Lên men Malolatic trong sản xuất rượu vang

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang

CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG
Sự ra đời “Etude sur le vin” của L.Pasteur đã khiến hầu hết các nhà làm rượu vang vào cuối
thế kỷ XIX đều tin rằng sự có mặt của vi khuẩn lactic trong rượu là một trong những nhân tố
bất lợi cho quá trình sản xuất và ảnh hưởng không tốt đến chất lượng sản phẩm.
Song, vào những năm 20 của thế kỷ XX, nghiên cứu của 2 tác giả Ferré và Ribéreau (1920)
trên hai loại rượu vang đỏ Burgundy và Boudeaux đã chứng minh được rằng vai trò rất quan
trọng của quá trình chuyển hóa acid malic trong sản xuất rượu vang. Nhờ đó mà quá trình lên
men malolactic đã được con người chấp nhận và khuyến khích sử dụng như một quá trình lên
men phụ xảy ra trong rượu vang nhằm mục đích chuyển hóa acid malic có trong vang nho, đặc
biệt là đối với vang đỏ. Quá trình này góp phần làm giảm vò chua gắt của acid malic, giúp cải
thiện hương và đảm bảo độ bền về mặt vi sinh cho sản phẩm rượu vang.
Sau đó, một loạt các nổ lực tìm kiếm các tác nhân gây ra quá trình lên men malolactic được
tiến hành. Người ta thấy rằng, dòch nho và vang là một môi trường mang tính chọn lọc đối với
một vài loài vi khuẩn lactic. Những loài này hiện nay đã được biết đến tương đối chính xác
(Lafon-Lafourcade and Joyeux, 1979). Trong một vài nghiên cứu trên dòch nước nho, các tác giả
Fendant và Dôle; Maret và Sozzi (1977, 1979); Marel và cộng sự (1979) đã ghi nhận lại sự có
mặt của các loài vi khuẩn lactic lên men đồng hình thuộc giống Lactobacillus (Lb. plantarum,
Lb. casei) trong dòch nho. Trong suốt giai đoạn lên men ethanol, những loài này bò biến mất
cùng với các loài lên men lactic dò hình (Lb. hilgardii, Lb. brevis). Các loài vi khuẩn lactic có
trong canh trường lúc này hầu hết đều thuộc giống Pediococcus (P. cerevisiae, P. pentosaceus)
và một loài trong giống Leuconostoc (Leuconostoc oenos). Như vậy, những vi khuẩn lactic đồng
hình thuộc giống Lactobacillus có mặt chủ yếu trong dòch nho sẽ bò tiêu diệt rất nhanh sau khi
bắt đầu quá trình lên men rượu và được thay thế bởi loài Leuconostoc oenos ở giai đoạn cuối
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 2
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang

của quá trình này. Đối với vang Bordeaux và Charentes (Pháp), Leuconostoc oenos này được
xem như là tác nhân chính gây lên men malolactic. Trong khi đối với rượu vang của Đức
(Benda, 1982) và Australia (Pan và cộng sự, 1980) thì Pediococcus lại chiếm ưu thế hơn. Sự
khác biệt này được tạo nên do nhiều nguyên nhân khác nhau, chủ yếu là do tính chất của mỗi
loại vang như sự đa dạng về thành phần, pH; khí hậu; chế độ trồng và bảo quản nho nguyên
liệu.
Trong một khoảng thời gian dài sau đó, con người đã cố gắng thúc đẩy quá trình lên men
malolactic bằng nhiều cách khác nhau, kể cả việc cấy giống vi khuẩn lactic thuần khiết vào dòch
nho và vang. Nhưng cho đến 1983, một vấn đề cần giải quyết như lượng sinh khối cho vào canh
trường đủ cho quá trình lên men và đạt được chất lượng mong muốn cũng như trạng thái sinh
lý của vi khuẩn trong canh trường cũng vẫn chưa được biết đến một cách rõ ràng.
Về sau, khi nghiên cứu thực hiện quá trình lên men malolatic trong phòng thí nghiệm bằng
cách cấy giống vi khuẩn từ bên ngoài vào, đặc biệt gần đây các nhà sản xuất thường sử dụng
các chế phẩm vi khuẩn Leuconostoc oenos đã qua sấy thăng hoa, người ta nhận thấy rằng loài
này có khả năng chống chòu rất tốt trong môi trường có pH thấp (pH 3,2), nồng độ ethanol cao
(12%) và hàm lượng SO
2
là 13 mg/L. Tuy nhiên, khi áp dụng trực tiếp vào thực tế sản xuất thì
kết quả đạt được không tốt, khoảng 90% lượng giống cấy ban đầu bò chết khi cho vào vang đỏ và
thậm chí nhiều hơn ở vang trắng. Do đó, người ta đã đưa ra giải pháp khắc phục như sau: trước
khi sử dụng, cần tái hoạt hóa các tế bào (reactivate) bằng cách cho chúng vào một môi trường
thuận lợi để có thể đạt được trạng thái sinh lý thích nghi cao hơn, tăng khả năng chống chòu
hơn với môi trường nước nho sau quá trình lên men ethanol. Kết quả đạt được theo phương án
này là rất tốt, khả năng sống sót của những chủng tái hoạt hóa này rất cao.
Một khó khăn khác trong tiến trình nghiên cứu và vẫn đang là vấn đề gây tranh cãi là việc
xác đònh thời điểm tiến hành cấy giống vào canh trường. Nhiều tác giả như Kunkee và cộng sự
(1967) đã đề nghò cấy giống trong giai đoạn lên men rượu. Một số khác lại cho rằng thời điểm
thích hợp hơn để cấy giống là trước hoặc sau khi lên men rượu (Gallander, 1979). Ribéreau-
Gayon và cộng sự (1975) lại đề nghò không nên đưa giống cấy vào thời điểm trước khi lượng
đường hoàn toàn cạn kiệt.

Từ những thành quả đạt được, con người vẫn đang tiếp tục tìm tòi và khám phá những giải
pháp mới về mặt công nghệ để hoàn thiện và nâng cao hiệu quả quá trình lên men malolactic
bao gồm:
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 3
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
 Việc nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic cố đònh để chuyển hóa acid malic thành acid
lactic trong các môi trường nuôi cấy tónh (Spettoli và cộng sự, 1982), nuôi cấy liên tục
(Cuenat và Villettaz, 1984), kể cả việc việc so sánh năng lực chuyển hóa acid malic của
các chủng nuôi cấy khác nhau (Naouri và cộng sự, 1991).
 Vấn đề chuyển hóa acid malic bởi enzyme malolactic cố đònh (EC 1.1.1.38) cũng được đề
cập đến rất nhiều nhưng kết quả nghiên cứu khi sử dụng enzyme cố đònh trên gel hầu
như không thành công (S. Gestrelius, 1982).
Nói tóm lại, lên men malolactic là một quá trình đóng một vai trò quan trọng trong sản xuất
rượu vang, bên cạnh quá trình lên men chính được thực hiện bởi nấm men để tạo nên chất
lượng cho sản phẩm thì quá trình lên men malolactic đóng một vai trò không thể thiếu trong
việc làm biến đổi các thành phần hoá học, góp phần cải thiện chất lượng về mặt giá trò cảm
quan của sản phẩm, mang lại cho rượu vang những hương vò đặc trưng. Việc tìm kiếm những
những giải pháp kỹ thuật ứng dụng cho quá trình này đã được con người nghiên cứu từ rất lâu
và vẫn đang được tiếp tục. Nhưng đến nay, những kết quả đạt được cũng chỉ mang ý nghóa về
mặt học thuật và chưa được áp dụng rộng rãi trong thực tế sản xuất.
1.2 KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALOLACTIC
1.2.1 Đònh nghóa
Lên men malolactic (ML) là một quá trình chuyển hoá L-malic acid (chứa 2 nhóm carboxyl
trong phân tử) thành L- hoặc D-acid lactic (chỉ chứa một nhóm carboxyl) và carbon dioxide
được thực hiện bởi các giống vi khuẩn lactic bao gồm Lactobacillus, Oenococcus, Leuconostoc,
Pediococcus. Đây thực chất là một quá trình dò hoá acid malic, khi đó L-malic được decarboxyl
hoá thành L-lactic acid bởi xúc tác là enzyme malate carboxylase (EC1.1.1.38). Quá trình này
xảy ra bên trong tế bào theo phản ứng sau:

Một số tác giả (Margalit, 1997) cho rằng đây thực chất chỉ là một phản ứng hoá sinh vì quá

trình này đơn giản chỉ có sự tham gia của một enzyme - xúc tác cho phản ứng tách nhóm CO
2

của cơ chất là acid malic thành acid lactic. Kết quả của phản ứng này là với mỗi 1 gam acid
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 4
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
malic sẽ tạo thành được 0,67 gam acid lactic và 0,33 gam CO
2
nhưng lại không sinh ra năng
lượng dưới dạng ATP mà tế bào có thể sử dụng được.
Tuy nhiên, nếu xét về ý nghóa của biến đổi trên đối với sự trao đổi chất của vi khuẩn lactic
thì chúng ta có thể xem đây là một quá trình lên men bởi vì nguyên nhân sau: cũng giống như
những quá trình lên men thông thường, mục đích của vi sinh vật thực hiện các chuyển hoá cơ
chất cũng chỉ phục vụ cho nhu cầu về mặt năng lượng để chúng có thể sinh trưởng và phát
triển (xem chi tiết ở phần 2.1.2.2). Quá trình lên men malolactic xảy ra bên trong tế bào cũng
có ý nghóa tương tự. Khi thực hiện phản ứng trên, chất cho điện tử chính là acid malic còn chất
nhận điện tử cũng chính là NAD
+
để chuyển thành NADH+H
+
và chất này sẽ tham gia vào các
chu trình sinh hoá trong cơ thể sinh vật để sản sinh ra năng lượng cung cấp cho tế bào.
Ngoài ra, cũng theo tác giả Margalit (1997), trong quá trình lên men malolactic, vi khuẩn
lactic có thể sử dụng 3 con đường khác nhau để chuyển hoá acid malic:
 Con đường chuyển hóa trực tiếp L-acid malic thành L-acid lactic và carbon dioxide nhờ
enzyme malate carboxylase. Cơ chế này có mặt ở hầu hết vi khuẩn malolactic.
 Con đường thứ hai liên quan đến việc phân giải acid malic nhờ xúc tác của hệ “enzyme
malic” thành oxaloacetate và tiếp tục thành acid pyruvic và CO
2
. L-lactate

dehydrogenase, sau đó, sẽ xúc tác cho phản ứng khử acid pyruvic thành L-acid lactic. Cơ
chế này được tìm thấy ở Lactobacillus casei và Lactobacillus faecalis.

 Con đường thứ ba là được tìm thấy ở Lactobacillus fermentum. Vi khuẩn này có khả
năng chuyển hóa L-acid malic thành acid lactic ở cả hai dạng đồng phân L- và D-. Ngoài
ra, còn có một số sản phẩm trao đổi chất trung gian như acetate, succinate và carbon
dioxide.
1.2.2 Vò trí của lên men malolactic trong quy trình sản xuất rượu vang
Trong công nghiệp sản xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiến hành sau
khi lên men chính, dòch lên men thu được gọi là “vang non” được tiến hành lắng gạn cặn và
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 5
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
được chuyển sang bồn hay nồi lên men tiếp theo. Quá trình này diễn ra rất chậm nhằm để
phân giải những gam đường cuối cùng, song song với quá trình này là vi khuẩn lactic sẽ phân
giải acid malic thành acid lactic làm cho vang được chuyển từ vò chua gắt sang vò chua nhẹ dễ
chòu, CO
2
còn được tiếp tục giải phóng nhưng có xu hướng giảm dần, hương vò rượu vang cũng
được hoàn thiện. Dung dòch lên men ở trạng thái tónh lặng, xác nấm men lắng xuống đáy bồn
hay nồi lên men. Tiếp theo, dòch vang được tiến hành lắng gạn tiếp vài lần, mỗi lần từ 20 đến
30 ngày để ổn đònh thành phần của rượu vang rồi tiếp tục đến quá trình ủ chín.
1.3 MỤC ĐÍCH VÀ ỨNG DỤNG
1.3.1 Mục đích
Lên men malolactic là một quá trình rất quan trọng trong sản xuất các loại vang đỏ hoặc các
loại rượu vang có độ chua cao được sản xuất từ những giống nho trồng ở các vùng khí hậu lạnh.
Quá trình này hoàn toàn không gây nguy hiểm đối với chất lượng vang vì trong quá trình lên
men vi khuẩn lactic chỉ sử dụng acid malic là chính mà không tác động gì tới các cấu tử và
thành phần khác có trong vang. E. Peymand đã xếp mức độ nguy hiểm cho chất lượng rượu
vang do tác động của vi khuẩn lactic theo chiều tăng dần lên như sau:
 Lên men đường arabinose, acid citric và đường xylose tạo thành một lượng không lớn

lắm các acid bay hơi và làm giảm chất lượng vang không đáng kể.
 Lên men acid tartaric, glycerin, glucose, fructose làm thay đổi khá rõ các hợp phần có
trong vang và làm giảm chất lượng của vang.
Mức độ gây xấu hay ảnh hưởng không tốt chất lượng rượu vang phụ thuộc vào đặc tính của
chủng vi khuẩn lactic và đặc điểm của vang. Quá trình lên men malolactic có ba ý nghóa quan
trọng trong sản xuất rượu vang:
1- Làm giảm độ acid của dòch vang sau lên men
Trước hết, về mặt hoá học, quá trình lên men ML làm cho pH của môi trường lên men tăng
lên khoảng 0,1 đến 0,3 đơn vò và làm giảm độ acid tổng (titratable acidity) xuống khoảng 0,01
đến 0,03 g/L (tính theo acid tartaric) bởi quá trình decarboxyl hoá một gốc acid và chuyển acid
malic thành acid lactic có độ acid yếu hơn. Tuy nhiên, không phải tất cả acid malic đều được
chuyển hoá hoàn toàn thành acid lactic mà chỉ khoảng 2/3 hàm lượng của chúng được chuyển
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 6
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
hoá thành acid lactic. Phần còn lại có thể bò phân giải hoặc oxi hoá thành CO
2
và thoát khỏi
dòch lên men.
2- Điều chỉnh hương vò đặc trưng cho vang
Sự chuyển hoá acid malic thường đi kèm với quá trình lên men các loại đường còn lại để tạo
ra rất nhiều sản phẩm là những hợp chất dễ bay hơi như alcetaldehyde, diacetyl, acetoin, acetic
acid, 2,3-butadiol, ethyl lactate và các rượu bậc cao... Tất cả các hợp chất này tạo nên một tổ
hợp các hương vò đặc trưng góp phần làm tăng phẩm chất của rượu vang thành phẩm.
3- Làm ổn đònh về mặt vi sinh cho rượu vang thành phẩm
Cuối cùng, về mặt bảo quản, quá trình lên men malolactic góp phần tạo nên tính ổn đònh về
chất lượng cảm quan và vi sinh. Điều này có nghóa là sự hiện diện của quá trình lên men
malolactic có khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật khác. Sự ức chế này được giải
thích bởi 3 nguyên nhân:
 Một số vi khuẩn không mong muốn có khả năng sử dụng acid malic làm nguồn chất
dinh dưỡng. Vì thế, việc giảm hàm lượng acid malic trong dòch lên men sẽ mang lại kết

quả tốt để giảm thiểu rủi ro về mặt vi sinh.
 Vi khuẩn malolactic sinh trưởng trước trong môi trường pH thấp và chúng sử dụng các
chất dinh dưỡng như (amino acid, các base nitơ, vitamin) làm cho môi trường ngày càng
nghèo nàn những chất này. Từ đó giới hạn được sự sinh trưởng và phát triển của những
vi khuẩn khác.
 Một số vi khuẩn malolactic có thể sản sinh ra độc tố (bacteriocins) có thể ức chế sinh
trưởng của những vi sinh vật khác mà không gây ảnh hưởng gì về mặt cảm quan và sức
khỏe con người.
Người ta nhận thấy rằng ở những loại rượu vang không có quá trình lên men malolactic hay
quá trình này không được kiểm soát chặt chẽ thì sau một thời gian đóng chai và bảo quản
thường xảy ra hiện tượng bò đục dòch vang hay đôi khi hình thành nên cặn lắng hay sủi bọt nhẹ
có khi kèm theo mùi lạ gần giống với mùi của món dưa cải bắp truyền thống của Đức
(sauerkraut). Dù ít hay nhiều thì điều này cũng làm ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng của rượu
vang thành phẩm. Vì vậy, nếu quá trình lên men malolactic được thực hiện một cách có kiểm
soát thì những rủi ro này có thể được loại trừ.

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 7
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
1.3.2 Phạm vi ứng dụng
Hiện nay, quá trình lên men malolactic được xem như là một giải pháp công nghệ quan
trọng nhằm cải thiện chất lượng của rượu vang đỏ và một số rượu rượu vang trắng (ở một số
vùng như Switzerland, Burgundy). Người ta nhận thấy rằng hầu hết các loại vang đỏ và khoảng
20% rượu vang trắng trên thế giới đều phải trải qua quá trình lên men này.
Đứng trên phương diện thành phần hoá học, lên men malolactic chỉ thích hợp cho sản xuất
các loại rượu vang có độ pH thấp, tức là có hàm lượng acid cao. Hầu hết các rượu vang đỏ (red
wine) trên thế giới đều được sản xuất thông qua quá trình lên men malolactic. Ví dụ như các
loại rượu vang đỏ: Pinot Noir, Merlot và Cabernet đều được tiến hành lên men malolactic gần
như hoàn toàn. Quá trình lên men malolactic xảy ra hầu hết ở vang đỏ bởi vì ở các vang này có
hàm lượng acid malic khá cao. Acid malic có thể bò phân giải bởi vi khuẩn lactic thành acid
lactic làm giảm vò chua gắt khó chòu cho vang. Hàm lượng acid malic trong nho còn tuỳ thuộc

vào giống nho, điều kiện trồng trọt và thời tiết. Đối với những loại rượu vang được sản xuất ở
vùng có khí hậu lạnh, đặc biệt là Đức, Pháp và miền đông nước Mỹ, thường có hàm lượng acid
malic khá cao nên cần thực hiện quá trình lên men malolactic. Ở vùng có khí hậu ấm áp hơn
thì ngược lại. Hầu như hàm lượng acid malic của nho sẽ giảm cùng với quá trình chín, do đó
nếu sử dụng loại nho này để lên men malolactic thì không thích hợp do hiệu quả của quá trình
làm giảm độ chua không đáng kểù mà thêm vào đó những chỉ tiêu về cảm quan mong muốn
cũng khó có thể đạt được (Davis và cộng sự 1985; Henick-Kling, 1993).
Đối với vang trắng, trừ trường hợp ngoại lệ là vang đi từ giống nho Pinot Chardonnay và
vang sản xuất tại Champagne, các nhà sản xuất rượu vang đều cho rằng các loại vang này đều
không thích hợp để lên men malolactic (theo Ribéreau-Gayon và công sự, 1975). Vấn đề quan
trọng đầu tiên là do hàm lượng acid tartaric có trong nho nguyên liệu thường cao hơn rất nhiều
so với hàm lượng acid malic và do đó, có thể dẫn đến pH thấp nhưng không thể kích thích vi
khuẩn lactic lên men. Để ngăn chặn và ức chế quá trình lên men malolactic xảy ra, người ta
thường sulfite hoá hoặc làm lạnh dòch lên men sau giai đoạn lên men chính.
Ngoài ra, một số loại rượu vang được sản xuất từ các loại trái cây khác ngoài nho như quả
mâm xôi (blackberry) hay quả anh đào (cherry) thì không cần thiết thực hiện quá trình lên men
malolactic. Người ta cho rằng, điều quan trọng nhất trong việc sản xuất các loại rượu vang này ở
chỗ hương vò trái cây (fruitiness) rất đặc trưng của chúng. Quá trình lên men malolactic có thể
làm giảm đi những hương vò đặc trưng này. Vì vậy, khi sản xuất các loại rượu vang dạng này
cần nên tránh quá trình lên men malolactic.
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 8
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
CHƯƠNG 2
TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC

2.1. VI KHUẨN LÊN MEN MALOLACTIC
2.1.1 Phân loại và hình thái vi khuẩn malolactic
Thuật ngữ “vi khuẩn malolactic” (malolactic bacteria) được dùng để chỉ những giống vi
khuẩn có khả năng lên men được acid malic trong rượu vang thành acid lactic. Có 4 giống vi
khuẩn lactic rất quan trọng trong sản xuất rượu vang: Lactobacillus, Oenococcus, Pediococcus,

Leuconostoc.

Oenococcus Pediococcus Lactobacillus
Hình 2.1 Các giống vi khuẩn lên men malolactic
1- Lactobaccilus.
Các trực khuẩn thuộc giống Lactobacillus đều là vi khuẩn gram dương. Chúng thường có
dạng hình que dài hoặc cũng có thể là ngắn gần như hình cầu. Đường kính khoảng 0,5 ÷0,7
µm và chiều dài có thể lên đến 8µm. Chúng đứng riêng lẻ, kết đôi hoặc kết thành chuỗi.
Có nhiều loài trong Lactobacillus được tìm thấy trong vang, được chia thành 2 nhóm: lên
men lactic đồng hình và dò hình tuỳ thuộc vào khả năng lên men đường hexose và pentose. Các
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 9
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
loài lên men lactic đồng hình được liệt kê trong bảng 2.1 chỉ tạo ra được acid lactic từ đường.
Những loài vi khuẩn lactic dò hình được liệt kê trong bảng đều là những loài dò hình bắt buộc,
nghóa là lên men đường tạo sản phẩm là acid lactic, chúng còn có khả năng tạo ra nhiều sản
phẩm như acid acetic, acid succinic, ethanol, carbon dioxide... pH hoạt động tối thích cho các
trực khuẩn Lactobacillus là 5,5 ÷5,8. Chúng không thể sinh trưởng được trong môi trường có
pH thấp hơn 3,5.
Bảng 2.1 Vi khuẩn Lactobacillus lên men đồng hình và dò hình thường gặp trong rượu vang
Lên men đồng hình đường hexose Lên men dò hình đường hexose
L. bavaricus
L. casei
L. homohoichii
L. curvatus
L. saki
L. plantarum
L. fermentum
L. brevis
L. buchneri
L. fructovorans

L. hilgardii
2- Pediococcus
Thuộc giống này là các vi khuẩn hình cầu, gram dương, không sinh bào tử, không chuyển
động, đứng riêng lẻ hoặc kết đôi, kết ba, kết bốn hoặc kết thành chùm, đôi khi thành chuỗi.
Chúng có thể là thể kò khí hoặc vi hiếu khí. Tất cả các loài vi khuẩn lactic thuộc giống này đều
lên men lactic đồng hình, nghóa là chúng chỉ có thể lên men đường thành acid lactic. Khác với
các vi khuẩn gram dương điển hình, chúng không chứa acid teichoic trong thành tế bào. Có 4
loài Pediococcus có khả năng phát triển ở pH 4,2 hoặc thấp hơn thường gặp trong rượu vang là:
P. damnosus, P. parvulus, P. pentosaceus, P. acidilactici.
3- Leuconostoc và Oenococcus
Tất cả các vi khuẩn Leuconostoc đều lên men dò hình, các tế bào thuộc các giống này có
hình cầu hay hình trứng dài, đứng riêng lẻ, kết đôi hoặc tạo thành chuỗi ngắn, có khả năng tạo
NH
3
từ asparagin và không có enzyme catalase. Việc nghiên cứu nuôi cấy giống vi khuẩn này
rất khó khăn vì chúng đòi hỏi môi trường nuôi cấy cần vài chất dinh dưỡng đặc biệt như β-D-
glucopyranosyl-D-pantothenic, nguồn acid béo sử dụng là Tween 80 và chất ức chế nấm men
cycloheximide. Người ta có thể nuôi cấy chúng trong dòch ép cà chua, táo hoặc nho. Tuy nhiên,
kết quả nghiên cứu cho thấy rằng chỉ có một loài của Leuconostoc được tìm thấy và phân lập từ
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 10
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
vang nho, đó là Leuconostoc oenos. Loài này có đặc
điểm hoàn toàn khác với những loài vi khuẩn khác
thuộc nhóm này là chúng có thể phát triển ở nồng
độ ethanol cao (>10%) và pH thấp (<4,2). Do đó,
vào năm 1995 một số nhà phân loại vi sinh vật học
đã đề xuất và đặt với tên mới là Oenoccocus oeni.
Cho đến nay, cách phân loại này được nhiều nhà
khoa học chấp nhận và Oenoccocus oeni đã trở
thành cái tên chính thức cho loài vi khuẩn này.

Trong số các giống vi khuẩn kể trên, qua rất nhiều nghiên cứu người ta thấy rằng vi khuẩn
Oenococcus oeni là loài có khả năng sinh trưởng mạnh mẽ nhất (chòu đựng và thích nghi tốt
nhất trong môi trường rượu vang). Đồng thời chúng còn có khả năng cải thiện hương và vò làm
tăng chất lượng cho sản phẩm. Các chủng vi khuẩn còn lại tuy vẫn có khả năng chuyển hóa
acid malic là giảm vò chua cho rượu vang nhưng chúng không có khả năng điều chỉnh hương vò
(off-flavour), thậm chí có thể là nguyên nhân gây ra các biến đổi không mong muốn trong giai
đoạn tàng trữ và bảo quản sản phẩm. Vì thế, trong công nghiệp sản xuất rượu vang Oenococcus
oeni là loài mang lại nhiều đặc tính mong muốn nhất cho chất lượng rượu vang và được nhiều
nhà sản xuất ưu tiên lựa chọn.
2.1.2 Đặc điểm sinh lý của Oenococcus oeni
2.1.2.1 Nhu cầu về chất dinh dưỡng
1- Nguồn carbon
Carbohydrate
 Monosaccharide: pentose và hexose
Con đường trao đổi các loại đường của vi khuẩn malolactic chưa được giải thích một cách
đầy đủ, đặc biệt là đối với chủng oenococci (Gravie 1986). Tuy nhiên, người ta có thể dự đoán
rằng vi khuẩn malolactic có thể chuyển hóa đường theo các con đường tương tự như những vi
khuẩn lên men dò hình khác.
Hình 2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 11
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt các con đường trao đổi chất ở vi khuẩn malolactic
Đường pentose
Việc chuyển hóa đường pentose (arabinose, ribose, xylose) được thực hiện thông qua con
đường pentose phosphate (Hình 2.4). Từ một phân tử đường ban đầu có thể chuyển thành một
phân tử acid pyruvic hoặc acetyl phosphate; pyruvate biến một phần thành aldehyde acetic và
CO
2
;

acetyl phosphate có thể biến đổi thành acetate và ATP hoặc bò khử thành ethanol. Như vậy,
cứ mỗi mol đường pentose sử dụng sẽ hình thành được 1 mol lactate, 1 mol acetate và 2 mol
ATP.
Đường hexose
Khác với vi khuẩn lên men lactic đồng hình, các vi khuẩn thuộc giống Oenococcus thuộc
loại lên men dò hình nên quy luật chuyển hóa đường hexose của chúng chủ yếu thông qua con
đường phosphoketolase để hình thành nên 1 mol lactate, 1 mol ethanol, 1 mol CO
2
, 1 mol ATP
từ một mol đường hexose.
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 12
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang















Hình 2.4 Sơ đồ tóm tắt con đường pentose phosphate
- Đối với glucose
So với các loại đường khác, glucose là cơ chất được vi khuẩn malolatic sử dụng nhiều hơn

cả. Glucose có thể tham gia trực tiếp vào các chu trình như:
 Con đường đường phân: tạo thành 2 phân tử acid pyruvic và 2 ATP.
 Con đường pentose phosphate: tạo thành acid lactic, CO
2
và acid acetic (hoặc ethanol) và
ATP.
 Con đường phosphoketolase: tạo thành acid lactic, ethanol, CO
2
và ATP.
- Đối với fructose
Ở vi khuẩn Oenococcus oeni, có 2 con đường trao đổi fructose: lên men lactic dò hình
(heterolactic fermentation) và lên men kết hợp: dò hình/mannitol (mixed heterolactic/mannitol
fermentation) (Richter và cộng sự 2003). Trong đó, ở con đường thứ nhất, vi khuẩn này sử dụng
fructose như nguồn cơ chất tham gia vào con đường đường phân bình thường (con đường
EMP). Ngược lại, ở con đường thứ hai (chủ yếu là con đường mannitol) thì fructose đóng vai trò
là chất nhận điện tử cuối cùng và bò khử thành mannitol (xem hình 2.6)


CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 13
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang


Hình 2.5 Con đường EMP chuyển hóa glucose thành acid pyruvic

CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 14
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
Bảng 2.2 Các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi đường ở Leuconostoc oenos
(Veiga-Da-Cunha và cộng sự, 1993)

Hình 2.6 Sơ đồ một số con đường chuyển hóa glucose và fructose ở vi khuẩn L. oenos
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 15
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
 Disaccharide: trehalose và saccharose
Sự chuyển hóa các disaccharide hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Hầu hết các tác
giả đều cho rằng vi khuẩn lactic sẽ đồng hóa các loại đường này bằng cách thủy phân chúng
thành monosaccharide trước, sau đó các đường đơn này tiếp tục tham gia vào các chuỗi chuyển
hóa như đã trình bày ở trên.

Hình 2.7 Sự sinh trưởng của O. oeni trong các môi trường đường khác nhau (10 g/l)
glucose ( ) , fructose ( ), saccharose ( )
Hình 2.7 cho thấy sự ảnh hưởng của các loại đường khác nhau đến sự sinh trưởng của vi
khuẩn O. oeni. Lượng sinh khối được xác đònh gián tiếp bởi chỉ số OD ở 600nm. Kết quả nghiên
cứu cho thấy, trong số các dung dòch đường sử dụng (glucose, fructose, saccharose) ở cùng
nồng độ (10 g/L), vi khuẩn sử dụng đường glucose là tốt nhất. Đường fructose cho pha lag dài
nhất. Đường saccharose cho pha lag ngắn hơn đường fructose, nhưng lượng sinh khối tạo thành
sau 180 giờ thì thấp hơn cả hai loại đường trên.
 Polysaccharide
Một số loài vi khuẩn malolactic có khả năng dò hóa các loại polysaccharide bên cạnh quá
trình sinh tổng hợp các chất này. Khi nghiên cứu trên loài Oenococcus oeni, Guilloux Benatier
và cộng sự (2000) đã tìm thấy được hoạt tính β(1→3) glucanase ngoại bào. Enzyme này xúc tác
cho phản ứng thủy phân glucan tạo thành glucose. Đây cũng là một dấu hiệu quan trọng góp
phần vào việc giải thích cho sự tăng hàm lượng các monosacchride trong suốt quá trình lên
men malolactic bên cạnh những lý do đã được đặt ra trước đó như sự thủy phân saccharose,
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 16
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
trehalose, phenolic glucoside với xúc tác acid (Costello và cộng sự 1985; Davis và cộng sự 1986a,
b).
 Acid hữu cơ: malate, citrate, pyruvate

Hình 2.8 Sơ đồ chuyển hóa một số acid hữu cơ trong vang bởi vi khuẩn malolactic
 Acid malic
Oenococcus oeni có thể phân giải acid malic thành acid lactic và CO
2
nhờ phản ứng
decarboxyl hóa với xúc tác enzyme malate carboxylase. Phản ứng này không trực tiếp sinh ra
năng lượng cho tế bào dưới dạng ATP nhưng nó là cơ sở cho sự hình thành lực vận chuyển
proton (proton motive force) qua màng tế bào (được đề cập chi tiết hơn ở phần 2.2.1.2), từ đó tế
bào có thể sinh tổng hợp được năng lượng.
Mặc dù vậy, năng lượng tổng hợp từ sự chuyển hóa acid malic không nhiều bằng năng
lượng được tạo thành bởi các con đường phổ biến như đường phân, trao đổi acid citric, pentose
phosphate, phosphateketolase... Do đó, để đảm bảo cho tế bào có thể sinh trưởng và phát triển
một cách thuận lợi, nhu cầu về glucose vẫn đóng vai trò cốt yếu. Tuy nhiên, một số nghiên cứu
cũng cho thấy nếu trong điều kiện không sinh trưởng (non-growing conditions), các vi khuẩn
malolactic, đặc biệt là Oenococcus oeni sẽ tiến hành phân giải acid malic trước thành acid lactic
rồi mới chuyển hóa glucose.
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 17
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
 Acid citric
Citric acid cũng được xem là nguồn cơ chất quan trọng trong quá trình tổng hợp năng lượng
của các loài vi khuẩn lactic thuộc giống Leuconostoc và Oenococcus. Sự chuyển hóa acid citric ở
vi khuẩn O. oeni được thực hiện qua nhiều phản ứng phức tạp hơn sự chuyển hóa acid malic
(chỉ qua một phản ứng) và diễn ra sau quá trình lên men malolactic.

Ghi chú: I Citrate lyase VII Acetoin reductase
II Oxaloacetate decarboxylase VIII Lactate dehydrogenase
III Pyruvate decarboxylase IX Pyruvate dehydrogenase complex
IV α-acetolactate synthase X Acetate kinase
V α-Acetolatate decarboxylase XI Decarboxyl hóa không enzyme
VI Diacetyl reductase XII Aspartate aminotranferase

Hình 2.9 Quá trình chuyển hóa acid citric và sự tổng hợp diacetyl được thực hiện bởi vi khuẩn
malolactic (Nguồn: Ramos and Santos, 1996)
Trong khoảng pH thích hợp cho O. oeni phát triển (pH 3,5-5,5), acid citric tồn tại dưới dạng
phân ly tạo thành monoanion HO-C(CH
2
COOH)
2
-COO
-
(H
2
Citrate
-
). Chất này sẽ

được vận
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 18
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
chuyển vào trong tế bào bởi một loại protein vận chuyển đặc biệt (citrate transporter). Khi đã
vào bên trong tế bào, H
2
Citrate
-
sẽ được vi khuẩn sử dụng và chuyển hóa qua nhiều phản ứng
khác nhau để hình thành nên sản phẩm cuối cùng là acetic acid, acetoin và CO
2
. Trong quá
trình này tế bào tiêu tốn một ion H
+
để kết hợp với một ion H

2
Citrate
-
tạo thành acid citric. Kết
quả là năng lượng được hình thành theo cơ chế tương tự như cơ chế tổng hợp năng lượng được
trình bày ở phần 2.2.1.2.
 Acid pyruvic
Oenococcus oeni có thể sử dụng trực tiếp pyruvate như nguồn cung cấp carbon (2 pyruvate
→ 1 lactate + 1 acetate + 1 CO
2
). Theo Nicole Warner và cộng sự (2005), kết quả nghiên cứu
khi nuôi cấy chủng vi khuẩn này trong môi trường có chứa pyruvate thu được như sau: lượng
sinh khối (tính theo khối lượng chất khô) đạt 4,0 g/mol pyruvat và lượng ATP tạo thành là
0,5mol/mol pyruvate. Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong môi trường chứa glucose, lượng sinh khối
đạt được là 8,3 g/mol glucose. Điều này chứng minh được rằng vi khuẩn malolactic có thể sử
dụng được acid pyruvic để sinh trưởng và lượng sinh khối tạo thành khi sử dụng acid pyruvic
chỉ bằng một nửa so với khi sử dụng glucose.
Cơ chế chuyển hóa acid pyruvic có thể biểu diễn tóm tắt theo sơ đồ sau:

Hình 2.10 Sơ đồ chuyển hóa pyruvate thành acetate và lactate
 Polyol
Các polyol đều không thích hợp cho sự sinh trưởng của hầu hết các loài vi khuẩn malolactic
ngoại trừ Lact. plantarum (theo Liu và cộng sự, 1995). Cơ chế chuyển hóa các loại polyol cũng
chưa được biết đến một cách rõ ràng.
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 19
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
 Sự chuyển hóa glycerol
Đối với glycerol, có hai con đường phân giải hợp chất này bởi vi khuẩn malolactic. Một là
phản ứng dehydrate glycerol thành hợp chất 3-hydroxyprionaldehyde bởi xúc tác enzyme
glycerol dehydrase hay glycerol kinase. Hai là phản ứng dehyrate hóa không enzyme để hình

thành nên acrolein với tác nhân chính là nhiệt hay điều kiện bảo quản dài hạn trong môi
trường acid.
Về mặt năng lượng, sự chuyển hóa đồng thời đường và glycerol rất quan trọng đối với các
trực khuẩn lactobacilli trong việc hình thành nên ATP từ hợp chất trao đổi trung gian đổi trung
gian là acetyl phosphate (Veiga-da-Cunha và Foster, 1992).
 Sự chuyển hóa mannitol
Ngược lại với glycerol, mannitol có thể xem như là nguồn carbon chính và nguồn năng
lượng cung cấp cho sự sinh trưởng của loài vi khuẩn lactic đồng hình Lact. plantarum (Davis và
cộng sự 1988; Liu và cộng sự 1995). Tuy nhiên, sự phân giải mannitol bởi loài vi khuẩn này chỉ
được tiến hành trong điều kiện có oxi (hô hấp hiếu khí) hoặc có mặt của các chất nhận điện tử
như citrate và α
αα
α-ketoacid (hô hấp kò khí) (Chen và McFeeters 1986).
Vi khuẩn lactic đồng hình có thể sử dụng mannitol làm cơ chất. Mannitol được vận chuyển
chủ động vào tế bào thông qua cơ chế phosphoryl hóa thành mannitol 1-phosphate nhờ xúc tác
của enzyme mannitol phosphotransferase. Sau đó, manitol 1-phosphate bò oxy hóa thành
fructose 6-phosphate bởi xúc tác của enzyme mannitol 1-phosphate dehydrogenase. Chất này
đóng vai trò là sản phẩm trao đổi trung gian (glycolysis intermediate) tham gia vào con đường
đường phân để tạo thành các sản phẩm trao đổi chất cuối cùng như ethanol, acid lactic... và
sinh tổng hợp ATP.
 Acetaldehyde
Một số chủng thuộc giống Oenococcus oeni (và Lactobacillus, trừ Pediococcus) có thể sử
dụng acetaldehyde ở cả hai dạng tự do và liên kết với SO
2
(Acetaldehyde-bound SO
2
) (Osborne
và cộng sự, 2000). Điều này có ý nghóa quan trọng trong sản xuất rượu vang vì acetaldehyde
(được hình thành chủ yếu bởi quá trình trao đổi chất của nấm men) là hợp chất dễ bay hơi tạo
mùi không mong muốn và làm tăng cường độ màu cho vang đỏ (do chất này có khả năng

chống lại ảnh hưởng của SO
2
trong môi trường, từ đó thúc đẩy phản ứng ngưng tụ anthocyanin
và catechin thành tannin tạo sắc tố bền,) (theo Timberlake và Bridle 1967a, Somer và
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 20
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
Wescombe 1987). Cơ chế chuyển hóa acetaldehyde thành ethanol đã được miêu tả theo phản
ứng sau:

Bảng 2.3 Khả năng phân giải acetaldehyde của một số chủng vi khuẩn malolactic
Chú thích: (+) có khả năng; (–) không có khả năng
2 – Nguồn nitơ
 Các acid amin
Vai trò của các acid amin đối với quá trình sinh trưởng của vi khuẩn malolactic vẫn đang
được nghiên cứu. Từ các kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy, nhu cầu về các acid amin đối với
từng chủng khác nhau là không giống nhau nhưng nhìn chung hầu hết các chủng đều cần
asparagine như một acid amin thiết yếu để sinh trưởng.
Theo Versari và cộng sự (1999), việc bổ sung thành phần acid amin vào môi trường nuôi cấy
rất cần cho sự sinh trưởng tối thích của vi khuẩn malolactic. Khi làm thí nghiệm trên các
chủng thuộc loài Oenococcus oeni trong môi trường nuôi cấy tổng hợp ở pH 5,0, tác giả đã thấy
rằng isoleucine, acid glutamic, tryptophan và arginine là những amino acid thiết yếu cho sự
sinh trưởng của loài này. Mặt khác, sự thiếu hụt các thành phần như glycine, phenyl alanine,
proline và tyrosine sẽ ảnh hưởng nhiều đến quá trình lên men malolactic nhưng ít ảnh hưởng
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 21
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
đến sinh trưởng của vi khuẩn lactic. Sự ảnh hưởng của các acid amin đến sinh trưởng của vi
khuẩn malolactic cũng như các cơ chế vận chuyển chúng cũng đã và đang được nghiên cứu.
Một số các acid amin quan trọng cho sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi khuẩn
malolactic:
 Arginine

Arginine đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi
khuẩn malolactic nói chung. Sự chuyển hóa arginine chủ yếu thông qua con đường ADI
(arginine deiminase pathway). Thông qua con đường ADI, một phân tử arginine bò deimine hóa
tạo thành citrulline, sau đó hợp chất này tiếp tục bò biến đổi thành Ornithine và thải ra ngoài
màng tế bào. Quá trình này cung cấp ATP cho tế bào qua cơ chế:
Arginine + H
2
O
Arg. deiminase
Citrulline + NH
3
Citrulline + P
i
Orn. transcarbamylase
Ornithine + Carbamyl-P
i
Carbamyl-P
i
+ ADP
Carbamate kinase
ATP + NH
3
+ CO
2


Hình 2.11 Tương quan về tốc độ phân giải arginine ( ) và hình thành citrulline ( ) đối với
vi khuẩn Oenococcus oeni
Một số loài vi khuẩn malolactic khác như Lact. hilgardii ngoài chuyển hóa arginine theo con
đường này, chúng còn có thể chuyển hóa theo con đường ADP (arginine decarboxylase

pathway). Tuy nhiên, sự chuyển hóa arginine ở những loài này được xem như không điển hình
cho vi khuẩn malolactic.
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 22
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
 Asparagine và glutamine
Asparagine được xem là acid amin thiết yếu cho sự sinh trưởng của hầu hết các chủng thuộc
loài O. Oeni. Sự chuyển hóa asparagine (xem hình 2.12) trong tế bào vi khuẩn lactic như sau:

Hình 2.12 Sơ đồ chuỗi chuyển hóa asparagine và glutamine ở vi khuẩn lactic
Đầu tiên, asparagine được vận chuyển vào trong tế bào nhờ protein vận chuyển và tiêu tốn
năng lượng dưới dạng ATP. Sau đó asparagine tiếp tục được deamine hóa thành acid aspartic
nhờ xúc tác asparaginase (E 3.5.1.1). Từ đây, acid aspartic tiếp tục được chuyển hóa tiếp theo 3
con đường chính:
 Sự chuyển hóa aspartic với xúc tác enzyme aspartase thành acid fumaric. Acid này
tiếp tục được chuyển hóa tiếp thành acid malic (bởi enzyme fumarase) hay acid
succinic (bởi enzyme succinate dehydrogenase).
 Sự chuyển hóa acid aspartic thành oxaloacetate (nhờ enzyme aspartate
aminotransferase) rồi thành pyruvate (nhờ enzyme oxaloacetate decarboxylase).
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 23
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
 Phản ứng decarboxyl hóa acid aspartic thành alanine bởi xúc tác enzyme aspatate
decarboxylase.
Cần lưu ý rằng đối với O. oeni, trong trường hợp sinh trưởng nhờ acid malic, ở hàm lượng
thấp (<0,3 mmol/L) acid aspartic có thể thúc đẩy sự sinh trưởng của chúng trong khi ở hàm
lượng cao hơn (>6 mmol/L) thì sự sinh trưởng nhờ acid malic lại bò ức chế (xem bảng 2.4),
song có thể làm tăng khả năng sử dụng đường glucose (S.Q. Liu, 2002).
Bảng 2.4 Ảnh hưởng của L-aspartic đến sinh trưởng của vi khuẩn malolactic
Lượng sinh khối tạo thành mg/mL
Chủng
Canh

trường 1
0,3 mmol/L
Canh
trường 2
10 mmol/L
Tỉ lệ ức chế
sinh trưởng
(%)

 Cysteine và methionine
Nghiên cứu của Pripis-Nicolau và các cộng sự (2004) trên các chủng thuộc loài O. oeni cho
thấy một số chủng có khả năng sử dụng methionine để tạo thành một lượng lớn các chất mùi
như 3-(methylsulphanyl) propionic acid và 3-(methylsulphanyl)propan-1-ol (2 hợp chất trung
gian trong quá trình chuyển hóa methionine ngoài 2 sản phẩm chính là methanethiol và
dimethyl disunfide). Chính sự hình thành nên 2 hợp chất này đã tạo nên sự khác biệt đối với
các loài lên men lactic trong sữa và lên men malolactic trong rượu vang.
 Serine
Một số chủng thuộc loài Oenococcus oeni có thể phân giải serine thành NH
3
và pyruvate bởi
enzyme serine dehydratase (deaminase).
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 24
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
 Protein và polypeptide
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy rằng: các cầu khuẩn Oenococcus oeni có khả năng
tổng hợp được protease ngoại bào (Rollan và cộng sự, 1993). Theo Leitao (2000), hoạt tính của
protease còn tùy thuộc vào từng chủng và không phổ biến ở tất cả các chủng. Sau đó, nghiên
cứu của Manca de Nadra và cộng sự (1997, 1999) đã chứng minh sự tạo thành các peptide và
acid amin trong suốt quá trình lên men malolactic ở cả vang đỏ và vang trắng bởi chủng O. oeni
X

2
L (chủng này được xem là có khả năng tổng hợp protease ngoại bào).
Tuy nhiên, tất cả những nghiên cứu nói trên cũng chưa làm sáng tỏ được khả năng thủy
phân các protein của các vi khuẩn lactic trong rượu vang mặc dù khả năng này đã được con
người biết rất rõ đối với vi khuẩn lactic trong sữa.
3- Nguồn khoáng (Mn, Mg, K, Na)
Đối với O. oeni, nhu cầu về các loại khoáng của từng chủng khác nhau cũng khác nhau. Tuy
nhiên một điều đáng lưu ý là trong các loại khoáng sử dụng thì nguyên tố Mn được xem là
nguyên tố rất quan trọng cần thiết cho sự sinh trưởng của O. oeni. Kết quả nghiên cứu của tác
giả S. Theobald và cộng sự (2005) trên các chủng O. oeni được nuôi cấy trong môi trường cơ
bản (Basal medium) và môi trường dòch cà chua (TJM) cho thấy (xem bảng 2.5):
Bảng 2.5 Lượng sinh khối thu được ứng với các môi trường chứa các loại khoáng khác nhau

Chú thích bảng: Các tế bào vi khuẩn O. oeni được nuôi cấy trong môi trường cơ bản (BM) có
bổ sung một loại khoáng. Môi trường này có thành phần như sau: 5 g/L pepton, 20 g/L trypton,
CHƯƠNG 2: TÁC NHÂN LÊN MEN MALOLACTIC 25
Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
5 g/L dòch chiết nấm men, 5 g/L glucose, 5g/L fructose, 3g/L acid citric, 1g/L Tween 80, 0,5 g/L
MgSO
4
.7H
2
O. Hàm lượng mỗi loại khoáng bổ sung vào môi trường BM tương ứng với hàm lượng
của nó trong dòch ép cà chua. Chỉ số OD
546
nm dùng để xác đònh lượng sinh khối thu được có
trong dòch canh trường tại thời điểm sau 10 ngày nuôi cấy.
 Trong số các cation được bổ sung vào môi trường nuôi cấy (Ca, Zn, K, Fe, Mn, Mg, Cu)
chỉ có Mn kích thích sự tăng trưởng của tế bào sau 10 ngày nuôi cấy: so với mẫu đối
chứng (H

2
O) chỉ số OD
546nm
= 0,77 thì mẫu bổ sung Mn có OD
546nm
= 0,95. Trong
trường hợp không sử dụng Mn mà sử dụng hỗn hợp các cation còn lại thì chỉ số OD
546mm

= 0,82.
 Sự có mặt của nguyên tố Ca cũng góp phần kích thích sự tăng sinh khối (OD
546nm
=
0,83).
 Trong trường hợp sử dụng đầy đủ các cation trong môi trường cho chỉ số OD
546nm
rất cao
(1,83).
 Trong tất cả các trường hợp, việc sử dụng môi trường TJM (môi trường nước ép cà chua)
đem lại kết quả cao nhất.
Kết luận:
 Mangan là nguyên tố kích thích sự sinh trưởng và tăng sinh khối đối với O. oeni.
 Các nguyên tố khác như: Ca, K, Mg cũng cần thiết nhưng ở mức độ thấp hơn.
 Các nguyên tố còn lại hầu như không ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng của O.
oeni.
4- Nguồn vitamin
Nhiều tác giả khẳng đònh vai trò của acid pantothenic đến sự sinh trưởng của O. oeni. Khi
được cung cấp đủ hàm lượng acid pantothenic cần thiết, các cầu khuẩn này sẽ tiến hành lên
men đường glucose theo con đường lên men lactic dò hình tạo thành lactate, ethanol và CO
2

. Ở
hàm lượng acid pantothenic thấp hơn (hàm lượng giới hạn) sẽ tạo thành một lượng lớn các
erythritol, acetate và glycerol. Khi đó, con đường lên men ethanol sẽ được thay thế bởi con
đường tạo thành các hợp chất này. Tuy nhiên, sự có mặt của acid pantothenic lại không ảnh
hưởng đến quá trình lên men đường ribose.
Ảnh hưởng của acid pantothenic đến quá trình lên men ethanol liên quan tới sự thay đổi
hàm lượng các CoA-SH và acetyl-CoA. Hai chất này là các cosubstrates (dạng coenzyme liên kết