nghiên cứu thành phần hóa học có cấu trúc từ cây ngô thù du ở Việt Nam

KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC
285
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CÓ CẤU TRÚC ALKALOIDS TỪ CÂY NGÔ THÙ DU VIỆT NAM
(EVODIA RUTAECARPA)
STUDY ON THE ALKALOID CONSTITUENTS OF VIETNAMESE
EVODIA RUTAECARPA
TRẦN MNH HNG*, MAI TH SƯƠNG SA*, V TH THƯƠNG*
DƯƠNG TH THUẤN*, NGUYN PHƯƠNG LAN*
NGUYN PHI HNG**
TÔ ĐO CƯỜNG***
TÓM TT
Ngô thù du (tên khoa học là Evodia rutaecarpa thuộc họ Cam, Rutaceae) là
một trong những dược liệu quý trong y học cổ truyền dùng để điều trị các bệnh viêm
nhiễm, sốt nóng, đau bụng… Bằng các phương pháp sắc ký, chúng tôi đã phân lập
được sáu hợp chất hóa học có cấu trúc dạng indolopyridoquinazolinone alkaloid có
tên là rutaecarpine (1), evodiamine (2), 7-hydroxyrutaecarpine (3), ketoyobyrine (4),
ketoyobyrine 16-methyl ether (5), và norketoyobyrine (6), dựa trên các đặc điểm hóa
lý, sự phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và qua sự so sánh với các công bố khoa
học trước đó. Đây là những hợp chất quan trọng trong thực vật này và là sự công bố
cấu trúc chi tiết lần đầu tiên của dược liệu Ngô thù du của Việt Nam.
ABSTRACT
Ngo-thu-du (Evodia rutaecarpa, Rutaceae) is one of the most important traditional
plant in oriental medicine. It was used as anti-inammation, anti-fever, anti-apdominal
pain, and many other diseases. In our experiment, from the fruit of E. rutaecarpa, six
natural compounds as rutaecarpine (1), evodiamine (2), 7-hydroxyrutaecarpine (3),
ketoyobyrine (4), ketoyobyrine 16-methyl ether (5), and norketoyobyrine (6), with the
chemical structure belonging to indolopyridoquinazolinone alkaloid skeleton, were
isolated. They are the main constituents of this plant and this is the rst time those
compounds have been isolated from the Vietnamese original E. rutaecarpa.
1. Gii thiu

Tên gọi: Ngô thù du (NTD) còn gọi là Ngô thù, Thù du, là quả chín phơi khô
của cây có tên khoa học là Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth thuộc họ Cam (Rutaceae)
[1]. Ở nước ta, cây thuốc được phát hiện ở tỉnh Hà Giang có tên là Xà lạp hay Ngô thù.
Trên thế giới, đặc biệt ở Trung Quốc còn các loại Ngô thù khác cũng dùng quả chín
làm thuốc như Thạch hổ Evodia rutaecarpa (juss.) Benth.var. ofcinalis (Dode) Huang
và Sơ mao Ngô thù du Evodia rutaecarpa (Juss) Benth. var. bonidieri (Dode) Huang.
Mô tả: Cây cao chừng 2.5-5.0 m. Cành màu nâu hay tím nâu, khi còn non có
* TS, và cộng sự Trường Đại Học Duy Tân
** TS, Trường Đại học Chosun Hàn Quốc
*** TS, Trường Đại học Công giáo Deagu Hàn Quốc
Bộ Giáo dục và Đào tạo - Trường Đại học Duy Tân
286
mang lông mềm dài, khi già lông rụng đi, trên mặt cành có nhiều bì khổng. Lá mọc
đối, kép lông chim lẻ. Cả cuống và lá dài độ 15-35 cm, hai đến 5 đôi lá chét có cuống
ngắn. Trên cuống lá và cuống lá chét có mang lông mềm. Lá chét dài 5-15 cm, rộng
2.5-5.0 cm, đầu lá chét nhọn, dài, mép nguyên, 2 mặt có lông màu nâu mịn, mặt dưới
nhiều hơn, soi lên ánh sáng sẽ thấy những điểm tinh dầu. Hoa đơn tính khác gốc, đa số
những hoa nhỏ tụ thành từng tán hay đặc biệt thành chùm. Cuống hoa trông to thô có
nhiều lông, màu nâu mềm. Hoa màu vàng trắng, hoa cái lớn hơn hoa đực.
Xuất xứ: Loại cây này mọc nhiều ở nhiều tỉnh của Trung Quốc như Quí Châu,
Quảng Tây, Vân Nam, Tứ Xuyên v.v.. [1, 2]. Ở Việt Nam có ở Hà Giang
Tác dụng dược lý: Vị thuốc này trong đông y thường được dùng để trị sốt nóng,
đau bụng, nôn nghịch, nuốt chua, đầu đau do quyết âm bệnh, tạng hàn, tiêu chảy, bụng
trướng đau, cước khí, sán khí, miệng lở loét, răng đau, thấp chẩn, thủy đậu [2]. Trong
một số nghiên cứu mới đây, dịch chiết của NTD có tác dụng kháng khuẩn, giảm đau
giống chất antipyrin, điều trị huyết áp cao, điều trị rối loạn vị, chữa trị các bệnh ngoài
da như eczema, viêm da thần kinh có hiệu quả [3-6]. Trong các bài nghiên cứu đã công
bố từ các tác giả Trung Quốc và Nhật Bản, thành phần hóa học chiếm khối lượng lớn
từ lá, thân, rễ và quả của NTD là các chất dạng alkaloid như evoden, ocimene, evodin,
evodol, gushuynic acid, evodiamine, rutaecarpine [6-9]. Các hợp chất này đã được thử

các hoạt tính sinh học như chống viêm, chống đông máu, chống tiêu chảy, làm tăng co
bóp cơ tim, chống béo phì và tăng khả năng miễn dịch [10-15].
Độc tính:
Nếu dùng lượng lớn NTD trong cùng một thời điểm thì sẽ gây tác dụng kích
thích thần kinh trung ương và có thể dẫn đến rối loạn thị giác, gây nên ảo giác [7, 8].
Tuy nhiên, độc tính của Evoxine rất thấp, liều chích tĩnh mạch gây chết (LD50) ở chuột
nhắt là 135g/kg [9].
Dược liệu này thường nhập của Trung Quốc vì nguồn cung cấp ở Việt Nam còn
thiếu và không được trồng và thu hái theo quy củ, luôn mang tính tự phát. Trong các
nghiên cứu của nhóm chúng tôi, dựa trên các kết quả sàng lọc sơ bộ, chúng tôi đã nhận
thấy cây NTD mọc ở Việt Nam cũng có các hoạt tính sinh học tương tự như của Trung
Quốc, do đó chúng tôi đã chọn NTD Việt Nam để nghiên cứu sâu hơn về thành phần
hóa học và tiến tới sử dụng các hợp chất này để kiểm tra hoạt tính sinh học trong điều
trị các bệnh.
2. Thiết bị, nguyên vt liu v phương php thc nghim
Để tiến hành phân tích thành phần hóa học của cây Ngô Thù Du Việt Nam, làm
cơ sở cho việc kiểm tra hoạt tính sinh học phục vụ điều trị bệnh sau này, chúng tôi đã
sử dụng một số thiết bị thí nghiệm hiện đại, một số nguyên liệu hóa chất và áp dụng
phương pháp tách chiết, cụ thể như sau:
1. Về thiết bị:
- Máy đo nhiệt Beotius: đo điểm nóng chảy
KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC
287
- Máy Jassco DIP 1000 (Tokyo, Japan): đo độ quay cực (α
D
)
- Máy UV 1201 (Japan): ghi lại Phổ UV
- Máy FRIT Impact 410 (Korea): Phổ hồng ngoại (IR) ghi dưới dạng viên nén
KBr
- Máy VG Trio Mass Spectroscopy: ghi Phổ khối MS

- Máy Q-TOF-2 (Japan): ghi phổ khối phân giải cao ion hóa bụi điện tử thức
dương HR-ESI-MS.
- Máy Brucker 400 MHz (German) với TMS là chất nội chuẩn: ghi phổ cộng
hưởng từ hạt nhân NMR
2. Về nguyên liệu:
- Bột Silicagel cỡ 70-230 và 270-400 mesh, pha đảo RP-18 gel cỡ 40-60 μm, bản
mỏng TLC Si-gel 60 F
254
được mua từ hãng Merck (German).
- Các dung môi hóa chất hữu cơ dùng cho tách chiết đều được mua từ hãng hóa
chất Daejung, Korea và ở dạng tinh khiết hoàn toàn.
- Quả của cây NTD (Fructus) được thu hái ở Cao Bằng, và được định danh
bởi Tiến sĩ Phạm Thanh Huyền, trưởng khoa Tài Nguyên Thực Vật, Viện Dược Liệu
Việt Nam (NIMM), số 3B, Quang Trung, Hà Nội. Mẫu tiêu bản quả khô NTD (a
voucher specimen) được lưu lại với mã số (TMH-0126) tại phòng lưu trữ mẫu dược
liệu, khoa Dược, Đại học Công giáo Daegu, Hàn Quôc (Catholic University of Daegu,
Kyeongbuk, Korea).
3. Phương pháp tách chiết (Extraction and Isolation)
Quả NTD được phơi khô trong bóng râm tại nhiệt độ phòng sau đó được nghiền
thành bột. Bột này (2.0 kg) được chiết nóng hồi lưu với methanol 3 lần, sau đó được
quay khô trong máy cất quay chân không để loại bỏ methanol. Lượng cao tổng thu
được tiếp theo được hòa tan vào nước cất (H
2
O) và lắc đều với các dung môi hữu cơ
n-hexane, ethyl acetate, n-buthanol. Sau khi cô đặc các phân đoạn trên thu được các
cao của từng phân đoạn tương ứng là: cao n-hexane (10.2 g), cao ethyl acetate (28.4 g)
và cao n-buthanol (61.1 g). Phần dịch nước còn lại được thu gom vào lưu trữ trong tủ
lạnh -4
o
C để tránh mốc, dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Cao n-hexane được tách sơ

bộ trên cột silica gel với hệ dung môi hexane-acetone theo tỉ lệ (50:1 ~ 1:1) thành 15
phân đoạn nhỏ, ký hiệu là H.1 ~ H.15. Từ phân đoạn nhỏ H-10, chúng tôi tiếp tục sử
dụng cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi hexane-ethyl acetate với tỉ lệ 10:1, sau đó
thu lại các phân đoạn nhỏ hơn và dùng phương pháp kết tinh lạnh để thu được hợp chất
1 (18 mg), 2 (4.6 mg), và 3 (11.2 mg). Tiếp theo, phân đoạn H-12 được đưa vào hệ sắc
ký lỏng trung áp (MPLC, Yamazhen, Japan) dùng hệ dung môi chloroform:methanol
(20:1 và 10:1) với đầu dò UV 254 nm, thu được các hợp chất 4 (2.4 mg), 5 (7.5 mg) và
6 (11.4 mg). Các hợp chất này đều được kiểm tra qua máy sắc ký lỏng cao áp HPLC
và có độ tinh sạch trên 95 %.
Bộ Giáo dục và Đào tạo - Trường Đại học Duy Tân
288
3. Kết qu v tho lun (Results and Discussion)
Cao chiết methanol của quả NTD được hòa tan trong nước và phân tách lần
lượt trong các dung môi theo tính phân cực tăng dần là n-hexane, ethyl acetate và
n-buthanol. Phân đoạn n-hexane đã được tiếp tục nghiên cứu bằng các phương pháp
sắc ký (column chromatography) hiện đại sử dụng silica gel pha thường và pha đảo
thu được sáu hợp chất tinh sạch (1–6) (Hình 1). Các chất này có phản ứng dương tính
với thuốc thử Dragendoff, chứng tỏ chúng đều là các hợp chất có chứa nguyên tử nitro
(nitrogen, N)
Hợp chất số 1: Theo phân tích trên phổ khối (ESI-MS), mũi phân tử (molecular
peak) m/z 287.1 [M]
+
ứng với công thức phân tử (molecular formula) C
18
H
13
N
3
O. Các
mũi cơ bản khác trên phổ này đặc trưng cho sự phân mảnh của hợp chất quinolone

alkaloid có chứa 3 phân tử nitro. Theo các đặc điểm trên phổ proton (
1
H NMR) và
carbon (
13
C NMR), chúng tôi thấy có sự xuất hiện của 18 phân tử cacbon (C) trong
đó có 8 methine carbon (bậc 3), là các carbon của vòng thơm (aromatic ring), và 2
methylene carbon (bậc 2), cùng với sự xuất hiện của các proton (phân tử hydro) của
vòng thơm ở các vị trí xung quanh δ
H
7.17-8.34 ppm, và 2 nhóm methylene proton nằm
trong khoảng δ
H
3.24 – 4.60 ppm. Đây là một đặc trưng của nhóm cấu trúc hóa học
có dạng indolopyridoquinazolinone alkaloid, dạng cấu trúc có chứa trong cây NTD đã
được các nhà khoa học trước đây công bố [3]. Thêm vào đó, sau khi so sánh từng vị
trí và tham khảo các bài báo đã công bố trước đó, cấu trúc số 1 được xác định tên là
rutaecarpine [3, 4, 6].
N
H
N
N
O
N
H
N
N
O
N
H

N
N
O
N
H
N O
N
H
N O
N
H
N
O
1 2
3
4
5 6
OH
MeO
Hình 1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất được chiết ra từ quả Ngô thù du (1–6).
Hợp chất số 2: Dựa trên phân tích trên phổ khối (ESI-MS), mũi phân tử (molecular
peak) m/z 307.1 [M]
+
ứng với công thức phân tử C
19
H
19
N
3
O. Các mũi cơ bản khác trên

phổ này đặc trưng cho sự phân mảnh của hợp chất quinolone alkaloid có chứa 3 phân
tử nitro (N) giống như chất số 1. Theo các đặc điểm trên phổ proton (
1
H NMR) và
carbon (
13
C NMR), chúng tôi thấy có sự xuất hiện của 19 phân tử cacbon (C) trong đó
các methine carbon (bậc 3), là các carbon của vòng thơm (aromatic ring), methylene
carbon (bậc 2), cùng với sự xuất hiện của các proton (phân tử hydro) của vòng thơm
ở các vị trí xung quanh δ
H
7.15 ~ 8.36 ppm, và 2 nhóm methylene proton nằm trong
khoảng δ
H
3.24 ~ 4.60 ppm. Đặc biệt, trên phổ cộng hưởng từ
13
C NMR còn có sự xuất
KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC
289
hiện của một đỉnh methyl carbon (CH
3
) ở vị trí δ
C
37.3 ppm và có độ dịch chuyển hóa
học δ
H
2.80 ppm (3H, s). Đây là nhóm N-methyl đặc trưng trong khung cấu trúc hóa
học dạng indolopyridoquinazolinone alkaloid. Sau khi so sánh từng vị trí và tham khảo
các bài báo đã công bố trước đó, cấu trúc số 2 được xác định tên là evodiamine [7, 9].
Hợp chất số 3: Hợp chất này có các đặc điểm trên phổ proton (

1
H NMR) và
carbon (
13
C NMR) giống như hợp chất số 1 và số 2. Tuy nhiên có một sự khác biệt lớn
là ở vị trí carbon số 7 (C-7). Trên phổ cộng hưởng từ
13
C NMR còn có sự xuất hiện của
một đỉnh hydroxy carbon (C-OH) ở vị trí 74.8 ppm, tại vị trí này, proton (H-7) có độ
dịch chuyển hóa học δ
H
6.91 ppm với hình dạng 2 mũi đôi (double doules) (1H, dd).
Đây là đặc trưng của nhóm hydroxylated carbon trong khung cấu trúc hóa học dạng
indolopyridoquinazolinone alkaloid. Dựa theo độ dịch chuyển hóa học và hằng số
ghép, hướng của nhóm hydroxy (OH) được xác định là beta (β orientation). Dựa trên
phân tích trên phổ khối (ESI-MS), mũi phân tử (molecular peak) m/z 305.12 [M]
+
ứng
với công thức phân tử C
18
H
15
N
3
O. Sau khi so sánh từng vị trí và tham khảo các bài báo
đã công bố trước đó, cấu trúc số 3 được xác định tên là 7-hydroxyrutaecarpine [7-13].
Hợp chất số 4: Hợp chất này có các đặc điểm trên phổ proton (
1
H NMR) và
carbon (

13
C NMR) giống như hợp chất số 1. Tuy nhiên có một số sự khác biệt là có
sự xuất hiện thêm một nhóm methyl có độ dịch chuyển hóa học là δ
H
2.11 ppm (3H,
s), và δ
C
31.0 ppm trên phổ cộng hưởng từ
1
H và
13
C NMR. Ngoài ra, còn có sự thay
thế nitro trong khung bằng một nhóm methine carbon (CH) ở vị trí C-13 trong khung
chính. Dựa trên phân tích trên phổ khối (ESI-MS), mũi phân tử (molecular peak) m/z
302.1 [M]
+
ứng với công thức phân tử C
20
H
18
N
2
O. Sau khi so sánh từng vị trí và tham
khảo các bài báo đã công bố trước đó, cấu trúc số 4 được xác định tên là ketoyobyrine
[15-17].
Hợp chất số 5: Hợp chất này có các đặc điểm trên phổ proton (
1
H NMR) và
carbon (
13

C NMR) giống như hợp chất số 4. Tuy nhiên có một sự khác biệt là có sự
xuất hiện thêm một nhóm methoxyl có độ dịch chuyển hóa học là δ
H
3.84 ppm (3H, s),
và δ
C
55.9 ppm trên phổ cộng hưởng từ
1
H và
13
C NMR. Dựa trên phân tích trong phổ
khối (ESI-MS), mũi phân tử (molecular peak) m/z 318.2 [M]
+
ứng với công thức phân
tử C
20
H
18
N
2
O
2
. Sau khi so sánh từng vị trí và tham khảo các bài báo đã công bố trước
đó, cấu trúc số 5 được xác định tên là ketoyobyrine 16-methyl ether [15-17].
Hợp chất số 6: Hợp chất này có các đặc điểm trên phổ proton (
1
H NMR) và
carbon (
13
C NMR) giống như hợp chất số 4 và số 5. Tuy nhiên có một sự khác biệt lớn

là ở vị trí carbon số 12 (C-12). Không có sự xuất hiện của các nhóm chức như methyl
hay methoxyl tại vị trí này, thay vào đó là một proton của vòng thơm. Dựa trên phân
tích trong phổ khối (ESI-MS), mũi phân tử (molecular peak) m/z 288.3 [M]
+
ứng với
công thức phân tử C
19
H
16
N
2
O. Sau khi so sánh từng vị trí và tham khảo các bài báo đã
công bố trước đó, cấu trúc số 6 được xác định tên là norketoyobyrine [17].
Như vậy, từ quả của cây Ngô thù du (NTD), chúng tôi đã dùng các phương
pháp sắc ký cơ bản và hiện đại để phân tích các thành phần hóa học có cấu trúc dạng
quinolone alkaloid. Theo các công bố khoa học trước đây, vị thuốc có chứa NTD
(Evodia rutaecarpa, người Trung Hoa gọi là Wu-Chu-Yu) là loại thảo dược phổ biến
được sử dụng ở Trung Quốc để điều trị đau đầu, đau bụng, xuất huyết sau sinh, bệnh