Báo cáo nghiên cứu khoa học

Tài liệu: Docs.vn Hỗ trợ : Y!M minhu888
I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây cà chua bị tấn công bởi rất nhiều loài virus. Trong số bệnh virus hại cà chua ở vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh quan trọng nhất (Pico et al., 1996).
Nguyên nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua khá phức tạp. Bệnh được xem là một bệnh phức,
có nghĩa là một bệnh nhưng do nhiều virus thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae gây ra
(Moriones & Navas-Castillo, 2000). Các begomovirus có hình thái phân tử dạng hình cầu kép (hình
chuỳ), không truyền qua hạt giống nhưng lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia
tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Pico et al., 1996).
Begomovirus là các virus có bộ gien DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2.6 – 2.8 kb.
Begomovirus có thể có bộ gien đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép (gồm hai phân tử
DNA-A và DNA-B). Cấu trúc của một phân tử DNA-A điển hình gồm có 6 gien được sắp xếp theo
hai chiều ngược nhau (Hình 1). Theo chiều kim đồng hồ có hai gien AV1 và AV2. Gen AV1(CP)
mã hóa vỏ protein, qui định tính đặc hiệu vector và nhập nhân tế bào. Gen AV2 mã hóa 1 protein
có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy DNA của virus. Ngược chiều
kim đồng hồ có 4 gien AC1, AC2, AC3 và AC4. Gien AC1 (Rep) mã hóa 1 protein có vai trò quan
trọng trong quá trình tái sinh virus và tương tác với các protein ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào.
Gien AC2 (TrAP) mã hóa 1 protein hoạt hóa phiên mã và ức chế phản ứng phòng thủ của cây. Gien
AC4 (REn) mã hóa 1 protein tăng cường sự tái sinh virus và tương tác với các protein ký chủ điều
khiển chu kỳ tế bào. Gien AC4 mã hóa 1 protein có chức năng cảm ứng triệu chứng và di chuyển
hệ thống (Stanley et al., 2005)
Hiện nay, có tới hơn 50 begomovirus phân lập từ cà chua (có từ tomato ở đầu tên virus) đã
được công bố trên thế giới (Fauquet et al., 2008). Trên cây cà chua, các begomovirus tạo triệu
chứng giống nhau, điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng;
lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus gây bệnh chỉ có thể
biết được dựa vào các phân tích phân tử (Moriones & Navas-Castillo, 2000).
Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh virus quan trọng nhất trên cà chua với tỉ lệ
nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có khi tới 100 %. Bệnh đã được phát hiện
thấy trên cà chua từ những năm 80. Một số nghiên cứu về tạo kháng huyết thanh chẩn đoán, lây
nhiễm nhân tạo đã được thực hiện trong thời gian này nhưng bản chất thật sự của virus vẫn chưa

rõ. Gần đây, dựa vào các phân tích phân tử, có ít nhất 3 begomovirus được phát hiện gây ra bệnh
DNA-A
~2.7kb
AC4
AC2 (TrAP)
AC1 (Rep)
(Rep)
AV1 (CP)
AC3 (REn)
AV2
1
Hình 1. Tổ chức bộ gien phân tử
DNA-A của begomovirus. CP = coat
protein. REn = replication enhancer.
TrAP = transcriptional activator
protein. Rep = replication associated
protein.
Tài liệu: Docs.vn Hỗ trợ : Y!M minhu888
xoăn vàng lá cà chua ở Việt Nam gồm tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) (Green et al.
2001), tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) và tomato yellow leaf curl
Kanchanaburi (TYLCKaV) (Hà et al. 2008). Trong số 3 virus trên, 2 virus được phân lập trên mẫu
cà chua gây bệnh xoăn vàng lá ở miền Bắc là ToLCVV và TLCVNV.
Cũng dựa trên các phân tích phân tử, Việt Nam dường như là trung tâm đa dạng của
begomovirus (Ha et al. 2006, 2008). Mặc dù vậy số lượng begomovirus được xác định trên thực
vật của Việt Nam vẫn còn ít, chỉ gồm 19 virus được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó nhiều loài
là cây dại (Green et al., 2001; Revill et al., 2003; Ha et al., 2006, 2008). Kết quả trên gợi ý rằng
nhiều begomovirus nữa đang gây hại trên cà chua và các cây trồng khác ở Viêt Nam và cần phải
được xác định.
Việc phòng trừ begomovirus trên cà chua nhìn chung là khó và chủ yếu hiện nay dựa vào các
chiến lược sau: (i) tạo giống kháng bệnh dựa vào nguồn gen kháng bệnh có nguồn gốc từ cà chua

dại; (ii) tạo giống kháng bệnh dựa vào gen của tác nhân gây bệnh, trong đó gen của begomovirus
được chuyển vào cây và thông qua cơ chế siRNA để tạo tính kháng; và (iii) phòng chống tổng hợp,
trong đó thành phần chủ chốt là tiêu diệt bọ phấn, cắt nguồn ký chủ của virus, nhổ bỏ cây bệnh, sử
dụng giống kháng (Czosnek, 2007). Việc xác định đầy đủ thành phần begomovirus trên cà chua
luôn cần thiết cho bất cứ chiến lược phòng chống nào
1.2. Mục đích và yêu cầu
Mục đích: Xác định thành phần loài Begomovirus hại cà chua tại Hà Nội và phụ cận.
Yêu cầu:
− Thu mẫu và xử lý mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá.
− Xác định sự có mặt của các begomovirus bằng PCR dùng mồi chung (degenerate primers) đặc
hiệu cho DNA-A của virus .
− Xác định thành phần begomovirus tại các điểm điểu tra dùng cặp mồi đặc hiệu với 2 loài virus
đã được xác định trước tại miền Bắc là tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) và tomato
yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV).
− Giải trình tự sản phẩm PCR của các mẫu virus có khả năng là loài mới.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thu mẫu và xử lý mẫu
Mẫu bệnh cây cà chua có triệu chứng điển hình của bệnh xoăn vàng lá được thu thập tại các
ruộng trồng thuộc Hà Nội và phụ cận.
Mẫu sau khi thu thập được số liệu hóa và xử lý khô bằng silicagel hoặc sấy ở 37
O
C. Mẫu sau
khi xử lý khô được bảo quản lâu dài trong lọ chứa silicagel ở 4
O
C.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
Nghiên cứu được thực hiện từ 24/06/2008 đến 15/01/2009 tại TT BCNĐ, ĐHNNHN
2.3. Chiết DNA từ mô lá cà chua
DNA tổng số từ mô lá được chiết theo 2 phương pháp:
Phương pháp chiết nhanh nhanh bằng NaOH (Wang et al., 1993): Cho khoảng 50 mg mô lá cà

chua vào tube 1,5 mL. Cho 0,5 mL dung dich NaOH 0,5 M vào tube. Dùng chày nhựa chuyên dụng
để nghiền nhuyễn mẫu lá. Hòa loãng dịch nghiền 50 - 100 lần với đệm Tris 0,1 M, pH = 8 (5 μL
dịch nghiền hòa loãng với 495 μL đệm Tris). Dịch hòa loãng này được dùng để chạy PCR.
2
Tài liệu: Docs.vn Hỗ trợ : Y!M minhu888
Phương pháp chiết dùng CTAB (Doyle & Doyle (1987). Khoảng 100 mg mô lá bệnh tươi (hoặc
20 mg mô lá bệnh khô) được nghiền với 1 mL đệm CTAB. DNA được chiết 2 lần với Chloroform:
isoamyl alcohol (24:1). Căn DNA được rửa 2 lần bằng ethanol 70% và hòa trong 50 uL nước cất 2
lần vô trùng. Dịch chiết DNA được giữ ở -20OC
2.4. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Các phản ứng PCR được thực hiện trong tube 0.5 mL với tổng thể tích phản ứng 25 μL chứa
2.5 μL dung dịch đệm PCR X10 (Fermantas), 0.5 μL dNTPS (10 mM môi loại A, T, G, C, Roche),
0.5 μL mỗi loại mồi đặc hiệu xuôi dòng và ngược dòng hoặc 1 μL cho mỗi mồi chung (đều đươc
chuẩn bị ở nồng độ 20 μM), 1.5 µL MgCl
2
, 0.25 µL Taq polymerase (Fermentas) và 0.5 μL DNA.
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với điều kiện sau:
khởi đầu biến tính ở 94
O
C trong 5 phút; tiếp theo là 35 chu trình PCR (biến tính ở 94
O
C 30 - 40
giây, gắn mồi ở 50
O
C 35 - 45 giây và tổng hợp sợi ở 72
O
C 1 – 1.5 phút). Phản ứng được kết thúc
với 5 phút ở 72
O
C.

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 % đươc chuẩn bị bằng đệm TAE và chứa 0.5
mg/mL ethidium bromide. Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm
TAE ở điện thế 100 V trong 30 - 40 phút. Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được
chup bằng máy ảnh số.
2.5. Mồi PCR
Ba cặp mồi đã được sử dụng trong nghiên cứu. Chi tiết của các mồi được trình bày ở Bảng 1 và
Hình 2.
Căp mồi thứ nhất là cặp mồi chung (universal/degenerate primers) BegoAFor1 / BegoARev1.
Cặp mồi này được thiết kế trên vùng bảo thủ của gien CP và Rep và đã được chứng minh có khả
năng phát hiện DNA-A của nhiều begomovirus (Ha et al., 2006, 2008)
Hai cặp mồi còn lại là các mồi đặc hiệu cho TYLCVNV (TYLCVNV-sp-F
1
/

TYLCVNV-sp-
R
1
) và ToLCVV (ToLCVV-sp-F
2
/

ToLCVV-sp-R
2
). Các mồi này đã được thiết kế dựa trên trình tự
chuỗi gien đã công bố của 2 virus này.
Bảng 1. Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu
Mồi Trình tự (5’ – 3’) Vị trí
Kích
thước
(bp)

Tham khảo
TYLCVNV-Sp-
F1
TGTGTTACATATTCTGTGTTTTCC 1094-1117
1386
Mã
GeneBank
DQ641697
TYLCVNV-Sp-
R1
AAATACATCAAAATCTGCAGAG
AGC
2456-2480
ToLCVV-Sp-F2 GACCAGTCTGAAGGTGTGAGTTC 1254-1276
454
Mã
GeneBank
DQ641705
ToLCVV-Sp-R2
ACTCAAGCTATAAAGAATACCT
AGAC
1683-1708
BegoAFor1
TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCA
RTC
*
Hình 2 ~1200
Ha et al.,
2006
BegoARev1

ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAA
TCC
*
* Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T), K (G / T) và i =
3
Tài liệu: Docs.vn Hỗ trợ : Y!M minhu888
inosine


2.6. Giải trình tự
Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLink
TM
Quick Gel
Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA được ước lượng
bằng điện di agarose với lượng DNA tham khảo là 2µl, 1µl, 0.5µl tương ứng với 1µg, 0.5 µg, 0.25
µg DNA (marker GeneRuler, Fermantas).
Sản phẩm PCR tinh chiết được giải trình tự trực tiếp cả 2 chiều bằng mồi PCR tại Viện Công
nghệ sinh học (Hà Nội)
2.7. Phân tích trình tự và xây dựng cây phả hệ.
Các chuỗi mẫu được xác định danh tính khi so sánh với các chuỗi đã công bố từ trước nhờ
phần mềm tìm kiếm BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information
( />Phân tích chuỗi và xây dựng cây phả hệ được thực hiện với các phần mềm miễn phí BioEdit
7.0, ClustalX1.83, Mega 4.0 và gói phần mềm thương mại DNASTAR.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Điều tra thu thập mẫu bệnh
Chúng tôi đã tiến hành điều tra bệnh xoăn vàng lá trên các ruộng trồng cà chua thuộc Hà Nội,
Bắc Ninh và Hưng Yên. Tổng số 50 mẫu cà chua đã được thu thập, số liệu hóa và xử lý khô để bảo
quản lâu dài. Các mẫu này đều tạo triệu chứng đặc trưng của bệnh xoăn vàng lá.
3.2. Kiểm tra PCR dùng mồi đặc hiệu begomovirrus
Do số lượng mẫu thu thập khá lớn nên chúng tôi đã chọn 19 mẫu bệnh đại diện cho các địa

điểm khác nhau để kiểm tra PCR. Đầu tiên, chúng tôi sử dụng cặp mồi chung đặc hiệu cho DNA-A
của nhiều loài begomovirus (BegoaFor1/BegoARev1) nhằm phát hiện sự có mặt của virus trong
mẫu cây bệnh. Phản ứng PCR đều tạo ra 1 sản phẩm có kích thước khoảng 1200 bp trên tất cả 19
mẫu thử, chứng tỏ sự có mặt của begomovirus trong mẫu (Hình 3A, Bảng 2)
(CEGPCKVQS)
(IPT/A/SIF/VLCNP)
AV1
AV2
AC3
AC2
AC1
AC4
BegoAFor1
BegoARev1
~ 1.2 kb
DNA-A
Hình 2. Sơ đồ tổ chức bộ gien DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của
begomovirus và vị trí tương đối của cặp mồi BegoAFor1 và BegoARev1. Mũi
tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các ORF. Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là
các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với 2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1.
4
Tài liệu: Docs.vn Hỗ trợ : Y!M minhu888
3.3. Kiểm tra PCR dùng mồi đặc hiệu ToLCVV và TYLCVNV
Hiện nay, tại miền Bắc Việt Nam mới chỉ công bố sự có mặt của 2 begomovirus gây bệnh xoăn
vàng lá cà chua là ToLCVV và TYLCVNV. Để kiểm tra sự có mặt của 2 virus này trên 19 mẫu cà
chua nhiễm begomovirus, chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu cho mỗi virus (phần 2.5).
Kiểm tra PCR với cặp mồi ToLCVV-sp-F2 / ToLCVV-sp-R2 (đặc hiệu ToLCVV) cho thấy 10/19
mẫu thử tạo các băng đơn và rõ với kích thước khoảng 450 bp (Hình 3B, Bảng 2), xác nhận sự có mặt
của ToLCVV.
Kiểm tra PCR với cặp mồi TYLCVNV-sp-R1 / TYLCVNV-sp-F1 (đặc hiệu TYLCVNV) cho thấy

8/19 mẫu tạo ra tạo các băng đơn và rõ với kích thước khoảng 1386 bp (Hình 3C, Bảng 2), xác nhận
sự có mặt của TYLCVNV.
Kiểm tra PCR đã phát hiện thấy mẫu số 12 (mẫu thu tại Yên Mỹ - Thanh Trì - Hà Nội) có kết quả
(+) với cả hai cặp mồi chứng tỏ mẫu này đã nhiễm cả 2 virus ToLCVV và TYLCVNV.
Quan trọng nhất là chúng tôi đã phát hiện 2 mẫu (mẫu số 9, thu tại Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội
và mẫu số 14, thu tại Yên Mỹ – Thanh Trì – Hà Nội) có phản ứng PCR (–) với cả hai cặp mồi. Kết
quả này gợi ý rằng các begomovirus nhiễm trên 2 mẫu này có thể không phải là ToLCVV hay
TYLCVNV. Tuy nhiên danh tính của chúng chỉ thể được xác định dựa trên phân tích trình tự chuỗi
gien virus.




Bảng 2. Kiểm tra PCR các mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá
TT
*
Mã
mẫu
Địa điểm thu mẫu
PCR đặc hiệu
Begomoviru
s
ToLCVV TYLCVNV
1 CC1 Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội. + – +
2 CC2 Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội. + + –
3 CC 3 Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội. + + –
5
1200 bp
454 bp
1386 bp

A
B
C
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá thu thập được.
A) PCR với cặp mồi chung đặc hiệu DNA-A của begomovirus. B) PCR với cặp mồi đặc hiệu DNA-A
của ToLCVV. C) PCR với cặp mồi đặc hiệu DNA-A của TYLCVNV. M là thang DNA (GeneRuler 1
kb, Fermentas). Các số từ 1 đến 19 là các mẫu cà chua (danh tính mẫu được trình bày ở bảng 2). Kích
thước sản phẩm PCR cũng được chỉ rõ.