CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT part 9 pps

182
Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D.
Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là T-
DNA (Transferred DNA), có chứa 2 hệ gene: Hệ gene gây khối u onc
(oncogeneic), chứa ít nhất 3 gene chịu trách nhiệm tổng hợp các hormone
auxin và cytokinin và do đó có liên quan đến việc sản sinh ra và duy trì sự
phân chia tế bào liên tục. Thứ hai là hệ gene mã hoá cho một số enzyme
điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các acid amine hay đường
gọi là opine. Hai loại enzyme đã được nghiên cứu kỹ nhất là octopine
synthetase và nopaline synthetase.
Vùng B có liên quan đến sự tái sinh
Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp
Vùng D là vùng độc có chứa các gene vir, giữ vai trò quan trọng trong
việc chuyển T-DNA vào hệ gene nhân của tế bào thực vật
Ngoài ra mỗi Ti-plasmid còn chứa các gene nằm ngoài vùng T-DNA
mã hoá cho các enzyme phân giải ocpine để làm nguồn dinh dưỡng
cacbon và nitrogen cho vi khuẩn.
2.1.1.2. T-DNA và các trật tự biên 25 bp
Vùng T-DNA có kích thước từ 10 kb đến 20 kb, nằm kẹp giữ hai trật
tự 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái (left border – LB) và
biên phải (right border – RB). Toàn bộ phần giới hạn giữa hai đoạn biên
này đều được chuyển sang tế bào thực vật. LB và RB là những yếu tố cần
thiết để định hướng cho sự chuyển DNA. Việc mất đi 6 bp đầu tiên hoặc
10 bp cuối cùng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyển của T-DNA. Quá
trình chuyển của T-DNA được bắt đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB.
Sự định hướng này là rất quan trọng nếu không việc chuyển sẽ kém hiệu
quả. Trong các gene được mã hoá ở vùng T-DNA có 3 gene rất quan trọng
trong việc phát triển khối u: một gene mã hoá cho việc chuyển enzyme
AMP-isopentonyl transferase và 2 gene mã hoá cho enzyme tham gia vào

sinh tổng hợp auxin (tryptophane-2 mono oxygenase và acetamid
hydrolase). Sự hoạt động của các gene này tạo điều kiện cho sự phát triển
của tế bào thực vật có sự phụ thuộc vào auxin và cytokinin. Đặc điểm này
được sử dụng để chọn lọc các tế bào được biến nạp từ trong phần lớn các
tế bào không được biến nạp.
2.1.1.3. Vùng vir
Chính hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyển
T-DNA sang tế bào thực vật. Nó có kích thước khoảng 40 kb và gồm 6
operon: virA, B, D và G là toàn toàn cần thiết cho việc tạo ra độc tính, còn
virC và E có liên quan với việc hình thành khối u. Trừ virG và A, các
operon khác đều là đa cistron. Nói chung gene virA biểu hiện ở mọi điều
kiện, gene virC biểu hiện thấp ở các tế bào sinh dưỡng nhưng thể hiện rất
mạnh ở các dịch chiết từ các mô bị tổn thương. Hoạt động của các operon
này có liên quan chặt chẽ với sự có mặt của các hợp chất phenol được tiết


183
ra từ vết thương của cây. Từ vết thương của cây thuốc lá người ta đã tinh
chiết và xác định được các hợp chất này là acetosyringon và alpha
hydroxyacetosyringon.
2.1.1.4. Quá trình chuyển T-DNA
Đoạn T-DNA muốn được chuyển, trước tiên nó cần phải được hoạt
hoá nhờ hoạt động của các gene vir. Hoạt động này xảy ra khi
Agrobacterium bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được chiết ra từ
vết thương của cây hoặc từ các tế bào nuôi cấy hoặc protoplast.
Đầu tiên là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gene virA
(protein virA). Protein này nằm ở màng trong của tế bào Agrobacterium,
đóng vai trò như là một chất thụ cảm đối với acetosyringon có trong môi
trường. Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá (có lẽ bằng việc
phosphoryl hoá) gene virG. Protein virG sau đó lại gắn vào gene chỉ huy

nằm sát gene khởi động thuộc các gene vir khác. Bằng cách như vậy,
protein của gene virG đã được hoạt hoá làm tăng quá trình phiên mã của
chính nó, đồng thời làm giảm quá trình này của các operon B, C, D và E.
Trong tiến trình chuyển T-DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt
Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25 bp, ở vị trí base thứ ba và thứ tư của
mạch đơn phía dưới mới được tổng hợp. Từ đó, một mạch T-DNA được
giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay vào đó là một mạch đơn mới được
tổng hợp theo hướng 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải. Điều
này giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển T-DNA.
Operon D chủ yếu mã hoá cho một loại endonuclease tạo ra các vết cắt nói
trên tại hai trật tự biên. Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường
nhờ sự tương tác giữa protein virD2 với một hoặc hai protein do gene virC
mã hoá. Protein gene vir E2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ra
làm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào thực vật. Phức
hợp protein-mạch đơn T-DNA là cấu trúc cần thiết cho việc chuyển T-
DNA sang tế bào thực vật và nó phải được sản sinh ra từ Agrobacterium.
Gene virB mã hoá cho ít nhất 11 protein để hình thành nên một cầu nối,
cho phức hợp trên chuyển từ Agrobacterium sang tế bào thực vật.
Tế bào thực vật bị thương tổn là nơi chuyển gene T-DNA. Trong các
mô được sử dung để chuyển gene, lá là nguồn tốt nhất cho tái sinh (Hình
9.4). Những tế bào ở mép lá bắt đầu tái sinh và khi những đĩa lá này được
nuôi cấy trên môi trường chứa Agrobacterium, những tế bào này rất hiệu
quả cho tác nhân chuyển gene. Kỹ thuật đĩa lá được sử dụng hiệu quả cho
chuyển gene vào thực vật nhờ sử dụng Ti-plasmid của Agrobacterium.
2.1.2. Chuyển nạp gene trực tiếp vào protoplast
Hầu hết các tế bào thực vật được bao bọc bởi thành cellulose nên khó
để hấp thụ các phân tử DNA ngoài vào tế bào. Tuy nhiên thành tế bào có
thể làm tan nhờ xử lý tế bào với enzyme cellulase (Hình 9.5). Kết quả thu
được các protoplast chỉ còn màng sinh chất rất thuận lợi cho các thao tác

184
thí nghiệm. Protoplast có thể hấp thụ các đại phân tử như DNA và chúng
có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua sự tạo thành callus.

Hình 9.4 Tái sinh cây từ đĩa lá nhiễm Agrobacterium
Mặc dầu protoplast đã được sử dụng thành công cho nhiều loài, tuy
nhiên hầu hết các cây nông nghiệp quan trọng như ngũ cốc là rất khó tái
sinh từ protoplast.
Gần đây đã thu được một vài thành công trong sinh trưởng ở lúa và
ngô từ protoplast của nuôi cấy tế bào phát sinh phôi. Phôi thực vật sinh
trưởng in vitro là nguồn tế bào quan trọng cho nuôi cấy. Các cây lúa và
ngô hữu thụ được tạo thành từ những tế bào được thao tác di truyền thu
được từ nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi.
2.1.2. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng xung điện
Tế bào được đặt ở trong một thiết bị có hiệu điện thế cao, xung điện


185
tạo các lỗ tạm thời (cỡ 30 nm) ở trên màng tế bào và DNA có thể xâm
nhập vào chất nguyên sinh. Bên cạnh những phương pháp biến nạp, người
ta còn sử dụng các phương pháp vật lý để đưa DNA vào trong tế bào.
2.1.3. Chuyển gene bằng phương pháp bắn gene

Hinh 9.5 Tái sinh cây từ protoplast


186
Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng
thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới.

Phương pháp này được Sanford (Cornell University, USA) đề xuất lần đầu
tiên vào năm 1987. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng viên đạn
có kích thước hiển vi, tỷ trọng cao đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng
tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào.
1-1,5 μm được dùng làm vi đạn
(microprojectile). Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp
cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quang vi đạn, hỗn
hợp được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm. Đĩa
kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với
nòng súng. Thường đạn lớn làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu
nhẹ. Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Ra khỏi đầu
nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạn vẫn tiếp
tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào. Một tỷ lệ nhất
định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá
trình biến nạp gene (Hình 9.6).

Hình 9.6 Sơ đồ súng bắn gene
2.1.4. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng kỹ thuật vi tiêm
(microinjection)
ông ở khá
nhiều đối tượng thực vật (Hình 9.7). Tuy nhiên, kỹ thuật này hiện nay ít
được các phòng thí nghiệm sử dụng, vì thao tác vi tiêm dưới kính hiển vi
đòi hỏi thiết bị vi thao tác (micromanipulator) cực nhạy, thiết bị kéo và
mài kim tiêm từ các ống thủy tinh (puller) rất đắt tiền. Ngoài ra, nó còn
đòi hỏi kỹ năng thao tác và sự kiên nhẫn cao của kỹ thuật viên.

Hình 9.7 vào tế bào


187

2.2. Biến nạp toàn bộ cơ thể
Ở động vật và thực vật sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế
bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn. Phần lớn thực vật được
tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên có vấn đề với phương
pháp tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại cỏ khác. Từ một tế
bào biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gene, trong
đó mỗi tế bào của nó mang DNA tạo dòng và tiếp tục chuyển cho thế hệ
sau, sau khi nở hoa và tạo hạt. Tế bào động vật không thể tái sinh từ tế bào
nuôi cấy, vì vậy người ta cần một phương pháp khác cho biến nạp động
vật. Phương pháp tiêu chuẩn ở động vật có vú (ví dụ như chuột) là những
trứng đã được thụ tinh được lấy ra từ ống dẫn trứng, DNA được đưa vào
bằng phương pháp vi tiêm và tế bào biến nạp sau đó được nuôi cấy trở lại
trong bộ phận sinh sản của cơ thể mẹ.
2.3 Một số thành tựu của việc tạo các cây trồng biến đổi gene trên thế giới
và ở Việt nam
2.3.1. Một số loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành công
Nói chung, hầu hết các loài thực vật đều có thể biến nạp được gene.
Bảng 9.1. trình bày các loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành
công. Thông thường hiệu quả biến nạp gene khác nhau tuỳ thuộc vào
thừng loại cây trồng và quá trình biến nạp gene vẫn còn bị hạn chế ở nhiều
loài. Ở đây chỉ minh hoạ các kết quả biến nạp gene thành công ở các giống
cây trồng quan trọng.
- Cây ngô:
1988). Tuy nhiên, có thể
dùng phôi ngô trong nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh
các cây hữu thụ mang gene biến nạp, sử dụng phương pháp bắn gene và
chọn lọc bằng chất diệt cỏ “bialaphos” đã cho kết quả là mô callus phát
sinh các phôi được biến nạp gene. Các cây biến nạp gene hữu thụ đã được
tái sinh, ổn định di truyền và biểu hiện gene bar
) cùng với hoạt tính chức năng của enzyme

phosphinothricin acetyltransferase quan sát được trong những thế hệ sau.
Hiện nay biến nạp gene ở ngô bằng phương pháp bắn gene đã được sử
dụng rộng rãi. Gần đây các kết quả biến nạp gene gián tiếp ở ngô nhờ
Agrobacterium cũng đã được thông báo. Các thể biến nạp gene của dòng
ngô lai gần (inbredline) A188 đã được tái sinh sau khi nuôi cấy chung
(cocultivation) giữa vector “super-binary” với phôi non. Tần số được
thông báo ở dòng A188 là khoảng 5-30%. Các thể lai thế hệ thứ nhất giữa
dòng A188 và 5 dòng lai gần khác được biến nạp với tần số khoảng 0,4-
5,3% (tính theo số cây biến nạp gene độc lập/phôi).


188
9.1.
TT
Loài
Phương pháp biến nạp gene
Thử nghiệm đồng ruộng
1
Chuối
Bắn gene/Agrobacterium
-
2
Luá mạch
Bắn gene
Kháng virus
3
Đậu tây
Bắn gene
-
4

Canola
Bắn gene/Agrobacterium
Chống chịu chất diệt cỏ,
điều khiển sự thụ phấn
5
Sắn
Bắn gene/Agrobacterium
-
6
Ngô
Bắn gene/Agrobacterium
Kháng côn trùng, chống
chịu chất diệt cỏ
7
Bông
Bắn gene/Agrobacterium
Kháng côn trùng, chống
chịu chất diệt cỏ
8
Đu đủ
Bắn gene/Agrobacterium
Kháng virus
9
Đậu phụng
Bắn gene/Agrobacterium
Kháng virus
10
Bạch dương
Bắn gene/Agrobacterium
Chống chịu chất diệt cỏ

11
Khoai tây
Agrobacterium
Kháng côn trùng, virus,
chống chịu chất diệt cỏ
12
Lúa
Bắn gene/Agrobacterium
Chống chịu chất diệt cỏ
13
Đậu tương
Bắn gene/Agrobacterium
Chống chịu chất diệt cỏ
14
Bí
Bắn gene/Agrobacterium
Kháng virus
15
Củ cải đường
Agrobacterium
Chống chịu chất diệt cỏ
16
Mía
Bắn gene
-
17
Hướng
dương
Bắn gene
-

18
Cà chua
Agrobacterium
Quả chín muộn, kháng
virus
19
Lúa mì
Bắn gene
-
- Cây lúa:
đây chưa đến 10 năm. Các nghiên cứu sau đó cũng đã sử dụng hai kỹ thuật
này để biến nạp gene vào protoplast và phục hồi các
: Taipei
309) nhưng hầu hết các giống japonica ưu tú cũng như phần lớn các giống
indica là khó tái sinh cây từ protoplast. Phương pháp bắn gene cho phép
thực hiện biến nạp gene hiệu quả ở lúa trong các kiểu gene độc lập. Hiện


189
nay, hơn 40 giống đã được biến nạp gene thành công. Mẫu vật sử dụng là
phôi non và các callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành. Hygromycin B là
marker chọn lọc thường dùng cho lúa. Tần số biến nạp có thể cao tới 50%
(tính theo số cây biến nạp gene có nguồn gốc độc lập/ số mẫu được bắn
gene). Gần đây, kỹ thuật biến nạp gene ở lúa thông qua Agrobacterium
cũng đã có những cải tiến có hiệu quả tương đương với kỹ thuật bắn gene.
- Cây lúa mì: Phương pháp bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp
gene ở lúa mì. DNA ngoại lai được bắn vào trong vảy nhỏ (scutellum) của
phôi non của hai giống lúa mùa xuân và một giống lúa mùa đông. Các
callus chống chịu được chọn lọc bằng phosphinothricin hoặc các nhân tố
ức chế trao đổi chất tương tự như basta, bialaphos hoặc glufosinate

ammonium. Chọn lọc bằng các hợp chất như thế không hiệu quả lắm và
kết quả là một số lớn cây thất thoát. Phân tích di truyền và phân tử đã xác
nhận sự hợp nhất ổn định của các gene biến nạp. Nói chung công nghệ di
truyền lúa mì vẫn còn tập trung ở một hoặc hai giống đặc trưng có khả
năng tái sinh cây nhanh, thích hợp với phương pháp bắn gene.
- Cây lúa mạch: Wan và Lemaux (1994), đã tái sinh một số lượng lớn
các cây lúa mạch biến nạp gene độc lập, tự thụ phấn. Các phôi hợp tử non,
các callus mới hình thành và các phôi có nguồn gốc từ tiểu bào tử hạt phấn
đã được dùng để bắn gene với plasmid mang gene bar gus
lùn vàng ở lúa mạch. Kiểm tra khả năng nảy mầm của phôi non để phân
lập các cây biểu hiện hoạt tính bar bằng môi trường chứa bialaphos, mặc
dù đây chưa phải là một chất chỉ thị tốt cho sự có mặt hoặc không của
gene.
- Cây đậu tương: Những cố gắng đầu tiên của cây đậu tương biến nạp
tập trung ở việc tái sinh cây từ protoplast và nuôi cấy dịch huyền phù phát
sinh phôi. Mặc dù có những thành công ban đầu, tiến triển của công việc
này vẫn còn chậm và việc phục hồi các cây biến nạp gene vẫn đang còn
gặp nhiều khó khăn. Công nghệ biến nạp gene ở đậu tương đã có triển
vọng hơn nhờ sự phát triển và tối ưu hoá của kỹ thuật bắn gene. Thực tế,
đậu tương đã được dùng như một cây mô hình để phát triển kỹ thuật cho
nhiều loài cây trồng khó áp dụng công nghệ di truyền. Kết quả đầu tiên ở
đậu tương là phục hồi thành công cây biến nạp gene nhờ Agrobacterium.
Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking
chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium. Các mẫu lá mầm được
xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kháng kanamycin và có hoạt
tính gusA, hoặc kháng kanamycin và chống chịu glyphosate. Có thể biến
nạp gene hiệu quả vào
dụng nhưng rất khó tái sinh được cây. Để biến nạp gene vào các giống đậu
tương khác nhau, người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản -
phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng sinh c

190
đạn (particle) có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai. Hàng trăm cây
đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả biến nạp đã cho
nhiều phenotype khác nhau. Nói chung ở các dòng đậu tương biến nạp
gene có nhiều bản sao của các gene biến nạp (số bản sao khoảng từ 1-50
nhưng thường thay đổi từ 2-10). Phân tích DNA (southern blot) ở thế hệ
sau của các bản sao gene phức cho thấy tất cả các bản sao cùng tách rời,
như thế mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện diện một kết quả biến nạp độc lập
và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên.
- :
Phaseolus thành công rất ít. Hai hướng được ứng dụng trong công nghệ di
truyền ở đậu tây là kỹ thuật xâm nhiễm bằng Agrobacterium và bắn gene.
Tuy nhiên, chỉ có kỹ thuật sau mới có khả năng phục hồi các cây biến nạp.
Cây đậu tây biến nạp biểu hiện các gene gusA, bar và protein vỏ của virus
khảm màu vàng đã được phục hồi. Các cây biến nạp gene qua năm thế hệ
tự thụ phấn vẫn không mất các gene biến nạp hoặc khả năng biểu hiện. Kỹ
thuật bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene gusA được điều khiển
bằng promoter concanavalin A, hoạt tính gus đã biểu hiện trong lá mầm và
vỏ hạt của các cây biến nạp.
- Cây bông: Phương thức biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium
tumefaciens là kỹ thuật đầu tiên được sử dụng để biến nạp gene vào cây
bông giống Coker 312 (Umbeck 1987). Cây bông biến nạp gene cũng của
giống t
1990). Hầu hết các giống bông có giá
trị kinh tế khác không thể tái sinh cây từ giai đoạn callus. Một số ít các
giống đó có thể tái sinh cây nhưng quá trình này thiên về biến dị dòng vô
tính (somaclonal variation). Phương thức phân phối gene ngoại lai trực
tiếp vào mô phân sinh của trụ phôi cũng đã được phát triển và đã phục hồi

cây biến nạp gene.
2.3.2
sống tự do hoặc cộng sinh tồn tại
phương thức biến đổi nitơ phân tử của khí trời thành dạng NH
3
.

Nitrogenease

N
2



NH
3

- nif) chỉ tồn tại ở
một số loài tảo lam và vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với các loài họ đậu
(Fabaceae). Dùng kỹ thuật tách gene nif từ các cơ thể cố định đạm chuyển
sang các cây trồng quan trong như lúa, ngô là một mô hình lý tưởng của
các nhà tạo giống (Hình 9.8).


191

Hình 9.8 Mô hình biến nạp gene nif
Quá trình cố định đạm thông qua enzyme nitrogenease phải xảy ra
trong điều kiện yếm khí nghĩa là không có mặt O
2

ở vùng phản ứng. Điều
kiện này được thực hiên ở các nốt sần của cây họ đậ
2
được vùng phản ứng sạch O
2
hoặc đưa vào tế bào một cơ chế bảo vệ như
legoglobin. Đó là mộ
) đang tìm cách giải quyết.
III. Kỹ thuật RFLP
1 Đại cương về kỹ thuật RFLP
Kỹ thuật này dựa trên cơ sở đặc hiệu trong việc cắt đoạn DNA của
một loại hình enzyme đặc hiệu gọi là enzyme giới hạn. Khi sử dụng một
hay nhiều enzyme giới hạn, chúng sẽ tìm đúng vị trí đặc hiệu để cắt và cho
những đoạn DNA dài ngắn khác nhau. Bất kỳ có sự biến đổi nào trong hệ
gene (sự đảo gene, đột biến điểm, tăng giảm các cấu trúc lặp ) đều dẫn
đến sự thay đổi các điểm cắt và do vậy, khi dùng phương pháp RFLP sẽ
cho bản đồ enzyme giới hạn khác biệt. Cá thể đã có sự biến đổi di truyền
nhất định, hay nói cách khác đã có thể thuộc biến chủng khác.
Kỹ thuật RFLP dễ làm, có độ chính xác cao và có thể thực hiện trên
DNA của nhiều cá thể trong thời gian ngắn. Sau khi xử lý kết quả nhiều
lần bằng phương pháp RFLP, mỗi một hệ gene của mỗi cá thể thuần chủng
sẽ cho một bản đồ gene xác định và giống nhau. Ngược lại khi bị biến đổi,
các cá thể biến chủng sẽ cho bản đồ RFLP khác nhau. Độ sai khác càng xa
thì sự biến chủng càng lớn. Khi độ sai khác cao hơn mức xác định, các cá


192
thể này đã có thể thuộc về chủng khác khi xem xét phân loại.
2. Thư viện chỉ thị (marker) phân tử
DNA marker là những marker phân tử được tạo ra nhờ kỹ thuật phân

cắt DNA bằng các enzyme giới hạn (restriction endonuclease). Khi tạo ra
những đọan DNA mới, người ta đã cố gắng tìm kiếm một sự liên kết giữa
marker và gene định vị trên nhiễm sắc thể nào đó. Bản đồ di truyền đơn
giản của ruồi giấm đã được phát hiện từ năm 1925. Những tính trạng có
biểu hiện giống nhau về di truyền được xếp vào cùng một nhóm liên kết
gene, trên cùng một nhiễm sắc thể. Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ
được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể đo
đếm được, gene đó được xem là marker gene. Ví dụ liên kết gene giữa lá
mầm có màu tím và tính kháng rầy nâu của một vài giống lúa ở Đông bắc
Ấn độ. Khi giống kháng có lá mầm màu tím được lai với giống nhiễm có
lá mầm màu xanh, ở thế hệ F2 có xuất hiện con lai có lá mầm màu tím.
Như vậy lá mầm màu tím được xem như marker đối với tính kháng rầy
nâu.
Việc lập bản đồ gene và chọn lọc nhờ marker như vậy rất chậm. Mặt
khác số marker quá ít và chỉ có ở quy mô hình thái. Việc áp dụng isozyme
marker có ưu điểm hơn, nhưng số marker cũng quá ít, không đáp ứng
được nhu cầu nghiên cứu.
DNA marker đã được chứng minh là có tầm quan trọng hơn về lâu
dài, do số lượng của nó lớn hơn rất nhiều lần isoenzyme marker. Việc áp
dụng DNA marker dễ dàng hơn và trong tương lai sẽ rẽ hơn.
Muốn phát hiện ra chuỗi mã DNA đặc biệt nào đó, người ta phải áp
dụng một kỹ thuật lai DNA-DNA. Các đoạn DNA được tách riêng ra nhờ
kỹ thuật điện di sẽ biến tính trước khi nó được chuyển qua màng lọc. Như
vậy các DNA trên màng lọc là DNA ở dạng sợi đơn. Để tìm một đoạn
DNA đặc biệt nào đó trên màng lọc cần phải có một DNA thăm dò, lai với
DNA đặc hiệu, thông qua các liên kết base. Nếu DNA thăm dò đã được
đánh dấu bằng chất đồng vị hay hoá chất nào đó thì sẽ xác định được một
chuỗi mã di truyền DNA cần nghiên cứu.
Về căn bản, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa
hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể được xem như một

DNA marker. Các DNA marker có thể được chia thành hai nhóm như sau:
- PCR-based: ALP, AFLP, SSR, SSCP
- DNA/DNA hybridization-based: RFLP, minisatellite
Các marker thuộc nhóm PCR-based có thể chia thành:
+ Marker ngắn, có tính ngẫu nhiên: RAPD, AP-PCR, ADF, AFLP
+ Amplicon đơn: ALP, SSR, SSCP
Những ưu điểm của DNA-marker so với marker hình thái và isozyme
marker là:


193
- Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền
- Có nhiều marker trong quần thể
- Đo lường không chi phối ảnh hưởng môi trường và ảnh hưởng có
tính chất phát triển.
Bảng 9.2 Các loại DNA marker
Marker
Tên đầy đủ
RFLP
ALP
AFLP
RAPD
DAF
SSR
AP-PCR
SSCP
MRHDV-DNA
Restriction fragment length polymorphism
Amplicon fragment length polymorphism
Amplified fragment length polymorphism

Random amplified polymorphic DNA
DNA amplification fingerprinting
Simple sequence repeat (microsatellite)
Arbitrary primer-PCR
Single strand conformation polymorphism
Moderately repeated, dispersed, and highly
variable DNA (minisatellite)
RFLP maker
Trong các DNA marker, RFLP là marker được dùng phổ biến và được
biết nhiều nhất. Để tạo ra chất thăm dò RFLP marker và thể đa hình DNA
gồm nhiều giai đoạn:
- Phân lập DNA
Trước hết phải chuẩn bị chất thăm dò của marker và bộ lọc DNA lai.
Đó là giai đoạn có tính chất quyết định trong phân tích RFLP. Ví dụ cần
có DNA từ mô lúa với số lượng nhiều và chất lượng tốt. Mô lúa được
nghiền trong nitơ lỏng. Chất đệm khi ly trích DNA có chứa SDS, chất này
có thể phân giải màng tế bào và màng nhân, phóng thích DNA vào dung
dịch. SDS là chất tẩy khá mạnh, có thể làm biến đổi protein ở nhiệt độ
65
0
C. Sự biến đổi này làm cho DNA gắn với protein bị tách rời ra khỏi
DNA cần nghiên cứu. Protein và chất cặn của tế bào được tách rời ra khỏi
DNA bằng phenol/chloroform hoặc bằng phương pháp kết tủa chọn lọc
của những chất cặn tế bào với potasium acetate. DNA ở pha lỏng sẽ được
kết tủa bằng cách thêm isopropanol.
Phân lập DNA bằng phương pháp này chỉ áp dụng đối với DNA có
kích thước lớn hơn 30 kb và có ít tạp chất polysaccharide. Lượng nhỏ của
tạp chất này sẽ gây khó khăn khi chạy điện di trên gel, do đó phải hết sức
thận trọng khi tách DNA.
Nguồn gốc mô cũng ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng DNA. Mô

cây khỏe và trẻ cho kết quả phân lập DNA tốt hơn từ mô già hoặc từ các
loài lúa hoang dại do bị lẫn tạp polysaccharide.


194
DNA được phân lập có thể tồn trữ trong điều kiện -20
0
C. Phải chú ý
rằng đông lạnh nhiều lần hoặc làm tan băng nhiều lần cũng có thể làm
phân huỷ DNA.
Trong quá trình phân lập phải sử dụng nhiều dung môi. Có hai dung
môi quan trọng là EDTA và Tris.
- Tris (Trima, base) được sử dụng với khả năng đệm rất có hiệu quả
trong dung môi. Ở pH 8.0, DNA rất ổn định. Trong điều kiện môi trường
axit, purine rất dễ bị loại thải (được gọi là “depurination”) do cầu nối
phosphodiester dễ bị phá vỡ. Do đó, người ta phải kiểm soát pH của dung
môi ở mức 8.0 khi dùng Tris.
- DNA có thể bị hỏng bởi các enzyme. Enzyme này có thể truyền từ
tay người làm thí nghiệm, hoặc từ không khí. Để ngăn ngừa khả năng
DNA bị thuỷ phân bởi enzyme, người ta phải sử dụng thêm EDTA. Tất cả
các enzyme thuỷ phân DNA được biết hiện nay đều cần Mg
++
làm
cofactor. EDTA có thể kìm giữ Mg
++
và làm bất hoạt nó trong dung môi.
Không có Mg
++
, enzyme không thể hoạt động.
Tiến trình thuỷ phân DNA được thực hiện bằng restriction

endonuclease. DNA sẽ được đưa về một bộ sưu tập DNA thống nhất sau
khi hoàn tất việc phân cắt các chuỗi mã thành những đoạn (DNA
fragment) riêng biệt. Độ lớn của các đoạn này sau khi tiêu hoá khoảng 30
kb, có khi nhỏ hơn 100 bp. Để xác định các DNA fragment thông qua kỹ
thuật phân tích Southern, người ta điện di các DNA trên agarose gel. Sau
khi điện di, các đoạn DNA được phân ra tùy theo trọng lượng phân tử.
Người ta có thể quan sát chúng bằng mắt, nhờ kỹ thuật nhuộm màu DNA
với ethidium bromide và xác định dưới tia cực tím. Khi phân tích
Southern, các đoạn DNA được chuyển vào các tấm lọc, nhờ lực mao dẫn.
Ở giai đoạn prehybridization (trước khi lai DNA) người ta khóa các vị trí
trên màng- nơi quá trình lai sẽ xảy ra, các DNA (gene liên kết với marker)
sẽ gắn với nucleic acid thăm dò (RFLP-marker) được đánh dấu bằng
phóng xạ. Sau khi hybridization, tấm lọc hay màng lọc được rửa để loại bỏ
các RFLP-marker không gắn hoặc gắn yếu với DNA đang nghiên cứu.
Tiếp đó nó tự ghi trên biểu đồ phát xạ. Sau khi điện di, gel được chụp dưới
tia cực tím. Các đoạn DNA xuất hiện thành các đốm liên tục. Nó sẽ cho tín
hiệu khi thể hiện ra trên phim X-quang. Các vạch có tính đa hình
(polymorphism) có thể được quan sát để đánh giá.
Có hàng triệu đoạn DNA sau khi phân cắt bằng một restriction
endonuclease nào đó. Nhưng chúng không thể được sử dụng như RFLP
marker, nếu từng đoạn này chưa được thanh lọc làm cho thuần khiết và
chưa được khuếch đại nhằm có đủ số lượng các đoạn DNA đồng nhất,
thuần chủng.
Theo ý nghĩa này, RFLP phải có tính chất như sau:
- Có số lượng cao trong mỗi quần thể


195
- Đồng trội (Codominant )
- Đo trực tiếp DNA

- Không bị ảnh hưởng của môi trường
- Không bị ảnh hưởng do yếu tố có tính chất phát triển
RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhưng qui trình
thực hiện rất phức tạp, nguy hiểm đến sức khoẻ người thực hiện, đắt tiền,
yêu cầu DNA có số lượng và chất lượng cao. Do đó người ta có xu hướng
áp dụng các marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở của phản ứng
chuỗi polymerase.
3.3. Lập bản đồ di truyền bằng chỉ thị RFLP
Việc lập bản đồ gene cũng như việc chọn lọc giống cây trồng trên cơ
sở DNA marker phát triển nhanh, nhờ sự khám phá ra phản ứng chuỗi
trùng hợp PCR và một dạng polymerase có tính chịu nhiệt. Xây dựng bản
đồ di truyền thường căn cứ trên sự xuất hiện của các biến dị có tính chất
nền tảng di truyền của quần thể.
Phương pháp phân tích đa hình về chiều dài các đoạn DNA (RFLP)
bằng kỹ thuật enzyme giới hạn, là cắt rời DNA hệ gene thành nhiều đoạn
ngắn dài khác nhau, từ đó lập nên bản đồ hệ gene, gọi là bản đồ enzyme
giới hạn của mỗi cá thể.
3.4. Ứng dụng kỹ thuật RFLP trong chọn giống thực vật
Trước đây người ta đã sử dụng các dị thể đánh dấu đơn lẽ trong thực
vật bậc cao để xem xét các đặc tính hình thái. Ví dụ, gene gây tính lùn,
gene tạo ra sự thiếu lục lạp hoặc làm biến dạng lá cây. Mặc dù các marker
rất có ích trong nhiều nghiên cứu ứng dụng cũng như cơ bản, nhưng nó rất
hạn chế trong chọn giống cây trồng. Những năm gần đây, có hai loại
marker mới đã được phân lập, chúng có nhiều triển vọng trong việc ứng
dụng vào công tác chọn giống. Đó là protein marker và DNA marker.
Những marker phân tử này khác với marker hình thái ở 5 đặc điểm di
truyền như sau:
- Kiểu gene của các locus phân tử có thể được xác định ở khắp cây
trồng, ở mức độ tế bào, mô. Kiểu hình của tất cả marker hình thái có thể
chỉ được phân biệt ở mức độ ở dạng cây bên ngoài.

- Một số tương đối lớn các allele được tìm thấy ở các locus phân tử.
Trong khi các gene ở các locus chứa marker hình thái, xuất hiện với tần số
thấp hơn và thường bị kích thích tạo ra các đột biến gene.
- Không ảnh hưởng gây hại đi kèm theo các gene của marker phân tử.
Trong khi ở marker hình thái, nó thường kết hợp với ảnh hưởng do kiểu
hình bất lợi gây ra.
- Alelle của marker phân tử thường là đồng trội, do đó nó cho phép tất
cả các kiểu gene được thể hiện trong mọi thế hệ phân ly giữa tính trội và
lặn.


196
- Đối với marker hình thái, ảnh hưởng mạnh mẽ của tính lấn át
(epistasis) làm hạn chế số marker đang phân ly, do đó nó có thể được đánh
giá như một thế hệ phân ly. Trong khi có rất ít ảnh hưởng lấn át hoặc đa
tính trạng (pleiotropic) được quan sát ở marker phân tử, cho nên số marker
đang phân ly có thể được theo dõi ở từng quần thể.
Các ứng dụng thông thường của marker phân tử là:
- Xác định mức độ phong phú di truyền
- Xác định độ chính xác về di truyền của con lai
- Ước đoán mức độ tạp giao
- Phát hiện sự du nhập gene hoang dại.
Nhiều gene đơn như tính bất dục đực, gene phục hồi phấn hoa, gene
kháng bệnh được chuyển nhiều lần từ một vật liệu di truyền vào vật liệu
khác. Ở đây tính trạng trội lặn được sử dụng và yêu cầu thời gian cần thiết
để chuyển nạp. Các quy trình chọn lọc này cồng kềnh, đắt tiền và yêu cầu
ruộng thí nghiệm quá lớn. Marker phân tử đánh dấu các gene có tầm quan
trọng về kinh tế. Nếu các gene đơn được đánh dấu bằng liên kết gene chặt
chẽ với các marker phân tử, chúng ta sẽ tiết kiệm được tiền của, thời gian
để chuyển các gene này vào vật liệu di truyền mà chúng ta mong muốn.

Marker phân tử cho phép xác định ở giai đoạn rất sớm sự có mặt hay
không của gene mong muốn. Tính chất đồng trội của các marker phân tử
cho phép tất cả các kiểu gene được xác định trong lai tạo, ngay cả trong
trường hợp gene đơn khó có thể được xác định trực tiếp.
Ứng dụng tiến bộ này được thể hiện ở cà chua, gene Mi (kháng tuyến
trùng) liên kết chặt chẽ với một alen hiếm Aps-1 (acid phosphatase) -
locus định vị trên nhiễm sắc thể số 6. Nhiều chương trình lai cà chua đã
ứng dụng để chọn lọc con lai với sự hiển diện của alen Aps-1 thay vì tính
kháng tuyến trùng.
Ở lúa đã tìm thấy gene cảm quang có liên quan chặt chẽ với Est-2 và
Pgi-2 trên nhiễm sắc thể số 3. Bởi vì các giống cảm quang trồng được mỗi
năm một lần trên ruộng, sự phát triển của các thế hệ rất chậm. Do đó lợi
dụng đặc tính liên kết gene này với 2 locus isozyme, quần thể phân ly sẽ
được đánh giá và các cá thể có tính cảm quang có thể được tuyển chọn.
Tuy nhiên phương pháp isozym marker là không đủ isozyme locus để
bao trùm lên toàn bộ bản đồ nhiễm sắc thể. Số isozyme markers quá ít là
hạn chế chính trong việc ứng dụng với quy mô lớn các isozyme marker để
cải tiến giống cây trồng.
Ngược lại, RFLP markers có rất nhiều và bản đồ của nó có thể được
chuẩn bị khá đầy đủ. Ở ngô và cà chua có hơn 500 locus RFLP đã được
sản xuất. Hiện nay đang thực hiện đánh dấu các gene kháng sâu bệnh với
các locus RFLP đánh dấu gene kháng bệnh bạc lá, đạo ôn, rầy nâu và rầy
lưng trắng. Sự hữu thụ của của RFLP lớn hơn rất nhiều trong khi đánh dấu


197
các locus điều khiển tính trạng số lượng (QTLs). Thông qua phân tích này,
QPLs được ứng dụng đối với tính kháng hạn và kháng mặn ở cây lúa.
Các nhà chọn giống có thể áp dụng marker trong nhiều tính trạng khác
nhau. Rõ ràng nhất là khi tính trạng mong muốn khó có thể tìm thấy vì nó

liên quan đến đặc tính của giống cây trồng như tính kháng sâu bệnh, tính
chống chịu hạn, ngập, nhiệt độ cao, mặn Những tính trạng này đòi hỏi
một quy trình và điều kiện môi trường đặc biệt để đánh giá. Chọn lọc gián
tiếp nhờ marker phân tử sẽ làm cho tiến độ chọn giống tiến hành đúng như
kế hoạch, hơn nữa có thể kết hợp nhiều tính trạng chọn lọc cùng một lúc.
Nhờ đánh dấu được các gene, nhà chọn giống có thể theo dõi tính chất di
truyền trong một cặp lai thông qua phân tích RFLP trong quần thể phân ly.
Ứng dụng RFLP marker để nghiên cứu bệnh đạo ôn trên lúa đã được
công bố. Để đánh dấu được gene kháng, người ta đã sử dụng một bộ giống
gần như đẳng gene (nearly isogeneic lines = NIL) từ giống rất nhiễm
CO39, và phân tích bằng RFLP cho thấy gene kháng Pi-z(t) liên kết với
dòng DNA sao chụp RG64 trên nhiễm sắc thể số 3. Khoảng cách giữa Pi-
z(t) và RG64 là 4,2 ± 1,7 cM. Gene kháng đạo ôn của Tẻ Tép (Pi-3) liên
kết với dòng DNA sao chụp RG869 trên nhiễm sắc thể số 6. Khoảng cách
giữa Pi-3 và RG64 là 10,6 ±3,8 cM.
Mc Couch và cs (1990) đã công bố gene đánh dấu đối với tính kháng
bệnh cháy bìa lá và rầy lưng trắng. Gene đánh dấu thông qua RFLP là
phương tiện giúp cho việc tuyển chọn các tính trạng chống chịu sâu bệnh
hại lúa. Tất cả các giống lúa đều có thể được phân chia thành nhiều kiểu
gene khác nhau khi phân tích RFLP.
Tanksley và cs (1990) nghiên cứu tại Đại học Cornell về các marker
dùng trong bản đồ gene của cây lúa. Có hơn 1000 RFLP marker đã được
xác định trên bản đồ gene của cây lúa (Bennett, 1994) thông qua phân tích
tính chất đồng phân ly và con số này sẽ dự kiến tăng lên 2000. Các kết quả
này với những thông tin cần thiết về bản đồ gene, tạo ra khả năng rất to
lớn áp dụng các markers trong chương trình lai tạo giống (Abenes và cs,
1993).
Nhiều côn trùng gây hại, nấm, vi khuẩn gây hại trên cây lúa có tính
đa dạng về địa lý và thời gian. Tính đa dạng này thường biểu hiện thông
qua sự khác biệt về độc tính và sự khác biệt về cây chủ có tính kháng.

Phương pháp phân tích RFLP và RADP đã được ứng dụng giúp hiểu rõ
hơn sự biến động của sâu bệnh hại lúa, cũng như để khai thác tốt nhất các
giống lúa kháng sâu bệnh.
- Rầy nâu: Sử dụng RFLP để lập bản đồ gene kháng với rầy nâu đã
được ghi nhận thông qua trường hợp thu nhận gene kháng từ lúa hoang dại
Oryza australiensis vào lúa trồng Oryza sativa (Ishii và cs, 1994). Gene
kháng rầy nâu được xác định là định vị trên nhiễm sắc thể số 12. Chỉ có
marker RG457 trong 14 marker thăm dò có tính đa hình đã phát hiện được


198
trên nhiễm sắc thể 12, tại đây gene kháng rầy nâu của Oryza australiensis
đã du nhập vào con lai của tổ hợp lai nói trên. Căn cứ vào tính chất đồng
phân ly giữa tính kháng rầy nâu và RG457, cho thấy gene kháng rầy nâu
có liên kết với RG457, khoảng cách giữa chúng là 3.68 cM. Với một liên
kết chặt chẽ như vậy, nó rất hữu ích khi chúng ta áp dụng phương pháp
chọn lọc với sự trợ giúp của marker (MAS: marker aided-selection) để có
các giống lúa kháng rầy nâu.
Nghiên cứu bản đồ RFLP nhằm mục đích phân lập các QTL điều
khiển tính kháng bệnh đạo ôn, đã được thực hiện tại IRRI (Wang và cs,
1992). Nghiên cứu này đã tìm hiểu di truyền tính kháng bệnh đạo ôn trên
giống Moroberekan, một giống lúa rẫy địa phương ở Tây phi có tính
kháng ổn định với bệnh đạo ôn (Bonman và Mackill, 1988). Một gene thể
hiện tính kháng hoàn toàn ký hiệu là Pi-5(t) đã được lên bản đồ.
- Bệnh bạc lá: Các phân tích di truyền đã chứng minh có sự hiển diện
của ít nhất 19 gene kháng bệnh bạc lá lúa (Ogawa và Khush, 1989;
Kinoshita, 1991). Cho đến nay 7 gene kháng bệnh bạc lá đã được lập bản
đồ bằng RFLP (Mc Couch và c, 1991; Ronald và Tanskley, 1991;
Yoshimura và cs, 1992). Người ta đã sử dụng quần thể phân ly để xác định
tính chất đồng phân ly giữa RFLP marker và các gene Xa-1, Xa-2, Xa-3,

Xa-4, Xa-5, Xa-10 và Xa-21. Gene Xa-1, Xa-5, Xa-21 là những “gene
tags” (vật đánh dấu gene) rất hữu dụng trong chọn lọc một chương trình
lai tạo có hiệu quả.
Muốn biết marker có phải là công cụ hữu ích trong chọn lọc giống lúa
hay không, người ta nghiên cứu bản chất của sự kết hợp gene trong một
nền tảng di truyền nào đó. Các marker cung cấp ngay những thông tin về
cây lúa nào mang gene gì và nó thể hiện trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp
tử. Các markers cho phép khẳng định chính xác kiểu gene trong đó hai
gene hoặc nhiều hơn hai gene kết hợp với nhau. Mối tương tác chưa chắc
chắn giữa các gene đơn, cũng có thể được đánh giá bằng phương pháp
này. Ví dụ, giống mang cả hai gene Xa-5 và Xa-4 được tìm thấy kháng
mạnh hơn đối với một isolate của dòng số 4 so với giống láu mang từng
gene này đơn độc (Nelson, 1993).
IV. Kỹ thuật PCR
1. Đại cương về kỹ thuật PCR
Phát triển phương pháp cho tạo dòng DNA trong những năm bảy
mươi đã có bước nhảy, vì lúc này gene và hoạt tính của gene được nghiên
cứu theo dạng mà trước đó không thể có được. Có cái gì đó tương tự xảy
ra trong những năm tám mươi là đã tìm ra phương pháp có tính cách
mạng: phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction, PCR).
PCR làm khuếch đại một đoạn nào đó trong phân tử DNA. Người ta
có thể chọn bất kỳ đoạn nào đó với điều kiện là đã biết trình tự ở những
đầu cuối. Điều này rất cần thiết vì để bắt đầu PCR mỗi đoạn ngắn


199
oligonucleotide (một mồi) phải lai với một đầu sợi đơn của phân tử DNA
(hình 9.9). Đoạn oligonucleotide này là mồi cho phản ứng tổng hợp DNA
và giới hạn đoạn cần khuếch đại.

Hình 9.9 Phản ứng PCR khuếch đạị trình tự đích
Để thực hiện phản ứng PCR người ta cho enzyme vào DNA nguồn và


200
mồi và ủ hỗn hợp này, như vậy những sợi bổ sung được tổng hợp. Sau đó
đun nóng hỗn hợp ở 94
0
C để cho những sợi mới tạo nên tách ra từ sợi
khuôn và làm nguội chúng trở lại để cho các phân tử mồi gắn vào vị trí
của nó, cả những sợi mới tạo thành. Điện di sản phẩm PCR trên gel
agarose. Lượng DNA mới tạo nên đủ để nhận ra vạch sau khi nhuộm
ethidiumbromide. Người ta có thể gắn sản phẩm PCR với một vector
plasmid hoặc phage để tạo dòng nghiên cứu ví dụ xác định trình tự DNA.
1.1. Nguyên tắc của PCR
Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt
(có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus
4 loại deoxynucleotide
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) và 2 primer,
, nhờ vậy có thể đủ
số lượng
3’ -
5’
(reverse primer-ký hiệu là R).
Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 9.10 và 9.11. Theo đó,
từ chu kỳ thứ 2 Taq polymerase bắt đ
(synthetic
oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide. Nếu biết trình tự của đoạn
gene cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng đ
25-35 chu kỳ, qua đó từ 10

-6
g DNA ban đầu có thể khuếch
đại (amplification) lên tới trên 1 g (khoảng 2 kb). .
Mỗi chu kỳ PCR bao gồm 3 giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:
- Gây biến tính ở 90-95
o
C trong vài giây cho đến vài phút
Trong giai đoạn biến tính phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép
được tách thành 2 sợi đơn (single strands) dùng làm khuôn cho các đoạn
mồi bám và enzyme RNA polymerase xúc tác tổng hợp. Tất cả các phản
ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng
hợp DNA từ chu kỳ trước đó).
- Ủ với mồi (annealing) ở 50-55
o
C
Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương
đồng ở DNA khuôn mẫu. Các primer bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển
động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt gãy liên tục
giữa primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi đơn. Các liên kết ion ổn định
hơn t đoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các
đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme polymerase có
thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.
- Tổng hợp (synthesis) ở 70-72
o
C trong vài chục giây cho đến


201
vài chục phút.
Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng

hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’ 3’. Các primer
ơ
t gãy. Các primer ở các vị trí không bắt
cặp chính xác lại bị rời ra (do nhiệt đ
. Enzyme Taq polymerase bổ sung các dNTP từ 5’ 3’.
Hình 9.10 Sơ đ phản ứng trùng hợp DNA polymerase (PCR)



Hình 9.11 Các chu kỳ phản ứng PCR

Phản ứng PCR về nguyên tắc là đơn giản, nhưng để đạt được kết quả
tốt cần phải thực hiện rất cẩn thận. Trình tự của đoạn mồi đối với kết quả
thí nghiệm cũng quan trọng như đảm bảo đúng nhiệt độ trong từng giai
đoạn của chu kỳ phản ứng. Cuối cùng là những vấn đề quan trọng sau khi
sử dụng sản phẩm khuếch đại PCR.
- Cấu trúc của mồi oligonucleotide cho phản ứng PCR
Mồi quyết định sự thành công hay thất bại của thí nghiệm PCR. Khi
nó được thiết kế đúng thì xảy ra sự khuếch đại đoạn DNA mong muốn.
Nếu đoạn mồi được thiết kế sai không xảy ra phản ứng vì không xảy ra sự
tổng hợp hoặc tổng hợp đoạn không mong muốn, thậm chí nhiều đoạn


202
DNA được khuếch đại (Hình 9.12).

Hình 9.12 Kết quả của PCR với các cặp primer khác nhau. Giếng 1 thể hiện
đoạn gene duy nhất được khuếch đại với độ lớn mong muốn. Ở giếng 2 không
có sản phẩm được khuếch đại do primer không lai với DNA khuôn. Giếng 3 và 4
chứa một sản phẩm có độ lớn sai và một hỗn hợp các phân tử (1 vạch đúng và 2

vạch sai), cả 2 kết quả đều do primer đã gắn sai vị trí trên DNA khuôn
Trình tự đoạn mồi phải tương ứng với trình tự hai đầu của đoạn DNA
mong muốn và mỗi đoạn mồi phải bổ sung với sợi khuôn thì mới xảy ra
phản ứng lai.

Hình 9.13 Độ dài primer quyết đinh tính chất đặc biệt PCR
- Kích thước của đoạn DNA
Đoạn DNA muốn khuếch đại không nên dài hơn 3 kb, trong trường
hợp lý tưởng độ lớn của nó nên nhỏ hơn 1 kb. Bằng kỷ thuật PCR thông