Bai giang tin sinh hoc 3

THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI
TRONG PHẢN ỨNG PCR
BẰNG FASTPCR VÀ
DNA CLUB
Mục tiêu của bài học

Thiết kế được những trình tự primer cho những
trình tự DNA khuôn (vi sinh vật, virus và các động
vật khác)

Phân tích được những thông số của primer qua
các phần mềm
Tìm ki m trình t sinh h cế ự ọ
2
Quá trình sao chép DNA trong tế bào
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
3
Qui trình phản ứng PCR
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
4
Các vi sinh
vật,
động vật
Thu nhận mẫu
Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được Mullis và
cộng sự mô tả vào năm 1986 và cũng do
chính phát minh này Mullis đã được trao
giải nobel vào năm 1993
Thành phần trong phản ứng PCR
Phản ứng PCR được thực hiện khi có:


DNA mẫu

Primers (mồi xuôi và ngược dài khoảng 18-30 bp không
bắt cặp bổ sung )

Taq polymerase ( emzyme chịu nhiệt tách từ vi khuẩn
suối mước nóng Thermus aquaticus )

4 loại deoxiribomucleotid triphọtphat (dATP , dCTP,
dTTP , dGTP) ,

Dung dịch đệm và Mg2+
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
5
MÁY PCR
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
6
PCR là một kỹ thuật duy nhất để
khuếch đại một mẫu DNA mong muốn
khuếch đại (ví dụ những đoạn gene
của vi sinh vật, vi khuẩn hay những
đoạn gene của người và những động
vật khác)
Nguyên tắc trong phản ứng PCR
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
7
Biến tính
Bắt cặp
Kéo dài
Nguyên tắc trong phản ứng PCR

Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
8
Phản ứng PCR gồm có 3 giai
đoạn:
• Biến tính DNA mẫu T=94
0
C
• Bắt cặp mồi Tm = 55
0
C-65
0
C
• Giai đoạn kéo dài, tổng hợp
DNA mới T kéo dài =70
0
C
Mục đích, nguyên tắc

Mồi là những đoạn nucleotide ngắn, bắt cặp bổ sung với
đầu 5' hay đầu 3' của mạch DNA khuôn mẫu. Mồi được
thiết kế dựa vào 2 vùng trình tự đã được biết, nằm ở hai
đầu của đoạn gen cần khuếch đại.
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
9
Forward primer
Reverse primer
Đoạn DNA cần khuếch đại
Primer là gì?

Primer là một đoạn ngắn oligonucleotide nó là khả

năng bắt cặp bổ sung với DNA khuôn

Primer sẽ bắt cặp với đoạn DNA khuôn (DNA mục
tiêu) cần khuếch đại số lượng lớn DNA
10
Tìm ki m trình t sinh h cế ự ọ
Đặc tính của primer
1. Tính chuyên biệt

2. Tính ổn định nhiệt độ của phản ứng
3. Tính tương thích cặp primer
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
11
Tính chuyên biệt

Chỉ có duy nhất một vị trí bắt cặp của primer trên
khuôn DNA.

Primer càng dài thì nó càng thể hiện tính duy nhất và
nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ bắt cặp càng cao. Để
đảm bảo tính duy nhất chiều dài của primer 17-28
base.

Thành phần (G+C) trung bình khoảng từ 50-60% sẽ
cho ta nhiệt độ lai
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
12
Template DNA
5’ TCAACTTAGCATGATCGGGTA GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA 3
’

GTTGAACGTA GTTGAACGTA
CAGTCAACTGCTAC
Tính chuyên biệt
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
13
Tỷ lệ G/C trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệt
độ lai thích hợp
Nhiệt độ của primer
1. Nhiệt độ nóng chảy:
Tmealt: Nhiệt độ nóng chảy là nhiệt độ của mồi khi chưa
bắt cặp với DNA khuôn Tmprimer=59.9+0.41*(%GC)-600/
(chiều dài nucleotide) khi mồi chưa bắt cặp với DNA,
thường nhiệt độ nóng chảy từ 55-65
0
C.
2. Nhiệt độ bắt cặp:
Tanneal:Là nhiệt độ của đoạn mồi bắt cặp với DNA
khuôn
Tanneal= Tm-primer -4
0
C
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
14
Tính ổn định

Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm và nhiệt độ bắt cặp của
mồi T anneal là hai yếu tố quan trọng để đảm bảo phản
ứng PCR thành công và thu được sản phẩm khuếch đại
(một số lượng lớn bản sao của đoạn DNA dùng làm
khuôn ban đầu).


Việc tính toán bằng phương pháp thủ công để kiểm tra
các yêu cầu trên cho mỗi đoạn mồi dự định thiết kế là
rất tốn thưòi gian và công sức. Công việc này trở nên dễ
dàng và nhanh chóng nhờ các phần mềm thiết kế mồi.
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
15
Tính ổn định
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
16
Cấu trúc kẹp tóc
Thiết kế mồi
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
17
Trình tự DNA
khuôn
Các qui tắc
chọn primer
Thông số của
phản ứng PCR
Thiết kế
Primer
1. Lấy các thông
số từ phần
mềm
2. Kiểm tra đặc
hiệu của
Primer bằng
blast

Làm thế nào để biết trình tự khuôn

Giải trình tự DNA hoặc RNA của các sinh vật (chúng
ta sẽ biết tự nucleotide của sinh vật) từ đó thiết kế
phản ứng mồi theo trình tự đã giải.

Chúng ta có thể lấy trình tự nucleotide của các sinh
vật trên cơ sở dữ liệu NCBI rồi từ đó thiết kế những
primer qua những phần mềm thiết kế PCR
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
18
Trình tự DNA khuôn
- Trình tự đích quan trọng trong phát hiện vi sinh vật
- Trình tự vừa có vùng bảo tồn cao cho một nhóm vi sinh
vật và vừa có vùng biến động đặc trưng cho từng loài
riêng biệt

Ví dụ 1: Các loài Ecoli co gen mã hóa ngoại độc tố: ST (heat
stable) và heat labile (LT) bảo tồn cao
Ví dụ 2: Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enteropathogenic
E. coli (EPEC), Enteroinvasive E. coli (EIEC),
Enterohemorrhagic E. coli (EHEC), Enteroaggregative E.
coli (EAEC) chọn ra những gene đặc trưng cho từng loài
ETEC, EPEC, EIEC và EHEC.


19
Tìm ki m trình t sinh h cế ự ọ
Tính tương thích


Mồi làm việc theo cặp, mồi xuôi và mồi ngược. Chúng
sử được sử dụng trong cùng điều kiện của phản ứng
PCR.

Một đặc điểm phải chú ý nhất về sự hòa hợp này là
nhiệt độ bắt cặp (Tanneal)

Nhiệt độ này thể hiện sự tương thích giữa mồi xuôi và
mồi ngược
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
20
Các thông số phản ứng PCR qua phần mềm
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
21
GC 45-55%
Tm: 55-
65
o
C
C u trúc k p tócấ ẹ
T b t c pự ắ ặ
Nh p trình ậ
t DNA ự
Nhập trình tự mồi
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
22
Thu nhận Gene PMWAV qua mã số truy cập
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
23
DNA club

Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
24
Bước 1: Nhập trình tự
DNA club
Gi i thi u môn h cớ ệ ọ
25
Bước 2: Chọn start primer selection