ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization) phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii de man, 1879)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA NUÔI TR ỒNG THỦY SẢN
PHẠM THỊ THANH NH ÀN
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ
(IN SITU HYBRIDIZATI ON) PHÁT HIỆN TÁC NHÂN
GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TR ÊN ẤU TRÙNG
TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879)
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành Bệnh học Thủy Sản
Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2008
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA NUÔI TR ỒNG THỦY SẢN
PHẠM THỊ THANH NH ÀN
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ
(IN SITU HYBRIDIZATION) PHÁT HIỆN TÁC NHÂN
GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TR ÊN ẤU TRÙNG
TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879)
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành Bệnh học Thủy Sản
Cán bộ hướng dẫn:
1. TS. LÝ THỊ THANH LOAN
2. CN. ĐOÀN VĂN CƯ ỜNG
Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2008
i
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành c ảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Thuỷ Sản Nha Trang
đặc biệt là thầy cô trong bộ môn Bệnh Học Thuỷ Sản đ ã tận tình truyền đạt kiến
thức cho chúng em trong thời gian qua.
Để hoàn thành tốt luân văn tốt nghiệp n ày tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận

tình của cán bộ trong viện nghi ên cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. V ì vậy em:
Chân thành cảm ơn Tiến Sĩ Lý Thị Thanh Loan đ ã hướng dẫn và tạo điều
kiện tốt nhất để em ho àn thành báo cáo này.
Chân thành cảm ơn CNSH Đoàn Văn Cường đã giúp đỡ và chỉ bảo cho em
trong quá trình th ực hiện và hoàn thành báo cáo này.
Chân thành cảm ơn anh Nguyễn Doãn Duẩn, người đã giúp đỡ em tận tình và
chỉ bảo cho em trong suốt quá tr ình thực hiện báo cáo n ày.
Qua đây em cảm ơn các anh chị thuộc Trung Tâm Quan Trắ c đặc biệt là anh
chị trong phòng mô học và phòng sinh học phân tử Trung Tâm Quốc Gia Quan
Trắc Cảnh Báo Môi Tr ường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam
Bộ - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II.
Do trình độ bản thân còn hạn chế và thời gian có hạn nên trong báo cáo
không tránh kh ỏi sai sót, rất mong được sự đóng góp ý ki ến của thầy cô v à bạn bè.
Tp. HCM tháng 11/2008
Sinh viên thực hiện
Phạm Thị Thanh Nh àn
ii
MỤC LỤC
ĐỀ MỤC TRANG
LỜI CẢM ƠN. i
DANH MỤC CÁC BẢNG ii
DANH MỤC CÁC HÌNH iii
DANH SÁCH CÁC CH Ữ VIẾT TẮT iv
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1
PHẦN 2. TỔNG QUAN T ÀI LIỆU 3
2.1. Đặc điểm sinh học của tôm c àng xanh 3
2.1.1. Hình thái tôm càng xan h 3
2.1.2. Vòng đời 4
2.1.3. Đặc điểm sinh sản 4
2.1.4. Sự phân bố 5

2.1.5. Đặc điểm của ấu tr ùng 6
2.2. Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh 8
2.2.1.Các bệnh do vi khuẩn 8
2.2.1.1. Bệnh hoại tử do vi khuẩn 8
2.2.1.2. Bệnh phát sáng 8
2.2.1.3. Bệnh đốm nâu 9
2.2.1.4. Bệnh do Ricketsia. 9
2.2.2. Bệnh hoại cơ (Idiopathic Muscle Necrosis) (IMN). 9
2.2.3. Bệnh do nguyên sinh động vật 10
2.2.4. Một số bệnh chưa xác định rõ tác nhân gây bệnh 10
2.2.4.1. Bệnh giữa chu kỳ ấu tr ùng 10
2.2.4.2. Bệnh lột xác dính vỏ. 10
2.3. Bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh 11
2.3.1. Tình hình nghiên c ứu bệnh đục thân tr ên tôm càng xanh 11
2.3.2. Dấu hiệu của bệnh đục thân 11
iii
2.3.3.Tác nhân gây b ệnh 12
2.3.4. Sự lây nhiễm 13
2.4. Các phương pháp chu ẩn đoán bệnh đục thân trên tôm càng xanh 14
2.4.1. Phương pháp lai Dot – blot 14
2.4.2. Phương pháp ELISA 15
2.4.3. Phương pháp RT – PCR 16
2.4.4. Phương pháp mô học truyền thống 17
2.4.5. Phương pháp lai t ại chỗ 18 2.4.5.1. Nguyên t ắc 18
2.4.5.2. Kỹ thuật lai tại chỗ 19
2.4.5.3. Mẫu dò 22
PHẦN 3: VẬT LIỆU V À PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 26
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 26
3.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 26
3.2.1. Vật liệu và dụng cụ cho ứng dụng ph ương pháp lai tại chỗ và

mô học truyền thống 26
3.2.3. Phương pháp nghiên c ứu 28
3.2.3.1. Phương pháp làm lame dương 28 3.2.3.2. Phương pháp t ổng hợp và đánh dấu mẫu dò 28
3.2.3.3. Phương pháp mô h ọc truyền thống v à lai tại chỗ 31
3.2.3.4. Bố trí thí nghiệm 36
PHẦN 4. KẾT QUẢ V À THẢO LUẬN . 37
4.1. Kết quả ứng dụng kỹ thuật ISH phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân 37
4.2. Kết quả so sánh ph ương pháp ISH với phương pháp mô học truyền thống
và kỹ thuật RT-PCR 47
4.2.1. So sánh về độ nhạy và độ chính xác của 3 ph ương pháp 47
4.2.2. So sánh về tính ổn định và hiệu quả của 3 phương pháp RT-PCR,
Mô học truyền thống v à ISH 51
PHẦN 5. KẾT LUẬN V À ĐỂ XUẤT Ý KIẾN 53
5.1. KẾT LUẬN 53
5.2. ĐỀ XUẤT 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG V À ĐỒ THỊ
BẢNG NỘI DUNG TRANG
Bảng 2.1 Đặc điểm phát triển các giai đoạn của ấu tr ùng tôm càng xanh
(aquacop, 1983) 6
Bảng 3.1 Thành phần hóa chất cho đánh dấu mẫu d ò 30
Đồ thị 4.1 Tỷ lệ nhiễm MrNV tr ên 10 mẫu thu có biểu hiện bệnh 48
Bảng 4.1 Bảng dấu hiệu lâm s àng của các mẫu 37
Bảng 4.2 Kết quả phân tích mô học tôm c àng xanh 39
Bảng 4.3 Kết quả một số phương pháp sinh h ọc phân tử 43
Bảng 4.4 Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh MrNV
của ba phương pháp ISH, Mô h ọc và RT-PCR trên tôm ấu trùng 47
Bảng 4.5 So sánh hiệu quả của cả 3 phương pháp RT-PCR, mô học truyền thống

và ISH 51
v
DANH MỤC CÁC HÌNH.
HÌNH NỘI DUNG TRANG
Hình 2.1. Hình Virus MrNV (Bonami và ctv, 2005) 13
Hình 2.2. Hình Virus XSV (Bonami và ctv, 2005) . 13
Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt kỹ thuật lai. 19
Hình 2.4 Digoxigenin – UTP/dUTP/ddUTP, alkali -stable 25
Hình 3.1 Sơ đồ xử lý mẫu 32
Hình 3.2 Sơ đồ nhuộm mẫu tự động . 33
Hình 4.1 Hình Post-larvae của tôm càng xanh với dấu hiệu: xuất hiện những đốm
trắng ở phần đuôi, phần bụ ng và phần đầu 38
Hình 4.2 Hình thái mô học tổ chức cơ tôm càng xanh 40
Hình 4.3 Hình tổ chức tế bào khối gan tụy 41
Hình 4.4 Sự xuất hiện thể vùi trên cơ quan mang của ấu trùng tôm càng xanh 41
Hình 4.5 Hình mô tôm kh ỏe mạnh mẫu A8 42
Hình 4.6 Tế bào nhiễm MrNV trên các cơ quan khác nhau c ủa tôm sau khi
nhuộm ISH 44
Hình 4.7 Tế bào nhiễm MrNV trên cơ quan gan t ụy sau khi nhuộm ISH 46
Hình 4.8 Tế bào nhiễm MrNV sau khi nhuộm ISH v à mô học truyền thống 49
vi
DANH SÁCH CÁC CH Ữ VIẾT TẮT.
TP.HCM : Thành phố Hồ Chí Minh.
MrNV : Macrobrachium rosenbergii nodavirus.
XSV : Extra Small Virus.
ISH : In Situ Hybridization.
RT-PCR : Reverse Transcriptase-Polymerase Chain
Reaction.
DNA : Deoxyribonucleic Acid .
RNA : Ribonucleic Acid .

cDNA : Complementary Deoxyribonucleic Acid .
S - ELISA : Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent
Assay.
IMN : Idiopathic Muscle Necrosis .
MCD : Larval Mid Cycle Disease .
OIE : Office International Epizootic .
FAO : Food and Agriculture Organization .
DIG : Digoxigenin.
1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
Ngành thủy sản Việt Nam trong những năm gần đây đ ã đạt được những
thành tựu đáng khích lệ, tốc độ tăng trưởng hàng năm trên 20% và đang tr ở thành
một trong những ng ành kinh tế quan trọng của quốc gia. Đặc biệt phải kể đến sự
đóng góp to lớn của nghề nuôi tôm. Kể từ khi xuất hiện, nghề nuôi tôm n ước ta
ngày càng chứng tỏ khả năng đem lại lợi nhuận rất cao cho nền kinh tế quốc dân. Ở
Việt Nam, trong 10 năm gần đây phong tr ào nuôi tôm nước lợ phát triển rất mạnh,
đặc biệt là khu vực các tỉnh ven biển Đồng Bằng Sông Cửu Long nh ư Cà Mau,
Bạc Liêu, Bến Tre, Đồng Tháp. Bên cạnh đó, trong những năm gần đây tôm c àng
xanh cũng đang trên đã phát triển mạnh và cũng chiếm một vị trí quan trọng tr ên thị
trường. Từ năm 2000 trở lại đây sản l ượng tôm càng xanh đều tăng rất mạnh v à đạt
tới 10000 tấn trong năm 2002 (Bộ Thủy Sản, 2003).
Tuy nhiên, ngh ề nuôi tôm càng xanh gặp phải không ít những khó khăn do
dịch bệnh xảy ra. Đặc biệt l à gây thiệt hại rất lớn và là mối nguy cho nghề nuôi tôm
chủ yếu là bệnh do virus gây ra như b ệnh đục thân do virus . Đây là một bệnh rất là
nguy hiểm và là một trong những bệnh gây thiệt hại nghi êm trọng cho người sản
xuất giống cũng nh ư người nuôi tôm thương phẩm, tỷ lệ chết có thể đạt tới 100%
chỉ trong vòng 5 ngày (Vijayan và cộng sự, 2003). Hiện nay bệnh n ày vẫn chưa có
biện pháp chữa trị m à chủ yếu trong quá tr ình nuôi tiến hành phòng bệnh là chính.
Vì vậy, việc chẩn đoán chính xác đ ược tác nhân để có thể đ ưa ra biện pháp xử lý
đúng và kịp thời là rất quan trọng và cần thiết trong nuôi trồng thủy sản.

Để tăng cường kiểm soát bệnh, cho đến nay đ ã có rất nhiều phương pháp
hiện đại đã và đang được phát triển và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh thủy sản nh ư
phương pháp Mô h ọc truyền thống, một số ph ương pháp dựa trên cơ chế miễn dịch
đặc hiệu (ELISA, Dot -Blot), các kỹ thuật PCR (PCR, RT -PCR)…Tuy nhiên vi ệc
tìm ra được phương pháp có tính đ ặc hiệu cao, tính nhạy cao v à là một công cụ hữu
hiệu để chẩn đoán đ ược chính xác tác nhân gây bệnh th ì luôn là mối quan tâm của
các nhà nghiên c ứu bệnh học thủy sản. V à với phương pháp lai t ại chỗ (In Situ
2
Hybridization) đó là kỹ thuật lai phân tử nhằm phát hiện tr ình tự nucleic nhất định
trong lát cắt mô. Nên nó đáp ứng được yêu cầu trên và là công cụ hữu hiệu để chẩn
đoán tác nhân mà phương pháp m ô học truyền thống không thể thực hiện đ ược.
Vì vậy, xuất phát từ thực tiễn cần thiết, đ ược sự đồng ý của khoa Nuôi Trồng
Thủy Sản, bộ môn Bệnh học Thủy Sản – trường Đại Học Nha Trang. D ưới sự
hướng dẫn của Tiến Sĩ Lý Thị Thanh Loan – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy
Sản II. Em được phân công thực hiện đề t ài:
“ Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (In Situ Hybridization) phát hiện tác
nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh ( Macrobrachium
rosenbergii De Man, 1879)”.
Mục tiêu:
Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (ISH) để phát hiện sự hiện diện của tác nhân gây
bệnh đục thân tr ên ấu trùng tôm càng xanh.
Nội dung nghiên cứu:
- Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (ISH) phát hiện tác nhân gây bệnh
đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh.
- So sánh kết quả thu được của phương pháp ISH v ới phương pháp mô h ọc
truyền thống và kỹ thuật RT-PCR về độ ổn đinh, độ nhạy, độ chính xác v à tính hiệu
quả.
Nghiên cứu đề tài này thành công s ẽ là tiền đề để nghiên cứu phát triển ph ương
pháp lai tại chỗ và ứng dụng để phát hiệ n chính xác đư ợc tác nhân gây bệnh trên đối
tượng thủy sản, cụ thể l à bệnh đục thân do virus tr ên ấu trùng tôm càng xanh.

3
PHẦN 2. TỔNG QUAN T ÀI LIỆU
2.1. Đặc điểm sinh học của tôm c àng xanh
2.1.1. Hình thái tôm càng xanh
Theo hệ thống phân loại của Holthius (1950), tôm càng xanh
Macrobrachium rosenbergii De Man 1879 đư ợc phân loại nh ư sau:
Ngành chân khớp Arthropoda
Lớp giáp xác Crustacea
Lớp phụ giáp xác bậc cao Malacostraca
Bộ mười chân Decapoda
Bộ phụ chân bơi Natantia
Phân bộ Caridea
Họ Palaemonidae
Họ phụ Palaemoninae
Giống Macrobrachium
Loài M. rosenbergii DE MAN 1879
Macrobrachium rosenbergii De Man 1879 là loài tôm càng xanh l ớn nhất
trong giống Macrobrachium. Tôm c àng xanh có cơ th ể thon dài, đối xứng hai bên.
Cấu tạo cơ thể gồm hai phần: phần đầu ngực phía trước, phần bụng phía sau [6 ].
Phần đầu ngực lớn có dạng h ơi giống hình trụ bao gồm phần đầu với 5 đốt
gần nhau mang 5 đôi phụ bộ v à phần ngực với 8 đốt liền nhau mang 8 đôi phụ bộ.
Phần đầu ngực được bao dưới tấm vỏ dày gọi là giáp đầu ngực [6].
Phần bụng gồm có 6 đốt có thể cử động v à một đốt đuôi, mỗi đốt mang một
đôi phụ bộ gọi là chân bơi. Mỗi đốt bụng có tấm vỏ bao. Tấm vỏ phía tr ước xếp
chồng lên tấm vỏ phía sau. Tuy nhi ên tấm vỏ của đốt bụng thứ hai phủ l ên cả hai
tấm vỏ trước và sau nó. Các đ ốt bụng hơi tròn trên mặt lưng và dẹp hai bên. Cơ thể
có dạng hơi cong như hình dấu phẩy, to ở phần đầu v à thon nhỏ về phía sau [6], [9].
Tôm có chủy dài vượt vảy râu, uốn cong l ên từ đoạn giữa chủy, gốc chủy ở
nơi hốc mắt nhô cao l ên thành mào. Có t ừ 11-16 răng trên ch ủy (2-3 răng sau hốc
4

mắt) và 10 -15 răng dưới chủy.
Các phụ bộ có hình dạng, kích cỡ và chức năng khác nhau với hai đôi râu có
chức năng xúc giác, một đôi h àm lớn, hai đôi hàm nhỏ và ba đôi chân hàm có ch ức
năng giữ và nghiền mồi. Năm đôi chân ngực có chức năng để bò, năm đôi chân
ngực để bơi và một đôi chân đuôi có chức năng như bánh lái. Hai đôi chân ng ực đầu
tiên của tôm chuyển hóa th ành hai đôi càng, đôi càng th ứ hai to dùng để bắt mồi và
tự vệ [37].
Ở tôm nhỏ có m àu sắc trong sáng, tr ên giáp đầu ngực có những sọc xanh đen
dọc hai bên. Tôm trưởng thành có màu xanh dễ nhận đôi khi có m àu nâu nhạt, cơ
thể có những vệt m àu xanh hơi sậm ngang lưng xen kẽ với màu trắng trong của cơ
thể [6], [9].
2.1.2. Vòng đời
Theo Ling và cộng sự (1962) và Phương (2003), v òng đời của tôm càng xanh
được chia thành 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, hậu ấu trùng và tôm trưởng thành. Khi
tôm trưởng thành, chúng thư ờng sống ở vùng nước ngọt và chính nơi này sẽ xảy ra
quá trình thành th ục, phát dục và giao vĩ đẻ trứng. Khi ôm trứng chúng có xu h ướng
bơi ra xa vùng nư ớc lợ từ 6 -8‰.
Ở đó ấu trùng được nở ra và sống trôi nổi theo kiểu ph ù du. Sau 11 lần lột
xác với 12 giai đoạn biến thái, ấu tr ùng (Nauplii) biến thành hậu ấu trùng (Post
larvae) lúc này tôm con di cư v ề vùng nước ngọt sống và lớn lên ở đó [35],[37].
2.1.3. Đặc điểm sinh sản
Ở tôm trường thành, tôm đực thường có kích thước lớn hơn tôm cái cùng
tuổi. Đầu ngực tôm đực to h ơn và khoang b ụng hẹp hơn so với tôm cái. Đôi c àng
thứ hai to, dài hơn và thường có màu xanh dương đ ậm. Các gốc chân ngực của tôm
đực xếp khít nhau h ơn so với tôm cái, hai lỗ sinh dục đực nằm đốt gốc của đôi chân
ngực thứ 5 [37].
Tôm cái thường có kích thước nhỏ hơn tôm đực, có phần đầu ngực v à đôi
càng thon nhỏ, ba tấm bụng đầu ti ên ở tôm cái rộng và dài tạo thành khoang bụng
làm buồng ấp trứng. Quá trình nở rộng của các tấm bụng n ày khi tôm tham gia sinh
5

sản lần đầu và đây cũng chính là đặc điểm quan trọng của tôm cái. Lỗ sinh dục của
con cái nằm ở phần ức, ngay gốc đôi chân ngực thứ 3, có dạng tam giác. Tr ên các
đốt giữa của các chân b ơi còn có nhiều lông tơ hình thành ở thời kỳ lột xác tiền giao
vĩ có tác dụng cho trứng bám v ào [6], [9], [16].
Buồng trứng của con cái nằm tr ên mặt lưng của phần đầu ngực, giữa dạ d ày
và gan tụy. Khi buồng trứng th ành thục sẽ có màu vàng có thể nhìn thấy qua giáp
đầu ngực, trải dài từ sau mắt đến đổt đầu của phần bụng. Ống dẫn trứng nối từ
buồng trứng ở trước tim chạy dọc hai b ên bụng đổ về phía túi ở đốt gốc của chân
ngực thứ 3 [6], [9].
Tôm thành thục và giao vĩ xảy ra hầu nh ư quanh năm. Mùa đ ẻ rộ của tôm
càng xanh ở Đồng Bằng Nam Bộ tập trung từ tháng 4 – 6 và từ tháng 8 – 10 [11].
Tôm càng xanh cái thành t hục lần đầu tiên ở khoảng 3 – 3,5 tháng kể từ hậu ấu
trùng 10- 15 ngày. Kích cỡ tôm nhỏ nhất đạ t thành thục từ 10 – 13 cm và 7,5g [9].
Quá trình lột xác tiền giao vĩ của tôm cá i sẽ tiết ra chất dẫn dụ có tác dụng
kích thích tôm đực tìm đến. Sau khi tôm lột xác 1 – 22 giờ, thường 3 – 6 giờ, tôm
bắt đầu giao vĩ. To àn bộ quá trình tiếp xúc và giao vĩ xảy ra trong vòng 20 – 35
phút. Sau khi giao v ĩ 2 – 3 giờ có khi 6 – 24 giờ tôm cái bắt đầu đẻ trứng [6], [9].
Tôm thường đẻ trứng v ào ban đêm, tôm cái thư ờng di chuyển từ tầng đáy l ên
tầng giữa hay tầng mặt để đẻ. Trong quá tr ình đẻ trứng, trứng đ ược thụ tinh khi đi
ngang túi chứa tinh. Trứng sẽ lần l ượt dính từng chùm vào các lông tơ của các đôi
chân bụng thứ tư, thứ ba, thứ hai, thứ nhất. Thời gian đẻ trứng khoảng 10 – 60 phút,
thường 15 – 25 phút. Những tôm cái thành thục chín muồi nhưng không được giao
vĩ vẫn đẻ trứng trong v òng 24 giờ sau khi lột xác. Những trứng n ày do không đư ợc
thụ tinh nên sẽ rụng sau 1 – 2 ngày (FAO, 1985) .
Trong quá trình ấp trứng, tôm cái th ường dùng chân bụng quạt nước, tạo
dòng nước cung cấp dưỡng khí cho trứng. Thời gian ấp cho đến khi trứng nở có thể
từ 15 – 23 ngày phụ thuộc vào nhiệt độ nước.
2.1.4. Sự phân bố
Tôm càng xanh phân b ố khắp các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới trên Thế Giới
6

Hiện nay được biết trên 100 loài, trong đó hơn m ột phần tư số này có ở châu Mỹ
[9]. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tôm c àng xanh phân bố ở tất cả các thủy
vực nước ngọt (đầm, hồ, ao, sông) v à các thủy vực nước lợ của nhiều v ùng trên thế
giới.Tôm càng xanh phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á v à một khu vực khá hẹp của
Đông Bắc Á, giới hạn từ ấn Độ đến phía Đông của n ước Úc và đảo Solomon nh ư
Thái Lan, Ấn Độ, Sigapore, Nhật Bản, Hồng Kông, Philippine, Ondonesia,
Australia, Việt Nam và khu vực Tây Nam Thái B ình Dương chủ yếu khu vực từ
Châu Úc đến New Guinea [9].
Ở Việt Nam, tôm c àng xanh phân bố tự nhiên từ Nha Trang trở v ào đến
Đồng Bằng Nam Bộ v à tập trung chủ yếu ở các v ùng nước ngọt và vùng cửa sông
ven biển ở Đồng Bằng Sông Cửu Long [35].
2.1.5. Đặc điểm của ấu tr ùng
Ấu trùng nở ra và sống trôi nổi theo ki êu phù du, sống trong vùng nước lợ 6 -
18‰. Ấu trùng có tính hư ớng quang mạnh, b ơi chủ động bụng ngửa đuôi h ướng về
phía trước. Có thể cho ấu trùng ăn bằng các loại Artemia, Moina, thịt cá, thịt mực,
Artemia tiền trưởng thành, trùng chỉ (giun đỏ), thức ăn chế biến, thức ăn nhân tạo
Tuy nhiên, thức ăn thường được sử dụng nhất l à ấu trùng Artemia và th ức ăn chế
biến. Ấu trùng qua 12 lần lột xác để trở thành hậu ấu trùng [36], [37].
Bảng 2.1. Đặc điểm phát triển các giai đoạn của ấu tr ùng tôm càng xanh
(Aquacop, 1983)
Giai
đoạn
phát
triển
Hình thái
Thời
gian tính
sau khi
nở
ngày

I
Dài 2-2,1mm (đo từ mút chủy đến mút Telson), có
dạng tam giác mang 7 đôi lông ở phía sau .
46K
4h15phút
1-3
II
Dài 2,2mm, mắt có cuống, đốt dứới cũng có dạng
tam giác, mang 8 đôi lông ở phía sau.
94 k 14h
3 - 5
III
Dài 2,6 mm, nhánh ngoài của Telson ngắn hơn
Telson với tia trong chưa mang lông phía sau. Gốc
chủy xuất hiện một gai chủy tr ên đầu.
152 k 34h
5 - 8
7
IV
Dài 3,2 – 3,4 mm, đốt đuôi hẹp ở phần sau, phía
trong chân đuôi có lông, sau g ốc chủy có 2 gai tr ên
chủy. Mỗi gai có 2 – 3 răng ở mép trước. Nhánh
ngoài Telson dai b ằng telson có dạng h ình chữ
nhật. nhánh ngoài chân ngực 4 mới nhú.
205 k 34h
7 – 10
V
Dài 3,8 – 3,9 mm, đốt dưới có lông chim. Hai gai
trên chủy có 4 – 5 răng. Telson nhọn. nhánh ngoài
chân ngực 4 xuất hiện đốt .

244 k 36h
VI
Dài 4 – 4,1mm, đốt đuôi kéo dài thêm và thu h ẹp
lại. phần sau có mang 3 đôi gai ở phía b ên và 5 đôi
lông cứng ở phía sau. Hai đôi cạnh đôi giữa có
lông chim. Nhánh ngoài telson dài quá mút telson,
chân bụng đã nhú.
286k 45h
9 – 15
VII
Dài 4,1 – 4,2 mm, mầm chân bụng nhú l ên với các
mức độ khác nhau, các m ầm to thì chẻ 2. Mỗi gai
trên chủy có 5 – 6 răng, ở mép dưới xuất hiện
nhánh 3 của nhánh antene.
330k 58h
10 - 17
VIII
Dài 4,4 – 4,7 mm, các chân bụng đều có 2 nhánh
chưa có mang lông hay ch ỉ có 1 – 2 lông ở nhánh
ngoài.
262k 56h
11 – 18
IX
Dài 5,6 – 5,8 mm, chân bụng phát triển d ài thêm,
nhánh ngoài có 4 – 5 lông cứng.
385k 69h
13 – 19
X
Dài 6 – 6,2 mm, chân ngực 1 và 2 có kẹp. Xuất
hiện 3 – 4 gai chủy phía trên.

492k 76h
15 – 27
XI
Dài 6,6 – 8 mm, chân ngực 1 và 2 có kẹp hoàn
chỉnh. Nhánh trong và nhánh ngoài chân bụng đều
mang lông. Phí dư ới thùy có 2 – 3 răng.
567k 93h
17 – 30
XII
Dài 8,2 – 9,7 mm, chủy có 8 – 9 răng, ở phía trên
đốt đuôi mang 5 đốt gai ở phía sau, 2 đôi giữa có
dạng lông chim. Tôm b ơi thẳng và ưa bò trên đáy
và thành của bể.
650k
112h
19 - 35
8
2.2.Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh
2.2.1.Các bệnh do vi khuẩn
2.2.1.1. Bệnh hoại tử do vi khuẩn
Tác nhân gây b ệnh: Các nhóm vi khu ẩn Pseudomonas và vi khuẩn dạng sợi
Leucothrix. Chúng hiện diện trên các sợi mang và trên các phần phụ. Ngoài ra các
yếu tố như nhiệt độ thay đồi đột ngột, mật độ ấu tr ùng cao, chăm sóc qu ản lý không
tốt sẽ làm giảm sức đề kháng của cở thể tôm v à làm cho bệnh trở nên ngày càng
trầm trọng hơn [6].
Đối tượng nhiễm: Thường xảy ra ở giai đoạn ấu tr ùng đặc biệt là giai đoạn
IV – V nhiễm cao [6].
Triệu chứng bệnh: Những ấu trùng bị bệnh thân thường có màu xanh xám,
không ăn yếu ớt và rớt xuống đáy bể. Tr ên râu và các phần phụ xuất hiện các đốm
nâu, hoại tử trên các phụ bộ. Các điểm hoại tử phát triển rất nhanh, nếu khô ng được

xử lý kịp thời th ì tỷ lệ chết rất nhanh [6].
Giai đoạn cấp tính thì ấu trùng có màu xanh nh ạt, dạ dày rỗng yếu dần và
chìm xuống đáy bể chết [21].
2.2.1.2. Bệnh phát sáng
Tác nhân gây b ệnh: Vi khuẩn phát sáng Vibrio harveyi gây bệnh trên các ấu
trùng giai đoạn sớm, bệnh th ường gặp cả trên đối tượng tôm nước ngọt và nước
mặn [6].
Triệu chứng bệnh : Sự phát sáng có thể quan sát dễ d àng vào ban đêm.
Ngoài ra còn quan sát được cơ thể tôm mờ đục, b ơi lội yếu dần và chết. Đây là một
bệnh nghiêm trọng có thể gây chết đến 100%. Vi khuẩn n ày rất nhạy cảm với
Chloramphenicol và Novobiocin nhưng kháng l ại Streptomycin [5], [6].
2.2.1.3. Bệnh đốm nâu
Bệnh này hay còn được gọi là bệnh đốm đen, bệnh tr ên vỏ.
Tác nhân gây b ệnh: Có thể do các nhóm vi khuẩn nh ư Aeromonas,
Pseudomonas [14]. Ngoài ra các yếu tố như môi trường ô nhiễm, mật độ nuôi quá
9
dày, chế độ cho ăn và chăm sóc quản lý không tốt cũng gây cho bệnh phát triển
nhanh và tỷ lệ chết cao hơn [8], [14].
Bệnh này xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển c ủa tôm, bệnh n ày gây
thiệt hại về kinh tế rất lớn, năng suất có thể giảm tới 30% [7], [8].
Triệu chứng bệnh: Tôm bị bệnh thường xuất hiện những đốm có m àu nâu,
sau đó chuyển dần sang màu đen. Tại các vết đen viêm dẫn đến lở loét. Các vết n ày
nằm phía trong của lớp vỏ kitin n ên khi tôm lột vỏ thì các vết này không mất đi.
Tôm bị bệnh nặng thường kém ăn, gầy yếu, các phần phụ bị cụt hết v à chết [7], [8].
2.2.1.4. Bệnh do Ricketsia
Triệu chứng bệnh : Sự suy thoái khối gan tụy của ấu tr ùng bị bệnh.
Tác hại: Bệnh này gây thiệt hại rất lớn đến sản l ượng tôm postlarvae, tỷ lệ tử
vong có thể đạt đến 95%. Giai đoạn ấu tr ùng rất dễ mẫn cảm với bệnh n ày, đặc biệt
là giai đoạn ấu trùng IV – V [21].
2.2.2. Bệnh hoại cơ (Idiopathic Muscle Necrosis) (IMN )

Bệnh này được biết với nhiều t ên gọi khác như bệnh trắng cơ (white muscle
disease), bệnh hoại tử cơ (muscle necrosis), b ệnh đục cơ (muscle opacity ho ặc milk
prawn disease) [31].
Tác nhân gây b ệnh: Bệnh xảy ra khi tôm bị sốc môi tr ường, do không đảm
bảo vệ sinh, do thay đổi mật độ, giảm ox y hòa tan lớn, do mật độ nuôi quá d ày.
Bệnh có thể cũng xảy ra sau khi đem tôm post-larvae về nuôi được 1 hoặc 2 ngày.
Bệnh này gây tỷ lệ chết cao ở ấu tr ùng tôm do sự chết hoại các sợi c ơ. Theo
Nash và cộng sự, 1987, cho rằng bệnh này gây chết 60% ở giai đoạn postlarvae 28
ngày tuổi trong trại sản xuất giống ở Thái Lan.
2.2.3. Bệnh do nguyên sinh động vật
Tác nhân gây b ệnh: Các động vật nguyên sinh được tìm thấy trên tôm càng
xanh như Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Opercularia, Vaginicola, Cothurnia ,
Lagenophrys, Acineta, Podophria, Tokophrya và Ephelota [21]. Chúng thường sống
ngoại sinh trên thân, các phần phụ và mang của tôm.
10
Triệu chứng của bệnh : Khi ấu trùng bị nhiễm cơ thể có màu hơi đục. Nếu
nhiễm nhẹ bệnh có thể hết sau khi lột xác. Nếu nhiễm nặng nó gây ngăn cản quá
trình lột xác, tôm khó khăn trong quá tr ình bơi lội, chìm dần xuống đáy và chết [6].
Tác hại của bệnh không chỉ l àm tôm chậm lớn mà còn là nơi mà vi khuẩn rất
dễ xâm nhập và gây bệnh. Những ao nuôi kém vệ sinh, n ước ô nhiễm, ít th ay nước
thì tôm rất dễ nhiễm bệnh.
2.2.4. Một số bệnh chưa xác định rõ tác nhân gây b ệnh
2.2.4.1. Bệnh giữa chu kỳ ấu tr ùng (Larval Mid Cycle Disease - MCD)
Bệnh này thường xảy ra trong các giai đoạn ấu tr ùng từ IV – XI (Anderson
và cộng sự, 1990). Bệnh này gây thiệt hại lớn cho nghề ương giống tôm càng xanh
[21].
Nguyên nhân gây b ệnh: Vẫn chưa được xác định [6]. Triệu chứng của bệnh
tương tự như bệnh hoại tử do vi khuẩn [6]. MCD cũng có thể là một loại bệnh do rất
nhiều nguyên nhân khác [21].
Triệu chứng bệnh: Ấu trùng bị bệnh thường bỏ ăn và xảy ra hiện tượng ăn

thịt lẫn nhau, những con yếu, bị bệnh sẽ bị con khỏe h ơn ăn thịt. Ấu trùng nhiễm
bệnh có màu xám lơ, bơi l ội yếu ớt và thường bơi theo hình xoắn ốc. Chúng chết
hàng loạt và nhanh chóng trong vòng 2 -3 ngày. Thường khi bắt đầu chết, m àu sắc
ấu trùng biến đổi trở lên nhạt hơn (mất sắc tố) [9], [10].
2.2.4.2. Bệnh lột xác dính vỏ
Bệnh này chủ yếu xảy ra ở giai đoạn ấu tr ùng, đặc biệt là sự lột xác biến thái
sang giai đoạn postlarvae.
Nguyên nhân gây b ệnh: Vẫn chưa được xác định, có thể l à do chất lượng
nước kém, lọc không kỹ hoặc do dinh d ưỡng không tốt, thiếu [9].
Triệu chứng bệnh: Ấu trùng bị bệnh này không thể lột vỏ hoàn toàn ra khỏi
các phần phụ, mắt hay chủy khi chúng thay vỏ, l àm tôm không hoạt động được,
không ăn được chết nhiều ở giai đoạn 11, không phát triển đến hậu ấu tr ùng [9].
Hay sau khi lột vỏ thì bị di tật các phụ bộ l àm cho chúng khó khăn trong quá tr ình
di chuyển và dần dần chết. Tỷ lệ chết có thể l ên tới 80% [6].
11
2.3. Bệnh đục thân tr ên ấu trùng tôm càng xanh
2.3.1. Tình hình nghiên c ứu bệnh đục thân tr ên tôm càng xanh
Bệnh đục thân hay c òn gọi là bệnh đục cơ, bệnh trắng đuôi [16], [18], [30] .
Bệnh này được nghiên cứu và phát hiện đầu tiên ở Guadeoupe [19]. Sau đó
bệnh xuất hiện ở Martinique ( Ấ n Độ) và Đài Loan [31], 5 tỉnh khác ở Trung Quốc
[24]], Thái Lan [32].
Bệnh này gây thiệt hại kinh tế nghi êm trọng cho ngành công nghiệp nuôi
trồng thủy sản của Ấn Độ v à các trại nuôi tôm càng xanh [26], [28]. Bệnh này có
thể gây chết rất nhiều, tỷ lệ tử vong có thể đạt tới 100% [27], [28].
Ở Việt Nam, bệnh đục thân l à một bệnh mới xuất hiện tr ên tôm càng xanh,
các nghiên cứu ở nước ta còn ít, mới chỉ bước đầu khảo sát dấu hiệu để t ìm ra tác
nhân. Có hai luận văn tốt nghiệp của sinh vi ên thực hiện tại Viện Nghiên Cứu Nuôi
Trồng Thủy Sản II.
Phạm Duy Lãm (2005), Ứng dụng kỹ thuật RT -PCR xác định MrNV và
XSV trên TCX. Kết quả thu được phát hiện thấy sự hiện diện của cả hai virus

MrNV và SXV trên tôm càng xanh.
Nguyễn Minh Vàng (2007), Ứng dụng phương pháp mô học truyền thống
khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế b ào TCX bị bệnh đục thân. Kết quả qua phương
pháp mô học truyền thống thấy đ ược dấu hiệu mô học của tôm c àng xanh khi bị
bệnh đục thân đó l à sự hoại tử cơ, những ổ viêm trong cơ và xu ất hiện thể vùi trong
khối gan tụy và lá mang.
2.3.2. Dấu hiệu của bệnh đục thân
Dấu hiệu của bệnh trắng đuôi đ ược quan sát thấy ở tất cả các giai đoạn phát
triển của ấu trùng.
Ấu trùng bị bệnh có dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn, mờ đục ở phần c ơ đuôi sau đó lan
dần khắp cơ thể và phần đầu cuối cùng là toàn bộ cơ của phần đầu ngực v à phần
bụng đều có màu trắng đục [26]. Ấu trùng bị bệnh nặng cơ thể có màu trắng đục bị
chết từ 2 – 3 ngày sau lần đầu chuyển post -larvae trong bể ương, mức độ chết đạt
cực đại vào ngày thứ năm kể từ khi quan sát thấy các biểu hiện lần đầu ti ên của
12
bệnh dẫn đến phải xả bỏ ho àn toàn trong b ể ương, tỉ lệ chết rất khác nhau có thể đạt
95% [22, [26], [28].
Khi quan sát mô tôm b ị nhiễm ở phân đuôi v à phần ngực, mô liên kết giữa
các vi quản của khối gan tụy thấy sự hoại tử củ a khối cơ, sự hiện diện của các thể
virus [33].
2.3.3. Tác nhân gây b ệnh
Tác nhân gây bệnh được phát hiện đầu ti ên do Arcier và cộng sự (1999) xác
định do Nodavirus gây ra, được đặt tên là Macrobrachium rosenbergii nodavirus
(MrNV). Sau đó Qian và c ộng sự (2003), phát hiện thêm một loại virus khác có t ên
là extra small virus (XSV). XSV và MrNV đư ợc phát hiện trên tôm bị bệnh đục
thân thu từ Trung Quốc [24]. Hai virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus
(MrNV) và extra small virus (XSV) đư ợc tìm thấy liên quan đến bệnh trắng đuôi
[16]. Hiện nay, bệnh này chưa có một biện pháp điều trị n ào cho hiệu quả vì vậy các
trại nuôi, bể ương cần có biện pháp quản lý tốt để giảm thiểu sự lan rộng của bệnh.
MrNV là một virus có dạng h ình cầu đa diện 20 mặt, không có m àng bao

bọc, có đường kính khoảng 26 – 27 nm (Hình 2.1). Bộ gen của MrNV gồm 2 sợi
đơn RNA (RNA – 1 và RNA – 2) với kích thước tương ứng là 2,9kb và 1,3kb. V ỏ
capsid là một chuỗi protein có khối l ượng 43kDa [16]. Với những đặc điểm n ày và
kết quả giải tr ình tự đoạn RNA1 của MrNV thì MrNV được xếp vào họ
Nodaviridae [16].
XSV là một tiểu thể giống virus có kích th ước nhỏ hơn virus MrNV, h ình đa
diện 20 mặt, không có m àng bao, có đường kính 14 - 16 nm (Hình 2.2). Bộ gen của
XSV là một sợi đơn RNA có kích thư ớc khoảng 0,8 – 0,9 kb [24]. Sau khi giải trình
tự bộ gen của XSV cho thấy RNA d ài 796 nucleotide và m ột đoạn poly (A) khoảng
15 – 20 nucleotide kết thúc ở đầu 3
’
[29]. Phân tích protein b ằng SDS – PAGE cho
thấy thể XSV chứa hai polypeptide l à capsid 17 kDa (CP – 17) và capsid 16 (CP –
16) [24].
13
Hình 2.1: Virus MrNV Hình 2.2: Virus XSV (Bonami và ctv, 2005)
Vai trò và mối quan hệ giữa MrNV v à XSV chưa được rõ ràng. Một điểm
đặc biệt là MrNV có thể xuất hiện một m ình trong các mẫu tôm bệnh, trong khi đó
XSV chỉ xuất hiện trong các mẫu tôm bệnh khi đ ã nhiễm MrNV [24]. Nên sự hiện
diện đồng thời của MrNV v à XSV trong bệnh trắng đuôi đ ược đặt ra giả thuyết l à
vai trò của mỗi loại virus n ày như thế nào trong việc phát triển cũng nh ư trong quá
trình phát sinh mầm bệnh? Theo Widada v à Bonami (2004) cho r ằng XSV không có
gen mã hóa cho RNA polymease. Nên có gi ả thuyết cho rằng XSV l à một satellite
virus và XSV s ử dụng enzyme RNA polymerase của MrNV nh ưng XSV sẽ mã hóa
một chức năng cần thiết cho sự phát triển của MrNV hay l àm phát sinh thêm m ầm
bệnh của MrNV th ì không xác định được [36]. XSV là một kiểu virus satellite đầu
tiên được báo cáo là gây bệnh ở động vật v à được ghi nhận là một satellite –
nodavirus cộng hưởng đầu tiên [36].
2.3.4. Sự lây nhiễm
Virus MrNV và XSV truyền từ bố mẹ sang con, virus n ày hiện diện trong mô

sinh trứng và trứng đã thụ tinh. Thế hệ con sinh ra từ tôm bố mẹ bị nhiễm virus sẽ
chết 100% khi phát triển đến giai đoạn post larvae. Tôm càng xanh b ố mẹ mang
virus nhưng lại không quan sát thấy sự xuất hiện của dấu hiệu đặc tr ưng của bệnh
trắng đuôi [32]. Vì thế chúng trở thành một vật mang virus rất l à nguy hiểm.
Artemia và một số loài tôm có thể là những vật mang virus rất nguy hiểm
dẫn đến sự lây lan MrNV v à XSV theo chiều ngang. Artemia bố mẹ mang mầm
bệnh của virus n ày sẽ truyền cho thế hệ con của chúng. Khi tôm c àng xanh giống
14
được cho ăn nauplii của artemia đ ã bị nhiễm virus n ày thì tôm giống này sẽ bị chết
ngay chỉ sau vài ngày [32]. Một số loài tôm như Penaeus monodon, Penaeus
indicus, Penaeus japonicus là những vật mang virus n ày mặc dù virus này không
gây chết những loài tôm này [32].
2.4. Các phương pháp chu ẩn đoán bệnh đục thân tr ên tôm càng xanh
Có rất nhiều phương pháp nghiên c ứu bệnh đục thân tr ên tôm càng xa nh như
phương pháp mô h ọc [15], [33]; kỹ thuật Northern blot [24]; kỹ thuật dot-blot [31];
kỹ thuật S-ELISA [26]; phương pháp lai t ại chỗ [18], [30]. Phương pháp RT -PCR
[18], [27], [30], [31], [35], [36].
2.4.1. Phương pháp lai Dot – blot
Nguyên tắc
Kỹ thuật lai Dot – blot là một trong các kỹ thuật lai tr ên pha rắn, một trong
hai trình tự bổ sung (thường là trình tự đích, tức là trình tự cần tìm) được cố định
trên một giá thể rắn, gọi l à các màng lai. Có hai lo ại màng lai: Màng lai b ằng
nitrocellulose- được sử dụng đầu tiên nhưng hiện nay không c òn thông dụng và
màng lai bằng nylon. Ngày nay người ta thường sử dụng màng lai bằng nylon do có
độ bền cơ học cao và cho phép lai nhi ều lần với nhiều mẫu d ò khác nhau [1].
Phương pháp này cho phép đ ịnh lượng tương đối một RNA đặc tr ưng trong
một hỗn hợp RNA m à không cần phải phân tách chúng ra. Ph ương pháp này ngư ời
ta không chuy ển các nucleic acid từ gel l ên màng lai mà đặt trực tiếp một l ượng
mẫu nhỏ lên màng lai hành m ột điểm – dot hay một khe – slot). Các RNA đư ợc cố
định trên màng lai sẽ được cho lai với mẫu d ò đã được đánh dấu [1].

Mẫu dò là một đoạn DNA thu đ ược từ RNA-1 của MrNV. Đoạn DNA đ ược
đánh dấu bằng PCR với tác nhân l à digoxygenine. M ẫu dò này được sử dụng để lai
với mẫu RNA- 1 thu được từ mẫu tôm bị nhiễm. Mỗi mẫu (1µl) là một điểm trên
màng lai. Mẫu sau khi qua các công đoạn xử lý bằng dung dịch lai v à tiên lai, mẫu
dò được thêm vào để quá trình lai xảy ra. Tiến hành rửa để loại đi mẫu d ò không lai
ra khỏi màng lai. Rồi thêm vào phản ứng kháng thể k háng DIG có gắn enzyme
Alkaline phosphatase để phát hiện các phân tử có tr ên màng lai.Các kháng thể này
15
sẽ kết hợp với DIG có trong các thể lai giữa tr ình tự đích và mẫu dò. Rửa tiếp để
loại bỏ các kháng thể tự do. Sau đó ủ với c ơ chất của enzyme để thực h iện phản ứng
màu ngay trên màng lai.
Ứng dụng: J. Sri Widada và c ộng sự (2003; 2004) đã sử dụng kỹ thuật lai
Dot-blot để phát hiện virus MrNV và XSV trên tôm càng xanh. V ới mẫu dò là một
đoạn acid nucleic từ genome của virus đ ược tạo dòng trong các vector như
tpCR2.1-TOBO.
2.4.2. Phương pháp ELISA ( A sandwich enzyme linked immunosorbent assay)
Đây là một phương pháp thử nghiệm hấp thu miễn dich nhờ enzym kết nối
với kháng thể đơn dòng và đa dòng. Đây là một trong các kỹ thuật phân tích miễn
dịch dùng để phát hiện kháng nguyên một cách đặc hiệu.
Nguyên tắc
Sử dụng kháng thể phủ lên các đĩa giếng, nếu có sự hiện diện của kháng
nguyên mục tiêu trong dung dịch mẫu thì kháng nguyên s ẽ bị giữ lại trên bề mặt
giếng bởi kháng thể. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiên nhờ kháng thể thứ
cấp có gắn enzyme alkaline phosphate . Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu vào giếng các
enzyme này sẽ xúc tác phản ứng thủy phân c ơ chất để tạo ra các sản phẩm có m àu.
Bằng cách theo dõi sự biến đổi của m àu có thể phát hiện sự hiện diện c ủa kháng
nguyên.
Kỹ thuật S-ELISA (Sandwich -ELISA) được Romestand và Bonami (2003)
sử dụng để chẩn đoán bệnh đục thân tr ên tôm càng xanh. Sử dụng kháng thể của
nodavirus, IgG (Immunoglobulin G) đ ể phát hiện protein capsid của MrNV. Các

kháng thể này được đánh dấu bằng Biotin, sau đó sử dụng hệ thống Avidin -
Peroxidase để phát hiện. Đây l à một phương pháp chẩn đoán bệnh trắng đuôi nhanh,
độ đặc hiệu và độ nhạy cao [26].
16
2.4.3. Phương pháp RT – PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain
Reaction)
Nguyên tắc
Vật chất di truyền của MrNV và XSV đều là RNA [16], [24]. Enzyme Taq
polymerase không ho ạt động trên RNA [1] nên không thể sử dụng trực tiếp kỹ thuật
PCR để nghiên cứu bệnh đục thân tr ên tôm càng xanh. Do đó ngư ời ta phải sử dụng
phối hợp kỹ thuật PCR với e nzyme phiên mã ng ược là reverse transcriptase. K ỹ
thuật RT – PCR được ứng dụng trong việc khuyếch đại các cDNA, l à sản phẩm của
sự phiên mã ngược trước đó từ RNA.
Kỹ thuật RT – PCR gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phi ên mã ngược và giai đoạn
khuyếch đại cDNA.
Giai đoạn phiên mã ngược:
Giai đoạn khuyếch đại cDNA.
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) do Karl Mullis và c ộng sự phát minh
năm 1985 [1], được sử dụng để khuyếch đại DNA .
Nguyên tắc
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn đều cần hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn
DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn v à DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đ ã được
hình thành dựa vào cấu trúc đặc tính đó của các DNA polymerase. Thực vậy, nếu ta
cung cấp hai mồi chuy ên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một tr ình tự DNA, ta
sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa l à để khuếch đại
một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các
mồi bổ sung chuy ên biệt, các mồi này gồm mồi xuôi (sens primer), mồi ng ược
(antisnes primer) [1].

PCR là một chuỗi phản ứng li ên tục, gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi
chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
17
Giai đoạn biến tính (Denaturation): Được tiến hành ở nhiệt độ cao 90 -
95
0
C trong thời gian 30 giây-60 giây. Các liên k ết hidro bị phá vỡ, sợi DNA xoắn
kép trở thành sợi đơn [1].
Giai đoạn bắt cặp (Annealing): khi nhiệt độ được hạ xuống thì các đoạn
mồi sẽ bắt cặp với các mạch đ ơn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguy ên tắc bổ sung.
Nhiệt độ của giai đoạn n ày tùy thuộc vào Tm của các cặp mồi đ ược sử dụng, thông
thường từ 40-70
0
C trong 30 giây - 60 giây [1].
Giai đoạn tổng hợp (Elongation): Khi nhiệt độ tăng lên 70-72
0
C thì các
enzyme DNA polymerase sẽ hoạt động gắn th êm các nucleotide vào cu ối các đoạn
mồi theo nguyên tắc bổ sung với sợi DNA khuôn v à kéo dài theo chi ều 5’-3’. Thời
gian của giai đoạn này tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA cần khuyếch đại,
thường kéo dài từ 30 giây đến vài chục phút [12].
Một chu kỳ bao gồm 3 b ước như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần
lặp lại làm tăng gấp đôi số lượng các bản sao tr ước đó, nghĩa là số lượng các bản
sao được tăng lên theo cấp số nhân [1].
2.4.4. Phương pháp mô h ọc truyền thống
Mô học là khoa học nghiên cứu sự phát triển, cách cấu tạo v à sự hoạt động
của các mô, các c ơ quan của động vật, thực vật. Từ đó mô học giúp chẩn đoán bệnh
dựa trên những biến đổi vi thể của cấu trúc tế b ào, mô, cơ quan.
Các bước làm tiêu bản mô học truyền thống ( Theo Lightner D V,1996).
 Cố định mẫu

Mục đích của giai đoạn n ày là giữ mẫu ở trạng thái tế b ào ít thay đổi nhất so với khi
sống và ngăn chặn những biến đổi sau khi chết.
 Xử lý mẫu
Mục đích: Khử nước và làm trong mẫu sau đó tẩm parraffin
Khử nước: Là làm thế nào để rút hết nước trong mẫu mô ra m à không làm
mô và tế bào bị co, không làm vị trí của các th ành phần cấu tạo trong mô thay đổi.
Mẫu sau khi cố định sẽ đ ược rửa qua nước sau đó ngâm trong cồn để khử n ước.