THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN pdf

THỬ GIỚI HẠN
NHIỄM KHUẨN

THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN


Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mốc có khả
năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong thuốc.
Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Trong khi làm thí nghiệm, chú ý
không đưa chất khử khuẩn vào mẫu thử.
Thử nghiệm được áp dụng cho tất cả các dược phẩm gồm cả nguyên liệu và thành
phẩm của các thuốc không tiệt khuẩn trong quá trình sản xuất.
Thử nghiệm sơ bộ
Tìm chất ức chế có trong thuốc:
Thử nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn sẽ không có giá trị nếu chất ức chế có trong thuốc
cản trở đến khả năng phát hiện các vi khuẩn. Vì vậy cần làm thí nghiệm kiểm tra trước
bằng cách lấy dung dịch chế phẩm đã được pha ở nồng độ thích hợp vào môi trường
chọn lọc cho Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa,
rồi cấy vào đó 1ml canh khuẩn 24 h tuổi đã pha loãng với dung dịch đệm phosphat pH
7,2 ít nhất tới 10
-3
các vi khuẩn tương ứng. Nếu vi khuẩn không mọc, thí nghiệm cần
thay đổi bằng cách:
1. Giữ nguyên lượng chất mang thử nhưng tăng thể tích môi trường.
2. Cho vào môi trường một lượng vừa đủ chất khử hoạt tính thích hợp.
3. Phối hợp cách làm (1) và (2) để vi khuẩn mang cấy có thể mọc được.
Tuỳ theo thành phần và nồng độ của mẫu thử, có thể thêm vào môi trường để trung hoà

chất ức chế các loại sau: lecithin đậu tương 0,5 %, polysorbat 20: 4 %.
Làm lại thí nghiệm với điều kiện chất ức chế trong lượng mẫu mang kiểm tra đã được
trung hoà.
Môi trường
Môi trường nuôi cấy có thể pha theo cách dưới đây hoặc có thể dùng môi trường khô
do các hãng sản xuất môi trường vi sinh vật cung cấp. Các môi trường tự pha chế phải
hấp tiệt khuẩn bằng nồi hấp ở nhiệt độ 115
o
C trong 30 phút trừ khi có những chỉ dẫn
riêng đối với loại môi trường đặc biệt.
Thạch dùng cho pha chế môi trường có độ ẩm dưới 15%. Nước và các chất dùng trong
các công thức phải tinh khiết.
Môi trường lỏng casein lecithin đậu tương polysorbat

Casein pancreatic
Lecithin đậu tương
Polysorbat 20
Nước


20,0 g
5,0 g
40,0 ml
960 ml

Hoà tan casein pancreatic và lecithin đậu tương vào 960 ml nước, đun cách thuỷ ở 48 -
50
o
C khoảng 30 phút cho tan hoàn toàn. Thêm 40 ml polysorbat 20, trộn đều, phân
chia vào các dụng cụ thích hợp.

Môi trường thạch casein đậu tương

Casein pancreatic
Natri clorid
15,0 g
5,0 g
Thạch
Bột đậu tương thủy phân bởi
papain
Nước
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 +
0,2

15,0 g
5,0 g
1000 ml


Môi trường lỏng casein đậu tương
Casein pancreatic
Dikali hydrophosphat
Bột đậu tương thuỷ phân bởi
papain
Glucose
Natri clorid
17,0 g
2,5 g
3,0 g
2,5 g
5,0 g

Nước 1000 ml
Hoà tan các chất rắn vào nước đun nóng nhẹ để tan hoàn toàn. Để nguội dung dịch ở
nhiệt độ phòng, phân chia vào các bình thích hợp đã tiệt khuẩn. pH sau khi tiệt
khuẩn:7,3 + 0,2.
Môi trường thạch muối - manitol
Casein pancreatic
Thạch
Pepton
Cao thịt
Natri clorid
D - Manitol
Đỏ phenol
Nước
5,0 g
15,0 g
5,0 g
1,0 g
75,0 g
10,0 g
0,025 g
1000 ml
Trộn, đun nóng, khuấy đều, đun sôi khoảng 1 phút để tan hoàn toàn, pH sau khi tiệt
khuẩn : 7,4 + 0,2.

Môi trường thạch Baird - Parker
Casein pancreatic
Cao thịt
Cao men bia
Lithi clorid
Thạch

Glycin
Natri pyruvat
Nước
10,0 g
5,0 g
1,0 g
5,0 g
20,0 g
12,0 g
10,0 g
950 ml
Đun nóng, khuấy đều sau đun sôi khoảng 1 phút, tiệt khuẩn, để nguội tới 45 - 50
o
C,
thêm 10 ml dung dịch kali telurit 1% vô khuẩn và 50 ml nhũ dịch lòng đỏ trứng. Trộn
kỹ, nhẹ nhàng rót vào các hộp.
Chế tạo nhũ dịch lòng đỏ trứng bằng cách: Sát khuẩn toàn bộ bề mặt quả trứng, đập vỡ
vô khuẩn quả trứng, lấy lòng đỏ trứng vào ống trụ chia vạch vô khuẩn. Thêm nước
muối vô khuẩn để có tỷ lệ lòng đỏ trứng so với nước muối là 3/7. Bỏ vào một cốc
khuấy vô khuẩn, trộn với tốc độ lớn trong 5 phút.
pH sau khi tiệt khuẩn 6,8 + 0,2.
Môi trường thạch Vogel – Johnson

Casein pancreatic
Cao men bia
Manitol
Natri pyruvat
Thạch
Glycin
Lithi clorid

Dikali hydrophosphat
Đỏ phenol
10,0 g
5,0 g
10,0 g
10,0 g
16,0 g
10,0 g
5,0 g
5,0 g
25,0 mg
Nước 1000 ml
Đun sôi để hoà tan các chất rắn trong khoảng 1 phút. Tiệt khuẩn, để nguội đến 45 -
50
0
C. Thêm 20 ml dung dịch kali telurit 1% vô khuẩn.
pH sau khi tiệt khuẩn 7,2 + 0,2.
Môi trường thạch cetrimid
Gelatin pancreatic
Cetrimid (Cetyl trimethylamoni
bromid)
Magnesi clorid
Thạch
Glycerin
Nước
20,0 g
0,3 g
1,4 g
13,6 g
10,0 ml

1000 ml

Hoà tan tất cả các chất rắn vào trong nước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun
sôi 1 phút cho tan hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn : 7,2 + 0,2
Môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện Fluorescin
Casein pancreatic
Peton
Dikali hydrophosphat khan
Magnesi sulfat (MgSO
4
.7H
2
O)
Thạch
Glycerin
Nước
10,0 g
10,0 g
1,5 g
1,5 g
15,0 g
10,0 ml
1000 ml
Hoà tan tất cả các chất rắn vào nước trước khi thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều,
đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 + 0,2.
Môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện Pyocyanin
Gelatin pancreatic
Kali sunfat khan

20,0 g
10,0 g
Thạch
Magnesi clorid khan
Glycerin
Nước
15,0 g
1,4 g
10,0 ml
1000 ml
Hoà tan các chất rắn trong nước trước khi thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi
khoảng 1 phút để tan hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 + 0,2.
Môi trường lỏng lactose
Cao thịt
Lactose
Gelatin pancreatic
Nước
3,0 g
5,0 g
5,0 g
1000 ml
Làm lạnh rất nhanh môi trường sau khi tiệt khuẩn.
pH sau khi tiệt khuẩn : 6,9 + 0,2

Môi trường lỏng selenit - cystin
Casein pancreatic
Natri selenit acid
Dinatri phosphat
Lactose

L- Cystin
Nước
5,0 g
4,0 g
10,0 g
4,0 g
10,0 mg
1000 ml
Đun nóng để tan hoàn toàn. Đun tiếp 15 phút nữa. Không cần tiệt khuẩn tiếp theo.
pH sau khi tiệt khuẩn : 7,0 +0,2
Môi trường lỏng tetrathionat
Casein pancreatic
Calci carbonat
Muối mật
Pepton
2,5 g
10,0 g
1,0 g
2,5 g
Natri thiosulfat
Nước
30,0 g
1000 ml
Đun nóng để hoà tan các chất rắn. Khi sử dụng thêm vào môi trường dung dịch gồm:
5,0 g kali iodid và 6,0 g iod trong 20 ml nước. Sau đó thêm 10ml dung dịch xanh
brilliant 1% và trộn đều. Không đun nóng môi trường sau khi thêm dung dịch xanh
brilliant.
Môi trường thạch xanh brilliant
Pepton
Đường trắng

Cao men bia
Casein pancreatic
Lactose
Natri clorid
Thạch
Đỏ phenol
5,0 g
10,0 g

3,0 g
5,0 g
10,0 g
5,0 g
20,0 g
80,0 mg

Xanh brilliant
Nước
12,5 mg
1000
ml
Đun sôi để hoà tan tất cả các chất rắn trong 1 phút. Chỉ tiệt khuẩn trước khi dùng. Rót
vào các hộp Petri và để nguội.
pH sau khi tiệt khuẩn: 6,9 +0,2
Môi trường thạch xylose - lysin - desoxycholat
Xylose
Đỏ phenol
L-Lysin
Thạch
Lactose

Natri desoxycholat
Đường trắng
Natri thiosulfat
3,5 g
0,08 g
5,0 g
13,5 g
7,5 g
2,5 g
7,5 g
6,8 g
Natri clorid
Săt (III) amoni citrat
Cao men bia
Nước
5,0 g
0,8 g
3,0 g
1000 ml

Đun nóng, lắc tròn để trộn đều chất rắn với nước. Chú ý không để nóng quá. Chuyển
ngay vào bình cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 50
o
C. Rót vào các đĩa ngay trước khi môi
trường nguội hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,4 + 0,2
Môi trường thạch bismuth sulfit
Cao thịt
Sắt (II) sulfat
Casein pancreatic

Bismuth sulfit
Pepton
Thạch
5,0 g
0,3 g
5,0 g
8,0 g
5,0 g
20,0 g
Glucose
Xanh brilliant
Dinatri hydrophosphat
Nước
5,0 g
25,0
mg
4,0 g
1000
ml
Đun nóng, lắc tròn để hoà đều các chất rắn với nước, không để nóng quá. Chuyển
ngay vào bình cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 50
0
C. Rót vào các đĩa để nguội.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,6 + 0,2
Môi trường thạch - sắt - ba đường
Casein pancreatic
Sắt (II) amoni sulfat
Pepton
Natri clorid
Lactose

10,0 g
0,2 g
20,0 g
5,0 g
10,0 g
Natri thiosulfat
Đường trắng
Thạch
D-Glucose monohydrat
Đỏ phenol
Nước
0,3 g
10,0 g
13,0 g
1,0 g
0,025 g
1000 ml
Hoà nóng các chất rắn với nước, đun sôi một phút cho tan hoàn toàn. Chuyển vào các
dụng cụ thích hợp để tiệt khuẩn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 + 0,2
Môi trường Mac - Conkey
Casein pancreatic
Natri clorid
Gelatin pancreatic
Thạch
1,5 g
5,0 g
17,0 g
13,5 g
Pepton

Lactose
Muối mật
Đỏ trung tính
Tím tinh thể
Nước
1,5 g
10,0 g
1,5 g
30,0 mg
1,0 mg
1000 ml

Hoà nóng các chất rắn với nước, đun sôi một phút cho tan hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn : 7,1 + 0,2
Môi trường thạch Levine - eosin - xanh methylen
Gelatin pancreatic
Dikali hydrophosphat
Thạch
Lactose
Eosin
Xanh methylen
Nước
10,0 g
2,0 g
15,0 g
10,0 g
0,4 g
0,065 g
1000 ml
Hoà tan nóng các thành phần gelatin pancreatic, dikali hydrophosphat và thạch trong

nước, để lạnh. Các thành phần còn lại chỉ thêm vào khi sử dụng bằng cách đun chảy
môi trường rồi thêm vào theo tỷ lệ: Cứ 100 ml môi trường thêm 5 ml dung dịch lactose
(1:5), 2 ml dung dịch eosin và 2 ml dung dịch xanh methylen (1:300). Môi trường sau
khi hoà trộn phải trong.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 + 0,2
Môi trường thạch Sabouraud
Glucosa 40,0 g
Casein pancreatic
Pepton
Thạch
Nước
5,0 g
5,0 g

15,0 g
1000 ml
Hoà tan, đun sôi cho tan hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn : 5,6 + 0,2
Môi trường thạch - khoai tây - glucose
Nấu 300 g khoai tây đã bóc vỏ và thái nhỏ trong 500 ml nước cất, lọc qua vải, thêm
nước cất để được 1000 ml, rồi thêm vào các thành phần sau: thạch 15 g; glucose 20 g.
Hoà tan nóng. Tiệt khuẩn. Khi dùng đun nóng chảy, để nguội đến 45
o
C. Điều chỉnh
môi trường bằng dung dịch acid tartric (1:10) đến pH 3,5 + 0,1. Rót vào các đĩa.
Chú ý:
Không dùng môi trường đun nóng trở lại lần thứ 2
Để ức chế vi khuẩn thường gặp mọc trên môi trường phát hiện nấm, mốc và men (môi
trường Sabouraud hoặc môi trường thạch - khoai tây- glucose) thêm vào một lít môi
trường 0,1g tetracyclin hoặc 50 mg cloramphenicol, làm đều ngay trước khi dùng.

Dung dịch đệm Natri clorid – pepton pH 7,0
Kali dihydro phosphat 3,56 g
Natri hydro phosphat 7,23 g
Natri clorid 4,30 g
Pepton 1,00 g
Nước cất 1000 ml
Có thể thêm chất hoạt động bề mặt hoặc chất khử tác dụng kháng khuẩn vào dung dịch
này như Polysorbat 80 0,1 đến 1,0%.
Hấp tiệt trựng 121
0
C trong 15 phỳt.
Môi trường nước thịt
Cao thịt 5,0 g
Nước 1000 ml
Môi trường thạch thường
Pepton 10,0 g
Natri clorid
Thạch
Nước
pH sau khi tiệt khuẩn
5,0 g
15 - 20 g
1000 ml
7,4 + 0,2
Môi trường pepton - natri clorid
Pepton
Natri clorid
Nước
pH sau khi tiệt khuẩn
10,0 g

5,0 g
1000 ml
7,0 + 0,2
Môi trường tăng sinh cho Clostridia
Cao thịt
Pepton
Cao men bia
Tinh bột dẽ tan
10,0 g
10,0 g
3,0 g
1,0 g
Glucose monohydrat
Cystein hydroclorid
Natri clorid
Natri acetat
Thạch
Nước cất
5,0 g
0,5 g
5,0 g
3,0 g
0,5 g
1000 ml
Hoà tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Hấp tiệt khuẩn 121
o
C
trong 15 phút. Nếu cần điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng 6,8.
Môi trường thạch Columbia
Casein pancreatic

Thịt
Dịch tim pancreatic
Cao men bia
Tinh bột ngô
10,0 g
5,0 g
3,0 g
5,0 g
1,0 g
Natri clorid
Thạch bột
Nước cất
5,0 g
15,0 g
1000 ml
Hoà tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Nếu cần điều chỉnh pH
sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng 7,3 + 0,2. Hấp tiệt khuẩn 121
o
C trong 15 phút. Làm
lạnh tới 45
o
C đến 50
o
C. Khi cần có thể thêm 20 mg gentamycin base và rót vào các
hộp Petri.
Môi trường sulfit - lactose
Casein pancreatic
Cao men bia
Cystein hydroclorid
Natri clorid

Lactose
Nước cất
5,0 g
2,5 g
0,3 g
2,5 g
10,0 g
1000 ml
Hoà tan tất cả các thành phần trong nước và điều chỉnh để có pH 7,1 + 0,1. Đóng vào
các ống nghiệm 16 x 160 mm mỗi ống 8 ml và một ống nhỏ Durham. Hấp tiệt khuẩn
121
o
C trong 15 phút. Bảo quản ở 4
o
C.
Môi trường lỏng Enterobacteria - Mossel
Genlatin pancreatic
D-Glucose monohydrat
Mật bò khô
Kali dihydrophosphat
Dinatri hydrophosphat
Xanh brilliant
Nước cất
10,0 g
5,0 g
20,0 g
2,0 g
8,0 g
15 mg
1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,0 - 7,4. Đun sôi trong 30 phút và làm lạnh
ngay.
Môi trường muối mật violet - red
Cao men bia 3,0 g