Kỹ thuật liệu pháp gene mới: ứng dụng nuclease ngón tay kẽm được thiết kế trước docx

Kỹ thuật liệu pháp gene
mới: ứng dụng nuclease
ngón tay kẽm được
thiết kế trước

Kể từ khi các kỹ thuật chuyển
gene và kỹ thuật di truyền ra đời
cho đến nay, nó tạo ra luồng tư
tưởng nơi các nhà y sinh học là
nhanh chóng ứng dụng các kỹ


thuật này trong việc chẩn đóan,
chữa trị các bệnh di truyền
khơng chỉ ở mức độ nghiên cứu
phịng thí nghiệm mà phải nhanh
chóng đưa ra ứng dụng lâm sàng.
Đến nay nhiều kỹ thuật đã được
áp dụng khá thành cơng ở các
dịng tế bào ni cấy và thậm chí
ở mơ hình dùng chuột thí nghiệm
các bệnh ở người, nhưng chúng
cũng cho thấy một trở ngại thực
sự lớn đó là làm sao chuyển
chúng ra ứng dụng lâm sàng.
Trên trang 646 tờ Nature 435, (2
June 2005), Urnov và cộng sự đã
cơng bố cơng trình nghiên cứu
theo đó một phương thức mới giúp

hiệu chỉnh sửa sai một đột biến di
truyền ở tế báo người. Phương thức
mới này ra đời từ sự kết hợp 2 quá
trình sinh học cơ bản vốn dĩ rất bảo
thủ về mặt tiến hóa: cắt xun sợi
đơi DNA ở điểm đặc hiệu và sửa
chữa sai sót sợi DNA bằng sự tái tổ
hợp đồng dạng. Sự thành công của
Urnov và cộng sự, về mặt lý thuyết,
cho thấy hịan tịan có thể ứng dụng
lâm sàng. Thành công của các tác
giả là nhờ họ kế thừa và phát triển
từ những nghiên cứu trước đó cũng
trên nền tảng phương thức kết hợp
hai quá trình sinh học nói trên. Đây
thực sự một bước tiến đáng kể trên
con đường ứng dụng kỹ thuật di
truyền vào chữa trị bệnh cho


người.
Trước hết cần nhắc lại là hầu hết
các chiến thuật chuyển gene thực
chất là liệu pháp thêm gene, nghĩa
là một phiên bản gene bình thường
(gene lành) của một gene nào đó sẽ
được chuyển vào một dịng tế bào
nào đó mà nhà nghiên cứu hay bác
sỹ điều trị quan tâm, tại đây chúng
sẽ tồn tại đồng thời với phiên bản

đột biến chị em của nó. Nhưng mục
đích sau cùng của việc đưa gene
vào tế báo là chỉnh sửa đột biến, do
vậy gene lành phải có khả năng tạo
ra những protein bình thường dưới
sự điều khiển của các dấu hiệu điều
hòa nội tại.


Quá trình sửa chữa hay hiệu chỉnh
đặc hiệu theo điểm của một đột
biến nào đó có thể chia làm 3
bước:
• Đầu tiên, điểm cần hiệu chỉnh
phải được dị tìm trong 3 tỷ cặp
base bộ gene người.
• Kế đến, base đóng vai trò kẻ
thay thế phải được đưa vào tế bào
một cách hiệu quả
• Cuối cùng, các yếu tố phản ứng
phải được đưa vào dạng tế bào
tương ứng trong cơ thể (ví dụ tế
bào phổi ở bệnh nhân mắc chứng
xơ hóa)


Để giải quyết vấn đề đầu tiên,
Urnov và cộng sự đã lợi dụng các
ZFN (zinc-finger nucleases- các
nuclease ngón tay kẽm). Những

protein tổng hợp này được mô tả
đầu tiên từ 1996, sau đó chúng
được cải biến phát triển thành các
yếu tố phản ứng nhằm phân cắt
DNA tại một điểm đặc hiệu, do vậy
chúng bao gồm vùng gắn DNA và
vùng phân cắt DNA.
Vùng gắn DNA của ZFN bao gồm
một sợi "ngón tay kẽm", sợi này
gồm khỏang 30 amino acid được
làm bền bằng một ion kẽm. Như
tên gọi thì vùng gắn lên DNA sẽ
gắn lên một trình tự DNA đặc hiệu


3 base. Trình tự amino acid trong
ngón tay kẽm biến thiên tùy theo
trình tự DNA mà nó sẽ gắn. Trong
bộ gene người, người ta tìm thấy
khỏang 900 protein mang ngón tay
kẽm và danh sách này còn sẽ được
bổ sung nữa trong tương lai.
Vùng cắt DNA của ZFN bắt nguồn
từ enzyme FokI và tự bản thân nó
thì khơng mang tính đặc hiệu. Để
có thể có chức năng phân cắt DNA,
vùng này phải được nhị trùng hóa
(dime). Do đó 2 ZFN phải gắn tại
vị trí hoặc gần vị trí cần hiệu
chỉnh.

Bằng cách liên kết gắn 4 ngón tay


kẽm theo cách thức sóng đơi, hai
ZFN này nối sau hai ZFN kia, khi
đó chúng tạo ra một vị trí nhận diện
đặc hiệu gồm 24 bp. Và với một
trình tự 24 bp thì có thể xác định
một trình tự duy nhất trong tịan bộ
genome, cho phép dị tìm điểm cần
hiệu chỉnh. Như vậy bước đầu tiên
của quy trình 3 bước đã được giải
quyết.


Chú thích: Những bệnh nhân mắc
hội chứng SCID mang một vài đột
biến đặc hiệu ảnh hưởng chức năng
tế bào T. Urnov và cộng sự sử
phương thức minh họa ở đây để
hiệu chỉnh khiếm khuyết và thu
được một tỷ lệ thành cơng đánh kể
với những dịng tế bào ni cấy
mang cùng đột biến. a, ZFN (Zinc-


finger nucleases) được thiết kế sao
cho những vùng ngón tay kẽm sẽ
nhận diện điểm đặc hiệu gần điểm
đột biến. b, Vùng phân cắt sẽ tạo ra

vết cắt xuyên sợi đôi DNA. c, Một
trình tự dạng hoang dại (khơng đột
biến) được đưa vào tế bào và và
được sử dụng như khuôn mẫu cho
quá trình sửa chữa DNA trong tế
bào – tái tổ hợp đồng dạng diễn ra.
d, Trình tự đột biến được sửa
chữa..
Sau khi được nhị trùng hóa,
enzyme này sẽ tạo ra một vết cắt
xun sợi đơi DNA tại vị trí gần
hoặc tại chính xác điểm đột biến.
Khi đó, các cơ chế sửa sai của tế


bào sẽ được kích họat. Trong số các
cơ chế sửa sai này, thì "sự tái tổ
hợp đồng dạng" tức là quá trình sửa
sai bằng cách sử dụng những trình
tự tương tự có sẵn trong tế bào làm
khn. Trình tự tương tự có thể dễ
dàng tìm thấy trong genome, nhưng
nó cũng có thể tìm thấy từ những
vật liệu DNA được con người chủ
động đưa vào trước đó. Như vậy
bước thứ hai đã được giải quyếtthay đổi một base.
Điểm đặc trưng đáng chú ý trong
quy trình phức tạp trên là tần xuất
diễn ra các sự kiện mong đợi.
Urnov và cộng sự cho thấy là họ đã

thành công khi hiệu chỉnh được


khỏang 15-20% các nhiễm sắc thể
đột biến ở một dòng tế bào nuôi
cấy theo chu kỳ. Hiệu suất này cho
phép việc đưa hai ZFNs và khn
DNA bình thường vào tế bào có thể
đủ để thực hiện sự thay đổi điểm
sai sót. Các tác giả cịn thậm chí
cho rằng họ đã thành công khỏang
5% khi tiến hành thực nghiệm trên
tế bào T thu từ một bệnh nhân,
cũng nên nhớ là hiệu quả cải biến
di truyền trên dòng tế bào T thường
cực kỳ thấp. Kết quả và sự giải
thích này hịan tịan phù hợp với
tốc độ tái tổ hợp đồng dạng, ở tế
bào khơng có hiện tượng DNA bị
cắt xun sợi thì tỷ lệ này chỉ
khỏang 0,001%.


Đến đây thì một vấn đề đặt ra là
cơng việc của Urnov và cộng sự có
ý nghĩa thế nào trong việc chữa trị
bệnh ở người. Trình tự DNA mà
các tác giả đã sửa chữa là một trong
những dạng đột biến gây ra hội
chính suy giảm miễn dịch kết hợp

trầm trọng - SCID (severe
combined immunodeficiency ) —
đây là một bệnh gây chết cho trẻ ở
giai đọan rất sớm, và cho đến nay
chưa có liệu pháp gene hay cấy gép
tủy xương nào tỏ ra hữu hiệu. Vài
năm trước, cũng đã có vài tác giả
thành công trong các nghiên cứu
chuyển gene ở bệnh nhân SCID.
Họ sử dụng retrovirus để thêm một


gene bình thường vào tế bào đích
(là những tế bào máu biểu hiện
CD34) lấy từ bệnh nhân. Sau thời
gian nuôi cấy, các tế bào này được
được trở lại bệnh nhân. Và khỏang
20−40% tế bào hồi hương là có
chứa gene bình thường. Ở bệnh
nhân, tỷ lệ chuyển gene này thực sự
là một con số có ý nghĩa vì ở những
tế bào sau khi được xử lý chúng có
điểm thuận lợi là chúng "khỏe
mạnh" hơn tế bào đột biến in vivo.
Do vậy nếu kết hợp nghiên cứu của
tác giả trước và kết quả nghiên cứu
của Urnov và cộng sự, khi đó các
nhà nghiên cứu có thể hy vọng là
họ sẽ phục hồi chức năng miễn dịch
cho các bệnh nhân SCID.

Hơn nữa, hướng nghiên cứu này
còn tránh được cái gọi là "q trình
tích hợp khơng mong muốn" vì
phương thức này nhằm sửa chữa
gene bệnh chứ không phải chèn
một phiên bản bình thường. Ở
những nghiên cứu trước „q trình
tích hợp khơng mong muốn“diễn ra
khi mà q trình chèn và tích hợp
gene xảy ra ở một vị trí khơng
mong đợi (ví dụ như gần gene thúc
đầy tăng trưởng). Phương thức của
Urnov và cộng sự đã giải quyết
được vấn đề này, cho thấy khả năng
hiệu chỉnh những sai hỏng mà
không tạo ra các hiệu ứng phụ
nghiêm trọng.


Một điểm lý thú nữa trong phương
thức mà Urnov và cộng sự đã sử
dụng đó là nó khơng địi hỏi ZFNs
và khuôn DNA phải hiện diện lâu
trong tế bào.
Mặc dù có những điểm ưu việt như
đã phân tích ở trên, nhưng kỹ thuật
mà Urnov và cộng sự đưa ra vẫn
còn nhiều điểm cần hịan thiện

trước khi nó thực sự ứng dụng lâm
sàng trên người. Ví dụ như liệu
rằng các phân tử ZFN cải biến có
kích họat hệ thống miễn dịch khiến
cho chúng bị đào thải ra khỏi cơ
thể. Kế đến là sự giới hạn với dòng
tế bào đang thực nghiệm. Kỹ thuật


này thực sự bị giới hạn bởi các
dòng tế bào tách từ bệnh nhân, cải
biến ex vivo và sau đó cho quay lại
cơ thể, như vậy các kỹ thuật được
sử dụng cho việc chuyển gene in
vivo sẽ tỏ ra không hiệu quả. Cuối
cùng, điều quan trọng là phải xác
định tính đặc hiệu của ZFN trong tế
bào như thế nào và liệu rằng sự dị
tìm và tái sắp xếp DNA có thực sự
diễn ra ở điểm đánh dấu hay
không? Bằng cách sử dụng kỹ thuật
Southern blot, Urnov và cộng sự
cho thấy là khơng có sự nhầm lẫn
khi đánh dấu DNA đích cần hiệu
chỉnh và cũng khơng có sự tái sắp
xếp bất thường. Do vậy cần phải có
những nghiên cứu chi tiết hơn nữa


về những vấn đề nói trên.