Nghiên cứu tính đối kháng của Aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI







LÊ THIÊN MINH







NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS
KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN
TRÊN NGÔ VÀ LẠC




Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC













Hà N
ội – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI





LÊ THIÊN MINH

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS
KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN
TRÊN NGÔ VÀ LẠC





Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62420201



LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC







NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS. TS. NGUYỄN THÙY CHÂU
2. PGS. TS. NGUYỄN THN XUÂN SÂM

Hà N
ội - 2014
i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường Đại học Bách khoa
Hà Nội, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã giúp đỡ tạo điều
kiện cho tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành luận án của mình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Nguyễn Thuỳ Châu - Nguyên
trưởng Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông
nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm – Trưởng bộ
môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học & CNTP, trường
Đại học Bách Khoa Hà Nội là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều
kiện thuận lợi, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt thời gian tôi
thực hiện luận án này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS. Đinh Duy Kháng - Trưởng phòng
Vi sinh vật học phân tử, đã tạo điều kiện thuận lợi và ủng hộ tôi trong quá trình thực
hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phụ trách đào tạo, Viện đào tạo sau đại
học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn

thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu sinh.
Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị và
các bạn đồng nghiệp ở Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch - Viện
Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, Phòng Vi sinh vật phân tử - Viện
Công nghệ sinh học và Bộ môn Vi sinh, Hóa sinh, Sinh học phân tử - Trường Đại học
Bách khoa Hà Nội. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ
quý báu đó.
Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã quan tâm và tạo điều kiện tốt
nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự động viên, khích lệ
của bạn bè trong và ngoài Viện đã dành cho tôi.
Hà Nội, ngày 23 tháng 6 năm 2014





Lê Thiên Minh


ii
LỜI CAM ĐOAN



Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng
tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực
và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.

Hà nội, ngày 23 tháng 6 năm 2014

Tác giả






Lê Thiên Minh













iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit deoxyribonucleic
ARN Axit ribonucleic
EDTA Axit etylen diamin tetra axetic

SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamit có chứa sodium dodecyl sulfate
TCA Axit trichloroaxetic
v/p vòng / phút
v/v Thể tích/thể tích
vvm thể tích/thể tích/phút
w/v Trọng lượng /thể tích
X Axit amin bất kỳ
WHO Tổ chức Y tế thế giới
Tm Nhiệt độ tan chảy
FDA Cục quản lý Thực phNm và Dược phNm Hoa kỳ
TE Tris EDTA
PCR Polymerase chain reaction
SDS Sodium dodecyl sulfate
TLC Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng)
EtBr Ethydium bromit
dNTP Deoxiribonucleotit triphosphat
A. flavus Aspergillus flavus
A. parasiticus Aspergillus parasiticus
NOR Norsolorinic acid
AVN Averantin
HAVN 5
’
hydroxyaverantin
OAVN Oxoaverantin
AVNN Averufanin
AVF Averufin
VHA Versiconal hemiacetal acetate
VAL Versiconal
VERB Versicolorin B
VERA Versicolorin A

DMST Demethylsterigmatocystin
DHDMST Dihydro demethylsterigmatocystin
ST Sterigmatocystin
DHST Dihydro sterigmatocystin
OMST O-methylsterigmatocystin
DHOMST Dihydro-O-methylsterigmatocystin
AFB
1
Aflatoxin B
1

AFB
2
Aflatoxin B
2

AFG
1
Aflatoxin G
1

AFG
2
Aflatoxin G
2

iv
Danh môc c¸c b¶ng
STT Tên bảng Trang
1

Bảng 1.1 Một số tính chất lý, hóa của các aflatoxin

8
2 Bảng 1.2 Giới hạn aflatoxin cho phép trên nông sản thực phm 12
3 Bảng 1.3 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn tinh hỗn hợp cho Bê và Bò 12
4 Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi 13
5 Bảng 1.5 Đặc điểm hình thái của A. flavus 14
6 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp mẫu A. flavus DA2 40
7 Bảng 3.1 Kết quả phân lập các chủng A. flavus từ ngô, lạc ở một số tỉnh Việt
Nam
44
8 Bảng 3.2 Khả năng tạo aflatoxin của các chủng A. flavus phân lập từ ngô và
lạc
45
9
Bảng 3.3a Đặc điểm hình thái của các chủng A. flavus phân lập từ các mẫu ngô
và lạc
47
10
Bảng 3.3b Đặc điểm hình thái của các chủng A. flavus phân lập từ các mẫu
ngô và lạc
48
11 Bảng 3.4a Đặc điểm cấu trúc vi học của các chủng A. flavus phân lập từ các
mẫu ngô và lạc
49
12 Bảng 3.4b Đặc điểm cấu trúc vi học của các chủng A. flavus phân lập từ các
mẫu ngô và lạc
50
13 Bảng 3.5 Khả năng sinh aflatoxin B1 của chủng A. flavus phân lập 52
14 Bảng 3.6 Hiệu quả giảm aflatoxin B1 của chủng A. flavus AF14 nuôi cấy trên

môi trường ngô bằng các chủng A. flavus không sinh aflatoxin
54
15 Bảng 3.7 Mật độ tế bào A. flavus DA2 và A. flavus AF14 khi nuôi hỗn hợp theo
tỉ lệ 1:1
55
16 Bảng 3.8 Trình tự các cặp mồi 58
17 Bảng 3.9 Tổng hợp kết quả PCR với các mồi đã sử dụng 60
18 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của A. flavus DA2 đến trọng lượng cơ thể chuột 63
19 B
ảng 3.11 Mật độ bào tử của chủng A. flavus DA2 tạo được trên các môi
trường khác nhau
66
v
20 Bảng 3.12 Khả năng tạo bào tử chủng A. flavus DA2 của nhiệt độ nuôi cấy
khác nhau
67
21 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của độ m môi trường đến khả năng tạo bào tử của
chủng A. flavus DA2
68
22 Bảng 3.14 Thời điểm thu bào tử của chủng A. flavus DA2 69
23
Bảng 3.15
Ảnh
hưởng của tỷ lệ tiếp giống
tới
mật độ bào tử A. flavus DA2

70
24
Bảng 3.16 Ảnh hưởng của độ dày khối ủ tới mật độ bào tử chủng A. flavus

DA2

71
25
Bảng 3.17 Mật độ bào tử A. flavus DA2 trong các chất mang ở các thời gian
bảo quản khác nhau

72
26
Bảng 3.18 Khả năng cạnh của chế phm A.flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau
bằng sắc ký TLC

76
27
Bảng 3.19

Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 khi bón vào đất ở các
tỷ lệ khác nhau

77
28
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của các thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến sự phát triển
sinh khối của A.flavus DA2

80
29
Bảng 3.21 Mức độ nhiễm nấm mốc A.flavus trên đất trồng ngô, lạc tại một số
tỉnh Việt Nam

82

30
Bảng 3.22 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin
trong đất trồng ngô sử dụng chế phm AF

84
31
Bảng 3.23 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên
ngô bắp ở giai đoạn trước thu hoạch

86
32
Bảng 3.24 Hiệu quả phòng chống nấm mốc và aflatoxin của chế phm AF trên
ngô sau thời gian bảo quản 6 tháng

89
33
Bảng 3.25 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin
trong đất trồng lạc được bón chế phm AF

91
34
Bảng 3.26 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên
lạc củ ở giai đoạn trước thu hoạch
92
35
Bảng 3.27 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên
lạc sau thời gian bảo quản 6 tháng
93
vi
Danh môc c¸c h×nh

STT

Tên hình Trang
1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số dạng aflatoxin 6
2
Hình 1.2 Aflatoxin tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền

9

3 Hình 1.3 Khun lạc A.flavus 15

4 Hình 1.4 Hệ sợi A.flavus quan sát dưới kính hiển vi 15
5 Hình 1.5 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin 17
6 Hình 1.6 Hàm lượng aflatoxin trên hạt bông giảm khi tỷ lệ AF36 tăng 29
7
Hình 3.1 Sắc ký đồ phân tích aflatoxin tạo bởi chủng A. flavus AF14
52
8
Hình
3.
2
Sắc ký đồ thể hiện khả năng sinh aflatoxin B1 của chủng A. flavus
DA2
53
9 Hình 3.3 Kiểm tra hàm lượng aflatoxin B1 của hỗn hợp các chủng A.flavus
nuôi cấy trên cơ chất ngô bằng sắc ký bản mỏng (TLC)
54
10 Hình 3.4 Chủng A. flavus DA2 cạnh tranh và lấn át chủng A. flavus AF14
trên đĩa thạch

56
11
Hình 3.5 Chất lượng ADN tổng số trên gen agarose 1,5%
59
12 Hình 3.6 Sản phm multiplex PCR của chủng A.flavus DA2 và A. flavus
AF14
59
13 Hình 3.7 Khả năng sinh aflatoxin của chủng A.flavus DA2 sau 5, 10 và 15
thế hệ
61
14 Hình 3.8 Sự tồn tại của các gen aflR, ver, omt và nor của chủng A.flavus
DA2 sau 5, 10 và 15 thế hệ
61
15 Hình 3.9 Đường cong sinh trưởng của chủng A.flavus DA2 65
16 Hình 3.10 Khả năng cạnh tranh của A.flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau 75
17 Hình 3.11 Khả năng đối kháng của chế phm A.flavus DA2 ở các thời điểm
cấy khác nhau
78
18 Hình 3.12 Khả năng đối kháng của chủng A.flavus DA2 khi có mặt của
thu
ốc bảo vệ thực vật
81
vii
19 Hình 3.13 Nấm mốc nhiễm trên đất trồng ngô 83
20 Hình 3.14 Khun lạc chủng A.flavus phát quang phân lập từ đất trồng ngô
được bón chế phm AF tại xã Tam Hồng, Yên Lạc, Vĩnh Phúc (8/2007-
6/2008)
85
21 Hình 3.15 Khả năng kiểm soát aflatoxin trên ngô trước thu hoạch của chế
phm AF

87
22 Hình 3.16 Bắp ngô ở ruộng sử dụng hai lần chế phm AF 88
23
Hình 3.17 Bắp ngô ở ruộng không sử dụng chế phm AF

88
24 Hình 3.18 Ngô sử dụng và không sử dụng chế phm AF sau thời gian bảo
quản 6 tháng
90
25 Hình 3.19 Chủng A. flavus phát quang và không phát quang phân lập trên
đất trồng lạc
92
26 Hình 3.20 Lạc sử dụng và không sử dụng chế phm AF sau thời gian bảo
quản 6 tháng
94







1
C LC
Trang
LI M N………………………………………………………………………………….……i
LI CAM OAN.……………………………………………………………………….…………ii
DANH MC CÁC KÝ HIU VÀ CH VIT TT ……………………………… ………… iii
DANH MC CÁC BNG.……………………………………………………………………… iv
DANH MC CÁC HÌNH NH,  TH…………………………………………………… … vi

MU……………………………………………………………………………………….… 4
CHNG I. TNG QUAN TÀI LIU 6
1.1 TNG QUAN V AFLATOXIN 6
1.1.1 Cu to 6
1.1.2 Tính cht hóa lý 7
1.1.3 c tính ca aflatoxin 8
1.1.4 Thc trng nhim aflatoxin trên ngô, lc 9
1.1.5 Gii hn aflatoxin cho phép trong nông sn thc phm 11
1.2 ASPERGILLUS FLAVUS 13
1.2.1 c m hình thái 13
1.2.2 Các yu tnh hng n s sinh trng ca A. flavus 15
1.2.3 u kin sinh aflatoxin 16
1.3 PHÒNG CHNG S NHIM AFLATOXIN 19
1.3.1 Bin pháp canh tác nông nghip 19
1.3.2 Bin pháp sau thu hoch 20
1.3.3 Bin pháp sinh hc 21
1.4 PHÒNG CHNG AFLATOXIN BNG CHNG A.FLAVUS KHÔNG SINH
AFLATOXIN 22
1.4.1 C ch kim soát nm mc và aflatoxin bng các chng A.flavus không sinh
aflatoxin 22
1.4.2 Tuyn chn các chng A. flavus không sinh aflatoxin làm tác nhân i kháng
24
1.5 NGHIÊN CU NG DNG CH PHM NM A. FLAVUS KHÔNG SINH C T
TRONG PHÒNG CHNG AFLATOXIN 26
2
1.5.1 Sn xut ch phm A. flavus không sinh aflatoxin 26
1.5.2 ánh giá hiu qu ca ch phm A. flavus không sinh aflatoxin  quy mô
phòng thí nghim và nhà kính 27
1.5.2 ánh giá hiu qu ca ch phm A. flavus không sinh aflatoxin  quy mô
ng rung 28

1.5.3 ánh giá tác ng ca ch phm 30
1.5.4 Các yu tnh hng n hiu qu ch phm 31
CHNG II. VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 33
2.1 VT LIU, HÓA CHT VÀ THIT B NGHIÊN CU 33
2.1.1 Vt liu nghiên cu 33
2.1.2 Hóa cht, dng c nghiên cu 33
2.1.4 Môi trng nghiên cu 34
2.2 PHNG PHÁP NGHIÊN CU 34
2.2.1 Phng pháp ly mu 34
2.2.2 Phng pháp phân lp 35
2.2.3 Sàng lc s b các chng sinh và không sinh aflatoxin bng phng pháp
phát quang 36
2.2.4 Phân tích aflatoxin bng sc ký n mng 36
2.2.5 Phân tích aflatoxin bng sc ký lng cao áp 36
2.2.6 Nuôi cy nm mc A. flavus cho vic nghiên cu kh nng to aflatoxin 36
2.2.6 Xác nh kh nng cnh tranh ca các chng A. flavus không sinh aflatoxin
i vi chng A. flavus sinh aflatoxin 37
2.2.7 Nghiên cu kh nng to bào t ca chng A. flavus DA2  các u kin nuôi
y khác nhau 37
2.2.8 Quy trình nuôi cy nm mc A. flavus DA2  qui mô phòng thí nghim 38
2.2.9 To ch phm cha bào t chng A. flavus DA2 (ch phm AF) 38
2.2.10 nh lng mt  bào t A. flavus trong ch phm 38
2.2.11 Xác nh s có mt ca mt s gen trong cm gen mã hóa cho các enzym
tham gia vào quá trình sinh tng hp aflatoxin ca các chng A. flavus bng k
thut multiplex PCR 38
2.2.12 Th nghim tính an toàn ca chng A.flavus DA2 40
2.2.13 Xác nh t l gia chng sinh aflatoxin vi chng A.flavus DA2 không sinh
aflatoxin 41
3
2.2.14 Xác nh thi m s dng ch phm 41

2.2.15 ánh giá nh hng ca mt s loi thuc bo v thc vt 41
2.2.16 ánh giá s cnh tranh ca A.flavus DA2 trong t trng ngô, lc 41
2.2.17 ánh giá hiu qu gim mt  A.flavus sinh c t và aflatoxin ca ch
phm AF trên ngô  giai n trc và sau thu hoch 42
2.2.18 ánh giá hiu qu gim mt  A.flavus sinh c t và aflatoxin ca ch
phm AF trên lc  giai n trc và sau thu hoch 43
2.2.19 Phng pháp x lý thng kê s liu: theo phn mm Microsoft Excel 43
CHNG III. KT QU VÀ THO LUN 44
3.1 PHÂN LP, TUYN CHN CHNG A. FLAVUS KHÔNG SINH AFLATOXIN LÀM
CHNG SN XUT CH PHM AF 44
3.1.1 Phân lp các chng Aspergillus flavus trên ngô, lc 44
3.1.2 Sàng lc các chng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin 45
3.1.3 Phân loi các chng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin phân lp c 46
3.1.4 Tuyn chn các chng A. flavus không sinh aflatoxin 51
3.1.5 ánh giá kh nng cnh tranh ca các chng A. flavus không sinh aflatoxin 53
3.1.6 Kim tra s có mt mt s gen trong cm gen mã hóa cho các enzym tham
gia vào quá trình sinh tng hp aflatoxin ca chng A. flavus DA2 57
3.1.7 Tính n nh v kh nng không sinh aflatoxin ca chng A. flavus DA2 61
3.1.8 ánh giá tính an toàn ca chng A. flavus DA2 trên ng vt thí nghim 62
3.2 NGHIÊN CU SN XUT CH PHM A. FLAVUS DA2 65
3.2.1 Nghiên cu công ngh nuôi cy b mt sn xut bào t chng A. flavus DA2
quy mô phòng thí nghim 65
3.2.2 Nghiên cu sn xut bào t chng A.flavus DA2  quy mô pilot 70
3.2.3 Nghiên cu hoàn thin ch phm AF t chng A.flavus DA2 72
3.3 NGHIÊN CU NG DNG CH PHM AF 75
3.3.1 Nghiên cu  quy mô phòng thí nghim 75
3.3.2 Nghiên cu  quy mô ng rung 82
T LUN VÀ KIN NGH 95
KIN NGH 95
TÀI LIU THAM KHO 96

4
U
Aflatoxin là nhng cht chuyn hóa có c tính cao, c sinh tng hp ch yu bi
các loài nm mc Aspergillus. Các c t này tn ti trong nông sn thc phm, không
nhng làm gim giá tr dinh dng ca thc phm mà còn là mt trong nhng nguyên nhân
gây nên nhng cn bnh nguy him cho ngi và ng vt nh viêm gan cp tính, ung th
gan, suy dinh dng  tr em.
Vic kim soát hàm lng aflatoxin có mt trong nông sn thc phm ã c
nghiên cu t rt lâu vi nhiu bin pháp khác nhau, mi bin pháp u có nhng u
nhc m nht nh nhng cha có bin pháp nào t c hiu qu nh mong i. Mt
 bin pháp truyn thng nh x lý sau thu hoch, chn to ging cây trng kháng nm
sinh aflatoxin… ch cho phép phát hin nm mc  giai n mun, khi nm mc ã phát
trin sinh c t và tn ti trong các sn phm thc phm. Nhng nm gn ây, xu hng
 dng chính nhng chng nm i kháng Aspergillus flavus không sinh c t có tính
nh tranh cao làm tác nhân kim soát ang c phát trin và t ra khá hiu qu. Ch
phm nm Aspergillus flavusi kháng ã c nghiên cu, ng dng và cp bng sáng
ch, c s dng rng rãi trong nông nghip  mt s quc gia nh M, n , Trung
Quc Ví d: chng NRRL 21882 và AF36 do các nhà khoa hc thuc b Nông nghip
 to ra ã có tác dng gim trên 90% hàm lng aflatoxin trên ngô và bông.
 thu nhn c các chng A. flavusi kháng không sinh c t, bên cnh nhng
bin pháp phân lp truyn thng da trên các c m sinh lý, sinh hóa, còn có mt
phng pháp mi da trên k thut PCR ã c phát trin  h tr cho công vic sàng
c này. Hu ht các gen trong cm gen tham gia vào quá trình sinh tng hp aflatoxin ca
m mc ã c sáng t và trình t ADN ca chúng cng ã c xác nh là c s khoa
c rt thun li cho vic áp dng phng pháp này trong sàng lc các chng mc tiêu.
Vit Nam nm trong min khí hu nhit i nóng, m là u kin rt thun li cho
các loài nm mc phát trin, xâm nhim vào cây trng ngay t giai n canh tác, trong
sut quá trình bo qun và ch bin nu không có bin pháp kim soát nghiêm ngt. Cho
n nay,  Vit Nam cha có công trình nghiên cu nào vng dng các chng nm mc
A. flavus không sinh c t phòng chng nm mc và c t aflatoxin trên ngô, lc. Mt

khác, kh nng i kháng ca các chng nm mc không sinh c t thng thay i theo
u kin khí hu và h sinh thái tng vùng nên vic ng dng các ch phm nm i
kháng c sn xut  nc ngoài trên ng rung Vit Nam không d dàng và em li
5
hiu qu không cao. Do ó, vic to lp mt ch phm nm A. flavusi kháng t nhng
chng phân lp c trên các ngun t nhiên bn a chc chn s mang li hiu qu gim
thiu s nhim aflatoxin.
Xut phát t nhng lý do trên, chúng tôi ã thc hin  tài: Nghiên cu tính i
kháng ca Aspergillus flavus không sinh c t phòng chng aflatoxin trên ngô và
c, vi các mc ích và ni dung nghiên cu chính sau ây:
c ích nghiên cu
Kim soát s nhim aflatoxin trên ngô, lc bng ch phm Aspergillus flavus không
sinh aflatoxin.
i dung nghiên cu
1. Phân lp, tuyn chn các chng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin có kh nng
nh tranh cao và n nh vi các chng A. flavus sinh aflatoxin.
2. Nghiên cu quy trình nuôi cy và to ch phm bào t t chng Aspergillus flavus
không sinh aflatoxin.
3. Nghiên cu ng dng ch phm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin nhm gim
thiu s nhim aflatoxin trên ngô, lc  quy mô phòng thí nghim và trên ng rung.
Nhng óng góp mi ca lun án
1. Là công trình nghiên cu u tiên  Vit Nam s dng c ch cnh tranh sinh hc bng
chng A. flavus không sinh aflatoxin trong kim soát aflatoxin nhim trên ngô và lc.
2. Lun án nghiên cu s dng k thut multiplex PCR  làm sáng t bn cht sinh hc
phân t ca chng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin phân lp t ngô (Vit Nam). Chng
A. flavus DA2 không mang 3 gen (ver, aflR và nor) trong cm gen sinh tng hp aflatoxin.
3. Lun án ã nghiên cu to c công ngh nuôi cy b mt cho sn xut ch phm bào
 chng A. flavus DA2 t sn lng cao (10
9
CFU/g) vi công nghn gin, giá thành

. Ch phm có tác dng gim s nhim nm mc và aflatoxin trên ngô, lc  giai n
ng rung và trong quá trình bo qun t 86,55% n 97%, m bo tính kh thi cao khi
a ra ng dng  quy mô ln.
6
CHNG I. TNG QUAN TÀI LIU
1.1 TNG QUAN V AFLATOXIN
1.1.1 Cu to
Aflatoxin là nhóm các hp cht có nhân difuranocumarin, là sn phm trao i cht
ch yu ca hai loài nm mc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Theo Reddy
và Farid có khong 18 cu trúc hóa hc gn nhau ca aflatoxin ã c xác nh. Da trên
c tính lý hóa và tính c khác nhau các aflatoxin c chia thành nhiu nhóm: B ( B1 ,
B2); G (G1, G2); M (M1, M2); P1 và Q1. Các loi aflatoxin này khác bit v hóa hc
không nhiu nhng khác bit vc tính là rt ln. Aflatoxin B1 và G1 có kh nng gây
ung th cao hn nhiu so vi các loi aflatoxin còn li. Trong các loi aflatoxin thì
aflatoxin B1 ph bin nht trong nông sn và gây tác hi nhiu nht, tip theo là G1, trong
khi ó B2 và G2 tn ti  nng  thp hn [115].
Công thc cu to ca mt s aflatoxin [11]:
Hình 1.1 Công thc cu to ca mt s dng aflatoxin
OCH
3
O O
O
O
O
Aflatoxin B1
Aflatoxin B2
O
O
O
O O

OCH
3
Aflatoxin M1
OH
OCH
3
O O
O
O
O
Aflatoxin M2
OH
OCH
3
O O
O
O
O
O
O
O
O
OCH
3
O
O
Aflatoxin G1
O
O
O

O
OCH
3
O
O
Aflatoxin G2
7
1.1.2 Tính cht hóa lý
Các aflatoxin c hoà tan trong các dung môi phân cc nh nh chloroform,
methanol, acetone, acetonitrile và c bit  dimetylsulfoxit.  hòa tan ca aflatoxin
trong nc dao ng là 10-20mg/lít.
Aflatoxin tinh khit rt bn vi nhit. Tuy nhiên, s có mt a hi nc và nhit
 cao có th phá hy c aflatoxin sau mt thi gian nht nh nh s phá hy aflatoxin
trong du n, trong c rang hoc trong dung ch có pH 7. Mc dù cha c nghiên cu
chi tit nhng dng nh nhit  cao ã m vòng lacton vi phn ng decacboxyl hóa.
Các aflatoxin tng i không bn khi c  trong không khí di ánh sáng mt tri và
tia t ngoi, c bit  các dung môi có  phân cc cao nên vic kh nhim aflatoxin
trong thc phm s có nhiu bin pháp hn [98, 99].
Các aflatoxin ít hoc không b phân hy trong u kin làm nóng khi thanh trùng,
không b phân hy khi un nu  nhit  thông thng ( nhit  120
o
C, phi un 30
phút mi mt tác dng c). Do vy, nó có th tn ti trong thc phm mà không cn s có
t ca nm mc tng ng, ng thi nó rt bn vi các men tiêu hóa. Tuy nhiên, các
aflatoxin có th b phá hy hoàn toàn vi vic x lý bng amoniac hay hypochlorit [98].
 có mt ca vòng lacton  phân t aflatoxin làm chúng d b thy phân trong môi
trng kim. c tính này là quan trng trong quá trình ch bin thc phm vì quá trình x
lý kim làm gim s nhim aflatoxin ca các sn phm. Tuy nhiên, nu x lý kim là nh
thì vic axit hóa s làm phn ng ngc tr li  to aflatoxin ban u [22, 11]. nhit
 cao (100

o
C), phn ng decacboxyl m vòng lacton hóa y ra dn n s mt nhóm -
OCH
3
ca vòng thm. Phn ng ng y ra tng t vi amoniac và các hp cht amin
khác [101].
Mt s tác nhân oxy hóa nh NaClO, KMnO
4
, Cl, H
2
O
2
, O
3
phn ng vi
aflatoxin làm thay i cu trúc phân t ca aflatoxin, c ch ca phn ng cha c xác
nh, tuy nhiên s thay i cu trúc phân t ã c th hin qua s mt tính cht phát
quang [101].
Các aflatoxin phát quang mnh khi  di ánh sáng cc tím sóng dài. Tính cht này
cho phép phát hin các hp cht này  nng  thp ( 0,5 ng trên sc kí bn mng). Nó cung
p m c bn v mt thc hành cho tt c các phng pháp hóa lý cho vic phát hin và
nh lng [6, 7]. Mt s tính cht lý, hóa ca các aflatoxin c trình bày theo bng 1.1
[115].
8
ng 1.1 t s tính cht lý, hóa ca các aflatoxin
Aflatoxin Công thc
phân t
Khi lng
phân t
Nhit  nóng chy

(
o
C)
Màu hunh quang
B1 C17H12O6 312 268-269 Xanh da tri(B)
B2 C17H14O6 314 268-289 Xanh da tri(B)
G1 C17H12O7 328 244-246 Xanh lá cây(G)
G2 C17H14O7 330 229-231 Xanh lá cây(G)
M1 C17H12O7 328 297-299 Xanh tím
M2 C17H14O7 330 293 Xanh tím
1.1.3 c tính ca aflatoxin
Aflatoxin là các cht có kh nng gây ung th, gây t bin gen, là tác nhân làm
gim kh nng min dch. Ngi có th b nhim aflatoxin do n phi các loi ng cc b
nhim hoc n tht các ng vt c nuôi bng ng cc b nhim aflatoxin. Các nghiên
u  nhng vùng có t l ung th cao trên th gii u cho thy nhim c aflatoxin là
nguy c chính gây ung th gan [99]. Do cu trúc hóa hc có vòng dihydro-furan nên
aflatoxin B1 liên kt vi mt s enzym làm cn tr trao i cht dn n t vong. Ngoài ra,
aflatoxin B1 còn tng tác ng hóa tr vi vt cht di truyn (DNA, RNA) làm ri lon
u trúc di truyn dn n tn thng gan và ung th gan [95]. Cho n nay, các lun
chng khoa hc công nhn kh nng tác ng lên t bào gan ca aflatoxin qua 5 giai n
sau: (1) c ch các polymerase là enzyme tham gia vào tng hp DNA và RNA. (2) Làm
chm hoc ngng hn s tng hp DNA. (3) Ngn cn c ch sinh tng hp RNA thông
tin. (4) Bin i hình dng nhân t bào. (5) Hn ch quá trình sinh tng hp protein [63].
 ch tác ng ca aflatoxin trong c th ngi nhim n nay vn cha c xác
nh rõ ràng. Các nghiên cu gn ây ch tìm thy snh hng ca các aflatoxin nhóm B
n st bin codon 249 ca gen p53. Hin tng này dn n nguy c gây ung th cao
do gen p53 là mt gen có tác dng ch ng vic tng lên không bình thng ca các t bào,
hình thành nên các dng u, bu trong c th [95].
9
Hình 1.2 Aflatoxin tng tác ng hóa tr vi vt cht di truyn

1.1.4 Thc trng nhim aflatoxin trên ngô, lc
1.1.4.1 Thc trng nhim aflatoxin trên ngô, lc ca các nc trên th gii
Theo ánh giá ca t chc nông lng th gii (FAO) hàng nm có t 25-50% nông
n sau thu hoch b nhim mycotoxin trong ó ch yu là aflatoxin. T l này còn cao hn
i vi các nc nm trong vùng khí hu nhit i, có ni 80% ngô b nhim mycotoxin.
Ngoài các nông sn thc phm thì các loi thc phm có ngun gc tng vt cng có
th b nhim mycotoxin do s dng các thc n có c t [67].
Các u tra ca M vi trên 1500 mu ngô thu hoch  v mùa ca các nm 1969-
1970, ch yu t các ngun thng mi, ã cho thy t 2-3% mu nhim aflatoxin B
1
và
G
1
 khong t 3-37 ppb. Trong nghiên cu tip theo vi 60 mu tông - nam ca M
aflatoxin B
1
ã c tìm thy trong 21 mu  mc t 6-308 ppb.  Thái Lan, 35% mu
ngô nghiên cu nhim aflatoxin B
1
i hàm lng trung bình 400 ppb.  Uganda t l
nhim là 40% vi hàm lng trung bình là 133 ppb. c bit o Sebu (Philippin), t l
này là 97% vi hàm lng trung bình là 213 ppb [131].
Theo Goto và công s, trong mùa ma nm 1984-1985  Thái Lan, 85% s mu ngô
thu thp t các kho bo qun ã nhim aflatoxin B
1
vi lng 6,30-1310 ppb và 0,6 -767 ppb,
theo th t [74]. Trong kho sát ca Makun và cng s cho thy 29/50 mu u thu nhn 
Nigeria nhim aflatoxin  mc 63,5 - 106,2 g/kg, 54% các mu bt m ch bin  các ch
nhim c t vi hàm lng 102,9 - 198,4 g/kg [97].
10

Trong nm 1973, nghiên cu v lc bóc v M cho thy 15% ca 361 mu có
aflatoxin gii hn t vt n 50 µg/kg. Stoloff ã tìm thy aflatoxin  86,5% ca 52 mu
trong các sn phm lc nhp vào an Mch làm thc n gia súc, mt mu có 3.465µg/kg.
Các aflatoxin ã tìm thy  41% ca 173 s mu lc  Sudan, 16 mu có trên 250 µg/kg và
9% s mu có trên 1000 µg/kg.  Philippin, tt c các mu b lc c kim tra nm 1967-
1969, có aflatoxin vi giá tr 155 µg/kg và giá tr trung bình 500 µg/kg [123].
1.1.4.2 Thc trng nhim aflatoxin trên ngô, lc  Vit Nam
 Vit Nam, ngô là cây lng thc quan trng th hai sau cây lúa và là cây màu
quan trng nht c trng  nhiu vùng sinh thái khác nhau, a dng v mùa v gieo
trng và h thng canh tác. Cây ngô không ch cung cp lng thc cho ngi, vt nuôi
mà còn là cây trng xóa ói gim nghèo ti các tnh có u kin kinh t khó khn. Sn
xut ngô c nc qua các nm không ngng tng v din tích, nng sut, sn lng: nm
2001 tng din tích ngô là 730.000 ha, n nm 2005 ã tng trên 1 triu ha; nm 2010,
din tích ngô c nc 1126,9 nghìn ha, nng sut 40,9 t/ha, sn lng trên 4,6 triu tn.
Bên cnh ó, trong s các cây công nghip ngn ngày ang c trng  Vit nam, lc là
cây thc phm, cây có du quan trng trong s các loi cây có du hàng nm trên th gii,
n phm lc có ngun protein cao làm thc n cho ngi và gia súc, làm nguyên liu cho
công nghip ch bin. Nm 2012 din tích gieo trng lc trong c nc t 220.000ha, sn
ng t 470.600 tn. Hàng nm Vit Nam xut khu khong 40.000-45.000 tn lc t
kim ngch xut khu 24-26 triu USD [17].
n tht sau thu hoch i vi cây ngô, lc là khá ln, trung bình t 13 - 15%. c bit
vic sn xut ngô, lc trong v Xuân thng gp rt nhiu khó khn cho vic thu hoch, bo
qun, s ch ngô, lc trong u kin ma kéo dài trong giai n cui v thu hoch. Ngô, lc
u không c bo qun hoc bo qun không úng qui trình s gim cht lng nghiêm
trng, c bit s phát sinh các loi nm Aspergillus sp. Sinh c t aflatoxin làm gim
cht lng cng nh hiu qu kinh tng thi gây bnh ung th gan cho ngi và ng
t.
 nc ta cng ã có mt s tác gi nghiên cu v mc  nhim nm mc và
aflatoxin trên ngô, lc. Nguyn Phùng Tin và cng s [9] ã nghiên cu mc  nhim
c trên ngô, kt qu là 38 mu bo qun trong kho lng thc ca thành ph Thanh Hóa

ã nhim nm mc thuc các chi sau: Aspergillus, Cladosporium, Penillium,
Sporotrichuro, Saccharomyces, Trichoderma, Geotrichum. Tuy nhiên cha có s liu v
11
c nhim mycotoxin trong công trình này. u Ngc Hào và cng sã nghiên cu mc
nhim mc và aflatoxin trên ngô ca các tnh Sn La và Thanh Hóa. Kt qu phân tích ca
24 mu ngô ht và 24 mu ngô bt cho thy các mu này ã nhim A.flavus vi  l cao,
 50-80%. Trong ó, có 33% s mu ngô ht ã nhim aflatoxin B1 t 10-40ppb, 8,3% s
u nhim aflatoxin B2 t 10-20ppb, 72% s mu ngô bt ã nhim aflatoxin B1 t 25-
250ppb, 9,5% s mu ngô nhim aflatoxin B2 t 10-20ppb, 74,7% mu khô lc nhim
aflatoxin[4]. Nguyn Thùy Châu và cng sã nghiên cu mc  nhim nm mc và
aflatoxin trên ngô và go  mt sa phng cho thy tn xut nhim aflatoxin trên ngô 
min Nam và min Bc Vit Nam là cao t 73,3% - 95,8% trong ó hàm lng aflatoxin
trung bình là 63,8ppb [10, 11]. Nm 1990-1995 Vin Dinh Dng ã kim tra 387 mu
ng thc thc phm nhn thy có 73 mu (19%) b nhim aflatoxin, trong ó có 68%
u lc và các sn phm t lc cng có cha loi c t này [16]. Phan Th Kim và Cng
ã tin hành kho sát phân tích trên 243 mu ngô, lc và sn phm ch bin làm thc n
gia súc ti 03 xã thuc huyn Tân K Ngh An tháng 6/2002 ã phát hin mc  và nguy
 nhim Aflatoxin khá cao trên 90% s mu ly ti các h gia ình ang c bo qun b
nhim aflatoxin, t l vt gii hn cho phép theo quy nh gii hn hàm lng aflatoxin
có trong thc phm ca B Y t là trên 23% (56/243mu) [14].
1.1.5 Gii hn aflatoxin cho phép trong nông sn thc phm
Trc thc trng nhim aflatoxin trên mt s nông sn  mc  cao cng nh tính
c ca aflatoxin i vi sc khe con ngi và vt nuôi, gây thit i v kinh t. Chính vì
vy, nhiu quc gia trên th gii ã có nhng quy nh gii hn aflatoxin nhim trong
ng thc, thc phm và thc n chn nuôi. Theo tiêu chun ca c quan qun lý Thc
phm và Dc phm M (FDA) gii hn aflatoxin cho phép trong lc  ch bin c
quy nh  mc 15 ppb (8 ppb cho B1), trong các loi ht khác và qu khô  ch bin tip
là 10 ppb (5 ppb cho B1). i vi ng cc, qu khô và các loi ht dùng n ngay cho
ngi, tiêu chun nghiêm ngt hn và quy nh  mc 4 ppb (2 ppb cho B1) [67]. Codex
a ra tiêu chun riêng cho aflatoxinB1 là 7,5-10,5 ppb [33]. Gii hn aflatoxin cho phép

trên nông sn thc phm c trình bày  bng 1.2.
12
ng 1.2 Gii hn aflatoxin cho phép trên nông sn thc phm
c
Gii hn aflatoxin ti
a cho phép (ppb)
Loi thc n
20
t ngô s dng làm thc n cho gia súc, gia
m  tt c các giai n khác nhau

20
Hàm lng ti a cho phép trong thc n cho gia
súc, gia cm hoc trong nguyên liu bt ngô
Châu Âu 5 Thc phm s dng cho ngi
Canada 15 Các sn phm thc phm ch bin t lc
Úc 15 Thc phm ch bin t du u tng và lc
10 Cho tt c các loi thc phm cha B1
Nht
100 Nguyên liu ch bin thc n chn nuôi
5 – 20 Ng cc, u tng và du thc vt
Trung
Quc
10 – 50 Trong các loi thc phm khác
30 t c các loi lng thc, thc phm
Châu Á
120 Trong các sn phm t lc
i Vit Nam, B Nông nghip và phát trin nông thôn cng ã ra quy nh v hàm
ng ti a aflatoxin B1 và hàm lng tng s các aflatoxin (B1+ B2 + G1+ G2) trong
thc n cho gia súc, gia cm theo quyt nh S 104/2001/Q/BNN (bng 1.4) và quy

chun k thut Quc gia 2013/QCVN/BNNPTNT - Quy nh gii hn ti a cho phép hàm
ng c t nm mc trong thc n tinh n hp cho bò (bng 1.3).
ng 1.3 Gii hn aflatoxin trong thc n tinh hn hp cho Bê và Bò
Hàm lng aflatoxin tính theo microgam/kg
(ppb) ti a cho phép
STT Loi c t
Bê (<6 tháng tui) Bò tht (> 6 tháng tui)
1 Aflatoxin B1 50 100
2
ng s các aflatoxin
( B1+B2+G1+G2 )
200 500
13
ng 1.4 Gii hn aflatoxin trong thc n chn nuôi
Loi vt nuôi
Aflatoxin B1
(ppb)
Aflatoxin tng s
(ppb)
Gà con t 1 – 28 ngày tui < 20 <30
Nhóm gà còn li <30 <50
t con t 1 – 28 ngày tui Không có <10
Nhóm vt còn li <10 <20
Heo con theo m t 1 – 20 ngày tui <10 <30
Nhóm heo còn li <100 <200
Bò nuôi ly sa <20 <50
1.2 ASPERGILLUS FLAVUS
Aflatoxin c to ra t mt s chng nm mc thuc chi Aspergillus nh: A. flavus,
A. parasiticus, A. nomius, A. pseudotamarii, A. bombycis [106]. Trong ó, loài A. flavus
có kh nng sinh aflatoxin mnh nht trong môi trng t nhiên và nhân to. Theo s liu

a Schoroder và Boller, có t 20-98% các chng A. flavus phân lp có kh nng to
aflatoxin [119]. A. flavus phân b khp ni trên trái t: di t, trên các nông sn thc
phm, c bit là trên lc và các sn phm ch bin t lc. Ngoài ra chúng còn c thy
nhiu trên si bông, nht là trên ht bông và khô ht bông, thc n gia súc, dm bông, di
tht và nhiu thc n khác…A. flavus xâm nhp vào nông sn, thc phm qua các m tip
p nh nhng ch do côn trùng hu hoi gây ra. Tuy nhiên,  cây lc ti A. flavus khó
xâm nhp, mà chúng xâm nhp khi c lc ã già, nht là sau khi thu hoch. A. flavus xâm
nhp vào ht lc cha 15-20% nc, tc là vào thi gian u ca vic làm khô [2].
1.2.1 c m hình thái
A. flavus có màu vàng xanh lá cây, trên môi trng nuôi cy nhân to (Czapeck hay
thch Sabouraud) hình thái khun lc sau 24h nuôi cy có màu vàng nht  trung tâm, rìa
mép b có màu trng mn, sau 48h hình thành min bào t trung tâm, xut hin các khi
bào t chín màu vàng nht chuyn sang màu vàng, sau 72-96 gi khun lc phát trin cc
i. ng kính khun lc t 4-5cm sau 6-7 ngày nuôi cy  nhit  phòng, các bào t
hình thành vòng tròn ng tâm u n, thng có 5-6 vòng tròn màu xanh lc trên b mt
khun lc [1, 114].
14
A. flavus có kh nng sinh các loi c t B1, B2 và axit cyclopizoic (CPA) [1].
Theo kt quã nghiên cu ca nhiu tác gi, không phi tt c các loi A. flavusu có
kh nng sinh c t aflatoxin.  Pháp 25% s chng A. flavus phân lp c t lng
thc, thc phm và thc n gia súc to aflatoxin. Các chng A. flavus to aflatoxin trên lc
chim 96%,  ht bông chim 78%,  lúa mch chim 49% và  go chim 35% [2]. Các
chng vùng nhit i có nhiu loài sinh c t hn so vi các chng vùng ôn i. Mt s ý
kin cho rng các chng sinh c t bao gi cng có u bào tính màu xanh lc, ngay
 các ging nuôi cy lâu ngày, có th bình 2 lp, cung bào tính có vách, có gai,
nhng chng sinh c t có s phình to mt phn si trên si nm to thành nhng mt
nh [2]. Tuy nhiên ch da vào c m hình thái s rt khó  xác nh chính xác nhng
chng A. flavus có kh nng sinh hay không sinh aflatoxin.
ng 1.5 c m hình thái ca A. flavus
c m hình thái A. flavus

- Dng khun lc - Bng nh giá
B mt: Dng len Hình dáng: hình cu, trùy
Màu sc: màu vàng xanh lá cây
ng kính: 25 -45 (µm)
Màu mt sau: tím nht, nâu hng
- Cung th bình
Git tit: Có hoc không có Có mt: Có hoc không
Sc t hoà tan quanh khun lc: Không
Kích thc: 5-10 × 3,5× 5,5 (µm)
ng kính: 6 -8 (cm)
- Th bình
- Giá bào t trn
Hình dng: Hình bình
B mt: Ráp hoc nhn
Kích thc: 6,5-12×3-6 (µm)
Chiu dài: 500 -800 (µm)
- Bào t trn
ng kính: 15 – 20 (cm) Hình dng: Cu, hình trng
- Khi bào t trn B mt: Có gai
Hình dng: Tia to tròn, ct
ng kính trc ln: 3 – 6 (µm)
ng kính: 300 -500 (µm)
Chiu dài: 50-300 (µm)
15
Hình 1.3 Khun lc A. flavus Hình 1.4 H si A. flavus quan sát di kính hin vi
1.2.2 Các yu tnh hng n s sinh trng ca A. flavus
Ngun cacbon: A. flavus có các enzyme thy phân tinh bt, nhng ngun
hydrocacbon thích hp nht cho s sinh trng và phát trin ca các loi nm này là
glucose và sacharose. Môi trng Czapeck – Dox có ngun thc n cacbon di dng
sacharose, thng c s dng làm môi trng nuôi cy và phân loi A. flavus.

Ngun nit: Có nhiu loi vi nm không phát trin c trên môi trng cha mui
amôn, do khi ng hoá NH
4
+
trong môi trng s tích lu các ion SO
4
2-
, HPO
4
2-
và Cl
-
…
làm h thp pH ca môi trng. Khi vi nm ng hoá NO
3
-
môi trng s tích lu các
cation K
+
, Na
+
…do ó làm tng pH môi trng. A. flavus có kh nng ng hoá các loi
mui amon và nitrat. Ngoài ra chúng còn có kh nng s dng axit glutamic, prolin,
trytophan, alanin, asparagin, histidin, lysine, methionine [1].
Nguyên t khoáng: Ngoài các ngun dinh dng ch yu trên m cho s tn ti
và phát trin, A. flavus còn òi hi mt lng cn thit các nguyên ta lng (P, K, S,
Mg, Ca), các nguyên t vi lng (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni…), các mui MgSO
4
, K
2

SO
4
,
KCl, FeSO
4
…cng rt cn thit cho s phát trin ca A .flavus [1].
Nhit : A. flavus là loi nm mc a nhit, có th sinh trng và phát trin  di
nhit  20-60
o
C, t
o
opt
25-35
o
C, di 12
o
C A. flavus không phát trin c hoc phát trin
t yu [2].
pH: A. flavus có th phát trin  khong pH khá rng (pH = 2 - 8) tu thuc vào loài.
Tuy nhiên pH ti u cho s phát trin ca chúng là 4,5-6,5 [2].
16
m: m ca môi trng cng nhm tng i ca không khí là yu t
quan trng quyt nh s sinh trng ca h si nm và s sn sinh bào t. m thích
p cho s phát trin h si ca A. flavus dao ng t 80-85%. A. flavus phát trin tt trên
các loi c cht có du nh các nông sn lc, ngô, go, bông. Hàm lng nc trong c
cht thích hp cho s phát trin ca chúng t 15-30% [2].
1.2.3 u kin sinh aflatoxin
n lng aflatoxin thng t l vi trng lng và h si nm to thành khi nuôi
y. Khi s lng h si nm t giá tr ti u thì sn lng aflatoxin là n nht, nhng
gim sút nhanh chóng khi h si nm bt u t phân gii. S sn sinh aflatoxin trong u

kin nuôi cy thông thng bt u t lúc hình thành các c quan mang bào tính ca
A.flavus và tng dn n giai n sinh bào t mnh m [90]. Thi gian nuôi cy có nh
ng ln n sn lng aflatoxin ca A. flavus. Kt qu nghiên cu a Gunnel cho thy,
sau 7 - 10 ngày nuôi cy b mt chng A. flavus  cho sn lng sinh khi cng nh sn
ng aflatoxin t cao nht [32].
Các nhit  cc tiu, ti thích, và cc i cho s to aflatoxin là 12
o
C, 25
o
C - 35
o
C
và 40
o
C - 42
o
C theo th t. Kh nng sinh c t a A. flavus có th tng khi chúng c
y chuyn trên môi trng thích hp và ngc i, b mt hot tính sau nhiu ln cy
chuyn liên tip trên môi trng không thích hp. Môi trng có b sung nm men, pepton
hoc các axit amin cùng vi u kin pH, nhit  thích hp (pH = 5–5,4; nhit  26–
28
o
C) là u kin tt nht cho s to aflatoxin.
Hàm m ca c cht cng là yu t quan trng nh hng n s phát trin ca
A.flavus và s to aflatoxin. Theo Diener, nhit  30
o
C và m 25% cho s hình thành
aflatoxin ln nht  ngô và m 83-88% cho s hình thành aflatoxin thp nht [53]. 
c nhân có hàm lng nc t 15-30%, trên ngô là 19-24% và trên go cn lng nc là
24-26% thì  hình thành aflatoxin xut hin sau 2 ngày. Nh vy có th nói, s sinh tng

p aflatoxin din ra rt nhanh, c bit sau thu hoch. C cht có hàm lng nc cao,
thi gian làm khô kéo dài là nguyên nhân dn n nhim aflatoxin [4]
Ngoài ra các vitamin nhóm B cng có tác dng kích thích s to thành các afltoxin.
Ngi ta ã xác nh c khi A. flavus phát trin trên ht lúa m thì hàm lng afltoxin
o ra  giai n phôi mm nhiu hn hn  giai n phôi nh. Vic thêm nc chit t
m lúa m, lipit hay các axit béo s kích thích tt s hình thành aflatoxin. u này khin
ngi ta ngh rng các cht này có vai trò quan trng trong vic sinh tng hp aflatoxin vì