Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn chuỗi chế tạo KIT phát hiện nhanh virus cúm A H5N1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT







LÊ HOÀNG ĐỨC





NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN CHUỖI CHẾ TẠO
KIT PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A/H5N1


CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
MÃ SỐ: 60 42 01 14



LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội, Tháng 11-2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT






LÊ HOÀNG ĐỨC






NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN CHUỖI CHẾ TẠO
KIT PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A/H5N1

CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
MÃ SỐ: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC


NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ



Hà Nội, Tháng 11-2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà
– Trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Phó viện trưởng Viện Công nghệ
sinh học đã định hướng nghiên cứu, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi
có thể hoàn thành luận văn này.
Tôi xin được cảm ơn TS. Lê Văn Sơn, Phó trưởng phòng Công nghệ
ADN ứng dụng và TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ Tế bào
thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình
thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ của ThS. Hoàng Hà cùng
tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thực vật và phòng Công nghệ ADN
ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã dành cho tôi trong suốt quá trình
làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Đào tạo, Ban lãnh đạo Viện Sinh thái &
Tài nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, các thầy cô giáo
đang công tác tại Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh

vật đã tạo điều kiện và tận tình giảng dạy cho tôi trong suốt khóa học.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân
thành tới những người thân trong gia đình và bạn bè – những người luôn động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.
Hà Nội, ngày tháng năm 2013


Lê Hoàng Đức


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất
kỳ công trình nào khác.
Tác giả


Lê Hoàng Đức





Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về virus cúm A 3
1.1.1. Giới thiệu về bệnh cúm 3
1.1.2. Cấu trúc chung của virus cúm A 3
1.1.3. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A 4
1.1.4. Lịch sử bệnh cúm A 6
1.1.5. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới và tại Việt Nam 7
1.1.6. Các phương pháp chẩn đoán virus cúm A/H5N1 10
1.2. Kháng thể đơn chuỗi và kỹ thuật phage display 11
1.2.1. Kháng thể 11
1.2.2. Kháng thể đơn chuỗi 12
1.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng của kháng thể đơn chuỗi 13
1.2.4. Kỹ thuật phage display 14
1.2.4.1. Giới thiệu chung về kỹ thuật phage display 14
1.2.4.2. Filamentous phage M13 14
1.2.4.3. Tạo thư viện phage display 16
1.3. Kỹ thuật ngƣng kết ứng dụng trong chẩn đoán 18
1.3.1. Hạt latex 19
1.3.2. Một số nghiên cứu ứng dụng hạt latex trong chẩn đoán 20
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Vật liệu 21
2.2. Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 23
2.2.1. Hóa chất 23
2.2.2. Thiết bị máy móc 27
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu 27
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


2.3.1. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng HB 2151 bằng sốc nhiệt
27
2.3.2. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony PCR) 28
2.3.5. Phương pháp tinh sạch kháng thể đơn chuỗi sử dụng sắc ký ái lực 30
2.3.6. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 31
2.3.5. Phương pháp lai Western blot 32
2.3.6. Phương pháp đo nồng độ protein bằng máy đo quang phổ 33
2.3.7. Phương pháp chế tạo bộ kit phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 dựa trên
tính ngưng kết của hạt latex đã gắn protein lên bề mặt 34
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Biểu hiện và tinh sạch kháng thể đơn chuỗi VH10 38
3.1.1. Tạo chủng E. coli HB2151 biểu hiện kháng thể VH10 tái tổ hợp 38
3.1.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện kháng thể đơn chuỗi VH10 43
3.1.3. Tinh sạch kháng thể đơn chuỗi VH10 46
3.2. Thử nghiệm tạo kit phát hiện nhanh cúm A/H5N1 theo nguyên lý
ngƣng kết miễn dịch 47
3.2.1. Chuẩn hóa lượng kháng thể gắn lên bề mặt hạt latex 47
3.2.2. Xây dựng phương pháp chẩn đoán virus cúm A/H5N1 bằng phán ứng
ngưng kết hạt latex 49
3.3. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và thử nghiệm bộ kit latex 52
3.3.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit latex 52
3.3.2. Đánh sự hoạt động của bộ kit latex với các mẫu thực địa 55
CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
KẾT LUẬN 57
KIẾN NGHỊ 58

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
bp
: base pair
cDNA
: Complementary DNA
DNA
: Deoxirybonucleotide acid
E. coli
: Escherichia coli
EDAC
: 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide
EDTA
: Ethylenediaminetetraacetic acid
IPTG
: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Kb
: Kilo base
kDa
: Kilo Dalton
LB
: Luria-Bertani
OD
: Optical Density
PBS

: Phosphate buffered saline
PCR
: Polymerase Chain Reaction
PVDF
: Polyvinylidene difluoride
RNA
: Ribonucleotide acid
scFv
: Single-chain variable fragment
SDS
: Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE
: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
TAE
: Tris-acetate-EDTA
TBS
: Tris Buffered Saline
TEMED
: N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine
WHO
: World Health Organization

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. (A) Các dạng hình thái của virus cúm A được nhuộm âm tính trên kính hiển vi điện
từ truyền qua. (B) Cấu trúc vủa virus cúm A 4
Hình 1.2. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của virus
cúm A 6
Hình 1.3. Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể 11
Hình 1.4. Các protein cấu thành virion của M13 15
Hình 1.5. Chu kỳ sống của phage M13 trong E. coli 15
Hình 2.1. Sơ đồ vector pTI2+/VH10 21
Hình 2.2. Quy trình gắn protein lên bề mặt hạt latex 33
Hình 3.1. Kết quả biến nạp vào tế bào E.coli HB 2151 38
Hình 3.2. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR dùng mồi đặc hiệu (pTI-NcoI-F và pTI-
NotI-R) từ dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc. 38
Hình 3.3. Hình ảnh điện di protein tổng số của tế bào E. coli HB2151 mang gen mã hóa cho
các cấu trúc kháng thể đơn chuỗi VH10 40
Hình 3.4. Kết quả lai Western blot kiểm tra protein tổng số của tế bào E. coli HB2151 mang
vector pTI2+/VH10 với kháng thể anti polyhistidin. 41
Hình 3.5. Hình ảnh điện di protein VH10 được biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau. 42
Hình 3.6. Hình ảnh điện di protein VH10 được cảm ứng biểu hiện ở các nồng độ IPTG khác
nhau 43
Hình 3.7. Hình ảnh điện di protein VH10 được cảm ứng biểu hiện ở các thời gian
khác nhau 44
Hình 3.8. Hình ảnh điện di kiểm tra tính tan của protein VH10 45
Hình 3.9. Hình ảnh điện di protein VH10 sau khi tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực His-tag. 45
Hình 3.10. Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên H5 với hạt latex được gắn với 100, 200
và 400 g kháng thể đơn chuỗi VH10. 46

Hình 3.11. Mô hình kiểm tra tính ngưng kết của hạt latex đã gắn protein lên bề mặt 48
Hình 3.12. Kết quả phản ứng ngưng kết soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại 10×10. 49
Hình 3.13. Hình ảnh bộ kit latex chẩn đoán virus cúm gia cầm H5N1 50



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thống kê số lượng người bị nhiễm và chết do cúm A/H5N1 từ năm 2003-2013 8
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu bệnh phẩm sử dụng trong nghiên cứu 22
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng colony PCR 23
Bảng 2.3. Công thức pha gel cô và gel tách 25
Bảng 2.4. Công thức tính độ nhạy và độ đặc hiệu 33
Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm bộ kit latex với các mẫu nước trứng 50
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit latex 52
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp ngưng kết hồng cầu 52
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu với kháng nguyên H5 của bộ kit latex 53
Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm bộ kit latex phát hiện virus cúm A/H5N1 với các
mẫu thực địa 54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cúm gia cầm (Avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở mọi
loài chim, kể cả gia cầm và thủy cầm, do các phân type (subtype) của nhóm
virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên. Virus cúm
A được chia thành các phân nhóm dựa trên hai glycoprotein bề mặt là
hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). HA được chia thành 16 phân nhóm
(từ H1 đến H16) và NA được chia thành 9 phân nhóm (từ N1 đến N9). Trong số
16 phân nhóm của virus cúm A, các chủng trong phân nhóm H5 và H7 có thể
gây ra thể cúm gia cầm độc lực cao, có khả năng lây lan mạnh, tử vong nhanh
ở những loài lông vũ cảm nhiễm. Hầu hết các virus cúm gia cầm có ảnh
hưởng đến người thường gây ra các triệu chứng đường hô hấp nhẹ hoặc viêm
kết mạc mắt, trừ một ngoại lệ là chủng H5N1. Virus cúm A/H5N1 là thể độc
lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây bệnh nặng với tỷ lệ tử
vong cao ở người trong các vụ dịch diễn ra vào năm 1997 và năm 2003.
Theo số liệu của Tổ chức y tế thế giới (WHO), từ năm 2003 đến tháng 6
năm 2013 đã có 375 người tử vong do cúm gia cầm trong số 630 ca nhiễm
H5N1 tại 15 nước. Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 bắt
đầu xuất hiện từ những tháng cuối năm 2003, đã có 62 ca tử vong trong số 125

người nhiễm cúm gia cầm. Đồng thời, bệnh cúm gia cầm cũng là nguyên nhân
làm hàng chục triệu con gia cầm bị chết hoặc bị tiêu huỷ gây thiệt hại kinh tế
nặng nề cho ngành chăn nuôi.
Hệ gen của virus cúm A/H5N1 có cấu trúc đặc trưng của hệ gen virus
cúm A là RNA sợi đơn âm (ss(-)RNA) có độ dài tổng số khoảng 13.500
ribonucleotide, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mã hóa cho 11 protein
khác nhau của virus. Trong đó, tên gọi của virus H5N1 dựa trên 2 protein
quyết định tính kháng nguyên là hemagglutinin nhóm 5 (H5) và
neuraminidase nhóm 1 (N1).


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Để ngăn ngừa nguy cơ bùng phát đại dịch cúm, việc chẩn đoán, phát hiện
nhanh và điều trị sớm cho các trường hợp nhiễm virus H5N1 là rất cần thiết. Ở
Việt Nam, hai kỹ thuật chủ yếu được sử dụng để chẩn đoán virus cúm A/H5N1
là kỹ thuật RT-PCR (PCR phiên mã ngược) và Real time PCR (PCR thời gian
thực), tuy nhiên chỉ có một vài nơi có thể thực hiện được và quá trình thực hiện
cũng mất nhiều thời gian. Do đó, việc chẩn đoán nhanh các trường hợp nghi
nhiễm cúm A/H5N1 ở Việt Nam gặp rất nhiều khó khăn về mặt kỹ thuật. Hiện
nay, dựa trên sự tồn tại của kháng nguyên bề mặt H5, người ta có thể xác định
nhanh và chính xác sự có mặt của virus H5N1 bằng cách sử dụng kháng thể đơn
chuỗi đặc hiệu với protein kháng nguyên này.
Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
ứng dụng kháng thể đơn chuỗi chế tạo kit phát hiện nhanh virus cúm
A/H5N1”.
Mục tiêu nghiên cứu:
- Biểu hiện và tinh sạch được kháng thể đơn chuỗi VH10 tái tổ hợp đặc
hiệu với kháng nguyên bề mặt H5 của virus cúm A/H5N1 trong E. coli.

- Thử nghiệm chế tạo kit phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 theo nguyên
lý ngưng kết miễn dịch.
Nội dung nghiên cứu:
- Nghiên cứu tối ưu các điều kiện biểu hiện kháng thể đơn chuỗi VH10 tái
tổ hợp ở E. coli và tinh sạch kháng thể đơn chuỗi VH10.
- Nghiên cứu chế tạo bộ kit phát hiện virus cúm A/H5N1 theo nguyên lý
ngưng kết miễn dịch.
- Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit phát hiện nhanh virus cúm
A/H5N1 và thử nghiệm bộ kit với các mẫu thực địa.




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu



CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về virus cúm A
1.1.1. Giới thiệu về bệnh cúm
Bệnh cúm là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây theo đường hô hấp do virus
cúm gây ra. Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae bao gồm 4 nhóm: virus cúm
A (Influenza A virus), virus cúm B (Influenza B virus), virus cúm C (Influenza C
virus) và Thogotovirus. Trong đó:
Nhóm virus cúm A (Influenza A virus) thường gây nhiễm cho các loài
vật như cá voi, hải cẩu, gia súc, gia cầm và các loài chim di cư hoang dã, sau
đó tiếp xúc với con người và gây bệnh cho người [38].
Nhóm virus cúm B (Influenza B virus) thường gây nhiễm cho con người
và một số gây nhiễm cho loài hải cẩu.

Nhóm virus cúm C (Influenza C virus) gây nhiễm cho người, chó và lợn,
tuy nhiên không gây bệnh nguy hiểm trên người [67].
Nhóm Thogotovirus gây bệnh cho động vật, người và động vật không
xương sống.
Các nhóm virus được nhận diện bởi sự khác nhau trong cấu trúc kháng
nguyên bề mặt, phức hợp protein cũng như vai trò gây bệnh khác nhau trên vật
chủ. Virus cúm A và B có kháng nguyên bề mặt là protein hemagglutinin (HA)
[38], kháng nguyên bề mặt của cúm C là HEF (hemagglutinin esterase fusion
protein) [67]. Còn ở Thogotovirus, kháng nguyên bề mặt của là GP
(glycoprotein).
1.1.2. Cấu trúc chung của virus cúm A
Virus cúm A được xác định type phụ dựa vào phản ứng huyết thanh học
của các glycoprotein bề mặt HA và NA. Hiện nay, có 16 phân type của kháng


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


nguyên HA (ký hiệu H1 đến H16) và 9 phân type của kháng nguyên NA (từ
N1 đến N9). Hầu hết các hạt của virus (virion) khi soi dưới kính hiển vi có
dạng hình cầu đường kính 80 – 120 nm hoặc hình sợi dài 200 – 300 nm, đường
kính 20 nm. Phân tử lượng của một hạt virion vào khoảng 250 triệu dalton [54].
Lõi virus mang vật liệu di truyền và 3 polymerase là PB1, PB2, PB3 đều
được gắn với nucleoprotein, phức hệ này tạo thành nucleocapside.

Hình 1.1. (A) Các dạng hình thái của virus cúm A được nhuộm âm tính trên kính hiển
vi điện từ truyền qua [80]. (B) Cấu trúc vủa virus cúm A [79]
Bao quanh nucleocapside là lớp protein nền (Matrix protein), ký hiệu là
M1. Tiếp đó là màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật chủ [23], [21], [19].
Lớp vỏ virus có bản chất là lipoprotein, bao gồm những gai mấu có bản chất là

protein trần hoặc đã được glycosyl hoá gắn chặt vào lớp kép lipid nhờ các tương
tác kỵ nước. Kích thước của những gai mấu có độ dài 10-14 nm, đường kính 4-6
nm. Có khoảng 500 gai mấu chia làm 2 loại: gai HA (hemagglutinin) và gai NA
(neuraminidase) [33], [17], [40], [42].
1.1.3. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A
Hệ gen của virus cúm A/H5N1 là RNA sợi đơn âm (ss(-)RNA) có độ
dài tổng số khoảng 13.500 ribonucleotide, bao gồm 8 sợi RNA riêng biệt, mã
hoá cho 11 protein khác nhau của virus. Các phân đoạn được sắp xếp theo
trật tự: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS
(NS1 và NS2) [54]. Trong đó:
A
B


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Phân đoạn 1 mã hoá cho enzyme polymerase PB2 (polymerase basic
protein 2) là tiểu đơn vị của RNA transcriptase, chịu trách nhiệm khởi đầu
phiên mã [43].
Phân đoạn 2 mã hoá cho enzyme polymerase PB1 (polymerase basic
protein 1) là tiểu đơn vị xúc tác của RNA transcriptase [24].
Phân đoạn 3 mã hoá cho enzyme kéo dài phiên mã PA (polymerase
acidic protein 2) là tiểu đơn vị của RNA transcriptase, tham gia tổng hợp
RNA [24].
Phân đoạn 4 mã hóa cho hemagglutinin (HA), đ â y l à một kháng
nguyên bề mặt đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A, có vai trò
đặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết định
tính gây bệnh của virus. Hemagglutinin là một glycoprotein có khả năng gây
ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA

có thể ngăn cản sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết
hồng cầu (HI, Hemagglutinin Inhibitory test). Có 16 loại HA, trong đó chỉ có
H1, H2, H3 tìm thấy ở các virus gây bệnh cho người. Virus mang gen H5, H7
và H9 có thể lây nhiễm từ chim sang người. HA được phân bố rải rác trên
bề mặt của virus, là protein gắn virus vào thụ thể của tế bào, gây ngưng kết
hồng cầu và tham gia vào quá trình khởi đầu xâm nhiễm của virus. [59]
Phân đoạn 5 mã hoá cho nucleoprotein (NP) [43].
Phân đoạn 6 mã hóa cho protein neuraminidase (NA). NA là các gai hình
nấm trên bề mặt của virus, NA vừa có vai trò kháng nguyên vừa có hoạt tính
enzyme phân cắt liên kết giữa thụ thể axit sialic và HA, nhờ vậy mà đẩy nhanh
quá trình lan truyền virus trong tế bào chủ [26].
Phân đoạn 7 mã hoá cho phần đệm matrix protein MA, gồm 2 tiểu phần
M1 và M2. Tiểu phần M1 là protein nền, là thành phần chính của virus, có
chức năng bao gói và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus. Tiểu phần
M2 là protein nội màng, có chức năng là kênh ion vận chuyển sản phẩm của


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


virus [39].
Phân đoạn 8 là gen NS có độ dài ổn định trong tất cả các chủng cúm A,
mã hoá cho hai tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2. Tiểu phần NS1
có chức năng vận chuyển mRNA ra tế bào chất, dịch mã, là protein kháng
interferon và tiểu phần NS2 có vai trò vận chuyển RNA ra khỏi nhân [52].
1.1.4. Lịch sử bệnh cúm A
Virus cúm A có phổ thích ứng rộng trên nhiều đối tượng vật chủ
khác nhau như: chim, gia cầm, thuỷ cầm, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và
người (Hình 1.2).

Hình 1.2. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của virus
cúm A [78]
Trong quá khứ, virus cúm A đã gây ra hàng loạt các trận đại dịch đối với
con người như dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 do virus cúm A/H1N1, dịch
cúm châu Á năm 1957 – 1958 do virus cúm A/H2N2, dịch cúm Hồng Kông
năm 1968 do virus cúm A/H3N2.
Năm 1959, biến thể cúm A/H5N1 đầu tiên trên thế giới được phát hiện
gây bệnh trên gà tại Scotland.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Năm 1996, virus cúm A/H5N1 xuất hiện trở lại và gây bệnh ở loài ngỗng
tại Quảng Đông, Trung Quốc.
Năm 1997, dịch cúm tại Hồng Kông do virus cúm A/H5N1 được ghi
nhận là lần đầu tiên virus này gây bệnh trên người [62].
Từ cuối năm 2003 đến nay, những đợt cúm gia cầm do virus cúm
A/H5N1 đã liên tiếp xảy ra ở 15 quốc gia trên toàn thế giới. Virus gây bệnh đã
được phân lập và định type, chủ yếu là chủng H5N1 có độc lực cao.
Tháng 6/2009, WHO đã công bố đại dịch cúm A/H1N1 trên toàn thế
giới.
Tháng 3/2013, dịch cúm do virus cúm A/H7N9 gây ra đã khiến 31 người
tử vong trong số 129 người mắc virus cúm này tại Trung Quốc.
1.1.5. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới và tại Việt Nam
Virus cúm A/H5N1 thuộc phân nhóm virus cúm gia cầm có khả năng
xâm nhiễm cao. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây
bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959, đây là biến thể H5N1 đầu tiên
trên thế giới với danh pháp: A/Ck/Scotland/59 (H5N1) và có số đăng ký trong
Ngân hàng gen: X07869.

Chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ ngỗng ở Quảng Đông - Trung
Quốc) và Hồng Kông (1997) là virus cúm A/H5N1 hiện đại mới xuất hiện với
những biến đổi sâu sắc không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và
gây chết ở người. Mặc dù về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng xét về độc
lực, loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên miễn dịch và mức độ truyền
lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều biến chủng H5N1 đã được
phát hiện trước đây [42], [70].
Một chủng mới của virus cúm A/H5N1 là chủng Phúc Kiến xuất hiện
từ năm 2005 và đã trở thành chủng virus cúm gia cầm phổ biến tại nhiều
tỉnh ở Trung Quốc và lây lan sang Hồng Kông, Lào, Malaysia, Thái Lan, Việt
Nam [7], [51], [57].


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Từ cuối năm 2005, virus cúm A/H5N1 chủ yếu là các chủng virus
thuộc phân dòng Thanh Hải (Trung Quốc) bắt đầu lan sang một số nước vùng
Trung Á, Nga, Đông Âu, Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc - Trung Phi và đến nay
cũng đã được phát hiện tại Việt Nam.
Theo số liệu thống kê của WHO, từ năm 2003 đến tháng 6 năm 2013,
những đợt cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao gây ra đã liên
tiếp diễn ra ở 15 quốc gia. Đã có 630 trường hợp người bị mắc cúm A/H5N1
trên toàn thế giới, trong đó có 375 trường hợp đã tử vong. (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Thống kê số lượng người bị nhiễm và chết do cúm A/H5N1
từ năm 2003-2013
Quốc
gia

2003 -2009

Năm
2010

Năm
2011

Năm
2012

Năm
2013

Tổng
số

M
C
M

C

M

C

M
C
M
C
M

C

Azerbaijan

8
5
0

0

0

0

0

0

0
0
8

5

Bangladesh

1
0
0

0

2

0

3

0

1
1
7

1

Campuchia

9
7
1

1

8

8

3

3

11
8
322

27

Trung
Quốc

38
25
2

1

1

1

2

1

2
2
45

30

Djibouti

1
0
0

0

0

0

0

0

0
0
1

0

Ai
Cập

90
27
29

13

39

15

10

5

4
3
173

63

Indonesia

162
134
9

7

12

10

7

7

0
0
192

160

I
rắc

3
2
0

0

0

0

0

0

0
0
3

2

Lào

2
2
0

0

0

0

0

0

0
0
2

2

Myanmar

1
0
0

0

0

0

0

0

0
0
1

0

Nigeria

1
1
0

0

0

0

0

0

0
0
1

1

Pakistan

3
1
0

0

0

0

0

0

0
0
3

1

Thái
Lan

25
17
0

0

0

0

0

0

0
0
25

17

Thổ Nhĩ
kỳ

12
4
0

0

0

0

0

0

0
0
12

4

Việt
Nam

112
57
7

2

0

0

4

2

2
1
125

62

Tổng
số

468
282
48

24

62

34

29

18

20
15
630

375


Ghi chú: M: số người mắc, C: số người
chết.
Nguồn: Cumulative Number of


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/H5N1. Reported
to
WHO, June,
2013 [77].
Tại Việt Nam, dịch cúm gia lần đầu tiên bùng phát vào cuối năm 2003
tại các tỉnh phía Bắc, trong một thời gian ngắn dịch bệnh đã nhanh chóng lây
lan ra hầu hết các tỉnh thành trong cả nước, hàng chục triệu gia cầm bị chết và
tiêu huỷ, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi gia cầm [14]. Dịch
cúm A/H5N1 vẫn thường xuyên tái phát hàng năm tại nước ta. Mới đây nhất,
dịch cúm A/H5N1 đã gây bệnh trên đàn chim yến, khiến cho hàng ngàn con
chim yến đã bị chết và bị tiêu hủy [74]. Đồng thời, dịch cúm A/H5N1 cũng
đã gây thiệt hại không nhỏ về mặt con người với 125 người mắc, trong đó có
62 người đã tử vong (Theo số liệu thống kê của WHO đến tháng 6 năm 2013).
Từ những tháng cuối năm 2003, khi lần đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm
trong nước, một số cơ quan nghiên cứu như Viện Công nghệ sinh học, Viện Vệ
sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y quốc gia đã tiến hành những nghiên cứu
định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hóa của virus cúm A/H5N1. Các
gen H5, N1 và gen cấu trúc đã được xác định trình tự và công bố trên Ngân hàng
gen quốc tế [10], [15], [18]. Về nguồn gốc, virus cúm A/H5N1 lưu hành ở Việt

Nam có cùng nguồn gốc với virus cúm A/H5N1 ở Nam Trung Quốc và Hồng
Kông và đây cũng là virus cúm thuộc thế hệ mới có biến đổi cơ bản về gen H5
và gen N1[4], [5], [48], [57].
Trong những năm 2004 – 2006, các chủng virus cúm A/H5N1 tại Việt
Nam cũng đã được phân lập và nghiên cứu chi tiết về quan hệ phân tử với các
chủng trong vùng và thế giới. Các kết quả đã chỉ ra rằng, virus cúm A/H5N1
vùng Nam và Đông Nam Á thuộc clade VTM (viết tắt: Vietnam-Thailand-
Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm vùng
Trung Quốc và Hồng Kông [9], [27], [48].
Năm 2007, biến chủng H5N1 phân dòng Phúc Kiến (clade 2.3.4) đã
xuất hiện tại Việt Nam và đến nay xuất hiện clade 2.3.2, các biến chủng này có


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


tỷ lệ tương đồng kháng nguyên H5 và N1 thấp so với các chủng phân dòng
Quảng Đông [2], [4].
Những nghiên cứu dịch tễ học phân tử, chẩn đoán, vector tái tổ hợp
dẫn truyền gen kháng nguyên sử dụng adenovirus hoặc virus Lasota và chuyển
gen vào thực vật cũng được tiến hành. Một số nghiên về tạo vaccine di truyền
ngược, vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và công
nghệ tái tổ hợp sản xuất chế phẩm kháng nguyên H5 trong thực vật và tế bào
cũng được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Thú y quốc gia, Viện
Di truyền Nông nghiệp và một số cơ sở nghiên cứu khác [1], [4], [8].
Các cơ sở y tế như Bệnh viện Nhi trung ương, Viện Vệ sinh dịch tễ
trung ương, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh cũng đã có một số nghiên cứu liên
quan đến cúm A/H5N1 trên người, song song với những nghiên cứu về cúm gia
cầm ở gia cầm. [15], [47], [13]. Những kết quả nghiên cứu trên đã và đang
làm sáng tỏ thêm về dịch tễ học phân tử, phát triển tiến hoá, genotype của

các chủng cúm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam.
1.1.6. Các phƣơng pháp chẩn đoán virus cúm A/H5N1
Các phương pháp chẩn đoán virus cúm A/H5N1 thường được sử dụng
nhất hiện nay và đã được WHO công nhận [76] bao gồm: phương pháp RT-
PCR, Real time PCR, phân lập virus và xét nghiệm miễn dịch. Tuy nhiên phổ
biến nhất vẫn là sử dụng phương pháp RT-PCR do chi phí và khả năng phát
hiện được virus cúm A/H5N1. Hiện nay, nhiều công ty đã phát triển các bộ
sinh phẩm chẩn đoán H5N1 bằng phản ứng RT-PCR, hầu hết các bộ sinh phẩm
này đều hoạt động theo các bước chính như sau:
- Tách chiết RNA tổng số mẫu bệnh hoặc mẫu nghi nhiễm bệnh.
- Thực hiện phản ứng tạo cDNA từ các mẫu RNA tách chiết này.
- Tiến hành phản ứng PCR nhân bản trình tự nucleotide đặc trưng cho
virus H5N1 sử dụng các cặp mồi đã được thiết kế đặc hiệu.
- So sánh và phân tích kết quả.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Phương pháp chẩn đoán virus H5N1 dựa trên nguyên tắc ngưng kết miễn
dịch đòi hỏi nguồn kháng thể đơn dòng. Phát hiện sự có mặt của virus H5N1 theo
phương pháp này dựa trên phản ứng ELISA. Hiện nay, các kháng thể đơn dòng
đặc hiệu cho kháng nguyên H5 và kháng nguyên M1 đã được chế tạo thành công
và được ứng dụng trong chẩn đoán virus cúm A/H5N1 [50], [69]. Gần đây, một
nhóm nghiên cứu ở Nhật Bản đã nghiên cứu và đưa ra một bộ kít chẩn đoán
nhanh virus H5N1. Bộ kit này dựa trên nguyên lý kỹ thuật sắc ký miễn dịch
(immunochromatographic) và có thể phát hiện virus H5N1 trong vòng 15 phút
ngay tại giường bệnh [53]. So sánh bộ kit với phương pháp chẩn đoán bằng phản
ứng RT-PCR cho thấy độ nhạy, độ đặc hiệu là tương đương nhau, tuy nhiên ưu
điểm nổi trội của bộ kit này đó là tiến hành rất đơn giản và có thể dùng ở những

cơ sở y tế không được trang bị đầy đủ các thiết bị máy móc hiện đại.
1.2. Kháng thể đơn chuỗi và kỹ thuật phage display
1.2.1. Kháng thể
Kháng thể là một sản phẩm đặc hiệu được hệ miễn dịch tổng hợp giúp cơ
thể tấn công các tác nhân gây bệnh. Các kháng thể là các immunoglobulin (có
bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B, các tương bào (biệt hoá từ
lympho B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tác
nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus [11]. Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4
chuỗi polypeptide, gồm hai chuỗi nặng (H) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ (L)
cũng giống hệt nhau (Hình 1.3).

Kháng thể đơn chuỗi
từ vùng biến đổi của
chuỗi nặng
Kháng thể đơn chuỗi
kết hợp từ vùng biến
đổi của chuỗi nặng và
chuỗi nhẹ


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Hình 1.3. Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể [71]
Chú thích: Fab: Vùng bám kháng nguyên; Fc: Vùng cố định; Fv: Vùng biến đổi;
scFv: Kháng thể đơn chuỗi kết hợp từ vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ
Chuỗi nhẹ có trọng luợng phân tử 25 kDa, chứa khoảng 211 – 221 axit
amin. Có hai loại chuỗi nhẹ là kappa (Қ) và lambda (λ). Mỗi phân tử Ig chỉ chứa
hoặc hai chuỗi nhẹ Қ hoặc hai chuỗi nhẹ λ mà không bao giờ chứa cả hai loại.
Mỗi chuỗi nhẹ của Ig chứa hai vùng axit amin: vùng biến đổi (V

L
) nằm ở đầu
phía đầu amin (-NH
2
) của phân tử và vùng cố định (C) nằm ở phía đầu cacboxyl
(-COOH) [11], [16].
Chuỗi nặng có trọng luợng phân tử của chuỗi nặng khoảng 50 kDa, chứa
khoảng 450 axit amin. Có 5 loại chuỗi nặng là γ, µ, a, d và e ứng với 5 lớp
kháng thể IgG, IgM, IgA, IgD và IgE [16]. Mỗi chuỗi nặng có 4 vùng axit amin:
một vùng biến đổi (VH) nằm ở phía đầu amin và ba vùng cố định nằm ở phía
đầu cacboxyl ký hiệu là CH
1
, CH
2
, CH
3
. Hai vùng biến đổi của chuỗi nặng và
chuỗi nhẹ nằm kề nhau tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop do
vậy đảm bảo tính đa dạng của phân tử kháng thể [16].
1.2.2. Kháng thể đơn chuỗi
Kháng thể đơn chuỗi hay mảnh kháng thể là sự kết hợp của những vùng
khác nhau của chuỗi nặng (VH) và chuỗi nhẹ (VL) thông qua một cầu nối ngắn,
thường là serine hoặc glycine. Các mảnh kháng thể tái tổ hợp được tạo vẫn bảo
tồn hoạt tính nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích được gọi là
các mảnh scFv (Single-chain variable fragment), Fab (Fragment antigen-
binding), sdAb (single domain antibody) (Hình 1.3).
Trước đây, các kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên được tạo ra
bằng cách gây miễn dịch theo kỹ thuật lai tế bào. Ngày nay, những tiến bộ của
sinh học phân tử đã cho phép sản xuất kháng thể tái tổ hợp nhờ vi khuẩn E. coli.
Nguyên lý cơ bản để tạo ra một kháng thể đơn chuỗi gồm các bước:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


- Các gen mã hóa cho chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được khuếch đại từ tế bào
lympho B thông qua quá trình sao chép ngược và phản ứng PCR.
- Sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme giới hạn và được tách dòng. Sau đó
các gen đơn được nối với nhau bằng một mảnh DNA nối.
- Đoạn DNA mã hóa cho kháng thể đơn chuỗi sẽ được cài vào trong một
vector phagemid và phagemid tái tổ hợp này sẽ được biến nạp vào tế bào vi
khuẩn E. coli thông qua
phương pháp biến nạp bằng sốc nhiệt hay xung điện
[44], [45].
1.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng của kháng thể đơn chuỗi

Hiện nay, kháng thể đơn chuỗi scFv đã được ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh
vực. Năm 1999, Harper và cộng sự đã nghiên cứu đặc tính của kháng thể scFv
chống lại virus Potato leafroll trên khoai tây. Trong đó, scFv được gắn kết thêm
với các thành phần khác như C
L
hoặc AP nhằm tăng hiệu quả trong việc chống
lại virus Potato leafroll [36].
Năm 2003, kháng thể scFv tái tổ hợp đã được Brichta và cộng sự chế tạo
thành công với mục đích kháng lại axit 2,4-dichlophenoxyacetic (2,4-D) có
trong một số loại thuốc trừ cỏ [25].
Cheng Xinyao và cộng sự (2005) đã sản xuất kháng thể tái đơn chuỗi
scFv tái tổ hợp kháng Sunfoglucolipit, một hợp chất có nhiều trong các tế bào
gây ung thư. Những mảnh kháng thể scFv được tạo ra với kích thước nhỏ, dễ
dàng xâm nhập vào các mô khối u hơn so với các kháng thể tự nhiên và giúp

kìm hãm sự phát triển của khối u [28].
Hannah và cộng sự (2005) đã kết hợp giữa scFv với vùng Fc để gia tăng
khả năng gắn kết của kháng nguyên và kháng thể nhằm chống lại bệnh nhiễm
trùng do virus West Nile gây ra. Nhóm tác giả đã thử nghiệm thành công trên
chuột với 100% số chuột được bảo vệ trước sự xâm nhiễm virus này [37].
Mới đây tại Việt Nam, Lê Quang Huấn và cộng sự (2010) đã xây dựng


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


thành công quy trình thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng nguyên đích và ứng
dụng kháng thể đơn chuỗi scFv đặc hiệu cho kháng nguyên EPCA trong ung thư
tiền liệt tuyến [12]. Trong một nghiên cứu khác, Lê Đình Chắc và cộng sự
(2010) đã tạo được kháng thể scFv đặc hiệu cho kháng nguyên CYFRA21-1 –
một chỉ thị điển hình cho bệnh ung thư phổi. Đây một hướng nghiên cứu mới
trong chẩn đoán và định hướng điều trị bệnh ung thư phổi thông qua sử dụng các
kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp [3].
1.2.4. Kỹ thuật phage display
1.2.4.1. Giới thiệu chung về kỹ thuật phage display
Các kháng thể đơn chuỗi như Fab, scFv, sdAb không chỉ được biểu hiện ở
tế bào vi khuẩn mà còn được bộc lộ (display) trên bề mặt thực khuẩn thể bằng
cách dung hợp với protein vỏ phage. Kỹ thuật bộc lộ các thực thể (peptide,
protein, kháng thể) trên bề mặt thực khuẩn thể được gọi là kỹ thuật phage
display. Kỹ thuật này được Smith đề cập lần đầu tiên vào năm 1985 [58]. Dựa
trên kỹ thuật phage display mà các protein với những đặc trưng mong muốn có
thể được chọn lọc từ một hỗn hợp chứa hàng triệu protein khác, sau đó các gen
mã hóa cho những protein này có thể được khuếch đại như một phần của bộ gen
phage. Thực thể display thường được dùng nhất là scFv và Fab, gần đây thư
viện phage display với một đoạn kháng thể chuỗi nặng VH (sdAb) đã được tạo

ra và cho thấy nhiều ưu điểm [20].
1.2.4.2. Filamentous phage M13
Trong kỹ thuật phage display, các phage hình sợi như filamentous
bacteriophage M13 và họ hàng gần của nó thường được dùng để bộc lộ các
peptide và protein. Phage hình sợi là một nhóm virus gây nhiễm vi khuẩn lớn, có
khả năng gây nhiễm nhiều vi khuẩn Gram âm khác nhau [20].
Virion M13 kiểu dại có đường kính 65 Å và dài 9300 Å (Hình 1.4).
Virion chứa hệ gen mạch đơn có độ lớn 6407 bp được bao bọc bởi lớp vỏ dài
dạng ống có bản chất là protein vỏ pVIII [65]. Một đầu của phage M13 được


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


bao phủ bởi 2 protein là pVII và pIX, đầu còn lại được bao phủ bởi protein pIII
và pVI. Ngoài các protein vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII, pX, pV, pI,
pIV, pXI [45].

Hình 1.4. Các protein cấu thành virion của M13 [61]
Chu kỳ sống của phage M13 bắt đầu bằng quá trình xâm nhiễm khi chúng
tiếp xúc với bề mặt vi khuẩn thông qua tương tác giữa protein pIII với F pilus
của E.coli [55]. Sau đó phage chuyển bộ gen của nó vào tế bào chủ và các
protein vỏ gắn với màng vi khuẩn. Bên trong vi khuẩn, nhờ các enzyme tổng
hợp của tế bào chủ mà bộ gen của phage được chuyển thành DNA dạng mạch
kép, tiếp theo sau quá trình này là quá trình tổng hợp 11 protein của phage M13
(Hình 1.5)


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Hình 1.5. Chu kỳ sống của phage M13 trong E. coli [61]
Khi các protein của phage và bộ gen DNA mạch đơn tích lũy đủ trong vi
khuẩn bị nhiễm, quá trình lắp ráp virion bắt đầu. Các protein cấu trúc pVIII,
pVII, pIX, pVI, và pIII đồng thời gắn với màng trong vi khuẩn và chờ đợi bộ
gen DNA mạch đơn tái bản. Khi đủ nồng độ, pV bọc bộ gen mạch đơn mới tổng
hợp của phage và ngăn cản sự chuyển hóa của nó thành DNA mạch kép [46],
[35]. Sau đó virion lắp ráp và được đẩy ra khỏi vi khuẩn. Do M13 là
bacteriophage không sinh tan nên tế bào chủ không bị chết sau khi nhiễm [45].
1.2.4.3. Tạo thư viện phage display
Về cơ bản, để tạo ra thư viện kháng thể cần khuếch đại các đoạn gen chuỗi
nặng và chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết hoặc lympho bào máu ngoại biên bằng
phiên mã ngược và PCR. Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn và tách
dòng vào vector phagemid để có thể biểu hiện khi dung hợp với protein của
phage [45]. Tất cả các protein vỏ trong của phage đã được sử dụng cho mục
đích display. Cách tiếp cận phổ biến nhất với peptide display là dung hợp các
peptide ngoại lai với đầu N của pIII hoặc pVIII, trong khi các protein thường
được gắn với pIII. Peptide và protein dung hợp với đầu N của pVII [31], pIX