Dự đoán epitope tế bào b không liên tục trên protein hemagglutinin của virus cúm a h5n1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
***


VÕ TRÍ NAM


DỰ ĐOÁN EPITOPE TẾ BÀO B KHÔNG LIÊN TỤC TRÊN
PROTEIN HEMAGGLUTININ CỦA VIRUS CÚM A H5N1



Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số chuyên ngành: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. TRẦN LINH THƯỚC



THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2012
Luận văn thạc sĩ

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS.TS. Trần Linh Thước đã
tạo điều kiện và định hướng giúp em trong quá trình thực hiện đề tài. Có những lúc
em làm không được tốt, và thầy vẫn hỏi thăm và nhắc nhở, động viên em. Em cảm
ơn thầy rất nhiều.
Và em muốn gửi lời cảm ơn đến chị Thảo và chị Phượng, tuy hai chị không
phải người hướng dẫ
n cho em nhưng khi em có những thắc mắc, chị đã rất sẵn sàng
giải đáp và góp ý cho em. Em biết cả hai chị đều rất nhiều công việc, nhưng hai chị
vẫn dành thời gian quý báu cho em, và động viên em, em cảm ơn hai chị.
Con cảm ơn má, má đã chăm lo cho con và tạo điều kiện cho con cả về vật
chất và tinh thần, dù đã có rất nhiều chuyện đã xảy ra trong gia đình. Con thương
má và cảm ơ
n má nhiều lắm.
Và anh cảm ơn em đã cố gắng ở bên và giúp đỡ anh rất nhiều trong một thời
gian dài.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2012
Luận văn thạc sĩ






MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG iii
DANH MỤC CÁC HÌNH iv
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Virus cúm A, phân type H5N1 4
1.1.1. Phân loại 4
1.1.2. Cấu trúc 4
1.1.3. Vòng đời 7
1.1.4. Diễn tiến của virus cúm A H5N1 9
1.2. Đáp ứng miễn dịch tế bào B 10
1.2.1. Giới thiệu tế bào B 10
1.2.1.1. Quá trình biệt hóa 10
1.2.1.2. Quá trình hoạt hóa 10
1.2.2. Kháng thể 12

1.2.2.1. Định nghĩa 10
1.2.2.2. Cấu trúc kháng thể 10
1.2.3. Giới thiệu epitope 17
1.2.3.1. Khái niệm 17

1.2.3.2. Phân loại 17
1.3 Tình hình nghiên cứu dự đoán epitope 19
1.3.1. Các cơ sở dữ liệu 19

Luận văn thạc sĩ

1.3.1.1. Protein Data Bank - PDB 17
1.3.1.2. IEDB-3D 20
1.3.2. Nghiên cứu dự đoán epitope tế bào B 20
1.3.2.1. Các phương pháp dự đoán epitope tế bào B 21
1.3.2.2. Các chương trình dự đoán epitope tế bào B 27
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 30

2.1. Vật liệu 30
2.1.1. Cơ sở dữ liệu cấu trúc protein PDB (Protein Data Bank) 30
2.1.2. Cơ sở dữ liệu cấu trúc epitope IEDB-3D 30
2.1.3. Chương trình dự đoán epitope không liên tục tế bào B Discotope 30
2.1.4. Chương trình khảo sát gắn Autodock 30
2.1.5. Các phần mềm được sử dụng 30
2.2. Phương pháp 31
2.2.1. Quy trình thực hiện 31
2.2.2. Khảo sát bộ thông số tối ưu cho chương trình Autodock 32
2.2.2.1. Quy trình 32
2.2.2.2. Thu nhận dữ liệu kháng thể gắn peptide HA 32
2.2.2.1. Chuẩn bị tập tin đầu vào cho chương trình Autodock 32
2.2.2.1. Chuẩn bị tập tin chứa thông số AutoGrid và thực thi AutoGrid 32
2.2.2.1. Chuẩn bị tập tin chứa thông số Autodock và thực thi Autodock 32
2.2.2.6. Phân tích kết quả 40
2.2.3. Thu nhận cấu trúc kháng thể 40
2.2.4. Dự đoán epitope không liên tục tế bào B bằng server Discotope, từ đó
thiết kế các peptide cần dự đoán 40
2.2.5. Thu nhận cấu trúc các epitope và non-epitope 40

2.2.6. Khảo sát gắn cấu trúc kháng thể với các cấu trúc peptide dự đoán, epitope
và non-epitope 40
Luận văn thạc sĩ






2.2.7. Phân tích kết quả khảo sát và đề xuất các epitope tế bào B không
liên tục 40
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 18

3.1. Khảo sát bộ thông số tối ưu cho chương trình Autodock 43
3.1.1. Thu nhận cấu trúc kháng thể gắn peptide HA 47
3.1.2. Phân tích kết quả khảo sát gắn 47

3.2. Thu nhận cấu trúc kháng thể 47
3.3. Dự đoán epitope không liên tục tế bào B bằng chương trình Discotope, từ đó
thiết kế các peptide cần dự đoán 49

3.4. Thu nhận cấu trúc các epitope và non-epitope 51
3.5. Khảo sát gắn cấu trúc kháng thể với các cấu trúc peptide dự đoán, epitope và
non-epitope 52

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42
4.1. Kết luận 57
4.2. Đề nghị 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

Luận văn thạc sĩ



Trang i


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ADT AutoDockTool
APC Tế bào trình diện kháng nguyên
CA Carbon anpha
CDR Complementarity Determining Region
cRNA Complementary RNA
CSDL Cơ sở dữ liệu
Fab Antigen−binding fragment
Fv Variable fragment
GA Genetic Algorithm
HA Hemagglutinin
M Matrix
M1 Matrix protein 1
M2 Matrix protein 2
MHC Major Histocompatibility Complex
NA Neuraminidase
NP Nucleocapsid protein
NS1 Non−structural protein 1
NS2 Non−structural protein 2
PA Polymerase A protein
PB1 Polymerase B1 protein
PB2 Polymerase B2 protein
Luận văn thạc sĩ

Trang ii


PDB Protein Data Bank
RMSD Root−mean−square−deviation
RNP RNA−nucleoprotein
vRNP Virus RNA−nucleoprotein
Luận văn thạc sĩ



Trang iii


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Chức năng của các protein virus cúm A 6
Bảng 1.2: Thống kê tình hình sử dụng các chương trình khảo sát gắn (2006) 28
Bảng 3.1: Cấu trúc kháng thể gắn HA thu nhận từ cơ sở dữ liệu PDB 43
Bảng 3.2: Độ sai lệch cấu trúc giữa peptide HA sau khi khảo sát gắn và peptide
thực nghiệm 44
Bảng 3.3: Năng lượng các trạng thái gắn kết của các peptide lên phân tử kháng
thể 46
Bảng 3.4: Bộ thông số tối ưu thu được 46
Bảng 3.5: Kết quả dự đoán bằng Discotope đối với các amino acid trên phân tử
protein HA có tham gia vào tương tác với phân tử kháng thể 46
Bảng 3.6: Các peptide được thiết kế 51

Bảng 3.7: Các epitope và non-epitope thu nhận được 52
Bảng 3.8: Năng lượng các trạng thái gắn kết của các mẫu đối chứng dương và
đối chứng âm lên phân tử kháng thể 54

Bảng 3.9: Năng lượng các trạng thái gắn kết của 07 peptide lên phân tử kháng
thể 54
Bảng 3.10: Các epitope và non-epitope thu nhận được 55



Luận văn thạc sĩ



Trang iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc của virus cúm A 5
Hình 1.2: Vòng đời virus cúm A 8
Hình 1.3: Sự lan nhanh của virus cúm A (H5N1) trên toàn thế giới 9
Hình 1.4: Sơ đồ biệt hóa của tế bào Lympho B 10
Hình 1.5: Hoạt hóa theo cơ chế chọn lọc kháng nguyên của lympho B 12
Hình 1.6: Điện di protein huyết tương 13
Hình 1.7: Mỗi một loại kháng nguyên chọn lọc một tế bào lympho B tạo
kháng thể 14

Hình 1.8: Tế bào lympho B tăng sinh và biệt hóa thành nhiều tương bào 14
Hình 1.9: Mô hình cấu trúc kháng thể và sơ đồ các chuỗi trong kháng thể 15
Hình 1.10: Chuỗi nhẹ của immunoglobulin 16

Hình 1.11: Các dạng gắn của kháng nguyên lên kháng thể 17
Hình 1.12: Epitope liên tục và epitope không liên tục 18
Hình 1.13: Thống kê tình hình sử dụng các chương trình khảo sát gắn (2006) 26
Hình 1.14: Mẫu tập tin kết quả của chương trình Discotope 29
Hình 2.1: Quy trình dự đoán epitope không liên tục tế bào B trên protein
Hemagglutinin của virus cúm A phân type H5N1 31

Hình 2.2: Quy trình khảo sát sự gắn kết peptide HA lên kháng thể bằng chương
trình Autodock 33

Hình 2.3: Giao diện chương trình AutodockTool (ADT) 34
Hình 2.4: Chọn phân tử nước trong đại phân tử 35
Hình 2.5: Quá trình thêm Hydro 36
Luận văn thạc sĩ



Trang v


Hình 2.6: Chọn các liên kết xoay cho phân tử ligand 36

Hình 2.7: Giao diện xác định thông số cho Autogrid 38
Hình 2.8: Tập tin thông số cho Autogrid 38
Hình 2.9: Tập tin thông số cho Autodock 39
Hình 3.1: Kết quả khảo sát gắn giữa peptide HA và kháng thể 45
Hình 3.2: Các gốc amino acid trên phân tử HA tham gia tương tác với phân tử
kháng thể 45
Hình 3.3: Cấu trúc phân tử protein HA mã số 1JSM 49
Hình 3.4: Kết quả dự đoán epitope tế bào B không liên tục bằng chương trình

Discotope trên cấu trúc 1JSM 50


Luận văn thạc sĩ Mở đầu



Trang 1

LỜI MỞ ĐẦU
Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, có tất cả ba type A, B và C. Trong đó
virus cúm A là loại virus gây độc cao nhất và có khả năng bùng phát thành đại dịch.
Trong quá khứ đã có nhiều trận dịch do virus cúm A phân type H5N1 gây ra. Và
theo các chuyên gia dự đoán trong tương lai rất có thể sẽ còn xuất hiện những trận
dịch khác gây nhiều thiệt hại, mà Việt Nam là một trong những nước có khả năng
chịu ảnh hưởng. Chính vì vậy việc phát triển vaccine phòng ngừa virus đóng vai trò
quan trọ
ng.
Việc sản xuất vaccine phòng chống cúm A đã và đang được phát triển.
Nhưng các phương pháp chế tạo vaccine phòng ngừa đang gặp nhiều khó khăn do:
virus có mức độ lây lan nhanh, rộng và khó kiểm soát. Hơn nữa, sự biến đổi nhanh
và phức tạp trong cấu trúc di truyền của virus cúm A cũng khiến nó trở thành một
đối tượng khó có thể bị khống chế. Trong nhiều phương thức tiếp cận, vaccine tiểu
phầ
n được đánh giá là một phương thức có nhiều ưu điểm và triển vọng. Cùng với
sự phát triển của dịch tễ học, các dữ liệu thực nghiệm về sự biến động cũng như lan
truyền của virus cúm A được công bố và tích lũy ngày một nhiều. Đây cũng là
nguồn dữ liệu cơ sở cho việc phân tích, dự đoán sự biến động củ
a virus cúm A cũng
như việc định hướng cho việc chế tạo vaccine cúm A. Trong các nghiên cứu nói

trên, vai trò của các công cụ tin sinh học góp một phần không nhỏ. Nhiều phương
pháp đã được áp dụng vào dự đoán epitop bên cạnh các phương pháp mới ra đời đã
phục vụ rất nhiều cho các nghiên cứu nói trên. Có thể kể đến các phương pháp như
phương pháp HMM (Hidden Markov Model), ANN (Artificial Neuron Network)
hay SVM (Support Vector Machine) đã được áp dụng vào dự đoán epitope trên
trình tự; các phương pháp như
phương pháp mô hình hóa tương đồng, phương pháp
dùng thang tính chất hóa lý của các amino acid hay phương pháp Discotope đã được
áp dụng cho việc dự đoán epitope cấu trúc. Áp dụng các phương pháp kể trên, rất
nhiều server, rất nhiều chương trình đã ra đời để phục vụ công việc nghiên cứu như
Discotope, MHCPred, CTLPred, Bebipred, CEP… Có thể nói các phương pháp
trong tin sinh học đang được áp dụng trên diện rộng và cả chiều sâu giúp tạo một
Luận văn thạc sĩ Mở đầu



Trang 2

nguồn lực lớn hỗ trợ cho các nghiên cứu thực nghiệm.
Tuy nhiên, trong khi các phương pháp dự đoán epitope liên tục dựa trên trình
tự đang phát triển mạnh mẽ và thu được những kết quả rất khả quan thì việc dự
đoán epitope không liên tục đang gặp phải những hạn chế nhất định, đặc biệt là hạn
chế về khả năng ứng dụng. Các epitope nhận diện bở
i tế bào B đang được rất kỳ
vọng do khả năng đáp ứng miễn dịch hiệu quả hơn hẳn so với epitope nhận diện bởi
tế bào T. Các khảo sát cho thấy hơn 90% các epitope nhận diện bởi tế bào B là
epitope không liên tục nên việc áp dụng các phương pháp vào dự đoán đang gặp rất
nhiều hạn chế. Lý do chính vì các epitope này có chiều dài dao động trong một
khoảng khá rộng (từ 6 đến 28 amino acid) và tính chấ
t không liên tục làm cho việc

xác định vô cùng khó khăn. Lấy ví dụ như chương trình Discotope giúp dự đoán
epitope không liên tục tế bào B với độ chính xác khá cao (trên 70%) so với phương
pháp khác nhưng kết quả trả ra chỉ là vị trí các gốc amino acid rời rạc được dự đoán
là thuộc các epitope không liên tục. Kết quả từ chương trình này rất khó để ứng
dụng vào thực tế do không thể lấy từng gốc amino acid riêng lẻ đi chế chế
tạo
vaccine được.
Từ thực tế trên, chúng tôi quyết định tiến hành nghiên cứu nhằm đưa ra một
quy trình để có thể ứng dụng các công cụ đã được thiết kế để dự đoán epitope
không liên tục nhận diện bởi tế bào B đáp ứng nhu cầu nghiên cứu chế tạo vaccine
hiện nay. Phương pháp khảo sát gắn, phương pháp cho phép khảo sát khả năng gắn
kết giữa 2 phân tử protein, hi
ện đang được sử dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu
tương tác giữa protein và protein như việc tìm vị trí tương tác của protein hay trong
quá trình dò tìm chất bào chế thuốc trong y học. Phương pháp này sẽ được chúng tôi
sử dụng nhằm giải quyết hạn chế của chương trình Discotope từ đó tiến hành dự
đoán epitope không liên tục nhận diện bởi tế bào B trên protein HA – protein nằm
trên màng đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus – của virus
cúm A H5N1.
V
ới mục tiêu trên, luận văn được thực hiện với các nội dung sau:
- Khảo sát bộ thông số tối ưu cho chương trình Autodock trong việc khảo
Luận văn thạc sĩ Mở đầu



Trang 3

sát gắn giữa phân tử kháng thể và phân tử peptide
- Dự đoán các gốc amino acid thuộc epitope không liên tục nhận diện bởi

tế bào B bằng chương trình Discotope, từ đó thiết kế các đoạn peptide
liên tục dùng cho dự đoán bằng phương pháp khảo sát gắn
- Khảo sát gắn giữa các đoạn peptide thiết kế được với phân tử kháng thể
nhằm tìm ra epitope kỳ vọng làm dữ liệ
u cho các nghiên cứu chế tạo
vaccine thực nghiệm.

Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu













Chương 1:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu



Trang 4
1.1. Virus cúm A, phân type H5N1
1.1.1. Phân loại [8]

Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, có tất cả ba type A, B và C. Các type
được phân biệt dựa trên sự khác biệt tính kháng nguyên ở hai loại protein là
nucleocapsid (NP) và matrix (M). Type A và C của virus cúm có khả năng xâm
nhiễm nhiều loài, trong khi đó type B hầu như chỉ xâm nhiễm vào người. Type A là
type có độc lực cao nhất và thường gây ra các bệnh rất trầm trọng.
Dựa trên sự đa dạng tính kháng nguyên của hai protein bề mặt là
hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) người ta chia virus cúm A thành những
phân type khác nhau. Kí tự H và N kết hợp với số
được dùng để đặt tên cho các
phân type; ví dụ phân type H5N1 có protein bề mặt HA thuộc loại H5 và NA thuộc
loại N1. Cho đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện được 16 loại HA và 9 loại NA
khác nhau.
1.1.2. Cấu trúc
Bộ gen virus cúm A gồm tám mảnh RNA sợi đơn mạch âm mã hóa cho 8
protein là HA, NA, NP, M1, M2, NS, PA và PB. Chức năng chính và tên đầy đủ
của các protein được thể hiện trên bảng 1.1.
Cấu trúc của virus cúm A được mô tả trên hình 1.1. Bên ngoài của phần tử
virus được bao bọc bằng một màng lipid c
ủa tế bào chủ, trên màng này có đính các
glycoprotein thuộc hai loại HA và NA. Mặt trong của lớp vỏ được bao bọc bằng
một lớp protein M1. Bên trong là phức hợp RNA-nucleoprotein (RNP) và các
protein không cấu trúc (NS1, NS2). Phức hợp RNP bao gồm một protein PA, một
protein PB1, một protein PB2 và nhiều protein NP gắn với một mảnh RNA bộ gen
virus.
HA là một glycoprotein có hai vị trí glycosyl hóa với trọng lượng phân tử
khoảng 76.000 Dalton [17]. Đây là một protein xuyên màng với phần đầu của
protein gồm năm vùng kháng nguyên lộ ra bề
mặt màng và phần đuôi kết dính bên
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu

Trang 5
trong màng. HA đóng vai trò tương tác với phân tử acid sialic (acid N-acetyl-
neuraminic) và giúp cho phân tử virus xâm nhập và bên trong tế bào chủ thông qua
quá trình dung hợp màng. Ngoài ra, HA còn một vùng có chức năng dung hợp
màng khi phân tử virus đã xâm nhập vào tế bào chủ. Vì protein HA mang 5 vùng
kháng nguyên chính của virus nên kháng thể hiện nay được sản xuất chủ yếu theo
hướng trung hòa HA. Tuy nhiên, bản thân HA có tần số biến đổi rất cao nên việc sử
dụng kháng nguyên loại này rất dễ bị thụ động. HA có hai cơ chế biến đổi là s
ự
chuyển dịch kháng nguyên (antigentic drift) và sự chuyển đổi kháng nguyên
(antigentic shift). Trong cơ chế chuyển dịch kháng nguyên, các đột biến điểm ngẫu
nhiên trên RNA được tích lũy dần qua thời gian có thể tạo ra chủng virus mới, làm
mất tác dụng của kháng thể. Cơ chế chuyển đổi kháng nguyên xảy ra khi hai chủng
virus khác nhau cùng xâm nhập vào một tế bào chủ. Lúc này, giữa chúng có sự trao
đổi các phân đoạn RNA với nhau. Cơ chế này gây ra những biến đổi l
ớn và nhanh
chóng trong bộ gen virus [11].

Hình 1.1: Cấu trúc của virus cúm A
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu



Trang 6
Bảng 1.1: Chức năng của các protein virus cúm A [11]
Mảnh Protein Tên đầy đủ Chức năng
1 PB1 Polymerase B1 protein
Tham gia vào giai đoạn kéo dài

trong quá trình phiên mã
2 PB2 Polymerase B2 protein Gắn cặp trong quá trình phiên mã
3 PA Polymerase A protein Tham gia vào quá trình phiên mã
4 HA Hemagglutinin Xâm nhập vào tế bào chủ
5 NP Nucleocapsid protein
Gắn RNA, một phần của phức hợp
phiên mã, vận chuyển RNA giữa
nhân và tế bào chất
6 NA Neuraminidase Cắt acid sialic, giải phóng virus
7
M1 Matrix protein 1 Protein nền, phần chính của virion
M2 Matrix protein 2
Kênh ion, làm giảm và duy trì pH
trong bóng màng
8
NS1 Non−structural protein 1
Vận chuyển RNA tế bào, cắt nối,
dịch mã, chống interferon
NS2 Non−structural protein 2 Chức năng chưa rõ

Cũng giống như HA, NA cũng là một glycoprotein bề mặt của virus nằm bắt
ngang qua màng lipid với phần đầu hướng ra ngoài màng và phần đuôi nằm bên
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu



Trang 7
trong phần tử virus. Trọng lượng phân tử của NA khoảng 220.000 Dalton. NA đóng
vai trò như một enzyme phân cắt liên kết giữa acid sialic với các glycoprotein và
glycolipid trên bề mặt virus như HA. Trên NA còn có một vị trí quyết định kháng

nguyên ở phía đầu. Ngoài ra, NA cũng có cơ chế đột biến hoán chuyển kháng
nguyên giống như HA. Trên NA có một vài gốc amino acid quan trọng mà khi đột
biến sẽ có thể kháng lại hoạt động của các phân tử ức chế NA. Sự biến
đổi các
amino acid này như sau: Arginine ở vị trí 292 thành Lysine, Histidine ở vị trí 274
thành Tyrosine, arginine ở vị trí 152 thành Lysine, acid Glutamic ở vị trí 119 thành
Valine.
1.1.3. Vòng đời
Virus cúm A nhận diện và bám dính trên một loại tế bào nhất định. Những tế
bào này có thụ thể là acid 5-N-acetyl neuraminic (acid sialic), hoặc trong một số
trường hợp thụ thể có thể là N-glycol neuraminic. Sau khi nhận diện, protein HA
trên bề mặt virus sẽ gắn lên các thụ thể và bắt đầu quá trình xâm nhiễm. Do sự kết
dính của HA và acid sialic ở xung quanh đ
iểm khởi đầu nên sau khi gắn được lên
các thụ thể trên bề mặt tế bào, màng tế bào chủ nhanh chóng phủ lấy phần tử virus
và dần dần được nhấn chìm vào trong tế bào chủ. Một bóng màng có chứa virus
tách dần ra khỏi màng tế bào và di chuyển và trong tế bào chất. H
+
được bơm vào
bên trong nhờ một loại protein vận chuyển ion H
+
trên màng đến pH tương thích
(pH=5-5,5), khi đó HA được cắt đứt thành nhiều domain và để lộ ra phần kỵ nước.
Phần kỵ nước tạo ra sẽ dính vào màng lipid của bóng màng dẫn đến sự hòa nhập
của màng bao virus và bóng màng. Sự kết hợp này tạo ra khoảng không gian làm
giải phóng vật chất bên trong virus vào trong tế bào chất của tế bào chủ. Mặt khác,
ion H
+
cũng được vận chuyển vào trong virus nhờ protein matrix (M2) trên màng
virus. Sự acid hóa này phá vỡ phức hợp M1-vRNP (virus RNA-Nucleoprotein), giải

phóng vRNP, các vRNP tự do dễ dàng xâm nhập vào nhân tế bào chủ (vì phức hợp
M1-RNP có kích thước lớn không đi qua được lỗ nhân). Sự di chuyển các vRNP
qua lỗ nhân vào bên trong nhờ tín hiệu định hướng nhân trên các protein NP. Vòng
đời của virus được minh họa trên hình 1.2.
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu



Trang 8

Hình 1.2: Vòng đời virus cúm A
Sau khi thâm nhập vào bên trong nhân tế bào chủ, virus cúm bắt đầu quá
trình sao chép. Phức hợp RNP được dùng làm khuôn để tổng hợp hai loại RNA
mạch dương khác nhau là RNA thông tin của virus (vmRNA) và cRNA
(complementary RNA) nhờ một enzyme của virus là RNA polymerase phụ thuộc
RNA. Enzyme này được đính kèm trong phức hợp RNP, bao gồm ba tiểu phần là
PA, PB1, PB2. Sự khác biệt giữa vmRNA và cRNA là vmRNA được gắn cặp 7-
methyl-guanosine ở đầu 5’ và đuôi polyA ở đầu 3’ trong quá trình tổng hợp còn
cRNA thì không. Sau khi tổng hợp, các vmRNA được đưa ra ngoài t
ế bào chất để
dịch mã bằng ribosome của tế bào chủ còn cRNA ở lại trong nhân làm khuôn tổng
hợp nên các RNA bộ gen mới. Các protein NS1 định hướng cho các vmRNA của
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu



Trang 9
virus ngoài nhân. Các protein NP, M1, NS1, NS2 và RNA polymerase sau khi tổng
hợp tại tế bào chất sẽ di chuyển vào trong nhân, kết hợp với nhau tạo thành phức
hợp RNP. Mặt khác, protein HA, NA và M2 được tiết ra bề mặt tế bào chủ thông

qua bộ máy Golgi.
Quá trình giải phóng virus phụ thuộc vào protein NA. Protein này phân hủy
các thụ thể acid sialic của tế bào chủ còn bám trên màng bao virus, không cho các
phần tử virus, sau khi được phóng thích ra, gắn chùm lại với nhau, cũng như ngăn tế
bào virus gắn vào tế bào chủ do tương tác vớ
i các NA gắn trên màng.
1.1.4. Diễn tiến của virus cúm A H5N1

Hình 1.3: Sự lan nhanh của virus cúm A (H5N1) trên toàn thế giới
Những triệu chứng do virus cúm được Hippocrates phát hiện và mô tả lần
đầu tiên vào năm 412 trước công nguyên. Nhưng các triệu chứng này rất khó kiểm
chứng do dễ nhầm lẫn với triệu chứng của bệnh bạch hầu, dịch hạch, sốt xuất huyết
và thương hàn. Năm 1357, tên gọi “influenza” ra đời lần đầu tiên tại Ý. Từ đó đến
nay đã có nhiều tr
ận dịch xảy ra. Trong đó, có ba trận dịch lớn xảy ra trong thế kỷ
qua đó là vào năm 1918, 1957 và 1968. Nghiêm trọng nhất là trận dịch vào năm
1918 có 80% dân số bị nhiễm bệnh, gây tử vong 20-50 triệu người. Bộc phát cuối
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu



Trang 10
cùng trong thế kỷ qua xảy ra 1997 ở Hồng Kông khi một virus cúm mới (H5N1) có
glycoprotein HA của virus cúm gây bệnh trên loài chim đã lây lan sang người và
gây tử vong 6 trong 8 bệnh nhân bị nhiễm bệnh. Một chủng H5N1 khác được phân
lập năm 2003-2004 ở một vài nước châu Á bao gồm Thái Lan và Việt Nam gây tử
vong 31 trong 43 bệnh nhân. Theo số liệu ngày 12 tháng 6 năm 2009 của WHO,
cho đến nay dịch cúm của virus cúm A phân type H5N1 đã lan nhiều nước trên thế
giới và gây tử vong 145 người (hình 1.3). Việt Nam vẫn nằm trong tình trạ
ng báo

động về mối đe dọa của virus cúm A phân type H5N1, do đó nhu cầu về vaccine
cho virus H5N1 đang rất cấp bách. [3][18]
1.2. Đáp ứng miễn dịch tế bào B
1.2.1. Giới thiệu tế bào B [1]
Tế bào B (hay còn gọi là lympho bào B) là một dạng của tế bào bạch huyết
đóng vai trò quan trọng trong miễn dịch dịch thể. Chức năng chủ yếu của tế bào B
là sản sinh ra kháng thể chống lại các kháng nguyên, thể hiện vai trò của tế bào
trình diện kháng nguyên (APC) và có thể biệt hóa thành tế bào nhớ sau khi được
hoạt hóa bởi kháng nguyên. Tế bào B là thành phần quan trọng trong đáp ứng miễn
dịch. Thông thường tế
bào B được tìm thấy ở túi Fabricius ở loài chim. Đây là một
loại mô tương tự với tủy xương, nơi phát triển của tế bào B ở động vật có vú.
1.2.1.1. Quá trình biệt hóa

Hình 1.4: Sơ đồ biệt hóa của tế bào Lympho B
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu



Trang 11
Quá trình biệt hóa của tế bào lympho B được minh họa trên hình 1.4. Các tế
bào mầm dòng lympho biệt hóa thành các tế bào tiền B khởi đầu bằng sự tổng hợp
chuỗi nặng µ (muy) trong bào tương nhưng chưa có chuỗi nhẹ. Tiếp theo là sự tổng
hợp chuỗi nhẹ mà phần lớn thuộc type κ (kapa), chuỗi nặng và chuỗi nhẹ ghép lại
thành phân tử Ig trong bào tương gọi là CIg (cytoplasma immunoglobulin). Các CIg
của tế bào tiền B sau đó đượ
c biểu lộ lên bề mặt tế bào gọi là SIg (Surface
immunoglobulin). Ở các tế bào lympho B trưởng thành đều có SIg thuộc lớp IgM
hoặc phối hợp giữa lớp IgM và IgD.
Các tế bào lympho B chiếm khoảng 5-15% tế bào lympho của máu. Trong

quá trình biệt hóa, chúng biểu lộ một số dấu ấn bề mặt (surface marker), dấu ấn có
tính chất kinh điển là SIg mà đa số là IgM đơn phân có đầu kỵ nước của chuỗi nặng
giúp cho việc neo phân tử vào màng t
ế bào. Đây là thụ thể chủ yếu mà tế bào
lympho B dùng để nhận biết kháng nguyên. Ngoài ra các tế bào lympho B còn có
các dấu ấn khác như dấu ấn cho phân tử MHCII, các thụ thể dành cho bổ thể (CR2,
CD21)…
1.2.1.2. Quá trình hoạt hóa
Khi một kháng nguyên đi vào cơ thể chúng sẽ gặp các tế bào lympho B có
mang các kháng thể bề mặt khác nhau. Mỗi một kháng thể có vị trí nhận biết kháng
nguyên và kháng nguyên thì chỉ kết hợp với kháng thể nào phù hợp với nó nhất.
Các tế
bào lympho B khi đã kết hợp được với kháng nguyên sẽ nhận được
một tín hiệu khởi động để tiếp tục biệt hóa thành tương bào, là các tế bào có tiềm
năng sinh kháng thể. Do các tế bào lympho B đã được chương trình hóa để chỉ sản
xuất một loại kháng thể đặc hiệu nào đó, cho nên các kháng thể vừa mới được tổng
hợp bởi tương bào sẽ hoàn toàn tương đồng với kháng thể g
ốc ban đầu. Do đó
kháng nguyên chọn kháng thể nhận biết mình một cách có hiệu quả.
Bên cạnh đó, sự hoạt hóa tế bào lympho B còn phụ thuộc vào bản chất của
kháng nguyên (hình 1.5), cụ thể như sau:
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu



Trang 12
− Kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức type I ở nồng độ đủ cao có thể hoạt hóa
trực tiếp một tỷ lệ đáng kể lympho B.
− Kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức type II có cấu trúc lập lại không bị
giáng hóa có thể tạo ra liên kết chéo (cross linking) để hoạt hóa tế bào lympho B.

− Kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức thì sự hoạt hóa tế bào lympho B cần thiết phải
có sự hợp tác của tế bào lympho T hỗ
trợ (Th) thông qua các cytokin.

Hình 1.5: Hoạt hóa theo cơ chế chọn lọc kháng nguyên của lympho B
1.2.2. Kháng thể
1.2.2.1. Định nghĩa [1]
Kháng thể bản chất là một loại glycoprotein do kháng nguyên kích thích tạo
ra và có thể kết hợp một cách đặc hiệu với kháng nguyên ấy. Kháng thể còn được
gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin), viết tắt là lg, vì khi chạy điện di miễn
dịch thì kháng thể nằm ở vùng globulin (hình 1.6).
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu



Trang 13

Hình 1.6: Điện di protein huyết tương
Mối quan hệ giữa kháng nguyên chọn lọc và kháng thể
Hiện nay người ta thừa nhận rằng cơ thể có sẵn khuôn tạo kháng thể trước
khi tiếp xúc với kháng nguyên, khuôn này chính là các kháng thể bề mặt có sẵn trên
tế bào lympho B.
Mỗi tế bào lympho B đã được chương trình hóa để sản xuất một loại kháng
thể khác nhau. Khi tiếp xúc với kháng nguyên, tế bào lympho B nào có kháng thể
bề mặt kh
ớp với cấu trúc của kháng nguyên thì mới chuyển thành tương bào sản
xuất kháng thể. Kháng thể này có cấu trúc giống như kháng thể bề mặt của tế bào
lympho B đó.
Dựa trên cấu trúc, loại và trình tự các amino acid của các quyết định kháng
nguyên, ước lượng có khoảng 10

7
-10
9
loại quyết định kháng nguyên khác nhau
trong thiên nhiên, như vậy cũng có khoảng 10
7
-10
9
loại tế bào lympho B tương ứng.
Sự tạo thành tương bào
Sau khi tiếp xúc lần đầu với kháng nguyên, tế bào lympho B tăng sinh nhiều
đợt rồi chuyển thành tương bào sản xuất kháng thể (hình 1.7, 1.8). Khoảng vài ngày
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu



Trang 14
sau khi tiếp xúc với kháng nguyên, kháng thể xuất hiện trong máu và đạt nồng độ
cao nhất vào khoảng tuần lễ thứ hai. Đó là đáp ứng tiên phát.
Do vậy trên lâm sàng các xét nghiệm tìm kháng thể đặc hiệu thường được
thực hiện vào khoảng sau một tuần khởi phát bệnh, lúc mà số lượng kháng thể đủ
cao để có thể cho kết quả dương tính.

Hình 1.7: Mỗi một loại kháng nguyên chọn lọc một tế bào lympho B tạo kháng
thể

Hình 1.8: Tế bào lympho B tăng sinh và biệt hóa thành nhiều tương bào