Những vấn đề thường gặp trong nuôi cấy mô thực vật pps

Những vấn đề thường
gặp trong nuôi cấy mô
thực vật



1. Sự tạp nhiễm
Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm
và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô
thực vật, gây hậu quả nghiêm tr
ọng
đến hiệu suất nuôi cấy. Một số
nguồn gây tạp nhiễm như từ mẫu
cấy, thao tác trong quá trình c
ấy, từ
côn trùng như ve bét, môi trường,
dụng cụ và các máy móc thiết bị
như màng lọc của tủ cấy, hệ thống
thông khí trong phòng cấy.
- Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy
là nguồn gây nhiễm chính và đây
cũng được xem là giai đoạn khó
nhất trong vi nhân giống. Mẫu cấy
có thể là đốt thân, đỉnh sinh trư
ởng,
mẫu lá, phát hoa hay rễ non. Tuy
nhiên để mẫu sống và phát triển
trong điều kiện vô trùng thì không
phải dễ. Môi trường b
ên ngoài luôn

có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề
mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp
vẩy…. của cây mẹ, đây là nơi cư
ngụ khá vững chắc mà chất khử
trùng không dễ tiếp xúc được
chúng. Đặc biệt, vi khuẩn thường
nhiễm vào hệ thống mô mạch và
gây nhiễm môi trường sau 1 tuần
nuôi cấy. Nhiễm khuẩn trong
trường hợp này thường gây những
vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy
và quan sát rõ nhất khi xem từ dư
ới
đáy chai nuôi cấy. Vài loài vi
khuẩn thường gây
nhiễm: Acinebacter, Aerococcus,
Agrobacterium, Bacillus,
Clostridium, Curtobacterium,
Erwinia, Pseudomonas….
- Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí
lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan
trọng thiết lập quá trình nuôi cấy
sạch. Cây trồng trong nhà kính ít
nhiễm vi sinh vật hơn ngoài đồng
ruộng. Các bộ phận như r
ễ, củ, thân
bò thì thường khó làm sạch h
ơn các
bộ phận khác.
- Môi trường không khí phòng

sáng, phòng cấy gây nhiễm nghi
êm
trọng nếu không được xử lý kịp
thời, nấm thường là nguyên nhân
gây nhiễm chính trong trường hợp
này. Nấm thường tồn tại dạng bào
tử lơ lửng trong không khí, khi
phòng nuôi có nhiều người ra vào
tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật
càng nhiều. Nếu màng lọc tủ cấy
không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng
loạt ngay trong quá trình cấy.
Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công
gây nhiễm những chai môi trường
chưa sử dụng hoặc những bình đã
được nuôi 2 - 3 tháng. Các loài n
ấm
thường gặp:Aspergillus, Candida,
Cladosporium, Microsprium và
Phialophra.
- Côn trùng, đặc biệt là ve bét là
mối nguy hiểm không thua gì nấm
mốc, chúng có nhiều loài khác
nhau: Dermataphagoides
pteronyssimus, Dermataphagoides
farinae
và Tyropharus
putrescentiae
… Ve bét có thể sống
trong ống dẫn của máy điều hòa

không khí, góc phòng, dư
ới kệ nuôi
cấy. Nó hoạt động tích cực hơn
vào lúc xế chiều ở những nơi có độ
ẩm và chất hữu cơ. Vòng đời của
chúng kéo dài 2 tuần. Khi cấy, ta
thường không phát hiện nhiễm
chúng, nhưng sau vài ngày ta sẽ
thấy những rãnh đường trên bề mặt
bình nuôi cấy và trên bề mặt môi
trường, đó là đường di chuyển của
chúng. Ve bét xâm nhập vào vào
bình nuôi cấy bằng cách chui qua
các khe hở miệng bình, khi chúng
xâm nhập chúng cũng mang theo
nấm làm bình nuôi cấy vừa nhiễm
nấm và ve bét cùng lúc. Một điều
thường thấy là mẫu cấy bị thối
nhũn và chết khi chúng xâm nhập
sau khoảng 2 tuần.

2. Tính bất định về mặt di truyền

Kỹ thuật nhân giống vô tính áp
d
ụng với mục đích tạo quần thể cây
trồng đồng nhất với số lượng lớn
nhưng phương pháp cũng tạo ra
những biến dị tế b
ào soma qua nuôi

cấy mô sẹo. Những biến dị này
cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng
vào cải thiện giống cây trồng
nhưng th
ực tế có rất ít biến dị có lợi
được báo cáo. Tần số biến dị thì
hoàn toàn khác nhau và không lặp
lại (Creissen v
à Karp 1985; Fish và
Karp 1986). Nuôi cấy mô sẹo cho
biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi
đỉnh. Cây trồng bị biến dị tế bào
soma qua nuôi cấy thường là biến
dị về chất lượng , số lượng và năng
suất và biến dị này không di truy
ền.
Đến nay việc gây ra biến dị chưa
được làm sáng tỏ nhưng đư
ợc đồng
ý nhất là do thay đổi vị trí DNA.
Nhân tố thường gây ra biến dị tế
bào là số lần cấy chuyền. Số lần
cấy chuyền càng nhiều càng cho đ
ộ
biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể
nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài
(Amstrong và Phillips, 1988). Số
lần cấy chuyền ít và thời gian giữa
hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm
sự biến dị.

3.Việc sản xuất các chất gây độc
từ mẫu cấy
Thường chúng ta hay thấy hiện
tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu
làm sinh trưởng của mẫu bị ngăn
chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này
là do m
ẫu nuôi cấy có chứa các hợp
chất Tannin và Hydroxyphenol, có
nhiều trong mô già hơn trong mô
non. Các phân tử Phenol làm nâu
mẫu Cattleya là Eucomic acid và
Tyramine. Có vài phương pháp làm
giảm sự hóa nâu mẫu:
- Than hoạt tính đưa vào môi
trường giúp ngăn cản quá trình hóa
nâu hay đen, đặc biệt có hiệu quả
trên các loài phong lan
Phalaenopsis, Cattleya và
Aerides
với nồng độ thường dùng
0.1-0.3%. Tuy nhiên than hoạt tính
cũng làm chậm quá trình phát triển
của mô do hấp thu các chất kích
thích tăng trưởng và các chất khác.

- Polyvinylpyrolidone (PVP), một
chất thuộc loại polyamide hấp thu
phenol qua vòng hydrogen ngăn
chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây

trồng khác nhau.
- Giảm sự hóa nâu bằng cách cho
các chất khử quá trình oxy hóa vào
môi trường ngăn chặn quá trình
oxy hóa phenol, chất khử thường
được dùng như ascorbic acid, citric
acid, L-cystein hydrochloride,
ditheithreitol, glutathione và
mecaptoethanol
Để hạn chế ảnh hưởng phenol các
nhà khoa học đưa ra vài kỹ thuật
khi thao tác trên mẫu:
- Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô
non
- Gây vết thương trên m
ẫu nhỏ nhất
khi khử trùng
- Ngâm mẫu vào dung dịch
ascorbic acid, citric acid vài giờ
trước khi cấy
- Nuôi cấy mẫu trong môi trường
lỏng, oxy thấp, không có đèn 1-2
tuần
4. Hiện tượng thủy tinh thể
Trong nuôi cấy mô cũng thường
gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu
nuôi cấy. Khi chuyển ra khỏi bình
nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước
và tỷ lệ sống sót thấp. Dạng này
thường thấy khi nuôi cấy trên môi

trường lỏng hay môi trường bán
rắn, đặc biệt khi sự trao đổi khí
thấp, quá trình thoát hơi nước tập
trung trong cây.
Để hạn chế quá trình thủy tinh thể
một phương pháp hiệu quả nhất
được nhiều người ủng hộ là làm
giảm ảnh hưởng của hàm lượng
nước trong môi trường nuôi cấy
bằng cách tăng nồng độ đường và
tạo điều kiện môi trường nuôi
(nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí)
thích hợp.
Nguyễn Văn Hiếu
Tài liệu tham khảo:
- Dương Công Kiên (2003), Nuôi
cấy mô thực vật II, NXB Đại học
quốc gia TP. HCM
- Edwin F. George (1993), Pl
ant
Propagation by Tissue Culture
,
part 1, Exegetics Ltd., Edington,
Wilts. BA13 4QG, England.
- Trần Văn Minh (1999), Giáo
trình Công nghệ sinh học Thực vật
,
Viện sinh học nhiệt đới