Chọn tạo giống nhờ công nghệ tế bào doc

Những người thực hiện:
Những người thực hiện:
1.
1.
Phạm Lê Ngọc Băng Dương
Phạm Lê Ngọc Băng Dương
2.
2.
Nguyễn Huỳnh Thảo Yến
Nguyễn Huỳnh Thảo Yến
3.
3.
Từ Thị Thanh Sơn
Từ Thị Thanh Sơn
4.
4.
Nguyễn Văn Tiền
Nguyễn Văn Tiền
5.
5.
Đinh Thj Thắm
Đinh Thj Thắm
6.
6.
Châu Thị Kim Ngọc
Châu Thị Kim Ngọc

PHẦN 1:
PHẦN 1:


KỸ THUẬT TRỒNG CÂY ĐƠN BỘI
KỸ THUẬT TRỒNG CÂY ĐƠN BỘI
IN VITRO VÀ PHƯƠNG PHÁP
IN VITRO VÀ PHƯƠNG PHÁP
TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG.
TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG.

A. TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI CẤY
A. TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI CẤY
BAO PHẤN, HẠT PHẤN
BAO PHẤN, HẠT PHẤN

Nguyên lý:
Nguyên lý:


Nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân trên môi
Nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân trên môi
trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để
trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để
kích thích các hạt phấn này phát triển thành
kích thích các hạt phấn này phát triển thành
cây đơn bội.
cây đơn bội.

S đ t o cây đ n b i t nuôi c y ơ ồ ạ ơ ộ ừ ấ

S đ t o cây đ n b i t nuôi c y ơ ồ ạ ơ ộ ừ ấ
h t ph n in vitroạ ấ
h t ph n in vitroạ ấ
Khử trùng bề mặt
Hoa
Tách các bao phấn
Loại bỏ chỉ nhị
Nuôi cấy trên
mt lỏng
Nuôi cấy trên
mt bán rắn(có agar)
Nhuộm acetoarmine để xác định
GĐPT của hạt phấn
Phát triển phôi
Cây đơn bội




3 ph ng th c sinh s n đ n tính đ c khi ươ ứ ả ơ ự
3 ph ng th c sinh s n đ n tính đ c khi ươ ứ ả ơ ự
nuôi c y h t ph n đ n nhân in vitroấ ạ ấ ơ
nuôi c y h t ph n đ n nhân in vitroấ ạ ấ ơ

Sinh sản đơn tính trực tiếp:
Sinh sản đơn tính trực tiếp:


Hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) → Phôi → Cây đơn bội.
Hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) → Phôi → Cây đơn bội.


Sinh sản đơn tính gián tiếp:
Sinh sản đơn tính gián tiếp:


Hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) → Mô sẹo → Chồi → Cây đơn bội.
Hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) → Mô sẹo → Chồi → Cây đơn bội.

Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp:
Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp:


Giống sinh sản đơn tính đực gián tiếp nhưng sự thành mô sẹo
Giống sinh sản đơn tính đực gián tiếp nhưng sự thành mô sẹo


ngắn,khó
ngắn,khó
nhận biết.
nhận biết.

Mô hình phát sinh đ n tính ơ
Mô hình phát sinh đ n tính ơ
đ cự
đ cự




Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn

Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn
bắt đầu từ thể 4 nhân đến ngay sau lần nguyên phân thứ
bắt đầu từ thể 4 nhân đến ngay sau lần nguyên phân thứ
nhất. Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốt hơn bao
nhất. Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốt hơn bao
phấn của hoa muộn.
phấn của hoa muộn.

Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau
Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau
khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy,
khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy,
nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đó tạo cây
nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đó tạo cây
đơn bội.
đơn bội.

Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp: Tùy theo đối tượng
Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp: Tùy theo đối tượng
nuôi cấy bao phấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi
nuôi cấy bao phấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi
trường thích hợp tương ứng.
trường thích hợp tương ứng.

Chọn lọc cây đơn bội: có nhiều cách để xác định cây đơn
Chọn lọc cây đơn bội: có nhiều cách để xác định cây đơn
bội như: làm tiêu bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo
bội như: làm tiêu bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo
hàm lượng DNA trong tế bào, so sánh cây tái sinh từ bao
hàm lượng DNA trong tế bào, so sánh cây tái sinh từ bao

phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái, kích
phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái, kích
thước.
thước.

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn


B. KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CÂY
ĐƠN BỘI.

Là nguyên liệu lí tưởng cho công tác giống
Là nguyên liệu lí tưởng cho công tác giống
cây trồng.
cây trồng.

Là những vật liệu di truyền quý giá cho
Là những vật liệu di truyền quý giá cho
công tác chọn tạo giống vì toàn bộ các gen
công tác chọn tạo giống vì toàn bộ các gen
đều ở trạng thái đồng hợp tử nên kể cả đặc
đều ở trạng thái đồng hợp tử nên kể cả đặc
tính lặn cũng được thể hiện.
tính lặn cũng được thể hiện.

Là nguyên nhân lí tưởng để nghiên cứu di
Là nguyên nhân lí tưởng để nghiên cứu di
truyền các tính trạng.
truyền các tính trạng.

Các thành t u c a vi c ự ủ ệ
Các thành t u c a vi c ự ủ ệ
nuôi c y cây đ n b i.ấ ơ ộ
nuôi c y cây đ n b i.ấ ơ ộ

PHẦN 2:
PHẦN 2:
TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI
TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI
CẤY NOÃN CHƯA THỤ TINH.
CẤY NOÃN CHƯA THỤ TINH.


Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh được gọi là
sự sinh sản đơn tính hay trinh nữ sinh (gynogensis).

Thành công đầu tiên trong lĩnh vực nghiên cứu tạo cây đơn
bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh đã được ghi nhận trên mô
sẹo đơn bội từ nuôi cấy noãn cây Ginkgo biola (Tulecke,
1964).Mặc dù trong thời gian này người ta tập trung vào nuôi
cấy cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn tạo được cây đơn bội
ở nhiều đối tượng thực vật khác nhau.Nhưng ở những loại cây
như hành,củ cải đường, Việc tạo cây đơn bội bằng con
đường sinh sản đơn tính đực không đạt kết quả.

Chính vì vậy đến khoảng những năm 70, các nhà nghiên cứu
đã tập trung giải quyết vấn đề tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy
noãn chưa thụ tinh và đã được nhiều thành tựu.

Tỷ lệ tạo cấy đơn bội bằng con đường trinh nữ sinh biến

động ở các loại cây khác nhau. Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi cấy
noãn chưa thụ tinh còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp do việc
tách tế bào trứng rất khó và dễ gây tổn thương. Nhằm nâng
cao hiệu quả, người ta đang tập trung nghiên cứu các yếu tố
như kiểu gen của cây mẹ và giai đoạn phát triển của túi
phôi,

Cá thể đơn bội
Sơ đồ các hướng ứng dụng đơn bội
Chọn giống ưu thế lai dòng đồng
hợp tử tuyệt đối
Dòng thuần ổn định (F1,F2)
Nhị bội hóa số lượng nhiễm sắc thể
(Tự phát, xử lí colchicin)
Nguyên liệu khởi đầu cho chọn giống
Tái sinh cây
Gây đột biến, chọn lọc in vitro
Lai với các thể đơn bội khác
bằng dung hợp protoplast
(Lai soma)
Nuôi cấy protoplast
các thể đơn bội

PHẦN 3:
PHẦN 3:
KĨ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN
KĨ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN
VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG
VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG
TÁC GIỐNG CÂY TRỒNG.

TÁC GIỐNG CÂY TRỒNG.

A. GIỚI THIỆU CHUNG
A. GIỚI THIỆU CHUNG



Các tế bào thực vật có tính toàn năng, có thể nuôi cấy điều khiển sự
Các tế bào thực vật có tính toàn năng, có thể nuôi cấy điều khiển sự
phát triển sinh thái của chúng cho đến khi hình thành 1 cây hoàn chỉnh.
phát triển sinh thái của chúng cho đến khi hình thành 1 cây hoàn chỉnh.
Cụ thể, bên trong vỏ tế bào trong đó các vật chất chính là các thông tin
Cụ thể, bên trong vỏ tế bào trong đó các vật chất chính là các thông tin
di truyền chứa trong nhân của tế bào đã quyết định mọi đường hướng
di truyền chứa trong nhân của tế bào đã quyết định mọi đường hướng
của quá trình thực hiện tính toàn năng của tế bào. Vì thế hoàn toàn có
của quá trình thực hiện tính toàn năng của tế bào. Vì thế hoàn toàn có
thể nuôi cấy tạo cây hoàn chỉnh từ khối nguyên sinh chất chứa nhân
thể nuôi cấy tạo cây hoàn chỉnh từ khối nguyên sinh chất chứa nhân
của tế bào. Việc nuôi cấy tế bào trần thực vật còn gọi là protoplast.
của tế bào. Việc nuôi cấy tế bào trần thực vật còn gọi là protoplast.
Ý nghĩa:
Ý nghĩa:
Nuôi cấy tế bào trần thành công sẽ cho phép mở ra khả năng
Nuôi cấy tế bào trần thành công sẽ cho phép mở ra khả năng
biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước kia thường bị
biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước kia thường bị
vỏ tế bào ngăn cản cũng như tạo ra khả năng dung hợp tế bào.
vỏ tế bào ngăn cản cũng như tạo ra khả năng dung hợp tế bào.
Ví dụ: hiện tượng co nguyên sinh và và qua đó con người cũng rất

Ví dụ: hiện tượng co nguyên sinh và và qua đó con người cũng rất
muốn tách lớp vỏ tế bào tiến hành trên chính tế bào. Sự ra đời
muốn tách lớp vỏ tế bào tiến hành trên chính tế bào. Sự ra đời
Protoplast đã mở ra cho con người hàng loạt triển vọng mới trong lĩnh
Protoplast đã mở ra cho con người hàng loạt triển vọng mới trong lĩnh
vực giống cây trồng kĩ thuật nuôi cấy tế bào trần là một kĩ thuật phức
vực giống cây trồng kĩ thuật nuôi cấy tế bào trần là một kĩ thuật phức
tạp, hiện đại của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Kĩ thuật này đã được tiến
tạp, hiện đại của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Kĩ thuật này đã được tiến
hành thành công trên nhiều cây đặc biệt là cây họ cà và hòa thảo
hành thành công trên nhiều cây đặc biệt là cây họ cà và hòa thảo

B. PHƯƠNG PHÁP TÁCH TẾ BÀO TRẦN
B. PHƯƠNG PHÁP TÁCH TẾ BÀO TRẦN



Sức trương của tế bào sống luôn cân bằng với áp luật cơ học
Sức trương của tế bào sống luôn cân bằng với áp luật cơ học
của thành tế bào .Vì vậy, khi tách vỏ tế bào bị vỡ khi không còn
của thành tế bào .Vì vậy, khi tách vỏ tế bào bị vỡ khi không còn
lực nén của vỏ.Để khắc phục hiện tượng, dùng dung dịch đường
lực nén của vỏ.Để khắc phục hiện tượng, dùng dung dịch đường
mannitol, sorbitol để gây hiện tượng co nguyên sinh khi tách vỏ tế
mannitol, sorbitol để gây hiện tượng co nguyên sinh khi tách vỏ tế
bào. Nồng độ dung dịch từ 0.3 đến 0.7 mol tùy theo đối tượng
bào. Nồng độ dung dịch từ 0.3 đến 0.7 mol tùy theo đối tượng
thực vật
thực vật


Để phá vỡ thành tế bào ,người ta sử dụng enzim tiếp xúc từ
Để phá vỡ thành tế bào ,người ta sử dụng enzim tiếp xúc từ
sinh vật chứa nhiều enzim phân giải .Nồng độ enzim thường là
sinh vật chứa nhiều enzim phân giải .Nồng độ enzim thường là
pH từ 5.5 đến 5.8 trong 3 đến 4 giờ.
pH từ 5.5 đến 5.8 trong 3 đến 4 giờ.



Sau khi rửa sạch enzym bằng cách li tâm trong các dung dịch
Sau khi rửa sạch enzym bằng cách li tâm trong các dung dịch
rửa khác nhau, ta thu được protoplast. Protoplast có thể đem nuôi
rửa khác nhau, ta thu được protoplast. Protoplast có thể đem nuôi
cấy, dung hợp hay chuyển nạp gen.
cấy, dung hợp hay chuyển nạp gen.




Quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh
Quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh
từ tế bào trần
từ tế bào trần


Sau một thời gian nuôi cấy (1-2 tuần), các
protoplast tái tạo vỏ và phân chia tạo nên
các microcallus (mô sẹo). Chuyển các

microcallus lên môi trường cứng, chúng sẽ
tạo thành các microcallus.

Từ đó chuyển sang môi trường tái sinh
chồi và cây hoàn chỉnh. Ở mỗi một giai
đoạn, người ta sử dụng các môi trường
nuôi cấy đặc hiệu khác nhau.


Tái sinh cây từ t
Tái sinh cây từ t
ế
ế
bào trần (protoplast)
bào trần (protoplast)




Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh
Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh
trưởng, phát triển của tế bào trần
trưởng, phát triển của tế bào trần

Nuôi cấy protoplast thường yêu cầu một số
Nuôi cấy protoplast thường yêu cầu một số
thay đổi so với quy trình nuôi cấy mô bình
thay đổi so với quy trình nuôi cấy mô bình
thường do bản chất của protoplast.
thường do bản chất của protoplast.


Các thay đổi thường liên quan đến sự điều
Các thay đổi thường liên quan đến sự điều
chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp
chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp
chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả
chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả
năng thẩm thấu và chất điều
năng thẩm thấu và chất điều
tiết sinh trưởng để
tiết sinh trưởng để
kích thích sự phân chia tế bào.
kích thích sự phân chia tế bào.

C. Ứng dụng công nghệ tế bào trần
C. Ứng dụng công nghệ tế bào trần
trong chọn tạo giống.
trong chọn tạo giống.



Dung hợp protoplast (lai soma, lai vô tính tế bào
Dung hợp protoplast (lai soma, lai vô tính tế bào
thực vật):
thực vật):



Protoplast là những tế bào không vỏ, chúng có thể hòa
Protoplast là những tế bào không vỏ, chúng có thể hòa

lẫn vào nhau (dung hợp) và thành một tế bào lai mang
lẫn vào nhau (dung hợp) và thành một tế bào lai mang
trong mình vật chất di truyền của cả hai tế bào.
trong mình vật chất di truyền của cả hai tế bào.



Việc dung hợp protoplast và tái sinh thành cây lai từ
Việc dung hợp protoplast và tái sinh thành cây lai từ
protoplast là một trong những thành tựu tuyệt vời của kĩ
protoplast là một trong những thành tựu tuyệt vời của kĩ
thuật nuôi cấy mô tế bào.Phương pháp này cho phép tiến
thuật nuôi cấy mô tế bào.Phương pháp này cho phép tiến
hành lai xa giữa các loài – điều không thể thực hiện được
hành lai xa giữa các loài – điều không thể thực hiện được
bằng các phương pháp lai hữu tính thông thường.
bằng các phương pháp lai hữu tính thông thường.


Có hai phương pháp dung hợp protoplast:




- Dung hợp bằng hóa chất: là chất có tác dụng dính kết
- Dung hợp bằng hóa chất: là chất có tác dụng dính kết
protoplast để dung hợp chúng (thương sử dụng
protoplast để dung hợp chúng (thương sử dụng
polyotylenglycol 5 - 25%). Quá trình dung hợp sẽ được cải
polyotylenglycol 5 - 25%). Quá trình dung hợp sẽ được cải

thiện hơn nếu xảy ra trong môi trường kiềm (pH 8 – 10) và
thiện hơn nếu xảy ra trong môi trường kiềm (pH 8 – 10) và
khi có bổ sung CaCl
khi có bổ sung CaCl
2
2
(50 – 250 mM).
(50 – 250 mM).


- Dung hợp bằng điện: Đưa dung dịch hỗn hợp protoplast
- Dung hợp bằng điện: Đưa dung dịch hỗn hợp protoplast
vào điện trường, các protoplast sẽ lần lượt sắp xếp thành
vào điện trường, các protoplast sẽ lần lượt sắp xếp thành
chuỗi nằm giữa hai bản cực. Khi có một xung điện cao
chuỗi nằm giữa hai bản cực. Khi có một xung điện cao
(750 – 1000V) trong một thời gian rất ngắn (1-200 mili giây)
(750 – 1000V) trong một thời gian rất ngắn (1-200 mili giây)
vùng tiếp xúc giữa 2 màng tế bào sẽ bị vỡ, 2 tế bào trần
vùng tiếp xúc giữa 2 màng tế bào sẽ bị vỡ, 2 tế bào trần
hòa nhập vào nhau, quá trình dung hợp sẽ xảy ra.
hòa nhập vào nhau, quá trình dung hợp sẽ xảy ra.

protoplast
Kích thích b ng đi n ằ ệ
hay hóa ch tấ
Dung h p t bàoợ ế
Dung h p nhânợ
Lá được cắt từ cây
X lí enzim đ hòa ử ể

tan màng t bàoế

Qúa trình dung hợp protoplast




Ng i ta cũng phân bi t 2 lo i ườ ệ ạ
Ng i ta cũng phân bi t 2 lo i ườ ệ ạ
dung h p:ợ
dung h p:ợ

Dung hợp đối xứng (sysmetric): khi dung hợp 2
Dung hợp đối xứng (sysmetric): khi dung hợp 2
protoplast cùng có nhân ở mức bội thể như
protoplast cùng có nhân ở mức bội thể như
nhau.
nhau.

Dung hợp không đối xứng (asyametric): tạo ra
Dung hợp không đối xứng (asyametric): tạo ra
các thể lai tế bào chất hay còn gọi là cybrid. Ở
các thể lai tế bào chất hay còn gọi là cybrid. Ở
đây chủ yếu chỉ là trộn tế bào chất để chuyển
đây chủ yếu chỉ là trộn tế bào chất để chuyển
nạp các vật chất di truyền tế bào chất (AND của
nạp các vật chất di truyền tế bào chất (AND của
ti thể và lạp thể). Một trong hai protoplast sẽ bị
ti thể và lạp thể). Một trong hai protoplast sẽ bị
diệt nhân trước khi dung hợp.

diệt nhân trước khi dung hợp.