Kĩ thuật di truyền pdf

1
KI THUẬT DI TRUYỀN
KI THUẬT DI TRUYỀN


2
I/ Khái niệm kĩ thuật di
I/ Khái niệm kĩ thuật di
truyền
truyền
1.Định nghĩa
Kĩ thuật di truyền là kĩ thuật
thao tác trên vật liệu di
truyền dựa vào những
hiểu biết về cấu trúc hoá
học của các axit nuclêic và
di truyền vi sinh vật.


3
2. Phương pháp
2. Phương pháp
Phương pháp được sử dụng phổ biến
hiện nay là kĩ thuật cấy gen, tức là
chuyển một đoạn AND từ tế bào cho
sang tế bào nhận bằng cách dùng
plasmit làm thể truyền.

4

II/ KỸ THUẬT CẤY GEN
GEN
(TẾ BÀO
CHO)
GEN
(TẾ BÀO
NHẬN)
Dùng PLASMIT hay
th th c khu nể ư ẩ

5


6

Plasmit laø gì ?

7

- Plasmit : Plasmit là những cấu trúc nằm trong
tế bào chất của vi khuẩn. Tuỳ loài vi khuẩn, mỗi
tế bào chứa từ vài plasmit đến vài chục plasmit.
- Plasmit chứa ADN dạng vòng, gồm khoảng từ
8.000 – 200.000 cặp nuclêôtit. ADN của plasmit
tự nhân đôi độc lập với ADN nhiễm sắc thể.

8

3. Các khâu chủ yếu của kỹ thuật cấy gen:

9

Kĩ thuật cấy gen có 3 khâu chủ yếu:
+ Tách ADN nhiễm sắc thể của tế bào cho và tách plasmit ra
khỏi tế bào.
+ Cắt và nối ADN của tế bào cho vào ADN plasmit ở những
điểm xác định, tạo nên ADN tái tổ hợp.

10

- Thao tác cắt tách đoạn ADN được thực hiện
nhờ enzim cắt (restrictaza). Các phân tử
enzim này nhận ra và cắt đứt ADN ở những
nuclêôtit xác định nhờ đó người ta có thể tách
các gen mã hoá những prôtêin nhất định. Việc
cắt đứt ADN vòng của plasmit cũng được thực
hiện do enzim cắt còn việc ghép đoạn ADN
của tế bào cho vào ADN plasmit thì do enzim
nối (ligaza) đảm nhiệm.

11

+ Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận, tạo điều
kiện cho gen đã ghép được biểu hiện.
Plasmit mang ADN tái tổ hợp được chuyển vào tế bào
nhận bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Vào tế bào nhận, nó tự nhân đôi, được truyền qua các
thế hệ tế bào sau qua cơ chế phân bào và tổng hợp

loại prôtêin đã mã hoá trong đoạn ADN được ghép.

12

- Tế bào nhận được dùng phổ biến là vi khuẩn đường ruột E.Coli.
Tế bào E.Coli sau 30 phút lại tự nhân đôi. Sau 12 giờ, 1 tế bào
ban đầu sẽ sinh ra 16 triệu tế bào, qua đó các plasmit trong
chúng cũng được nhân lên rất nhanh và sản xuất ra một lượng
lớn các chất tương ứng với các gen đã ghép vào plasmit.

13


Tế bào nhận được dùng phổ biến là vi khuẩn đường ruột
E.Coli. Tế bào E.Coli sau 30 phút lại tự nhân đôi. Sau 12 giờ,
1 tế bào ban đầu sẽ sinh ra 16 triệu tế bào, qua đó các plasmit
trong chúng cũng được nhân lên rất nhanh và sản xuất ra một
lượng lớn các chất tương ứng với các gen đã ghép vào
plasmit.

Trong kĩ thuật cấy gen người ta còn dùng thể thực khuẩn làm
thể truyền. Nó gắn đoạn ADN của tế bào cho vào ADN của nó
và trong khi xâm nhập vào tế bào nhận nó sẽ đem theo cả
đoạn ADN này vào đó.


14
KỸ THUẬT CẤY GEN
KỸ THUẬT CẤY GEN
Enzim cắt

Enzim cắt
Gắn đoạn bị cắt vào plasmit nhờ enzim nối
Chuyển đến tế bào nhận
ADN của tế
bào nhận E.coli
ADN Plasmit
tái tổ hợp
dạng vòng


15
–
Tách ADN
Tách ADN
nhiễm sắc thể của tế bào cho,tách
nhiễm sắc thể của tế bào cho,tách
plasmit ra khỏi tế bào
plasmit ra khỏi tế bào
–
C t và n i ADN của tế bào cho và ADN plasmit ắ ố
C t và n i ADN của tế bào cho và ADN plasmit ắ ố
ở những điểm xác đònh,tạo ADN tái tổ hợp.
ở những điểm xác đònh,tạo ADN tái tổ hợp.


* Cắt: Enzim cắt (restrictaza)
* Cắt: Enzim cắt (restrictaza)


* Nối: Enzim nối (ligaza)

* Nối: Enzim nối (ligaza)
–
Chuy n ADN tái t h p vào t bào nh n, tạo ể ổ ợ ế ậ
Chuy n ADN tái t h p vào t bào nh n, tạo ể ổ ợ ế ậ
điều kiện cho gen đã ghép được biểu hiện .
điều kiện cho gen đã ghép được biểu hiện .


16
SƠ ĐỒ
SƠ ĐỒ
CẤY GEN
CẤY GEN
NHỜ
NHỜ
THEÅ
THEÅ


THÖÏC
THÖÏC
KHUẨN
KHUẨN
ADN thể thực khuẩn đứt
ADN tế bào cho
Enzim nối
Chuyển đến tế bào nhận
ADN của tế
bào nhận E.coli
Enzim cắt

Enzim cắt

17

III/ PHƯƠNG PHÁP PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)
1. Nguyên tắc của phương pháp PCR:
ADN polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ AND mạch khuôn
cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt.
Mồi: đoạn AND ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuôn.
Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % ADN mạch đôi
bị tách mạch thành mạch đơn). T
m
= 4(G + C) + 2(A + T) °C
Nếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ
sung với 2 đầu của một trình tự ADN, ADN polymerase sẽ xúc tác
tổng hợp đoạn ADN nằm giữa 2 mồi.

18

2. Phản ứng PCR:

Thành phần phản ứng:
- ADN bản mẫu
- Mồi xuôi và mồi ngược
- dNTP (gồm 4 loại: dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
- MgCl
2
- Enzyme polymerase (Taq polymerase, Pfu…)

- Dung dịch đệm.
- Nước cất 2 lần (đã khử trùng)

19


Các bước của phản ứng:
Là một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
Bước 1: Biến tính (denaturation)
ADN được biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 – 95
0
C, trong
thời gian 30s – 1 phút.
Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization)
Nhiệt độ cần cho sự bắt cặp mồi với ADN mạch khuôn là T
a
(T
a
thấp hơn Tm khoảng 5
0
C).
Bước 3: Kéo dài (elongation)
Nhiệt độ được tăng lên đến 72
0
C, để ADN polymerase hoạt
động kéo dài mạch.

20

21

3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

ADN mẫu:
- ADN sạch, lượng ADN sử dụng cho PCR có khuynh hướng giảm
(khoảng 100 ng)
- Giảm lượng mẫu

hạn chế sản phẩm “kí sinh”.
- PCR có thể thực hiện trên các mẫu không được bảo quản tốt.

Enzyme :
-
Enzyme polymerase đầu tiên chịu nhiệt được tách chiết từ
Thermus aquaticus là Taq polymerase.
-
Enzyme Pfu ADN polymerase thu nhận từ vi khuẩn Pyroccus
furiosus có khả năng chịu nhiệt cao hơn, có hoạt tính 3’-5’
exonuclease.
-
Tth polymerase, tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng
phiên mã ngược khi có RNA và Mn2+, khi có ADN và Mg2+ thì
enzyme này thực hiện khuếch đại ADN.

22


Mồi và nhiệt độ lai T
a

- Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất, quyết định tính đặc hiệu của phản
ứng.
-
Khi thiết kế mồi cần chú ý: thành phần GC, khả năng bắt cặp bổ
sung giữa “mồi xuôi” và “mồi ngược”, khả năng tạo cấu trúc “kẹp
tóc”.
-
Tm của 2 mồi không cách biệt quá xa.
-
Mồi đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại và không bắt cặp
với trình tự khác trên gen.

Các thành phần khác của phản ứng:
-
dNTP: thường sử dụng ở nồng độ là 20 -200 µM đối với mỗi loại.
-
Mg
2+
: quá ít

hiệu quả nhân bản giảm
quá nhiều

tạo sản phẩm không đặc hiệu

Số lượng chu kỳ: không vượt quá 40

23

4. Ứng dụng của phương pháp PCR

-
Tạo số lượng lớn bản sao ADN

dòng hóa gene, giải trình tự, lập
bản đồ di truyền, sản xuất mẫu dò…
-
Biến đổi một trình tự ADN: thêm vị trí của enzyme cắt hạn chế,
gây tạo đột biến trên ADN, thêm trình tự promoter, trình tự gắn
của ribosome…
5. Hạn chế của phương pháp PCR
-
Ngoại nhiễm:
Xử lí: Khử trùng khu vực thao tác .
Việc thiết lập phản ứng PCR và phân tích sản phẩm được tiến
hành ở các khu vực khác nhau.
-
Nhân bản không đặc hiệu:
-
Các sai sót do Taq polymerase

24

5. Các dạng khác của PCR:
-
RT –PCR (reverse transcriptase –PCR): RNA  cADN  ADN.
-
RT – PCR (Realtime PCR – PCR định lượng): xác định hàm lượng
sản phẩm PCR tạo ra ở từng thời điểm.
Nguyên tắc: xác định hàm lượng sản phẩm dựa trên tín hiệu huỳnh
quang.

25

-
PCR nested: sử dụng nhiều hơn một cặp mồi

thu nhận sản phẩm đặc hiệu hơn.