CNSHDV: Tái lập trình nhân tế bào tạo tế bào gốc Pluripotent

TÁI LẬP TRÌNH NHÂN BẰNG CÁC
NHÂN TỐ XÁC ĐỊNH
NHẰM TẠO TẾ BÀO PLURIPOTENT
Thực hiện: Bùi Thanh Long.
Lớp: ĐVH – K17
Giáo viên giảng dạy: TS. Trần Quốc Dung.
CẤU TRÚC BÀI BÁO CÁO
PHẦN I. MỞ ĐẦU
PHÂN II. NỘI DUNG
1. Các nhân tố xác định
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent
3. So sánh phương pháp sử dụng nhân tố xác định với các
phương pháp khác.
PHẦN III. KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN I: MỞ ĐẦU
Tế bào gốc phôi hứa hẹn là nguồn cung cấp tế bào cho các liệu
pháp cấy ghép tế bào, có thể trong tương lai được sử dụng để
điều trị các bệnh khác nhau và thương tích. Tuy nhiên, như
trong trường hợp cấy ghép nội tạng, từ chối miễn dịch sau khi
cấy ghép là một vấn đề vướng mắc với loại trị liệu này. Hơn
nữa, việc sử dụng các phôi người hiện nay gặp phải những khó
khăn nghiêm trọng về mặt đạo đức. Những vấn đề này có thể
được khắc phục nếu tế bào pluripotent được tạo ra từ các tế bào
soma của bệnh nhân. Có 3 phương pháp khác nhau nhằm tạo tế
bào pluripotent từ tế bào cơ thể là: phương pháp chuyển nhân,
phương pháp dung hợp tế bào và phương pháp tái lập trình
nhân bằng các nhân tố xác định. Trong phạm vi của bài tiểu
luận này chỉ xin đề cập đến phương pháp thứ 3: Phương pháp
tái lập trình bằng các nhân tố xác định.
PHẦN I: MỞ ĐẦU

Hình 1: Các phương pháp tái lập trình nhân tế bào soma
Phần II: Nội dung
1. Các nhân tố xác định
Thực tế là nhân tế bào soma có thể được tái lập trình bằng cách
chuyển vào tế bào trứng hoặc dung hợp với các tế bào gốc phôi,
điều này đòi hỏi tế bào trứng và tế bào gốc phôi phải chứa nhân
tố phục hồi. Các nhân tố phục hồi này có thể tương tác với nhau
để duy trì khả năng tạo tế bào pluripotent trong các tế bào gốc
phôi. Dưới đây là một số nhân tố thường được sử dụng trong việc
tái lập trình nhân tế bào.
Phần II: Nội dung
1.1. Oct3/4 (POU5F1).
POU5F1 là một yếu tố phiên mã thuộc nhóm POU, đặc biệt là trong các
tế bào gốc phôi,phôi sớm và các tế bào mầm, và thường được lựa chọn
là Oct3 (Okamoto et al 1990) hoặc Oct4 (Scholer et al. 1989). Vô hiệu
hóa Oct3/4, phôi sẽ chết trong tử cung của con cái mang (Nichols et al.
1998), mặc dù các phôi này có thể đạt tới giai đoạn phôi nang, nuôi
cấy in vitro các khối nội bào của hợp tử chỉ làm thay đổi sản phẩm của
phôi nang thành dòng dưỡng bào, và Oct3/4 biến các tế bào ES biệt
hóa thành các dưỡng bào, trong khi đó các tế bào đối chứng có mặt
Oct3/4 lại có thể duy trì trạng thái tế bào gốc pluripotent (Niwa et al.
2000). Tương tự như vậy, vô hiệu hóa Oct3/4 bằng siRNA trong tế
bào ES người làm cho những tế bào này biệt hóa thành dòng dưỡng bào
(Zaehres et al. 2005). Ngược lại, tăng Oct3/4 lên gấp đôi trong các tế
bào ES gây ra sự biệt hóa thành nội bì và trung bì nguyên thủy (Niwa
et al 2000). Do đó, hàm lượng Oct3/4 rất quan trọng, quyết định số
phận của các tế bào trong các tế bào ES.
Phần II: Nội dung
1.2. Sox2
Sox2 là một yếu tố phiên mã thuộc nhóm Sox (SRY-related HMG-box)

có trong các tế bào ES, phôi sớm, các tế bào mầm và tế bào gốc thần
kinh. Vô hiệu hóa Sox2, phôi sẽ chết ở giai đoạn phát triển ngoại bì
nguyên thủy (Avilion et al 2003). Hợp tử có thể phát triển thành phôi
nang với hình thái bình thường, nhưng các tế bào chưa phân hóa không
tăng lên khi phôi nang được nuôi cấy in vitro, và chỉ có lớp dưỡng bào
và nội bì nguyên thủy được tạo ra. Phá vỡ Sox2 ở các tế bào ES chuột
bằng cách loại trực tiếp có điều kiện hoặc RNAi dẫn đến sự biệt hóa rất
nhanh (Ivanova et al. 2006; Masui et al 2007). Những dữ liệu này
chứng minh rằng Sox2 là không thể thiếu đối với việc duy trì khả năng
tạo ra tế bào pluripotent trong cả phôi sớm và các tế bào ES. Một
protein thuộc nhóm Sox khác, Sox15, cũng có hàm lượng cao trong các
tế bào ES, nhưng vai trò của nó vẫn chưa được đánh giá rõ ràng
(Maruyama et al 2005).
Phần II: Nội dung
1.3. Nanog
Nanog là một protein homeobox, đặc biệt có mặt trong các tế bào
pluripotent và bên trong khối tế bào của phôi giai đoạn phôi nang
(Chambers et al 2003; Mitsui et al 2003). Vô hiệu hóa Nanog
phôi bị phá vỡ các tổ chức mô ngoài phôi tại E5.5, không thể thấy
rõ lá mặt hoặc ngoại bì nguyên thủy (Mitsui et al 2003). Thiếu
Nanog phôi nang vẫn có hình thái bình thường, nhưng khối nội
bào chỉ tạo ra các tế bào nội bì đỉnh và không có các tế bào có
nguồn gốc từ ngoại bì khi phôi nang được nuôi cấy in vitro. Tế
bào ES có thể thiếu Nanog, nhưng chúng có xu hướng biệt hóa
thành dòng nội bì ngoài phôi ngay cả khi có mặt của LIF (yếu tố
ức chế bệnh bạch cầu). Một nhóm khác báo cáo rằng ngay cả với
dị hợp tử Nanog cũng làm cho các tế bào ES không ổn định, dễ
bị tổn thương và tự động phân hóa (Hatano et al. 2005).
Phần II: Nội dung
RNAi-mediated loại bỏ Nanog đã dẫn tới sự biệt hóa đối với cả tế

bào ES ở chuột (Hough et al. 2006; Ivanova et al 2006) và người (
Hyslop et al. 2005; Zaehres et al. 2.005). Quan trọng hơn, sự có
mặt của Nanog ở các tế bào ES chuột cho phép các tế bào này tự
đổi mới khi không có LIF. Tương tự như vậy, sự có mặt của Nanog
trong tế bào ES người kích hoạt sự tăng trưởng mà không có dưỡng
bào nào (Darr et al 2006). Ngoài ra, sự có mặt của Nanog trong tế
bào ES cho thấy hoạt động tái lập trình tăng lên rõ rệt sau khi dung
hợp với các tế bào soma (Silva et al 2006). Sự biểu hiện của Nanog
được điều hòa bởi Oct3/4 và Sox2 (Kuroda et al. 2005; Rodda
et al. 2005; Wu da & Yao 2005) và bị ngăn chặn bởi p53 (Lin et al
2005), GCNF (Gu et al. Năm 2005) và TCF3 (Pereira et al 2006).
Phân tích gen kết tủa kháng nguyên trên nhiễm sắc thể chứng minh
rằng Oct3/4, Sox2 và Nanog chia sẻ nhiều gen đích ở tế bào ES ở
cả chuột và người (Boyer et al. 2005; Loh et al. 2006).
1.4. c-Myc
c-Myc là một yếu tố phiên mã mở khóa helix-loop-helix/leucine (chuổi
leucine xoắn – vòng – xoắn) liên kết với protein của chính nó, Max. c-
Myc được điều hòa bởi STAT3 (Kiuchi et al. năm 1999) và đóng vai
trò quan trọng trong việc tự đổi mới và duy trì khả năng tạo tế bào
pluripotent ở các tế bào ES chuột (Cartwright et al, 2005): sự biểu hiện
ổn định của c-Myc gây ra tự làm mới của các tế bào ES chuột mà
không cần LIF, trong khi đó, các dạng trái ngược của c-Myc gây ra sự
biệt hóa ngay cả khi có mặt của LIF. GSK3β điều hòa ngược hoạt động
của c-Myc bằng cách phosphoryl hóa phụ thuộc vào sự suy giảm của
proteasome (Sears et al, 2000). Vì vậy, c-Myc là một mục tiêu chung
cho cả LIF và tín hiệu dẫn đường Wnt. c-Myc gắn trong hệ gen ở nhiều
vị trí khác nhau (Fernandez et al . 2003; Li et al. 2003; Cawley et al.
năm 2004) đã cho chúng ta ý tưởng làm thay đổi cấu trúc nhiễm sắc
thể (Knoepfler et al 2006) và kích hoạt sự biểu hiện của một số miRNA
(O'Donnell et al 2005).

Phần II. Nội dung
1.5. Klf4
Klf4 là một nhân tố phiên mã Kruppel-like (còn được gọi nhân tố gut-
enriched Kruppel-like, GKLF) (Rowland et al 2005). Ban đầu được xác
định là một nhân tố ức chế khối u trong các bệnh ung thư đường tiêu hóa
(Zhao et al. 2004; Wei et al, 2005). Một mô hình loại bỏ có điều kiện có vai
trò hỗ trợ cho Klf4 trong bệnh ung thư đường tiêu hóa (Katz et al 2005).
Tuy nhiên, Klf4 biểu hiện quá nhanh trong ung thư tế bào biểu bì hình vảy
và bệnh ung thư vú (Foster et al 1999, 2000). Hơn nữa, sự cảm ứng của
Klf4 trong keratinocytes là cơ sở ngăn chặn sự chuyển đổi giữa 2 quá trình
phân chia và biệt hóa và bắt đầu chứng loạn sản tế bào biểu bì hình vảy
(Foster et al, 2005). Vì vậy, Klf4 được kết hợp với việc ức chế khối u và sự
phát sinh ung thư. Biểu hiện lạc vị trí của Klf4 ngăn cản sự tăng nhanh số
lượng tế bào, nhưng nếu chỉ cắt bỏ một trong các gen đích của nó, p21, là đủ
để trung hòa hiệu ứng kìm hãm tế bào của Klf4. Trong tế bào đã loại bỏ p21,
Klf4 tiến hành sự gia tăng tế bào bằng cách điều hòa p53
(Rowland et al 2005). Điều này có thể là một lý do giải thích cho chức năng
kép của Klf4 trong các bệnh ung thư.
Ngoài những biểu hiện của nó được biết đến ở đường tiêu hóa,
tinh hoàn và da, người ta còn tìm thấy Klf4 biểu hiện cao trong
các tế bào ES chuột chưa biệt hóa (Tokuzawa et al 2004). Người
ta cũng đã thấy STAT3 bất hoạt trong tế bào ES chuột làm giảm
một cách đột ngột sự biểu hiện của Klf4 và sự kìm hãm biểu hiện
của Klf4 cho phép sự tự đổi mới không phụ thuộc vào LIF
(Tokuzawa et al 2004). Một kết quả nghiên cứu khác cũng cho
biết hiệu quả tích cực của Klf4 trong sự tự đổi mới của các tế bào
ES chuột (Li et al 2005), và Klf4 đã được biết đến như là một yếu
tố kết hợp với Oct3/4 và Sox2 để kích hoạt lõi promoter Lefty1
(Nakatake et al. 2.006).
Phần II. Nội dung

Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.1. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố
Để thử nghiệm các nhân tố kích hoạt khả năng tạo tế bào pluripotent, các
nhà khoa học đã phát triển một hệ thống trong đó khả năng tạo tế bào
pluripotent có thể được phát hiện bằng sự biểu hiện của gen chỉ thị.
Fbx15 được biểu hiện một cách đặc biệt trong các tế bào ES và phôi sớm,
nhưng không cần cho sự tự đổi mới và phát triển của các tế bào ES
(Tokuzawa et al. 2003). Họ đã chèn β-geo (một sự kết hợp của gen kháng
β-galactosidase và neomycin) vào locus Fbx15 ở chuột bằng cách tái kết
hợp tương đồng. Các tế bào ES từ hợp tử tương đồng có β-geo
(Fbx15
βgeo/βgeo
) đã được đề kháng với một nồng độ cực cao của G418 (lên
đến 12 ml mg
-1
), trái lại các tế bào soma của chuột có nguồn gốc từ
Fbx15
βgeo/βgeo
đã nhạy cảm với sự lựa chọn này. Do đó, nó vẫn có thể xảy ra
ngay cả với sự cảm ứng cục bộ của khả năng tạo tế bào pluripotent cũng
làm cho các tế bào soma kháng G418 ở nồng độ bình thường (0,3 mg ml
-
1
).
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.1. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố
Họ đã đưa thêm yếu tố MEFs vào gen Fbx15
βgeo/βgeo

bằng vector
retrovirus và nuôi cấy chúng trong tế bào ES với môi trường có
chứa G418. Với bất cứ yếu tố đơn lẻ nào, cũng không thu được
khuẩn lạc kháng G418. Tuy nhiên, bằng cách kết hợp bốn yếu tố
(Oct3/4, Sox2, c-Myc và Klf4), họ đã thu được nhiều khuẩn lạc
kháng G418. Các tế bào này giống như các tế bào ES cả về hình
thái và khả năng phân chia. Hơn nữa, khi cấy vào tế bào trần của
chuột, các tế bào gốc pluripotent (iPS) được tạo ra có chứa mô sẹo
của tất cả ba lá mầm. Do đó, các tế bào pluripotent có thể được tạo
ra từ nguyên bào sợi chỉ bằng việc sử dụng một vài yếu tố xác định
(Takahashi & Yamanaka 2006).
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.1. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố
Các tế bào iPS với lựa chọn Fbx15 không góp phần tạo ra dòng
mầm hoặc trưởng thành, cho thấy sự tái lập trình của chúng chỉ xảy
ra cục bộ. Gần đây, Các nhóm nghiên cứu báo cáo rằng đã cải
thiện đáng kể chất lượng của các tế bào iPS (Maherali et al. 2007;
Okita et al. 2007; Wernig et al 2007). Cả ba nhóm nghiên cứu đều
sử dụng bốn yếu tố như nhau, nhưng Nanog được sử dụng như là
một yếu tố chỉ thị. Các tế bào iPS với lựa chọn Nanog cho thấy
nhiều mẫu gen đã biểu hiện tương tự như trong các tế bào ES hơn
khi lựa chọn Fbx15. Các tế bào iPS được cải thiện này cũng đã góp
phần tạo ra dòng mầm và trưởng thành. Những dữ liệu này cho
thấy nếu kết hợp chính xác bốn yếu tố thì có thể tạo ra các tế bào
pluripotent không hề khác biệt so với các tế bào ES.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.1. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố
Sử dụng bốn yếu tố nào để tạo ra tế bào pluripotent vẫn là một câu hỏi

khó trả lời. Trong mô hình của Yamanaka và cộng sự thì c-Myc đóng vai
trò rất quan trọng. Như là một gen giả ung thư mạnh, c-Myc góp phần
vào sự gia tăng nhanh chóng của các tế bào iPS. Ngoài ra, bằng cách gắn
vào nhiều vị trí của bộ gen và bổ sung các phức hợp histon acetylase, c-
Myc sẽ làm mở các nhiễm sắc thể (Adhikary & Eilers 2005). Tuy nhiên,
biểu hiện của một mình c-Myc trong nguyên bào sợi sẽ khiến apoptosis
hoặc thoái hóa phụ thuộc vào p53. Nhóm nghiên cứu đã chủ trương dùng
Klf4 để vô hiệu hóa hiệu ứng bất lợi của c-Myc bằng cách trấn áp p53.
Sau đó Oct-3/4 và Sox2 được gắn đến các vị trí mục tiêu của chúng và
nhằm tạo tế bào pluripotent bằng cách tăng cường gen stemness và gen
trấn áp sự biệt hóa. Gần đây Niwa và cộng sự cho thấy Klf4 cũng có chức
năng như một đồng nhân tố của Oct-3/4 and Sox2 (Nakatake et al 2006).
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.1. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố
Tuy nhiên, hiện nay chúng ta vẫn không biết liệu bốn yếu tố này có
thể tạo ra các tế bào iPS từ các tế bào soma của người hay không.
Có thể bổ sung các yếu tố để tạo ra các tế bào iPS của người,
nhưng cần thêm nhiều nghiên cứu để xác định có hay không trường
hợp này. Ngoài ra, việc sử dụng các vectơ retrovirus và các gen giả
ung thư c-Myc đặt ra mối quan tâm về sự an toàn phải được giải
quyết trước khi áp dụng đối với các tế bào iPS của người trong y
học tái tạo. Trong thực tế, chúng tôi thấy rằng khoảng 20% các con
chuột bắt nguồn từ việc lựa chọn Nanog có các tế bào iPS phát
triển khối u (Okita et al 2007). Vì thế, cần loại bỏ các c-Myc của
retrovirus trước khi ứng dụng lâm sàng.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
Tái lập trình các tế bào soma của chuột và người thành tế bào pluripotent, đã có

thể thành công với bốn yếu tố là: Oct4, Sox2, c-Myc và Klf4. Xem xét sự có mặt
không đúng chỗ của c-Myc là nguyên nhân gây ra khối u ở thế hệ con cháu thứ
2 và bản thân các retrovirus có thể xen vào các gen gây đột biến, các thế hệ của
tế bào iPS được tạo ra với một số lượng tối thiểu của các yếu tố có thể đẩy
nhanh các ứng dụng lâm sàng của phương pháp này. Người ta đã nhận thấy rằng
tế bào gốc thần kinh trưởng thành ở chuột thể hiện mức Sox2 và c-Myc nội sinh
cao hơn tế bào gốc phôi, và Oct4 ngoại sinh cùng với Klf4 hoặc c-Myc là đủ để
tạo ra các tế bào iPS từ tế bào gốc thần kinh. Những tế bào iPS được tạo ra từ
hai yếu tố tương tự như tế bào gốc phôi ở mức độ phân tử, đã góp phần vào việc
phát triển của dòng mầm, và các mẫu biến dị. Cá nhà khoa học đề xuất rằng,
trong việc tạo ra tế bào iPS, số yếu tố tái lập trình có thể được giảm xuống khi
sử dụng các tế bào soma với mức độ biểu hiện nội sinh của các yếu tố được bổ
sung phù hợp.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
Các tế bào soma của chuột và người có thể được lập trình lại thành tế bào
iPS thông qua sự biểu hiện của một tập hợp các yếu tố xác định (Oct4,
Sox2, c-Myc và Klf4, cũng như Nanog và LIN28 của người). Có thể tạo
ra các tế bào iPS từ nguyên bào sợi của chuột và người khi không có c-
Myc của retrovirus, và do đó có ý kiến cho rằng biểu hiện nội sinh của c-
Myc có thể có một vai trò trong quá trình tái lập trình. Tế bào gốc thần
kinh (NSC) biểu hiện Sox2 nội sinh, có thể có chức năng trong việc duy
trì tính đa năng của NSCs, và Sox2 đã được đề xuất trong việc duy trì tế
bào pluripotent bằng cách điều hòa sự biểu hiện của Oct4. NSCs đã được
tạo ra từ việc chuyển gen Oct4-GFP (OG2)/ROSA26 của heterozygous ở
não chuột trưởng thành, protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP)
được biểu hiện dưới sự kiểm soát của promoter Oct4 (Oct4-GFP) và
chuyển gen lacZ của Escherichia coli từ locus ROSA26 (ROSA26 lacZ).
Các NSCs được tạo ra có khả năng tự đổi mới và có tính đa năng.

Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
Ba sự kết hợp khác nhau của ba yếu tố cũng có khả năng tạo ra các tế bào
iPS từ NSCs: Oct4, Klf4 và c-Myc (OKM); Oct4, Klf4 và Sox2 (OKS);
và Oct4, c-Myc và Sox2 (OMS). Các nhà khoa học đã không thấy có các
tập hợp tế bào GFP1 khi kết hợp ba yếu tố mà không bao gồm Oct4. Tập
hợp tế bào GFP1 đã được quan sát thấy 1 tuần sau khi cấy truyền với sự
kết hợp OKM (Không có Sox2). Tập hợp tế bào GFP1 chỉ được hình
thành sau 14-21 ngày với sự kết hợp OKS (không có c-Myc), và đã bị trì
hoãn hơn nữa với sự kết hợp OMS (Không có Klf4). Tuy nhiên, các tế
bào iPS ba yếu tố OKM, OKS và OMS có biểu hiện gen tương tự trong
ESCs, và tất cả các loại tế bào iPS 3 yếu tố đều biệt hóa thành tất cả ba lá
mầm. Những kết quả này chỉ ra rằng tế bào iPS ba nhân tố có thể được
tạo ra trong sự vắng mặt của Sox2, Klf4 hoặc c-Myc của retrovirus trong
NSCs với sự biểu hiện nội sinh của ba yếu tố này.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
Tiếp theo họ đã đánh giá khả năng kết hợp hai yếu tố để tạo ra các
thế hệ tế bào iPS từ NSCs. Chỉ hai sự kết hợp được thành công
trong việc tái lập trình NSCs. Đầu tiên nhóm nghiên cứu đã quan
sát thấy tập hợp tế bào GFP1 khi nuôi cấy NSC có nhiễm Oct4 và
Klf4 (OK) và 1-2 tuần sau đó ở những NSC có nhiễm Oct4 và c-
Myc (OM). Tế bào iPS hai yếu tố OM cho thấy có biểu hiện gen
như ESC và góp phần tạo ra ba lớp mầm trong các khối u. Klf4 và
c-Myc có thể chức năng mạnh như nhau. Được biết Klf4 có vai trò
bất hoạt p53 (cũng gọi là Trp53), gen ức chế khối u, làm cho tế bào
không bị hủy diệt; Klf4 cũng kết hợp cùng với protein chuyển tín
hiệu gen gây ung thư RASV12 để kích thích sự tăng nhanh số

lượng tế bào.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
Tương tự, sản phẩm c-Myc của gen theimmortalizing, khi kết hợp
với RAS đột biến đã bộc lộ hiệu ứng gây ung thư. Nó đã được báo
cáo rằng c-Myc làm tăng hoạt động của telomerase ở NSCs, một cơ
chế có thể chịu trách nhiệm về tính bất diệt của NSCs. Bởi vì c-
Myc làm tăng tình trạng nổi khối u trong Chimaera pups, các
nghiên cứu gần đây chứng minh rằng các thế hệ tế bào iPS không
có c-Myc của retrovirus là một phát hiện đáng kể. Điều quan trọng
là việc các tế bào iPS được tạo ra từ NSCs với Oct4 và Klf4 và
không có c-Myc đưa chúng ta đến gần hơn các thế hệ của các tế
bào iPS phù hợp cho việc cấy ghép.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
Nhóm nghiên cứu đã so sánh giữa tế bào iPS hai yếu tố OK với các
tế bào iPS bốn yếu tố và ESCs. Vào ngày 14 sau khi gây nhiễm,
năm nhóm tế bào GFP1 được tách ra và nhân giống trong điều kiện
nuôi cấy ESC, ba dòng tế bào iPS hai yếu tố OK (60%) (B-2, D-7
và F-4) có hình thái không thể phân biệt với ESCs. Không có nhóm
nào hình thành từ NSCs gây nhiễm với việc điều khiển virus (MX).
Các nhà khoa học đã ước lượng hiệu quả tái lập trình từ số lượng
các nhóm tế bào Oct4-GFP1 và tỷ lệ cấy truyền với kiểm soát virus
MX-GFP trên NSCs cho tế bào iPS hai yếu tố OK và iPS bốn yếu
tố bằng chiều thời gian.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố

Qua đó, họ tính toán hiệu quả tái lập trình cho NSCs bốn yếu tố là
3,6% và 0,11% đối với các phương pháp tiếp cận hai yếu tố, so với
tái lập trình nguyên bào sợi với việc lựa chọn (<0,08%) và không
có lựa chọn (0,5%). Tải nạp với tất cả bốn yếu tố có tác động tích
cực về thời gian và số lượng các nhóm tế bào GFP1. Phân tích các
gen của virus để xác định kiểu gen nhờ phương pháp khuếch đại
gen (PCR). Các gen virus của tất cả bốn yếu tố được phát hiện
trong các tế bào iPS bốn yếu tố, trong khi các tế bào iPS hai yếu tố
OK chỉ chứa gen Oct4 và Klf4.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
Tế bào iPS hai yếu tố OK bắt màu rõ với SSEA-1 và alkaline
phosphatase, và bộc lộ các mẫu gen chỉ thị ở ESC tương tự như trong các
tế bào iPS bốn yếu tố và ESCs. Kết quả định lượng PCR theo thời gian
thực (qRT-PCR) chứng minh rằng biểu hiện nội sinh của Oct4, Sox2, c-
Myc và Klf4 trong tế bào iPS hai yếu tố OK là có thể so sánh được với
ESCs, và cho thấy sự im lặng của các bản sao virus trong tế bào iPS hai
yếu tố OK với sự giảm 1.000 lần sau 30 ngày. Ngoài ra, trong các tế bào
iPS bốn yếu tố, mức độ biểu hiện nội sinh cũng tương tự như trong ESCs,
và các gen chuyển đã hoàn toàn im lặng. Biểu hiện toàn bộ gen của iPS
hai yếu tố cũng tạo thành đám như ESCs và iPS bốn yếu tố. Phân tích
biểu đồ tán xạ của vi dàn DNA chứng minh sự giống nhau giữa các tế
bào iPS hai yếu tố và ESCs cao hơn sự giống nhau giữa các tế bào iPS
hai yếu tố và NSCs. Như vậy, tế bào iPS hai yếu tố (Dòng F-4) dường
như rất giống với ESCs chuột ở mức độ chuyển toàn bộ.