
M. expansa
.
Đầu có 4 giác bám tròn, sâu.
Nhìn chung, hình thái của sán dây
M. benedeni

tương đối giống với
M.
expansa.
Có một điểm quan trọng để phân biệt 2 loài là sự sắp xếp của tuyến gian
đốt. Ở loại này tuyến gian đốt có dạng vạch, nằm tập trung ở giữa đốt sán. Trứng
sán cũng có hình 3 cạnh hoặc 4 cạnh hơi tròn, trong ấu trùng có 6 móc, kích thước
trứng khoảng 0,063 x 0,086mm.
1.5.4. Phương pháp phân loại sán dây dựa vào kỹ thuật phân tử PCR
1.5.4.1. Kỹ thuật PCR (Polymerasa Chain Reaction)

* Giới thiệu
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerasa Chain Reaction (Phản ứng chuỗi
trùng hợp – phản ứng khuếch đại gen). Đây là kỹ thuật của sinh học phân tử cho
phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật
thành nhiều bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt, kỹ thuật này được nhà khoa học
người Mỹ – Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 tại công ty Cetus; mặc dù
nguyên tắc này đã được mô tả chi tiết trước đó một thập niên bởi Khorana và cộng
sự, (Kleppe và cộng sự, 1971; Panet và cộng sự, 1974), và được giới thiệu lần đầu
19



tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận
được giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993. Kể từ đó đã tạo nên một tác
động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới.

* Nguyên lí

Nguyên lý nhân gen trong tế bào:

DNA là vật chất di truyền của cơ thể sống quy định đặc tính của cơ thể (ngoại
trừ một số loại virus có vật chất di truyền là RNA). Đối với những sinh vật có cấu
trúc tế bào nhân chuẩn, các phân tử DNA tồn tại dưới dạng kết hợp với protein
thành các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào. Ngoài ra, tại các cơ quan khác như ty
thể và lạp thể (ở thực vật) cũng chứa DNA ở dạng plasmid.
Các phân tử DNA ở những tế bào hoạt động bình thường chỉ được nhân lên
trong quá trình phân bào nguyên nhiễm. Để thực hiện được quá trình này, đòi hỏi
phải có mặt enzyme DNA polymerasa, sự tham gia của các đoạn mồi có trình tự bổ
sung gắn vào vào sợi DNA khuôn và các dNTPs làm nguồn cung cấp nucleotit.
Trong quá trình phân bào nguyên nhiễm, các sợi DNA kép được mở xuắn tách
thành các sợi DNA sợi đơn. Dưới tác dụng của enzyme DNA polymerase, quá trình
tổng hợp DNA được xảy ra theo cách gắn lần lượt các nucleotit vào đoạn mồi để
kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn.


Nguyên lý của kỹ thuật PCR

Nguyên lý của PCR là dùng mồi nucleotide lai bổ sung vào một đầu của đoạn
DNA cần tìm rồi men DNA polymerase sẽ khuếch đại và nhân bội lên theo một dây
chuyền phản ứng, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới từ đó
dễ dàng cho việc quan sát và xét nghiệm.
Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản
của sao chép DNA trong cơ thể nhưng có sự khác biệt:
+ Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzyme helicase.
20



+ Kết hợp với enzyme DNA polymerasa chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới
trong môi trường thích hợp.

+ Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên
biệt, chủ động.
Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA
riêng biệt. Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự
có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.
Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của
DNA polymerasa được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các
suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerasa chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp.
Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerasa không có nhiều
khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerasa chịu
nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100
0
C. Ở nhiệt độ này DNA
sẽ bị biến tính (DNA dạng xoắn sẽ duỗi ra và ở dạng thẳng). Một phản ứng PCR là
một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến
tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài.
* Chu kỳ nhiệt

Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều
lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ).
• Giai đoạn biến tính
(denaturation):
Tách chuỗi DNA từ sợi đôi tách thành 2 sợi đơn. Nhiệt độ tăng lên 94 - 96°C
để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nhiệt độ tăng lên sẽ phá vỡ cầu
nối hydrogen của chuỗi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến
thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ
còn dạng sợi đơn. Thời gian ở giai đoạn này khoảng: 1 - 2 phút.
• Giai đoạn bắt cặp
(annealing):