Nghiên cứu tính đối kháng của Aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc (tóm tắt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI


LÊ THIÊN MINH


NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS
FLAVUS KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG
AFLATOXIN TRÊN NGÔ VÀ LẠC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62420201


TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC




Hà Nội – 2014
Công trình này được hoàn thành tại
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. NGUYỄN THÙY CHÂU
2. PGS. TS. NGUYỄN THN XUÂN SÂM


Phản biện 1: PGS. TS. LÊ LƯƠNG TỀ

Phản biện 2: PGS. TS. NGUYỄN THN HOÀI TRÂM
Phản biện 3: GS. TS. NGUYỄN VĂN TUẤT



Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp
Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Vào hồi …. giờ…. ngày… tháng…… năm………


Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
2. Thư Viện Quốc gia

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN


1. Lê Thiên Minh, Nguyễn Tiến Nam, Nguyễn Thùy Châu. (2010). Hiệu quả của chế
phm Aspergillus flavus (AF) không sinh aflatoxin để phòng chống afltoxin trên
lạc. Tạp chí Nông nghiệp và Phát Triển Nông thôn, (5/2010). pp (81-85).
2. Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu. (2010). Tác dụng của chủng A.flavus DA2
không sinh và phòng chống aflatoxin trên ngô ở giai đoạn ngoài đồng và trong quá
trình bảo quản. Tạp Chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, (6/2010). pp (30-
34)
3. Lê Thiên Minh, Nguyễn Hồng Hà, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Nguyễn Thùy Châu.
(2011). Nghiên cứu sản xuất chế phm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin để
phòng chống aflatoxin. Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Cơ điện Nông nghiệp và
Bảo quản Chế biến Nông sản, Thực phNm. NXB Khoa học và Kỹ thuật. (1/2011).
pp.213-219.

1
MỞ ĐẦU
Aflatoxin là những chất chuyển hóa có độc tính cao, được sinh tổng hợp
chủ yếu bới các loài nấm mốc Aspergillus. Các độc tố này tồn tại trong nông
sản thực phNm, không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của thực phNm mà
còn là một trong những nguyên nhân gây nên những căn bệnh nguy hiểm cho
người và động vật như viêm gan cấp tính, ung thư gan, suy dinh dưỡng ở trẻ
em.
Việc kiểm soát hàm lượng aflatoxin có mặt trong nông sản thực phNm đã
được nghiên cứu từ rất lâu với nhiều biện pháp khác nhau, mỗi biện pháp đều
có những ưu nhược điểm nhất định nhưng chưa có biện pháp nào đạt được hiệu
quả như mong đợi. Những năm gần đây, xu hướng sử dụng chính những chủng
nấm đối kháng Aspergillus flavus không sinh độc tố có tính cạnh tranh cao làm
tác nhân kiểm soát đang được phát triển và tỏ ra khá hiệu quả. Chế phNm nấm
Aspergillus flavus đối kháng đã được nghiên cứu, ứng dụng và cấp bằng sáng
chế, được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp ở một số quốc gia như Mỹ, Ấn
Độ, Trung Quốc
Việt Nam nằm trong miền khí hậu nhiệt đới nóng, Nm là điều kiện rất thuận

lợi cho các loài nấm mốc phát triển, xâm nhiễm vào cây trồng ngay từ giai đoạn
canh tác, trong suốt quá trình bảo quản và chế biến nếu không có biện pháp
kiểm soát nghiêm ngặt. Do đó, việc tạo lập một chế phNm nấm A. flavus đối
kháng từ những chủng phân lập được trên các nguồn tự nhiên bản địa chắc chắn
sẽ mang lại hiệu quả giảm thiểu sự nhiễm aflatoxin.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
tính đối kháng của Aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống
aflatoxin trên ngô và lạc”, với các mục đích và nội dung nghiên cứu chính sau
đây:
Mục đích nghiên cứu
Kiểm soát sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng chế phNm Aspergillus
flavus không sinh aflatoxin.
Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập, tuyển chọn các chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin có
khả năng cạnh tranh cao và ổn định với các chủng A. flavus sinh aflatoxin.
2. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và tạo chế phNm bào tử từ chủng Aspergillus
flavus không sinh aflatoxin.
3. Nghiên cứu ứng dụng chế phNm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin

2
nhằm giảm thiểu sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở quy mô phòng thí nghiệm
và trên đồng ruộng.
Những đóng góp mới của luận án
1. Là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam sử dụng cơ chế cạnh tranh
sinh học bằng chủng A. flavus không sinh aflatoxin trong kiểm soát aflatoxin
nhiễm trên ngô và lạc.
2. Luận án nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để làm sáng tỏ bản chất
sinh học phân tử của chủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin phân lập từ ngô
(Việt Nam). Chủng A. flavus DA2 không mang 3 gen (ver, aflR và nor) trong
cụm gen sinh tổng hợp aflatoxin.

3. Luận án đã nghiên cứu tạo được công nghệ nuôi cấy bề mặt cho sản xuất chế
phNm bào tử chủng A. flavus DA2 đạt sản lượng cao (10
9
CFU/g) với công nghệ
đơn giản, giá thành rẻ. Chế phNm có tác dụng giảm sự nhiễm nấm mốc và
aflatoxin trên ngô, lạc ở giai đoạn đồng ruộng và trong quá trình bảo quản từ
86,55% đến 97%, đảm bảo tính khả thi cao khi đưa ra ứng dụng ở quy mô lớn.

Bố cục luận án
Luận án gồm 124 trang, 35 bảng và 26 hình; Mục lục 3 trang; Mở đầu: 2
trang; Chương 1. Tổng quan tài liệu: 27 trang; Chương 2. Vật liệu và phương
pháp nghiên cứu: 11 trang; chương 3. Kết quả và thảo luận: 51 trang; Kết luận
và kiến nghị: 1 trang; Tài liệu tham khảo: 12 trang ( Bao gồm 11 tài liệu tiếng
Việt, 129 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục: 15 trang.
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN
Aflatoxin là nhóm các hợp chất có nhân difuranocumarin, là sản phNm trao
đổi chất chủ yếu của hai loài nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus.
Aflatoxin là các chất có khả năng gây ung thư, gây đột biến gen, là tác
nhân làm giảm khả năng miễn dịch. Người có thể bị nhiễm aflatoxin do ăn phải
các loại ngũ cốc bị nhiễm hoặc ăn thịt các động vật được nuôi bằng ngũ cốc bị
nhiễm aflatoxin. Các nghiên cứu ở những vùng có tỷ lệ ung thư cao trên thế
giới đều cho thấy nhiễm độc aflatoxin là nguy cơ chính gây ung thư gan.

3
1.2 PHÒNG CHỐNG SỰ NHIỄM AFLATOXIN
Trên thực tế, đã có một số biện pháp kiểm soát aflatoxin được ứng dụng
như: biện pháp canh tác nông nghiệp, biện pháp sau thu hoạch, phương pháp
sinh học, sử dụng vi sinh vật đối kháng…

Việc sử dụng các chủng vi sinh vật đối kháng không có hại cho con người
và thực phNm mà lại có khả năng giảm sự tạo độc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc
tạo độc tố là biện pháp lý tưởng. Các nghiên cứu của Dorner cho thấy, lạc đã bị
nhiễm Aspergillus flavus và aflatoxin từ giai đoạn trước thu hoạch. Vì vậy,
nhiều Quốc gia như Mỹ, Ấn Độ, Thái Lan, Nigeria đã có chiến lược phòng
chống nhằm giảm tổn thất do aflatoxin gây nên trên lạc ở giai đoạn trước và sau
thu hoạch. Việc sử dụng chủng A. flavus không sinh độc tố để ức chế các chủng
A. flavus sinh độc tố nhiễm trong đất trồng lạc theo cơ chế loại trừ cạnh tranh đã
được thực hiện ở các nước này. Cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ đã cho
phép đưa vào danh mục chủng Aspergillus flavus AF36 như là tác nhân sinh
học an toàn để phòng chống aflatoxin trên ngô, lạc và bông. Chế phNm AF36
sản xuất từ chủng A. flavus AF36 được công nhận là thuốc bảo vệ thực vật tích
cực để giảm các aflatoxin trên ngô, lạc và bông bằng việc cạnh tranh và thay thế
chủng A. flavus sinh aflatoxin vốn nhiễm tự nhiên trên đất trồng ngô, lạc và
bông. Chủng A. flavus AF36 chứa các gen mã hoá cho sự tạo aflatoxin bị đột
biến và không thể hiện sự trao đổi vật chất di truyền với các chủng sinh
aflatoxin.
Sử dụng chủng nấm A.flavus không sinh độc tố phân lập được để kiểm soát
aflatoxin là dự án quan trọng của Bộ Nông nghiệp Mỹ. Cách tiếp cận này đã
được chấp nhận ở Châu Phi và trở thành một hợp phần của dự án “đánh giá
mức độ nhiễm aflatoxin và can thiệp bằng cách sử dụng các biện pháp kiểm
soát sinh học” được tài trợ bởi cơ quan phát triển Đức (BMZ).
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
- 55 mẫu ngô, 45 mẫu lạc và 140 mẫu đất được thu thập tại các tỉnh Nghệ An,
Đắc Nông, Vĩnh Phúc và Hà Nội
- Chuột nhắt trắng giống Swiss do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp
- Mẫu ngô sạch của Viện Nghiên cứu ngô đã được kiểm tra không bị nhiễm độc
tố aflatoxin.

4
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phân lập phân loại A.flavus không sinh độc tố theo Rapper Fennel; Sàng
lọc và xác định khả năng cạnh tranh các chủng A.flavus không sinh aflatoxin
theo phương pháp của Tanaka và công sự; Xác định sự có mặt của một số gen
tham gia vào quá trình sinh tổng hợp aflatoxin theo phương pháp của Criseo và
cộng sự; Xác định hàm lượng aflatoxin bằng TLC theo phương pháp của
OAOC, phương pháp sắc ký lỏng cao áp theo tiêu chuNn Việt Nam TCVN
6953:2001.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG A.FLAVUS KHÔNG SINH
AFLATOXIN LÀM CHỦNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AF
3.1.1 Phân lập các chủng Aspergillus flavus trên ngô, lạc
Từ 100 mẫu ngô, lạc lấy ở một số địa điểm khác nhau, chúng tôi đã phân
lập được 85 chủng nấm mốc có hình thái giống loài A. flavus. Trong đó, ở Yên
Thành, Nghệ An số chủng nấm mốc phân lập được trên số mẫu là 27/30, chiếm
90%. Ở Cư’Mgar, Đắc Nông số lượng chủng nấm mốc A. flavus phân lập được
trên số mẫu là 24/30, chiếm 80% và ở Yên Lạc, Vĩnh Phúc số lượng chủng nấm
mốc A. flavus phân lập được trên số mẫu là 21/25, chiếm 84%. Tỷ lệ nhiễm
mốc ở 15 mẫu ngô Đông Anh, Hà Nội là 86% và tỷ lệ nấm mốc A. flavus phân
lập /tổng số mẫu trung bình là 85%. Kết quả trên cho thấy, các mẫu ngô, lạc ở
các tỉnh được khảo sát đã bị nhiễm A. flavus với tần suất cao (80-90%) và
không có sự chênh lệch đáng kể giữa các vùng. Như vậy, có thể nói rằng A.
flavus là loài nấm mốc nhiễm chính trên ngô và lạc ở Việt Nam.
3.1.2 Sàng lọc các chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin
Theo một số tài liệu đã công bố không phải tất cả các chủng A. flavus đều
sinh aflatoxin. Do vậy, để sàng lọc các chủng không sinh aflatoxin, từ 85 chủng
A. flavus phân lập được ở trên tiến hành nuôi cấy trên môi trường ngô theo
phương pháp của Tanaka và cộng sự. Sau 7 ngày nuôi cấy, mẫu được tách chiết
và xác định hàm lượng aflatoxin B1 tạo thành bằng kỹ thuật sắc ký bản mỏng

(TLC)
Từ 85 chủng A. flavus phân lập đã sàng lọc được 21 chủng A. flavus không
sinh aflatoxin sử dụng cho các thí nghiệm tiếp sau. Kết quả phân tích cũng chỉ

5
ra rằng 70,5% số chủng phân lập được có khả năng tạo aflatoxin dao động từ
80-600 ppb.
Dựa trên khả năng sinh aflatoxin và mức độ phát triển của các chủng
A.flavus phân lập, 05 chủng A. flavus (DA1, DA2, AL21, AL22 và AL23)
không sinh aflatoxin và 01 chủng A. flavus AF14 sinh aflatoxin đã được chọn
sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3 Khả năng cạnh tranh các chủng A.flavus không sinh aflatoxin
Theo kết quả thu được ở trên, 05 chủng A. flavus (DA1, DA2, AL21, AL22
và AL23) sau khi được phân loại, sàng lọc bằng các khóa phân loại và xác định
không sinh aflatoxin được đánh giá khả năng cạnh tranh với chủng A. flavus
AF14 sinh aflatoxin thông qua sự giảm hàm lượng aflatoxin trên môi trường
ngô. Chủng A. flavus AF14 sinh aflatoxin được nuôi hỗn hợp với từng chủng A.
flavus không sinh aflatoxin đã tuyển chọn theo tỉ lệ 1:1 (số bào tử của mỗi
chủng là 1,5 x 10
5
CFU/g) trên cơ chất ngô sạch không có aflatoxin ở nhiệt độ
28
o
C, độ Nm 25% trong thời gian 7 ngày. Sau đó chiết xuất và phân tích hàm
lượng aflatoxin được tạo thành.

Hình 3.1 Sắc ký đồ thể hiện hàm lượng aflatoxin B1 của hỗn hợp các chủng A.
flavus nuôi cấy trên môi trường ngô
Hình 3.1 chỉ ra rằng, khi nuôi riêng chủng A. flavus AF14, sau 7 ngày nuôi
cấy hàm lượng aflatoxin B1 là 600 ppb. Kết quả phân tích cũng cho thấy, các

chủng A. flavus không sinh aflatoxin khảo sát đều thể hiện khả năng canh tranh
làm giảm hàm lượng aflatoxin B1 của chủng AF14 với mức độ khác nhau, dao
động từ 42-85%. Hiệu quả giảm khác nhau là do các chủng A. flavus DA2, A.
flavus DA1, A. flavus AL21, A. flavus AL22, A. flavus AL23 có khả năng cạnh
tranh khác nhau đối với chủng A. flavus A14. Khi nuôi hỗn hợp chủng A. flavus

6
A14 và chủng A. flavus DA2 hàm lượng aflatoxin trong môi trường ngô giảm
nhiều nhất, chỉ còn 90 ppb, hiệu quả giảm aflatoxin B1 là 85%.
3.1.4 Sự có mặt một số gen thuộc cụm gen mã hóa cho các enzym
tham gia vào quá trình sinh tổng hợp aflatoxin của chủng A.flavus
DA2
Chủng A. flavus DA2 được xác định là không sinh aflatoxin dựa trên các
phương pháp nuôi cấy, phân tích bằng TLC, sắc ký lỏng cao áp HPLC và có
khả năng cạnh tranh cao với chủng A. flavus AF14 sinh độc tố. Theo nhiều tài
liệu nghiên cứu, các chủng A. flavus không sinh aflatoxin có thể do thiếu một số
gen mã hóa cho các enzym trong quá trình sinh tổng hợp aflatoxin hoặc vẫn có
đầy đủ các gen mã hóa cho quá trình sinh tổng hợp aflatoxin nhưng không sinh
độc tố do chúng bị đột biến gen. Để hiểu bản chất không sinh aflatoxin của
chủng A. flavus DA2 phân lập được ở mức độ gen, kỹ thuật multiplex PCR đã
được sử dụng để xác định sự thiếu hụt của 4 gen trong cụm gen sinh tổng hợp
aflatoxin, đó là: aflR, nor, omt và ver.
Kết quả hình 3.2 cho thấy, trong khi chủng sinh độc tố A. flavus AF14 có
đầy đủ cả 4 gen cần thiết cho sự tạo aflatoxin thì chủng A. flavus DA2 chỉ có
gen omt. Ba gen mục tiêu aflR, ver và nor là các gen quan trọng mã hóa cho quá
trình hình thành các sản phNm trung gian trong con đường sinh tổng hợp
aflatoxin hoàn toàn không có. Trong đó, gen aflR là gen điều khiển và là nhân
tố phiên mã quan trọng cho hầu hết các gen cấu trúc, kiểm soát quá trình sinh
tổng hợp aflatoxin. Theo Criseo chủng này không có khả năng tạo aflatoxin vì
không có đầy đủ 4 gen aflR, nor, omt và ver là cụm gen đã được chứng minh là

các gen chìa khóa cho sự tạo aflatoxin.

Hình 3.2 Sản phm multiplex PCR của chủng A. flavus DA2 và AF14
Chú thích: Line 1: A. flavus DA2; Line 2: A. flavus AF14; Line 3: Marker
1 2 3
AflR

1034 bp

Omt 795 bp
Ver 537 bp
Nor 399 bp

1650 bp
1000 bp
850 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp

7
3.1.5 Tính ổn định liên quan đến khả năng không sinh aflatoxin của
chủng A.flavus DA2
Chủng A.flavus DA2 được nuôi trên môi trường ngô qua 15 thế hệ, sau mỗi
5 thế hệ khả năng sinh aflatoxin đã được phân tích bằng TLC. Bên cạnh đó, sau
mỗi 5 thế hệ, chủng A. flavus DA2 được chiết tách ADN và sử dụng kỹ thuật
multiplex PCR để kiểm tra sự có mặt của các gen aflR, ver, omt và nor thuộc
cụm gen mã hóa cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp aflatoxin.

Sau 15 thế hệ không hề có vết của aflatoxin trên bản sắc ký. Kết quả PCR
(hình 3.4) cũng chỉ ra rằng, sau khi cấy chuyền qua 15 thế hệ 3 gen mục tiêu
aflR, verb và nor là các gen quan trọng mã hóa cho quá trình hình thành các sản
phNm trung gian trong con đường sinh tổng hợp aflatoxin vẫn vắng mặt. Vì vậy,
có thể khẳng định rằng chủng A. flavus DA2 ổn định về mặt di truyền.

Hình 3.3 Sắc ký đồ thể hiện khả năng sinh aflatoxin của chủng A.flavus DA2
sau 5, 10 và 15 thế hệ
Chú thích: Chun B1: Aflatoxin B1 chuNn; Mẫu 1: A.flavus DA2 thế hệ thứ 5; Mẫu 2: A.flavus
DA2 thế hệ thứ 10; Mẫu 3: A.flavus DA2 thế hệ thứ 15.

Hình 3.4 Sự tồn tại của các gen aflR, ver, omt và nor của chủng A. flavus DA2
sau 5, 10 và 15 thế hệ
1 2 3 4 5
795 bp

1650 bp
1000 bp
850 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp


8
Chú thích: Line 1: Marker; Line 2: chủng A. flavus DA2 gốc; Line 3: Chủng A. flavus DA2
sau cấy chuyền 5 thế hệ; Line 4: Chủng A. flavus DA2 sau cấy chuyền 10 thế hệ; Line 5: Chủng A.
flavus DA2 sau cấy chuyền 15 thế hệ.

3.1.6 Tính an toàn của chủng A.flavus DA2 thử nghiệm trên động
vật
Chủng A.flavus DA2 được thử độc tính trên chuột Swiss trắng có kết quả
như sau: cho chuột uống hỗn dịch bột thuốc pha trong hồ tinh bột, với mức liều
từ 10,0g – 30,0g mẫu thử/kg/ngày không nhận thấy biểu hiện gì khác thường,
không nhận thấy biểu hiện ngộ độc trên chuột thí nghiệm trong thời gian theo
dõi. Tất cả chuột đều ăn uống, hoạt động bình thường. Không xác đinh được
liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD
50
) vì không tìm được liều gây chết
chuột. Chuột ở nhóm chứng và nhóm thử tăng trọng lượng cơ thể đều như nhau
trong thời gian theo dõi.
3.2 SẢN XUẤT CHẾ PHẨM A.FLAVUS DA2
3.2.1 Xác định đường cong sinh trưởng
Thời gian nhân nuôi thích hợp cho thu hồi sinh khối chủng A. flavus DA2
là 48h, vì khi tiếp tục kéo dài thời gian nhân nuôi sẽ xảy ra hiện tượng thiếu
dinh dưỡng và có bào tử trên thành bình nuôi cấy, sinh khối nấm mốc giảm.
3.2.2 Sản xuất bào tử chủng A.flavus DA2 bằng công nghệ nuôi cấy
bề mặt
3.2.2.1 Lựa chọn môi trường thích hợp
Môi trường thích hợp cho sự phát triển và sự tạo bào tử của chủng A.
flavus DA2 là môi trường MT1 (môi trường cám trấu). Ở môi trường này mật
độ bào tử đạt 7,1x10
7
CFU/g. Book và cộng sự đã nghiên cứu công nghệ sản
xuất bào tử chủng Aspergillus flavus không sinh độc tố trên môi trường hạt lúa
mì, sau 7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 31
0
C sản lượng bào tử đạt 4,9x10
9

CFU/g.
Như vậy môi trường cám trấu cho mật độ bào tử thấp hơn môi trường hạt lúa mì
nhưng môi trường cám trấu có giá thành rẻ hơn nhiều so với môi trường hạt lúa
mì và là nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt nam. Tận dụng được nguồn phế phụ
phNm nông nghiệp khi ứng dụng sản xuất bào tử chủng A. flavus DA2 ở quy mô
pilot. Vì vậy, môi trường này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Chủng A. flavus DA2 có khả năng tạo bào tử cao nhất là 7,1x10
7
CFU/g tại
30
0
C sau 7 ngày nuôi cấy. Theo Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, nhiệt độ thích

9
hợp với đa số nấm mốc là 30-32
o
C. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu
của Book và Cotty khi nuôi cấy A.flavus AF36 ở nhiệt độ 31
0
C mật độ bào tử
đạt 4,9x10
9
CFU/g sau 7 ngày nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm cho thấy, nhiệt độ
thích hợp để nuôi cấy chủng A.flavus DA2 cho sự tạo bào tử là 30
0
C.
3.2.2.3 Ảnh hưởng của độ ẩm của môi trường.
Khi tăng độ Nm môi trường nuôi từ 55% đến 65%, khả năng tạo bào tử của
chủng A. flavus DA2 tăng dần và đạt giá trị cực đại là 7,1x10

7
CFU/g khi độ Nm
môi trường cám trấu là 65%. Ở các giá trị độ Nm môi trường cám trấu cao hơn,
khả năng tạo bào tử của chủng A.flavus DA2 giảm dần. Kết quả này phù hợp
với đặc điểm sinh lý chung của nấm mốc thường sinh trưởng và có hoạt tính
sinh học tốt trên môi trường rắn có độ Nm từ 60 – 65%.
3.2.2.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy.
Mật độ bào tử chủng A.flavus DA2 nuôi cấy trên môi trường cám trấu tăng
nhanh trong khoảng thời gian từ 4-8 ngày. Ngày thứ 9 mật độ bào tử đạt
2,0x10
9
CFU/g và đạt cao nhất ở ngày thứ 10, là 2,2x10
9
CFU/g. Như vậy, thời
gian nuôi cấy phù hợp cho sự tạo bào tử chủng A.flavus DA2 là 9 ngày. Nếu
kéo dài thời gian nuôi cấy đến ngày thứ 10 thì sẽ làm tăng chi phí trong sản
xuất, trong khi sản lượng bào tử A.flavus DA2 tăng lên không nhiều.
3.2.2 Sản xuất bào tử chủng A.flavus DA2 ở quy mô pilot
3.2.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến sản lượng bào tử chủng A.
flavus DA2
Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nấm mốc/nguyên liệu càng cao thì lượng
bào tử tạo thành nhiều hơn ở giai đoạn sớm của quá trình nuôi. Với tỷ lệ mốc
ban đầu là 10% thì thu được lượng bào tử khi kết thúc quá trình nuôi đạt
2,1x10
9
CFU/g. Tỷ lệ giống ban đầu là 5% mật độ bào tử thu được thấp hơn, chỉ
đạt 7,5x10
8
CFU/g. Do vậy, tỷ lệ tiếp giống khi nuôi cấy bề mặt chủng A.flavus
DA2 cho sản lượng bào tử cao là 10%.

3.2.2.2 Ảnh hưởng của độ dày khối ủ đến sản lượng bào tử của chủng
A. flavus DA2
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khối ủ có độ dày 6,0 cm cho mật độ bào tử
lớn nhất đạt 2,1x10
9
cfu/g, các mẫu có độ dày khối ủ là 8 cm và10 cm có hệ sợi
phát triển yếu hơn hẳn, chủ yếu chỉ mọc trên bề mặt khối môi trường. Do đó, độ
dày khối ủ khi nuôi cấy bề mặt chủng A. flavus DA2 là 6 cm.

10
3.2.3 Hoàn thiện chế phẩm AF từ chủng A.flavus DA2
3.2.3.1 Nghiên cứu lựa chọn chất mang
Mật độ bào tử của chủng A. flavus DA2 hầu như không giảm sau 6 tháng
bảo quản và chỉ giảm nhẹ đối với các chất bảo quản là canxi alginate và than
bùn, từ 1x10
9
CFU/g xuống còn 7x10
8
CFU/g và từ 1x10
9
CFU/g xuống còn
8x10
8
CFU/g, theo thứ tự sau 12 tháng bảo quản. Mật độ bào tử giảm mạnh ở
chất mang là cám gạo, từ 1x10
9
CFU/g, xuống còn 1x10
7
CFU/g sau 6 tháng bảo
quản và còn 1x 10

5
CFU/g sau 12 tháng bảo quản. Do giá thành chất mang
canxi alginat đắt hơn than bùn nên chúng tôi chọn than bùn để làm chất bảo
quản bào tử chủng A. flavus DA2.
3.2.3.2 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm A.flavus DA2 quy mô
pilot
Từ các kết quả nghiên cứu thu nhận được, quy trình công nghệ nhân nuôi,
thu hồi và tạo chế phNm A.flavus DA2 được đưa ra như sau:
Chủng A.flavus DA2
Trong ống nghiệm
môi trường thạch nghiêng PDA
Nuôi cấy bề mặt
Nhân giống cấp 1
trên bình tam giác 500ml
Nhân giống cấp 2
trên hệ thống tăng lên men
chìm sục khí 100 lít/mẻ
Thu hồi sinh khối bào tử nấm
Phối trộn chất mang
Đóng gói
Chế phẩm AF
Chủng A.flavus DA2
Trong ống nghiệm
môi trường thạch nghiêng PDA
Nuôi cấy bề mặt
Nhân giống cấp 1
trên bình tam giác 500ml
Nhân giống cấp 2
trên hệ thống tăng lên men
chìm sục khí 100 lít/mẻ

Thu hồi sinh khối bào tử nấm
Phối trộn chất mang
Đóng gói
Chế phẩm AF


11
Thuyết minh quy trình:
+ Giữ giống
Chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin được giữ giống ở ống thạch
nghiêng có môi trường PDA sau đó được cấy sang môi trường khoai tây lỏng
trong bình tam giác 500ml. Thành phần môi trường khoai tây lỏng: Glucoza
20g/l, dịch chiết khoai tây 1000ml, pH điều chỉnh đến 5,5.
+ Nhân giống cấp 1
Nuôi cấy lắc chủng A.flavus DA2 ở bình tam giác có môi trường PDA lỏng
trên máy lắc điều chỉnh nhiệt độ Sanyo (Nhật Bản), vận tốc 200 v/ph, nhiệt độ
30
0
C trong thời gian 48h.
+ Nhân giống cấp 2
Sinh khối chủng A.flavus DA2 được chuyển sang hệ thống tăng lên men
chìm sục khí 100 lít/mẻ chứa môi trường PDA (pH 5,5) đã được khử trùng và
làm nguội đến nhiệt độ 30
0
C (điều kiện khử trùng là 1atm, trong thời gian 30
phút). Tỷ lệ tiếp giống 10%, nuôi cấy trong thời gian 48h, vận tốc khuấy 200
v/ph, nhiệt độ nuôi cấy 30
0
C.
+ Nuôi cấy bề mặt

ChuNn bị môi trường cám trấu: cám trấu được trộn đều theo tỷ lệ 4:1. Bổ
sung 1 lượng nước để đạt được độ Nm 65% là độ Nm thích hợp để nuôi cấy
chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin. Cho nguyên liệu cám trấu vào túi
nilong hoặc bao PP dệt, mỗi túi chứa 5kg cám trấu, hấp khử trùng ở nhiệt độ
121
0
C trong 1 giờ. Để nguyên liệu cám trấu nguội đến 30
0
C rồi đổ vào các khay
có kích thước 80cmx50cmx15cm, độ dày cám trấu 6cm/khay, mỗi khay có 5kg
môi trường. Tiếp giống với tỷ lệ 10% vào môi trường cám trấu, trộn thật đều
hỗn dịch chủng giống A.flavus DA2 không sinh aflatoxin và cám trấu. Nuôi cấy
chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin ở nhiệt độ 30
0
C trong 9 ngày. Các
khay nuôi cấy được đặt trên các dàn sắt có kích thước dài 1,2m, rộng 0,6m, cao
1,5m.
+ Thu hồi các bào tử tạo chế phm AF từ chủng A.flavus DA2
Sau khi kết thúc nuôi cấy, sấy khô sinh khối ở nhiệt độ 45
0
C trong 48h.
Phối trộn lượng sinh khối thu được sau khi sấy với than bùn tỉ lệ sinh khối
chủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin và than bùn là 1:1. Đóng gói chế
phNm AF vào túi polyetylen và bảo quản chế phNm nơi khô mát.

12
3.3 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM AF TRÊN NGÔ VÀ LẠC
3.3.1 Nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm
3.3.1.1 Nghiên cứu tỷ lệ giữa chủng sinh aflatoxin và chủng không sinh
aflatoxin A. flavus DA2

+ Khả năng cạnh tranh của chế phm A.flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau

Hình 3.5 Sắc ký đồ thể hiện khả năng cạnh tranh của chế phm A. flavus DA2
ở các tỷ lệ khác nhau
Chú thích: Chun: ChuNn aflatoxin; Mẫu M1: Tỷ lệ AF14/DA2 = 3/1; Mẫu M2: Tỷ
lệ AF14/DA2 = 2/1; Mẫu M3: Tỷ lệ AF14/DA2 = 1/1; Mẫu M4: Tỷ lệ AF14/DA2 =1/2.
Chủng sinh độc tố A.flavus AF14 được tiến hành nuôi cấy đồng thời với
chế phNm chứa chủng không sinh độc tố A. flavus DA2 trên môi trường ngô hạt
đã thanh trùng với tỷ lệ (chủng AF14/DA2): 3/1, 2/1, 1/1 và 1/2 sao cho mật độ
bào tử tổng số đạt 1,5x10
5

CFU/g ngô. Sau 9 ngày nuôi cấy tiến hành tách chiết
độc tố và xác định hàm lượng aflatoxin bằng sắc ký TLC.
Kết quả phân tích cho thấy khả năng ức chế sự tạo aflatoxin là không cao
nếu như tỉ lệ chủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin được sử dụng thấp hơn
chủng AF14 sinh aflatoxin. Vết aflatoxin chỉ hoàn toàn mất đi ở các mẫu ngô
khi tỉ lệ A. flavus DA2 cao hơn A.flavus AF14 sinh aflatoxin.
+ Khả năng cạnh tranh của chế phm A. flavus DA2 trên đất trồng ngô, lạc
ở quy mô phòng thí nghiệm
Tiến hành nhiễm đồng thời chủng A.flavus AF14 sinh độc tố và A. flavus
DA2 trên đất trồng ngô, lạc đã tiệt trùng với mật độ tổng số 2x10
5
CFU/g. Kết
quả nghiên cứu khả năng cạnh tranh của chủng A. flavus DA2 không sinh
aflatoxin trong đất trồng ngô, lạc ở các tỷ lệ khác nhau được trình bày ở bảng
3.1.

13
Bảng 3.1 Khả năng cạnh tranh của chủng A. flavus DA2 khi bón vào đất ở các

tỷ lệ khác nhau
Tỷ lệ chủng AF14/DA2 khi
nhiễm vào đất (%)
Tỷ lệ chủng AF14/DA2 sau khi
nhiễm vào đất 01 tháng (%)
AF14 DA2 AF14 DA2
100
60
50
40
20
0
40
50
60
80
100
25,13
0
0
0
0
74,87
100
100
100
Chủng A.flavus DA2 đã thể hiện tính cạnh tranh cao đối với chủng A.
flavus AF14 sinh aflatoxin. Sau khi nhiễm vào đất trồng ngô, lạc 1 tháng, tỷ lệ
chủng A. flavus AF14:DA2 từ 60:40; 50:50; 40:60 và 20:80 đã chuyển thành
25,13: 74,87; 0:100; 0:100; 0:100, theo thứ tự. Với tỉ lệ 1/1 chủng A. flavus

DA2 đã có thể ức chế hoàn toàn chủng A.flavus AF14 sinh aflatoxin, cao hơn so
với kết quả nghiên cứu của Brown và cộng sự khi nuôi cấy hỗn hợp hai chủng
sinh và không sinh độc tố với cùng tỷ lệ 1/1 (giảm aflatoxin trên ngô là 78%).
Kết quả 3.1 chỉ ra rằng, để đạt được hiệu quả cạnh tranh cao cần bổ sung
chế phNm DA2 vào môi trường với mật độ bằng hoặc lớn hơn chủng A. flavus
sinh độc trong tự nhiên.
3.3.1.2 Ảnh hưởng của thời điểm sử dụng đến khả năng cạnh tranh của
chế phẩm A. flavus DA2
Chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin và chủng A.flavus AF14 sinh
aflatoxin được cấy đồng thời hoặc cấy cách nhau 24 giờ lên môi trường ngô hạt
đã được thanh trùng (tỉ lệ 1/1 ở mật độ tổng 1,5.10
5
CFU/g ngô). Sau 7 ngày
nuôi ở 28
o
C, tiến hành tách chiết độc tố và kiểm tra hàm lượng aflatoxin trong
môi trường nuôi cấy bằng sắc kí bản mỏng để xác định được thời điểm sử dụng
chế phNm hợp lí cho hiệu quả cạnh tranh cao.

14


Hình 3.6 Sắc ký TLC thể hiện khả năng đối kháng của chế phm A. flavus DA2
ở các thời điểm cấy khác nhau
Chú thích: ChuNn: ChuNn aflatoxin B1; Mẫu 4: Chủng A. flavus DA2 cấy trước chủng A.
flavus AF14 24h; Mẫu 5: Cấy đồng thời 2 chủng A. flavus DA2 và A. flavus AF14; Mẫu 6: Chủng
A. flavus AF14 cấy trước chủng A.flavus DA2 24h.
Kết quả phân tích aflatoxin ở hình 3.6 cho thấy, ở mẫu ngô cấy chế phNm
A.flavus DA2 trước AF14 24h, không phát hiện được aflatoxin. Ở mẫu ngô cấy
đồng thời A.flavus DA2 và AF14 cho hiệu quả giảm nhiễm aflatoxin cao, vết

aflatoxin mờ đi so với mẫu cấy chủng A.flavus AF14 sinh aflatoxin trước chế
phNm A.flavus DA2. Hiệu quả giảm nhiễm aflatoxin đạt được trong 2 trường
hợp chủng A.flavus DA2 cấy trước và cấy đồng thời với chủng AF14 là khá
cao. Do đó, có thể khẳng định, khi triển khai trên đồng ruộng nên sử dụng chế
phNm A.flavus ngay từ đầu vụ trước khi gieo trồng để tạo ưu thế cạnh tranh. Sử
dụng một lượng lớn chế phNm A.flavus DA2 thì hiệu quả cạnh tranh vẫn khá
cao cho dù trong đất đã bị nhiễm A.flavus sinh độc tố từ trước đó.
3.3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến
sinh trưởng, phát triển và khả năng cạnh tranh của chủng A. flavus DA2
+ Ảnh hưởng của thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến khả năng phát triển
của chủng A.flavus DA2
Thuốc bảo vệ thực vật được người dân sử dụng phổ biến để diệt sâu và trừ
cỏ trên ngô, lạc là thuốc trừ sâu Sumithion 50EC (chứa 95% hoạt chất
Fenitrothion do công ty Sumitomo Chem. Co.,Ltd Nhật Bản sản xuất) và thuốc
diệt cỏ Saicoba 800EC (chứa 80% hoạt chất Acetochlor do công ty Cổ phần
Bảo vệ Thực vật Sài Gòn sản xuất) đã được chọn để sử dụng trong thí nghiệm
này.
Mẫu 4
Mẫu 5
Mẫu 6
Chun

15
Kết quả nghiên cứu cho thấy, thuốc trừ sâu Sumithion 50EC và thuốc trừ
cỏ Saicoba 800EC đều không ảnh hưởng đến sự phát triển sinh khối của
A.flavus DA2 trong điều kiện phòng thí nghiệm. Khi tăng lượng thuốc bảo vệ
thực vật gấp 6 lần nồng độ sử dụng ngoài thực tế vẫn không thấy có sự ảnh
hưởng nào đến sự phát triển sinh khối của A. flavus DA2. (Nồng độ khuyến cáo
sử dụng của Sumithion 50EC là 2,5ml/l, Saicoba 800EC là 1,5ml/l).
+ Ảnh hưởng của thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến khả năng cạnh tranh

của chế phm A.flavus DA2
Chủng A.flavus DA2 và chủng sinh độc tố A.flavus AF14 được nuôi cấy
đồng thời trong môi trường PDA lỏng (tỉ lệ 1:1, với mật độ tổng 1,5x10
5

CFU/ml), lắc 200 vòng/phút ở 30
0
C để nghiên cứu sự ảnh hưởng của các loại
thuốc trừ sâu Sumithion 50EC và thuốc trừ cỏ Saicoba 800EC đến khả năng
cạnh tranh của chế phNm AF đối với A.flavus AF14. Các loại thuốc trên được
bổ sung vào các mẫu thí nghiệm với nồng độ thông thường được khuyến cáo sử
dụng (thuốc trừ sâu 2,5 ml/l, thuốc diệt cỏ 1,5 ml/l). Sau 9 ngày nuôi, tiến hành
thu dịch nuôi, tách chiết và xác định hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc
kí bản mỏng TLC.

Hình 3.7 Khả năng đối kháng của chủng A. flavus DA2 khi có mặt của thuốc
bảo vệ thực vật bằng TLC
Chú thích: 1: Aflavus DA2 nuôi cấy trong môi trường có thuốc trừ cỏ; 2: Aflatoxin B1
chuNn; 3: Aflavus AF14 nuôi cấy trong môi trường có thuốc trừ cỏ; 4: Hỗn hợp DA2 và AF14 nuôi
cấy trong môi trường có thuốc trừ cỏ; 5: Aflavus DA2 nuôi cấy trong môi trường có thuốc trừ sâu;
6: Hỗn hợp DA2 và AF14 nuôi cấy trong môi trường có thuốc trừ sâu; 7: Aflavus AF14 nuôi cấy
trong môi trường có thuốc trừ sâu;
Kết quả ở hình 3.7 cho thấy, thuốc diệt cỏ Saicoba 800EC và thuốc trừ sâu
Sumithion 50EC không làm giảm khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2.
Khi nuôi cấy hỗn hợp chủng DA2 và AF14 trên môi trường khoai tây lỏng có
1 2

3

4

5

6 7


16
bổ sung 2 loại thuốc hóa học này vết aflatoxin trên bản mỏng mờ đi, chứng tỏ
hiệu quả giảm nhiễm aflatoxin đạt được vẫn khá cao.
3.3.2 Nghiên cứu ở quy mô đồng ruộng
3.3.2.1 Đánh giá mức độ nhiễm A. flavus trên đất trồng ngô, lạc
Một vấn đề quan trọng được nhiều nhà khoa học quan tâm là sự có mặt của
loài nấm gây hại A. flavus trên đất trồng của một số tỉnh ở Việt Nam. Mật độ
của nó có ảnh hưởng lớn đến chất lượng nông sản nói chung trong giai đoạn sau
thu hoạch. Các chủng nấm mốc A. flavus nhiễm trong đất trồng ngô, lạc tại các
tỉnh Vĩnh Phúc, Nghệ An, Đắc Nông được phân lập theo phương pháp của
Raper và Fennel.
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, mật độ nhiễm A. flavus trong đất trồng
ngô, lạc ở Việt Nam là rất cao (>10
4
CFU/g đất), do đó cần có biện pháp phòng
chống nấm mốc và độc tố của chúng ngay từ giai đoạn đồng ruộng. Những kết
quả về điều tra khảo sát mức độ nhiễm các loài A. flavus sinh aflatoxin trong đất
trồng ngô, lạc ở các tỉnh là cơ sở quan trọng trong việc xây dựng được liều sử
dụng thích hợp của chủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin dùng để phòng
chống aflatoxin trên ngô, lạc tại các địa phương này.
3.3.2.1 Khả năng cạnh tranh của chủng A. flavus DA2 (Chế phẩm AF)
trên đất trồng ngô và ngô ở giai đoạn đồng ruộng và trong quá trình bảo
quản
+ Khả năng cạnh tranh của chế phm AF trong đất trồng ngô
Kết quả ở bảng 3.2 chỉ ra rằng, ở ruộng ngô đối chứng không sử dụng chế

phNm AF tổng mật độ nấm A.flavus trong đất trồng ngô là 2,0x10
4
CFU/g, trong
đó mật độ chủng A.flavus sinh aflatoxin chiếm 90% số chủng A.flavus phân lập
được. Khi sử dụng 1 lần, 2 lần và 3 lần chế phNm AF, tỷ lệ chủng A.flavus sinh
aflatoxin trong đất trồng ngô giảm từ 90% xuống còn 39,4%, 7,3% và 4,5%
theo thứ tự. Như vậy, chủng A. flavus DA2 đã có khả năng cạnh tranh cao và
thay thế các chủng A. flavus sinh aflatoxin tồn tại tự nhiên trong đất, vì vậy đã
làm giảm rõ rệt mật độ các chủng A. flavus sinh aflatoxin trong đất trồng ngô.
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Robert và công sự khi sử dụng
chủng A. flavus AF36 để phòng chống A. flavus và aflatoxin trên ngô, chủng
này đã có tác dụng giảm 95% A. flavus sinh aflatoxin trong đất trồng ngô.

17
Bảng 3.2 Khả năng cạnh tranh của A. flavus DA2 không sinh aflatoxin trong
đất trồng ngô sử dụng chế phm AF
Công thức thí
nghiệm
Mật độ
A.flavus tổng
số trong đất
x10
4
(CFU/g)
Mật độ chủng
A. flavus sinh
aflatoxin trong
đất x10
4

(CFU/g)
Tỷ lệ chủng
A.flavus sinh
aflatoxin (%)
Ngô không sử dụng
chế phNm AF (ĐC)
2,00 ± 0,05 1,800 ± 0,12 90,0
Ngô sử dụng 1 lần
chế phNm AF
2,10 ± 0,13 0,828 ± 0,04 39,4
Ngô sử dụng 2 lần
chế phNm AF
2,16 ± 0,08 0,158 ± 0,07 7,3
Ngô sử dụng 3 lần
chế phNm AF
2,20 ± 0,11 0,100 ± 0,05 4,5
+ Khả năng giảm A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin trên ngô bắp trước
thu hoạch của chế phm AF
Christensen Clyde đã có những nghiên cứu công phu về nguyên nhân
nhiễm nấm mốc trong quá trình bảo quản nông sản. Tác giả cho thấy, đất là nơi
phát sinh đầu tiên của các nấm mốc. Các nấm này đã nhiễm vào rễ của cây,
phát tán theo gió, côn trùng nhiễm vào bên trong các hạt lương thực. Vì vậy,
nông sản đã bị nhiễm A.flavus và aflatoxin ngay từ giai đoạn đồng ruộng.
Khi ứng dụng chế phNm AF ở quy mô đồng ruộng, chủng A.flavus không
độc sẽ dần thay thế các chủng độc, kết quả chủng gây độc giảm, chủng không
độc tăng cùng với sự giảm hàm lượng aflatoxin.
Các bắp ngô ở thửa ruộng sử dụng và không sử dụng chế phNm AF được
lấy mẫu theo phương pháp đường chéo, mỗi thửa ruộng thí nghiệm lấy 100 bắp
rồi tẽ lấy hạt sau đó trộn đều rồi lấy 1kg làm mẫu đại diện, sau đó lấy 100g làm
mẫu phân tích aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng TLC. Hiệu quả giảm nấm mốc

và aflatoxin trên ngô hạt trước thu hoạch được thể hiện ở bảng 3.3.


18
Bảng 3.3 Hiệu quả giảm A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin của A. flavus DA2
trên ngô bắp ở giai đoạn trước thu hoạch

Công thức thí nghiệm
Các chỉ tiêu đánh giá
Tỷ lệ hạt
nhiễm A.
flavus sinh
aflatoxin (%)
Hàm lượng
aflatoxin
trên ngô
hạt (ppb)
Hiệu quả
giảm
aflatoxin
(%)
Ngô không sử dụng chế phNm AF 15 ± 1,24 5 ± 0,05 0
Ngô sử dụng 1 lần chế phNm AF 5 ± 1,70 0 100
Ngô sử dụng 2 lần chế phNm AF 0 0 100
Ngô sử dụng 3 lần chế phNm AF 0 0 100
Ngô bắp thu hoạch từ lô không sử dụng chế phNm AF (ĐC), tỷ lệ hạt
nhiễm A.flavus sinh aflatoxin trung bình là 15%, hàm lượng aflatoxin trung
bình trên ngô ở lô không bón chế phNm AF là 5 ppb. Trong khi đó, ở ngô bắp
thu hoạch từ lô thí nghiệm sử dụng 1 lần chế phNm AF tỷ lệ hạt nhiễm A.flavus
sinh aflatoxin trung bình là 5%, không phát hiện thấy aflatoxin trên các mẫu

ngô hạt được phân tích. Ở ngô bắp thu hoạch từ lô bón 2 và 3 lần chế phNm AF,
không phát hiện chủng A.flavus sinh aflatoxin trên các hạt ngô và không phát
hiện được aflatoxin trên các hạt ngô được phân tích. Chứng tỏ chủng A. flavus
DA2 đã có khả năng cạnh tranh cao với các chủng A.flavus sinh aflatoxin vốn
nhiễm tự nhiên trên các hạt ngô ở giai đoạn trước thu hoạch và ức chế sự tạo
aflatoxin của các chủng này.
+ Khả năng giảm A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin trên ngô bảo quản
của chế phm AF
Ngô thu hoạch từ mỗi đợt sử dụng chế phNm AF (từ đợt thứ nhất đến đợt
thứ 3) được đưa vào bảo quản và theo dõi trong thời gian 6 tháng để đánh giá
hiệu quả cạnh tranh của chế phNm AF từ chủng A. flavus DA2. Toàn bộ thử
nghiệm được tiến hành từ tháng 12/2007 - 6/2009 tại kho bảo quản của xã Tam
Hồng, huyện Yên Lạc, tỉnh Vĩnh Phúc; quy mô bảo quản 01 tấn/mô hình. Hiệu
quả phòng chống nấm mốc và aflatoxin trên ngô của chế phNm AF trong quá
trình bảo quản được trình bày ở bảng 3.4.

19
Bảng 3.4 Hiệu quả phòng chống A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin của chế
phm AF trên ngô sau thời gian bảo quản 6 tháng

Công thức thí
nghiệm
Các chỉ tiêu đánh giá
Tỷ lệ hạt
nhiễm
A.flavus sinh
aflatoxin (%)

Hàm lượng
aflatoxin trung

bình trên hạt ngô
(ppb)
Hiệu quả
giảm
aflatoxin (%)
Ngô không sử dụng
chế phNm AF
100 98,0 ± 1,02
Ngô sử dụng 01 lần
chế phNm AF
50 55,0 ± 0,75 53,9
Ngô sử dụng 02 lần
chế phNm AF
10 12,6 ± 1,05 87,1
Ngô sử dụng 03 lần
chế phNm AF
0 3,0 ± 0,93 97,0
Sau 6 tháng bảo quản, ngô hạt thu hoạch từ lô không sử dụng chế phNm AF
100% hạt bị nhiễm A. flavus sinh aflatoxin, hàm lượng aflatoxin trung bình trên
ngô hạt là 98ppb. Trong khi đó, ngô hạt thu hoạch từ lô sử dụng 1 lần chế phNm
AF có 50% hạt bị nhiễm A. flavus sinh aflatoxin, hàm lượng aflatoxin trung
bình là 55ppb, hiệu quả giảm aflatoxin là 56% so với ngô thu hoạch từ lô không
sử dụng chế phNm AF. Ngô thu hoạch từ ruộng sử dụng 02 lần chế phNm AF có
10% hạt bị nhiễm A. flavus sinh aflatoxin, hàm lượng aflatoxin trung bình trên
ngô hạt là 12,6%, hiệu quả giảm aflatoxin so với lô đối chứng là 87,1%. Ngô
hạt thu hoạch ở lô sử dụng 3 lần chế phNm AF hoàn toàn không có A. flavus
sinh aflatoxin, hàm lượng aflatoxin trung bình là 3ppb, hiệu quả giảm aflatoxin
so với lô đối chứng là 97%. Kết quả này cho thấy, chủng A. flavus DA2 đã có
khả năng cạnh tranh cao với chủng A. flavus sinh aflatoxin vốn nhiễm tự nhiên
với tần suất cao trên ngô trong quá trình bảo quản và ức chế sự phát triển cũng

như giảm sự tạo aflatoxin của các chủng này.

20
3.3.2.2 Khả năng cạnh tranh của chủng A. flavus DA2 không sinh
aflatoxin trong đất trồng lạc và trên lạc ở giai đoạn đồng ruộng và trong
quá trình bảo quản
+ Khả năng giảm sự nhiễm A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin trên lạc
trước thu hoạch của chế phm AF
Chế phNm AF được sử dụng 3 đợt cho cây lạc quy mô 01ha ở 3 vụ lạc liên
tiếp từ 2/2007-12/2008 tại xã Tam Hồng, huyện Yên Lạc, tỉnh Vĩnh Phúc. Liều
sử dụng là 01 kg/sào, ở giai đoạn lạc được 15-20 ngày sau khi trồng. Sau mỗi vụ
tiến hành lấy mẫu đất ở lô thí nghiệm và đối chứng, phâp lập và đánh giá tỷ lệ
các chủng A.flavus sinh và không sinh aflatoxin trong đất. Hiệu quả cạnh tranh
của chủng A. flavus DA2 trong đất trồng lạc được trình bày trong bảng 3.5
Bảng 3.5 Khả năng cạnh tranh của A. flavus DA2 không sinh aflatoxin trong
đất trồng lạc sử dụng chế phm AF
Lô thí nghiệm Mật độ A.
flavus tổng
số trong đất
trồng lạc

x10
4
(CFU/g)

Mật độ các
chủng A.
flavus sinh
aflatoxin trong
đất trồng lạc

x10
4
(CFU/g)
Tỷ lệ chủng A.
flavus sinh
aflatoxin trong
đất trồng lạc
(%)
Lạc không sử dụng chế
phNm AF
2,50 ± 0,13 2,00 ± 0,15 80,0
Lạc sử dụng 1 lần chế
phNm AF
2,56 ± 0,31 1,48

± 0,23 58,0
Lạc sử dụng 2 lần chế
phNm AF
2,62 ± 0,16 0,290

± 0,06 11,0
Lạc sử dụng 3 lần chế
phNm AF
2,70 ± 0,10 0,135

± 0,02 5,0
Kết quả ở bảng 3.5 chỉ ra rằng, ở lô lạc không sử dụng chế phNm AF tổng
mật độ nấm A.flavus trung bình trong đất trồng lạc là 2,5x10
4
CFU/g, trong đó

mật độ chủng A.flavus sinh aflatoxin (chủng phát quang màu xanh nước biển
trên môi trường Czapek cải tiến) là 2x10
4
CFU/g, chiếm 80% số chủng A.flavus
phân lập được. Ở lô thí nghiệm sử dụng 01 lần chế phNm AF, mật độ chủng

21
A.flavus sinh aflatoxin là 1,48x10
4
CFU/g, chỉ chiếm 58% trong tổng số chủng
A.flavus phân lập được trong đất trồng lạc. Khi sử dụng 02 lần chế phNm AF,
mật độ chủng A.flavus sinh aflatoxin trung bình là 2,9x10
3
CFU/g, chiếm 11%
số chủng A.flavus phân lập được. Ở lô lạc được dùng 03 lần chế phNm AF, mật
độ chủng A.flavus sinh aflatoxin trung bình là 1,35x10
3
CFU/g, chỉ chiếm 5%
trong tổng số các chủng A.flavus phân lập được trong đất trồng lạc. Điều này
chứng tỏ, chủng A. flavus DA2 có khả năng cạnh tranh cao và đã thay thế các
chủng A.flavus sinh aflatoxin tồn tại tự nhiên trong đất trồng lạc ở các lô thí
nghiệm, vì vậy đã làm giảm rõ rệt mật độ các chủng A.flavus sinh aflatoxin
trong đất trồng lạc. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Cotty và
cộng sự khi sử dụng chủng không sinh aflatoxin A. flavus 36 để phòng chống
A.flavus và aflatoxin trên lạc, chủng này đã có tác dụng giảm 80-95% A. flavus
sinh aflatoxin trong đất trồng lạc.
Bảng 3.6 Hiệu quả giảm A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin của chủng A.
flavus DA2 trên lạc củ ở giai đoạn trước thu hoạch

Công thức thí nghiệm

Các chỉ tiêu đánh giá
Tỷ lệ hạt
nhiễm A.flavus
sinh aflatoxin
(%)
Hàm lượng
aflatoxin
trên lạc
(ppb)
Hiệu quả
giảm
aflatoxin
(%)
Lạc không sử dụng chế phNm AF 10 ± 1,95 15,24 ± 1,03 0
Lạc sử dụng 01 lần chế phNm AF 7,0 ± 1,23 9,13 ± 1,48 40,10
Lạc sử dụng 2 lần chế phNm AF 3,0 ± 0,78 5,62 ± 0,89 63,13
Lạc sử dụng 3 lần chế phNm AF 0 2,05 ± 0,72 86,55
Lạc hạt từ các mẫu lạc củ ở giai đoạn trước thu hoạch từ lô không sử dụng
chế phNm AF tỷ lệ hạt nhiễm A. flavus sinh aflatoxin trung bình là 10%, hàm
lượng aflatoxin là 15,24 ppb. Trong khi đó, lạc hạt từ các mẫu lạc củ ở giai
đoạn trước thu hoạch từ lô sử dụng 01 lần chế phNm AF có 7% hạt bị nhiễm A.
flavus sinh aflatoxin, hàm lượng aflatoxin trên lạc là 9,13 ppb, hiệu quả giảm
40,10 %. Ở lạc hạt từ các mẫu lạc củ thu thập giai đoạn trước thu hoạch từ lô sử
dụng 3 lần chế phNm AF, không phát hiện A. flavus sinh aflatoxin. Hàm lượng
aflatoxin ở lô thí nghiệm sử dụng 3 lần chế phNm AF là 2,05 ppb (Hiệu quả