ỨNG DỤNG CỦA PCR TRONG Y HỌC pot

ỨNG DỤNG CỦA PCR TRONG Y HỌC

1. KỸ THUẬT PCR (Polymerase chain reaction-Phản ứng chuỗi polymerase)
1.1. Quá trình phát hiện kỹ thuật PCR
Vào một buổi tối cuối tuần của tháng 4 năm 1983, trong lúc đang lái xe trên đường ở
gần vùng đồi núi của California, một ý tưởng loé lên trong đầu của Kary Mullis khi ông phải lùi xe
lại do chạy lố đường, hình ảnh hai làn bánh xe mới tách khỏi hai làn bánh xe cũ: «
Dùng nhiệt
độ tách sợi đôi ADN thành hai mạch đơn
». Lúc đó Kary Mullis chỉ là một nhà hoá sinh học
bình thường, đang làm việc trong một phòng thí nghiệm nhỏ.
Từ ý tưởng đó, Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase)
vào năm 1985, tạo nên một cuộc cách mạng lớn trong đời sống khoa học. Chỉ sau 8 năm (1993),
K. Mullis đã được trao giải Nobel về hoá học nhờ phát minh này.




1.2. Nguyên lý của kỹ thuật PCR
Từ một đoạn ADN chọn lọc , nó sẽ được nhân lên gấp hàng triệu lần hoặc hơn nữa trong
một thời gian ngắn. Trong thời gian này, sự sao chép ADN được tạo ra trong môi trường
in vitro

như trong quá trình phân bào.
Để tạo được quá trình này, trước tiên chuỗi ADN kép được làm nóng đến mức bị tách
thành hai nhánh đơn. Làm nguội các nhánh đơn này rồi nhờ xúc tác của enzym ADN polymerase
và các tiền chất deoxynucleotid tương ứng để nhánh ADN bổ sung được tổng hợp. Trong ống
nghiệm, quá trình này không thể tự xảy ra được mà phải có các đoạn ADN mồi (primers) sẽ tổng
hợp với những vị trí bổ sung trên hai chuỗi đơn. Các đoạn mồi khởi động đặc thù thường được
tổng hợp nhân tạo. Từ vị trí gắn của mồi khởi động, nhánh bổ sung sẽ được tổng hợp. Mồi khởi
động mang tính đặc thù riêng cho mỗi ADN có trình tự nhất định. Với mỗi loại mồi khởi động thì

chỉ ADN đặc hiệu với nó được sao chép.
Sau khi các chuỗi bổ sung đã được tổng hợp xong, hai chuỗi kép được tạo thành qua
quá trình này sẽ lại được dùng nhiệt để tách ra và quá trình tổng hợp lại được lặp lại như trên để
sản sinh ra 4 chuỗi ADN và cứ như thế tiếp diễn.
Bằng cách sử dụng một loại ADN polymerase bền với nhiệt (
Taq
polymerase), có thể
trộn lẫn bệnh phẩm với các tiền chất deoxynucleotid, mồi thử cho hai chuỗi và polymerase, sau
đó hỗn hợp này được đưa vào chu trình xử lý bằng nhiệt độ thích hợp với sự tách chuỗi, tiếp cận
của mồi và tổng hợp các chuỗi bổ sung. Trong vòng 60 phút, sự khuếch đại có thể lên đến 1
triệu lần. ADN khuếch đại sẽ dễ dàng được phát hiện bằng các phương pháp khác nhau, thông
thường nhất, bằng điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethidium bromide.
ADN polymerase chịu nhiệt đầu tiên được sử dụng có nguồn gốc từ vi khuẩn
Thermus
aquaticus
(
Taq
polymerase). Hiện nay, hầu hết
Taq
polymerase đều được trích từ
E. coli
tái tổ
hợp.



2. ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR TRONG Y HỌC
Bằng kỹ thuật PCR, từ một lượng khuôn ADN rất nhỏ như: một giọt máu, một sợi tóc
hay một tế bào… người ta có thể khuếch đại chính xác, trật tự một lượng lớn lên đến hàng triệu
bản nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản ứng. Trong công nghệ sinh học, PCR

được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN…
PCR được ứng dụng rất rộng rãi trong y học: trong chẩn đoán bệnh ung thư (tìm HPV
trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRCA 1 - BRCA 2
trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen IgH và TCRy trong u lympho
không Hodgkin, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh…), nghiên
cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)…
Trong Vi sinh học, PCR là một phương tiện hữu dụng để
phát hiện các tác nhân vi
sinh vật
gây bệnh trong các trường hợp:
* Tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan B, viêm gan C,
Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1…), các vi khuẩn (
Chlamydia
,
Legionella
,
Mycoplasma
,
Treponema pallidum
…).
* Tác nhân nuôi cấy thường quy cho kết quả chậm:
M. tuberculosis
.
* Tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh
trước đó (vd: Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất đầu…).
PCR cũng được dùng để
xác định độc tố của vi sinh vật
: Tiểu đơn vị A của độc tố
ruột không chịu nhiệt của
Escherichia coli

, và gần đây, các gen elta và elfB của
E.coli
sinh độc tố
ruột (enterofoxigenic
Escherichia Coli
, ETEC); vt1 và vt2 của
E. coli
gây chảy máu đường ruột
(enterohemorrhagic
Escherichia coli
; EHEC); eaeA và bfpA của
E. coli
gây bệnh đường ruột
(enteropathogenic Escherichia coli; EPEC); ial của
E.coli
xâm nhập đường ruột (enteroinvasive
Escherichia coli
; EIEC) và
Shigella
đã được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn đoán phân biệt
giữa các loại
Escherichia coli
gây tiêu chảy.
PCR khuyếch đại các gen nói trên đã thay thế hoặc bổ sung cho các thử nghiệm kinh điển có độ
nhậy và độ đặc hiệu kém hơn hoặc là thay thế cho các kỹ thuật phức tạp hơn.
Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT - cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây
bệnh của chúng. PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó, có thể phân
biệt một cách chắc chắn
Vibrio cholerae
gây bệnh tả thực sự với các

Vibrio cholerae
khác, thuộc
các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết;
nonagglutination, NAG).
Clostridium difficile
cũng được định loại thông qua xác định các loại độc
tố riêng biệt của chúng bằng PCR.
PCR còn được dùng để nghiên cứu về
tính kháng thuốc của vi khuẩn
. Từ trước đến
nay, tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh được xác định bằng các kỹ thuật dựa trên nuôi cấy
như kháng sinh đồ theo Kirby Bauer (khuếch tán trên thạch) và xác định nồng độ ức chế tối
thiểu (MIC - Minimal Inhibitory Concentration). Các kỹ thuật này chiếm nhiều thời gian nên khó
cho phép có định hướng điều trị kịp thời trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp. Ngoài ra, các kỹ thuật
nuôi cấy có hiệu quả phục vụ điều trị không cao đối với một số vi sinh vật, như
Mycobacterium
tuberculosis
, có thời gian tăng trưởng rất dài (nhiều tuần lễ). Với kỹ thuật PCR, người ta có thể
phát hiện nhanh tính kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh qua khảo sát gen kháng
thuốc. Ví dụ, khảo sát gen
pbp1a
và
2a
của
Streptococcus pneumoniae
bằng kỹ thuật PCR-SSCP,
kỹ thuật PCR phát hiện đột biến kháng Rifamicin ở gen rpoB , phát hiện kháng INH do thiếu gen
catalase (gen Kat G) của vi khuẩn Lao
Trong lĩnh vực ký sinh trùng, người ta dùng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lỵ amíp,
Leishmania

,
Echinococcus
,
Microsporidia
,
Giardia
,
Cryptosporidium
,
Toxoplasma gondii
…

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hoàng Minh (2001), «Một số kỹ thuật sinh học phân tử hoá sinh và vi sinh trong chẩn đoán
bệnh lao».
Tạp chí Thông tin y dược
, số 12, tháng 12 năm 2001.
2. Lê Văn Phủng (2001), «Một số ứng dụng của PCR trong vi sinh vật».
Tạp chí Y học thực hành

2001.
3. Hoàng Văn Sơn (2002), «Thành tựu mới của sinh học phân tử trong ung thư học».
Tạp chí
Thông tin y dược
, số 2, tháng 2 năm 2002, tr. 8 -10.
4. Phạm Hùng Vân (1996). «Phản ứng chuỗi polymerase (PCR), một cuộc đại cách mạng trong
sinh học phân tử».
Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh
. Số đặc biệt năm 1996, tr. 27 - 35.
5. Banavaliker J.N., Bobby Bhalotra, Sharma D.C., Manoj K. Goel (1998), «Identification of

Mycobacterium tuberculosis
by polymerase chain reaction in clinical specimens».
Ind J Tub
, 45.
15.
6. Richard Frothingham (1996), « Applications of the polymerase chain reaction to infectious
disease diagnosis ».
Ann Saudi Med1996
; 16: 657 - 665.
Review Article
.
7. Wayne W. Grody (2006), «Molecular Diagnostics Overview and Focus on Infectious Diseases:
An Expert Interview». PRIVATE
Medscape PathologyPRIVATE "TYPE=PICT;ALT=" Expert
Interview
.

ThS.BS. Mai Văn Tuấn, khoa Vi Sinh-BVTW Huế
(Tổng hợp từ các tài liệu)