cong nghe pcr

KỸ THUẬT PCR
Polymerase Chain Reaction
Sự phát minh ra kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR hay còn đ ợc gọi là phản ứng
chuỗi trùng hợp polymeraza đ ợc Kary Mullis
phát minh vào năm 1983.

Hai năm sau (1985), phát minh này đ ợc chính
thức công bố trên tạp chí khoa học quốc tế.

Bằng công trình này, Kary Mullis đ ợc tặng giải
th ởng Nobel Hoá học năm 1993.
Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng đ ợc coi là
một b ớc ngoặt hay một kỹ thuật mang tính cách
mạng !thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ Sinh
học hiện đại .( J. Watson)
Phơngphápnàycóđộnhạyrấtcaovàngàynayđãtrở
thànhmộtcôngcụnghiêncứuđầutaytrongphầnlớncác
phòngthínghiệmcóliênquanđếngenvàADNthuộccác
lĩnhvựckhoahọcsinhhọc,nôngnghiệp,môitrờng,ytế,d
ợcphẩm,phápy
Khỏi nim
Kỹ thuật PCR là một ph ơng pháp cho phép
nhân nhanh số l ợng lớn một đoạn ADN.
Sự tái bản DNA trong cơ thể
sống
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzym ADN
polymeraza để nhân bản một đoạn ADN nhờ hai đoạn
mồi oligonucleotít (primer) t ơng hợp với hai đầu 3 ở hai

mạch đơn của đoạn ADN
Kỹ thuật này đợc phát minh nhờ sự phát hiện ra Taq
polymerase,làmộtDNApolymerasetừvikhuẩnThermus
aquaticussốngởsuốinớcnóng
C¸c yªu cÇu cÇn thiÕt cho PCR

2 måi tæng hîp oligonucleotide
(mçi måi cã kho ng 20-50 ả
nucleotide) ( u 3' OH t do)đầ – ự

ADN khuôn

DNA polymerase chÞu nhiÖt (Tag-
polymerase)

4 lo¹i nucleotide dNTP's: A, T,
G, C

Mg
++
, dung dịch đệm, pH, etc.
Cỏc giai on trong phn ng PCR
Có 3 giai đoạn chính trong 1 phản ứng PCR và chúng đ ợc
lặp lại từ 20-40 lần. Việc này đ ợc tự động hóa nhờ
Thermo cycler, là thiết bị có khả năng làm tăng và giảm
nhiệt độ của ống phản ứng trong thời gian rất ngắn
1. Giãn xoắn (denaturation): Hai sợi của chuỗi xoắn kép đ ợc
tách ra nhờ nhiệt độ cao (94-95
o
C).

2. Gắn primer (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng đ ợc
giảm xuống (55-60
o
C) để các primer gắn vào các sợi ADN
t ơng ứng theo nguyên tắc bổ sung của các bazơ nitơ.
3. Kéo dài mạch bổ sung ADN (DNA extension): Phản ứng
trùng hợp phân tử ADN đ ợc thực hiện nhờ enzym ADN
polymeraza (65-75oC) để kéo dài mạch bổ sung theo
nguyên tắc bổ trợ với sợi khuôn từ đầu 3 đến 5 .
1 0
2 0
3 2
4 4
5 8
6 16
7 32
8 64
9 128
10 256
11 512
12 1024
13 2048
14 4096
15 8192
16 16.384
17 32.768
18 65.536
19 131.072
20 265.144
21 524.288

22 1.048.576
23 2.097.152
24 4.194.304
25 8.388.608
26 16.777.216
27 33.544.432
Gắn mồi vào
chuỗi DNA
(30-65
o
C)
30 giây
Tách thành sợi
đơn DNA
(94
o
C, 30 giây)
Tổng hợp
chuỗi mới
(65-75
o
C, 2-5
phút)
Khuôn DNA được biến đổi
thành 2 sợi đơn
(94
o
C, 5 phút
Chu
trình

PCR
Chu kỳ phản ứng PCR
Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 b ớc đ ợc lập đi lập lại nhiều
lần. Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu đ ợc hàng triệu
bản copy của một đoạn ADN nào đó, đủ cho các mục đích
thí nghiệm khác nhau.
Hỗn hợp phản
ứng PCR
GĐ1
GĐ2
GĐ3
Bắt đầu chu kỳ mới (2)
Nhắc đi nhắc lại n chu kỳ
Thời gian (phút)
Nhiệt độ (oC)
Cycling Program
Step 1: 94
o
C for 30 sec
Step 2: 94
o
C for 15 sec
Step 3: 55
o
C for 30 sec
Step 4: 72
o
C for 1.5
min
Step 5: Go to step 2 for

35 times
Step 6: 72
o
C for 10 min
Step 7: 4
o
C forever
Step 8: END
PCR-Chu kỳ 1
PCR-Chu kỳ 2
PCR-Chu kỳ 3
Tốc độ tổng hợp ADN của phản ứng
PCR
Sợi ADN khuụn
Đoạn gen cần
nhân bản
Chu kỳ thứ
1
Chu kỳ thứ
2
Chu kỳ thứ
2
Chu kỳ thứ
3
Chu kỳ thứ
4
2
1
=
2 bản

sao
2
2
=
4 bản
sao
2
3
=
8 bản
sao
2
4
=
16 bản sao
Chu kỳ thứ
35
2
35
= 34 triệu bản
sao
Số phân tử ADN đ ợc tổng
hợp tăng theo hàm số mũ

Tốc độ tổng hợp đoạn DNA mục tiêu
được tính bằng công thức (2
n
- 2n)x
n = số chu kỳ

x = số bản sao của DNA khuôn
C¸c thao t¸c sau PCR

Sau khi ch¹y PCR, sản phÈm ® îc nhËn biÕt b»ng
c¸ch ch¹y ®iÖn di trªn gel
Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của PCR
- Nồng độ DNA khuôn, nucleotides, cations (đặc biệt
Mg
2+
) và enzyme polymerase
- Tỷ lệ bắt cặp sai của polymerase (Taq, Vent exo, Pfu)
- Thiết kế mồi
Mg2+ ions:

Hình thành phức chất ở dạng hòa tan với dNTP's giúp
dNTP có thể liên kết lại với nhau

Tăng cường hoạt tính trùng hợp của polymerase

Tăng Tm của sự tương tác giữa mồi và DNA khuôn (i.e.
ổn định tương tác giữa mồi và DNA khuôn)
Thông thường,

Nồng độ Mg2+ thấp thì làm giảm hiệu suất nhân của PCR

Nồng độ Mg2+ cao dẫn đên sự tích lũy các sản phẩm
không đặc hiệu (sự bám sai vị trí của mồi- mispriming).
Một số nh ợc điểm của
Taq
polymeraza

Thiếu chức năng sửa chữa lỗi trong quá trình
tổng hợp phân tử ADN mới

Có thể lắp ghép nhầm dNTP vào sợi khuôn
không theo nguyên tắc bổ trợ (xác suất thấp),
dẫn đến có lỗi về trình tự trong một số tr ờng
hợp.
Một số DNA polymerases chịu nhiệt
khác

Stoffel fragment: là tag polymerase (61kD) nh
ng có thể hoạt động ở nhiệt độ cao gấp 2 lần
so với tag tự nhiên

Một số enzym mới đ ợc phát triển gần đây, nh
Tli-
và
Pfu-
polymeraza, có độ chính xác cao
hơn nh ng tốc độ tổng hợp ADN và hiệu suất
phản ứng PCR không cao bằng
Taq
-polymeraza.

Recombinant
Taq
polymerase
có tính đồng nhất cao độ phân gi i cao hơn.
Những lưu ý khi thiết kế mồi

Tính đặc hiệu (Specificity)
Dặc hiệu cho trình tự mục tiêu
cần nhân (tránh lai không đặc
hiệu)
Tính ổn định (Stability)
Hình thành dạng sợi đôi
bền vững với DNA khuôn
trong PCR
Tính tương thích(Compatibility)
Mồi được dùng như một
cặp nên cần hoạt động
được trong cùng điều kiện
PCR
Tính duy nhất (Uniqueness)
Độ dài
Nhiệt độ gắn mồi
Sự phù hợp của cặp mồi
Nội cấu trúc
Thành phần các Base
Tính tự ổn định (Internal Stability)
Các đặc trưng của mồi :
Lưu ý khi thiết kế:
Nhiệt độ nóng chảy
Chiều dài mồi

Qu¸ ng¾n ko ®Æc
hiÖu.

Qu¸ dµi gi¶m hiÖu
qu¶ lai


Th êng tõ 18-25
Mồi cần tránh các trình tự tương đồng/bổ
sung
Hàm lượng G/C
-
Nên có 45- 60% G/C
-
Không nên chứa PolyG hoặc PolyC  tăng tính bắt cặp kông đặc hiệu của mồi
Trình tự đầu cuối 3’
-
Vị trí kết thúc ở đầu 3' của mồi có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự
bắt cặp nhầm của mồi
-
Việc có G hoặc C làm tăng việc bắt cặp chính xác ( liên kết hydrogen của gốc
G/C lớn hơn)
Công thức tính Tm của mồi:
*Các mồi có kích thước ít khác nhau, có T
m
gần
giống nhau  tăng hiệu quả của PCR
Đối với mồi
≤
20bazơ thì nhiệt độ gắn mồi
Tm = [2 x (tổng số A + T) + 4 x (tổng số A + T)]0C
VD: CAGCAAATATCTGTCCTTAC ==> Tm = 2x12+4 x 8
= 560C
Đối với mồi
>
20 - 35bazơ thì nhiệt độ gắn mồi


Tm = 22 + 1,46 [2 (tổng số G+C) + (tổng số A + T)]0C
Đối với mồi
>
35 – 70 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi

Tm = 81,5 + 16,6lgC+ + 0,41 (%tổng số G+C) - 600/l

C+: nồng độ cation hoá trị một (Na+) tính theo M, l: chiều
dài mồi.

Cần xác định Tm lý thuyết rồi thử nghiệm tìm Tm tối ưu.